Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

Kristin  M. Riching; Sarah  D. Mahan; Marjeta Urh; Danette  L. Daniels

doi:10.3791/61787

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61787

⸱

9 listopada 2020

Kristin M. Riching¹ , Sarah D. Mahan¹ , Marjeta Urh¹ , Danette L. Daniels¹

¹Promega Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC₅₀ i Dmax₅₀.

Streszczenie

Ukierunkowane związki degradacji białek, w tym kleje molekularne lub chimery ukierunkowane na proteolizę, są ekscytującą nową metodą terapeutyczną w odkrywaniu leków małocząsteczkowych. Ta klasa związków indukuje degradację białek poprzez zbliżenie białka docelowego i białek maszynerii ligazy E3 wymaganych do ubikwitynacji i ostatecznie degradacji białka docelowego poprzez szlak ubikwityna-proteasomal (UPP). Profilowanie degradacji białka docelowego w sposób wysokoprzepustowy pozostaje jednak dużym wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność szlaków komórkowych wymaganych do osiągnięcia degradacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół i strategię badań przesiewowych opartą na zastosowaniu endogennego znakowania białek docelowych CRISPR/Cas9 za pomocą 11-aminokwasowego znacznika HiBiT, który uzupełnia się z wysokim powinowactwem do białka LgBiT, w celu wytworzenia białka luminescencyjnego. Te ukierunkowane na CRISPR linie komórkowe z endogennymi znacznikami mogą być używane do pomiaru degradacji indukowanej związkami w czasie rzeczywistym, kinetycznych żywych komórkach lub w trybie litycznym punktu końcowego poprzez monitorowanie sygnału luminescencyjnego za pomocą czytnika opartego na płytce luminescencyjnej. W tym miejscu przedstawiamy zalecane protokoły badań przesiewowych dla różnych formatów, a także opisujemy obliczanie kluczowych parametrów degradacji szybkości, Dmax, DC₅₀, Dmax₅₀, a także multipleksowanie z testami żywotności komórek. Podejścia te umożliwiają szybkie odkrywanie i klasyfikację związków we wczesnym stadium przy jednoczesnym utrzymaniu endogennej ekspresji i regulacji białek docelowych w odpowiednich tłach komórkowych, co pozwala na skuteczną optymalizację wiodących związków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Ukierunkowana degradacja białek stała się jednym z najszybciej rozwijających się obszarów w odkrywaniu leków małocząsteczkowych, znacznie wzmocnionym przez sukces terapeutyczny immunomodulujących molekularnych związków kleju (np. IMiD) w leczeniu raka, oraz obiecujące wczesne dane z badań klinicznych związków chimery ukierunkowanych na proteolizę¹^,^2,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Ukierunkowane związki degradacji białek działają poprzez zbliżenie docelowego białka z białkami maszynowymi ligazy E3¹^,^2,^3,⁴^,⁵^,⁶^,7^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Ta indukowana związkiem rekrutacja białka docelowego do ligazy E3 prowadzi do ubikwitynacji i degradacji białka docelowego poprzez szlak proteasomalny ubikwityny (UPP)¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Historycznie rzecz biorąc, programy badań przesiewowych w celu odkrywania leków małocząsteczkowych opierały się na wstępnych testach biochemicznych w celu oceny aktywności i uszeregowania związków rzędu. Stanowi to jednak poważne wyzwanie dla docelowych degraderów białek, których ostateczna aktywność, degradacja przez proteasom, zależy od kaskady zdarzeń komórkowych¹^,²,⁴^,5^,⁶^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Mnogość szlaków i złożoność kompleksów białkowych wymaganych do pomyślnej degradacji celu wymaga podejść do testów komórkowych w celu wczesnego badania przesiewowego i selekcji początkowych związków. Obecnie zdecydowanie brakuje technologii monitorowania degradacji białek docelowych w sposób wysokoprzepustowy w kontekście środowiska komórkowego¹⁴. Tutaj przedstawimy protokoły do oceny aktywności degradacji litycznej żywej żywej komórki lub punktu końcowego w czasie rzeczywistym przy użyciu CRISPR/Cas9 endogennie oznakowanych docelowych linii komórkowych HiBiT¹⁸^,¹⁹^,²⁰ do monitorowania utraty docelowego białka za pomocą pomiaru luminescencyjnego po leczeniu związkami degradującymi¹⁰^,¹¹^,¹⁸^,¹⁹.

Aby osiągnąć skuteczną degradację celów terapeutycznych i rozszerzyć proteom ulegający leczeniu, pojawiły się liczne podejścia i typy degraderów, które mogą celować w szeroki zakres białek do zniszczenia, w tym te zlokalizowane na lub w błonie plazmatycznej, lizosomach, błonach mitochondrialnych, cytoplazmie i jądrze²¹^–⁵⁷. Dwie podstawowe klasy najczęściej badanych związków to kleje molekularne i białka ukierunkowane na cimeras²^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,¹²^,²⁶. Kleje molekularne są monowalentne, a więc zazwyczaj mają mniejszy rozmiar i ułatwiają nowy interfejs interakcji białko-białko z białkiem docelowym po związaniu ze składnikiem ligazy E3²^,¹²^,²⁶. Są to najczęściej degradery, które wiążą się ze składnikiem ligazy Cereblon (CRBN) E3²^,¹²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷. Ostatnio jednak ekscytujące nowe przykłady wykorzystujące inne maszyny ligazy E3, takie jak DCAF15⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰ i rekrutacja CDK/Cyclin do DDB1⁴⁵ pokazują potencjał ekspansji tej klasy związków. W przeciwieństwie do tego, PROTAC są większymi, dwuwartościowymi cząsteczkami, składającymi się z docelowego liganda wiążącego, najczęściej inhibitora, połączonego za pomocą łącznika chemicznego z ligazą E3 uchwyt¹^,³^,⁴^,⁵^,⁷^,¹³. W związku z tym związki te są zdolne do bezpośredniego wiązania się zarówno z ligazą E3, jak i z białkiem docelowym¹^,³^,⁴^,⁵^,⁷^,¹³. Wykazano, że liczne białka są degradowane przez te dwuwartościowe cząsteczki, a najczęściej używane uchwyty ligazy E3 rekrutują się do CRBN lub Von Hippel Lindau (VHL)¹^,³^,⁴^,5^,⁷^,¹³. Jednak liczba dostępnych uchwytów do rekrutacji ligazy E3 w chimerach ukierunkowanych na projekt proteolizy szybko rośnie, rozszerzając możliwości tej klasy związków o potencjał degradacji różnych klas docelowych, a także zwiększenia swoistości komórek lub typów tkanek²⁴^,⁴⁸^,⁶¹^,⁶². W połączeniu z minimalnym wymogiem angażowania białka docelowego, nawet przy marginalnym powinowactwie, związki degradacyjne dają nadzieję na rozszerzenie proteomu podatnego na działanie leków.

Scharakteryzowanie komórkowej dynamiki utraty białka, jak również potencjalnej regeneracji białka po leczeniu, jest kluczowe dla zrozumienia funkcji i skuteczności związku degradacji. Chociaż możliwe jest badanie zmian poziomu białka endogennego w odpowiednich układach komórkowych za pomocą testów przeciwciał Western blot lub spektrometrii mas, podejścia te są trudne do dostosowania do formatów badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, mają ograniczoną zdolność kwantyfikacji lub zdolność do pomiaru zmian kinetycznych w wielu punktach czasowych¹⁴. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy komórkowy system luminescencyjny oparty na płytkach do monitorowania zmian poziomów białek endogennych, który wykorzystuje insercję genomową za pośrednictwem CRISPR/Cas9 znacznika 11 aminokwasów, HiBiT, do loci dowolnych kluczowych celów degradacji¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Peptyd ten uzupełnia się z wysokim powinowactwem do swojego partnera wiążącego, LgBiT, aby wytworzyć jasną luminescencję w obecności swojego substratu¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁶³, dzięki czemu te oznaczone endogenne białka świecą w komórkach lub lizatach¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁶³. Względne jednostki światła (RLU) mierzone za pomocą luminometru są wprost proporcjonalne do oznaczonych docelowych poziomów białka¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁶³. Wraz z rozwojem stabilizowanych substratów lucyferazy, możliwe są pomiary poziomu białka kinetycznego w czasie rzeczywistym w przedziałach czasowych 24-48 godzin¹⁸^,⁵³^,⁶⁴. Pozwala to na określenie pełnego profilu degradacji dla dowolnego celu przy dowolnym stężeniu związku, w tym analizę ilościową początkowej szybkości degradacji, maksimum degradacji (Dmax) i odzysku po traktowaniu związkiem¹⁸^,⁵³. Jednak w przypadku badań przesiewowych dużych bibliotek związków degradacyjnych analizę punktów końcowych można również łatwo przeprowadzić w formacie 384-dołkowym przy różnych stężeniach leku i wyznaczonych porach.

Protokoły przedstawione w tym manuskrypcie reprezentują strategie badań przesiewowych komórek dla ukierunkowanych związków degradacji białek, mające zastosowanie do wszystkich typów degraderów. Wykorzystanie linii komórkowych HiBiT CRISPR wraz z tymi protokołami nie ogranicza się jednak do degradacji białek, a raczej jest to ogólne narzędzie do monitorowania dowolnego endogennego poziomu białka docelowego, który można modulować po leczeniu w celu zbadania wpływu związków, a nawet mechanizmów oporności²⁰^,⁶⁵^,⁶⁶. Warunkiem wstępnym dla tych metod wykrywania opartych na luminescencji jest endogennie znakowana linia komórek docelowych HiBiT CRISPR, która ma kluczowe znaczenie, ponieważ umożliwia czułe wykrywanie luminescencyjne, przy jednoczesnym zachowaniu endogennej ekspresji celu i natywnej regulacji promotora¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Poczyniono znaczne postępy w wykorzystaniu CRISRP/Cas9 do wstawiania znaczników genomowych, szczególnie w skalowalności²⁰ i wysokiej czułości wykrywania, w różnych formatach, w tym pulach CRISPR lub klonach z heterozygotyczną lub homozygotyczną insercją alleli¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Możliwe jest stosowanie egzogennej ekspresji HiBiT lub innych fuzji reporterowych w komórkach zamiast znakowania endogennego, ale należy zachować znaczną ostrożność przy użyciu systemów z nadekspresją białek¹⁴^,¹⁸. Mogą one prowadzić do artefaktów w zrozumieniu prawdziwej siły działania związku i dynamiki odzyskiwania białek¹⁴^,¹⁸, w tym potencjalne pętle transkrypcyjnego sprzężenia zwrotnego aktywowane po degradacji celu. Ponadto związki we wczesnym stadium o niskiej sile działania mogą zostać pominięte i prezentować się jako fałszywie ujemne wyniki w badaniach przesiewowych. Ponieważ utrata białka może wynikać z toksyczności wywołanej związkiem i śmierci komórki, opisane tutaj protokoły zawierają wysoce zalecane, ale opcjonalne testy żywotności komórek, luminescencyjne lub fluorescencyjne w połączeniu z protokołem degradacji. Protokół składa się z dwóch głównych sekcji: litycznego punktu końcowego i kinetycznego badania przesiewowego żywych komórek. W każdej z tych sekcji znajdują się opcje multipleksowanych pomiarów żywotności komórek w formatach końcowych lub kinetycznych. Monitorowanie zmian znakowanego białka endogennego wymaga uzupełnienia LgBiT w komórkach. W związku z tym sekcja badań przesiewowych kinetycznych odwołuje się do ważnych protokołów dotyczących ich wprowadzenia, co można osiągnąć poprzez przejściową lub stabilną ekspresję i jest niezbędne do wykonywania pomiarów luminescencyjnych na żywych komórkach. Wszystkie przedstawione tutaj podejścia umożliwiają szybkie uporządkowanie rang i ocenę aktywności związków, umożliwiając badania przesiewowe związków na wczesnym etapie i szybszą identyfikację degraderów ołowiu.

Ten protokół jest przeznaczony do badania związków degradacyjnych w połączeniu z linią komórkową HiBiT CRISPR. Protokoły generowania wstawienia HiBiT CRISPR dla wielu celów zostały przedstawione w kilku ostatnich publikacjach¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Protokół

1. Badania degradacji końcowej z wykorzystaniem białek docelowych CRISPR HiBiT w formacie litycznym z opcjonalną fluorescencyjną analizą żywotności komórek

Przygotowanie i wysiew ssaczej linii komórkowej adherentnej lub w zawiesinie
1. Dostosuj gęstość komórek do poziomu 2,22 x 10⁵/ml poprzez rozcieńczenie w odpowiedniej pożywce komórkowej stosowanej do pasażowania i wzrostu komórek.
2. Rozdzielić komórki do płytek, zachowując minimum 3 studzienki na każdy wariant eksperymentalny oraz kontrolny. Rozdzielić 90 µL (20 000 komórek) zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę białych płytek 96-dołkowych. W przypadku formatu 384-dołkowego należy nanieść 36 µL (8000 komórek) zawiesiny komórkowej na dołek w białych płytkach 384-dołkowych.
Przygotowanie i dodawanie związków
1. Przygotować płytki z PROTAC lub badanym związkiem degradującym w szeregowych rozcieńczeniach o stężeniu końcowym 1000x w 100% DMSO. Następnie rozcieńczyć go do stężenia końcowego 10x w pożywce hodowlanej. Do pożywki dodać równą objętość DMSO, która posłuży jako kontrola DMSO bez związku.
2. W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 10 µL 10-krotnych roztworów związku i roztworów kontrolnych do 90 µL komórek. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 4 µL 10-krotnych roztworów związków i roztworów kontrolnych do 36 µL komórek.
3. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2₂ przez pożądany czas lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu.
  UWAGA: Ponieważ jest to test końcowy, badanie wielu punktów czasowych będzie wymagało przygotowania oddzielnych płytek do degradacji dla każdego punktu czasowego, zgodnie z opisem w powyższym kroku 1.1.2. Czas inkubacji niezbędny do wykrycia degradacji indukowanej związkiem jest bardzo zróżnicowany i prawdopodobnie zależy również od stężenia związku. Sugerowane początkowe punkty czasowe to 6 h i 24 h.
4. W przypadku pomiaru końcowej luminescencji bez opcjonalnego pomiaru żywotności komórek, należy przejść bezpośrednio do kroku 1.3 poniżej. W przypadku przeprowadzania analizy multipleksowej z pomiarem żywotności komórek, należy przejść do następnej sekcji 1.4 poniżej.
Pomiar lityczny komórek
1. Bezpośrednio przed wykonaniem pomiarów litycznych HiBiT należy przygotować 2x odczynnik do detekcji litycznej poprzez dodanie 20 µL podłoża litycznego i 10 µL białka LgBiT na każdy 1 ml buforu litycznego. Przygotować odpowiednią ilość 2x odczynnika detekcyjnego dla liczby studni przeznaczonych do analizy, uwzględniając dodatkową objętość w celu zniwelowania błędów pipetowania (tj. liczba studni + 10%).
2. Dodać przygotowany odczyn do detekcji litycznej do komórek. W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 100 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studzienki zawierającej 100 µL komórek. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 40 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studzienki zawierającej 40 µL komórek. Mieszaj płytkę na wstrząsarku do mikro płytek przez 10–20 min przy 350 obr./min.
3. Pomiar luminescencji należy przeprowadzić za pomocą luminometru umożliwiającego odczyt luminescencji z płytki 96- lub 384-dołkowej.
Opcjonalne multipleksowanie żywotności komórek
UWAGA: Ten etap jest wykonywany przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu CellTiter-Fluor (CTF) (patrz Tabela materiałów).
1. Na 30–40 minut przed planowanym pomiarem punktu końcowego przygotować 6-krotny roztwór odczynnika do wykrywania żywotności komórek poprzez dodanie 10 µL podłoża do 2 ml buforu do analizy. Należy przygotować odpowiednią ilość odczynnika 6x dla każdej analizowanej studzienki, uwzględniając dodatkową objętość na błędy pipetowania (tzn. liczba studzienek + 10%).
2. Należy dodać przygotowany odczynnik do dołków. W przypadku formatu 96-dołkowego należy dodać 20 µL odczynnika 6x do każdej studzienki zawierającej już 100 µL objętość. Dla formatu 384-dołkowego dodać 8 µL 6x odczynnika do każdej studzienki zawierającej 40 µL komórek. Wymieszać krótko za pomocą wstrząsarki do mikropłytek, a następnie inkubować płytkę przez 30 min w 37 °C inkubator.
3. W wyznaczonym punkcie końcowym pomiaru (tj. 6 lub 24 h po zastosowaniu preparatu, krok 1.2.3), zmierz fluorescencję przy użyciu urządzenia zdolnego do odczytu fluorescencji (380–400 nm)_Ex/505 nm_Em) w formacie 96- lub 384-dołkowym.
4. Przygotować 2x odczynnik do detekcji litycznej poprzez dodanie 20 µL podłoża litycznego i 10 µL białka LgBiT na 1 ml buforu litycznego. Przygotować odpowiednią ilość 2-krotnego odczynnika detekcyjnego dla liczby studzienek do analizy, uwzględniając dodatkową objętość na błędy pipetowania (np. liczba studzienek + 10%).
5. Do studni dodać przygotowany odczyn do detekcji lizy. W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 120 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studni zawierającej już 120 µL objętość. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 48 µL 2x odczynnika do detekcji litycznej do każdej studzienki zawierającej już 48 µL objętość. Mieszaj płytkę na wstrząsarze do mikropłytek przez 10–20 min.
6. Pomiar luminescencji należy przeprowadzić za pomocą luminometru zdolnego do odczytu luminescencji w płytkach 96- lub 384-dołkowych.
Ilościowe określenie degradacji i żywotności komórek
1. Oblicz średnią wartość względnych jednostek światła (RLU) dla kontroli DMSO w danym punkcie czasowym. Wartość tę należy przyjąć jako bazowy poziom białka docelowego do obliczenia frakcyjnej degradacji, normalizując do niej wyniki wszystkich pozostałych badanych preparatów w tym samym punkcie czasowym. Na przykład, jeśli średnia wartość RLU dla studzienek z kontrolą DMSO po 6 h wynosiła 10 000, a wartość RLU dla konkretnego związku po 6 h wynosiła 5 000, frakcyjną degradację oblicza się następująco: 5 000 ÷ 10 000 = 0,5 (Równanie 1).
  Równanie 1:
2. Wyznacz procent degradacji na podstawie ułamkowych jednostek RLU:
  Równanie 2:
3. Nanieś na wykres ułamkową wartość RLU lub % degradacji w określonych punktach czasowych, aby uszeregować aktywność związków.
4. Opcjonalnie można przeanalizować dane dotyczące względnych jednostek fluorescencji (RFU) dla pomiaru testu żywotności komórek, porównując wartości dla wszystkich wariantów z kontrolą DMSO. Jeśli dla któregokolwiek wariantu zaobserwowano istotny spadek RFU w stosunku do kontroli DMSO, dane dotyczące degradacji można dodatkowo znormalizować względem danych z testu żywotności komórek, aby określić zmiany poziomu białka w relacji do spadku żywotności komórek.

2. Kinetyka degradacji białek docelowych CRISPR z tagiem HiBiT w czasie rzeczywistym i opcjonalny luminescencyjny test żywotności komórek

UWAGA: Możliwość przeprowadzenia screeningu kinetycznego i analizy degradacji wymaga koekspresji białka LgBiT w komórce, co zostało opisane wcześniej¹⁸^,¹⁹^,⁶³. Można to osiągnąć poprzez przejściową transfekcję wektora LgBiT, zastosowanie BacMam LgBiT lub poprzez wykonanie insercji HiBiT za pomocą CRISPR w stabilnej linii komórkowej LgBiT.

Wysiew linii komórek adherentnych.
1. Usunąć medium z kolby za pomocą aspiratora, przemyć komórki DPBS, dysocjować komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i odczekać do pełnej dysocjacji komórek z dna kolby. W przypadku linii komórek w zawiesinie przejść do sekcji 2.2.
2. Zneutralizować trypsynę za pomocą pożywki hodowlanej z dodatkiem surowicy, wymieszać w celu zebrania i resuspensji komórek, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej.
3. Wirować komórki przy 125 x g przez 5 min. Odlać pożywkę hodowlaną i resuspenderować w równym objętości świeżej pożywki hodowlanej.
4. Wysiać komórki na płytki analityczne, zapewniając minimum trzy powtórzenia dla każdego stanu badawczego i kontrolnego. Dla formatu 96-dołkowego ocenić gęstość komórkową, dostosować ją do poziomu 2 x 10⁵ komórek/mL w medium analitycznym i nanieść 100 µL (20 000 komórek) na dołek w płytce 96-dołkowej. Dla formatu 384-dołkowego ocenić gęstość komórkową, dostosować ją do poziomu 4,44 x 10⁵ komórek/mL w medium analitycznym i nanieść 18 µL (8 000 komórek) na dołek.
5. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ przez noc lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu.
Wysiew komórek w zawiesinie
1. Dostosować gęstość komórkową do poziomu 2,22 x 10⁵ komórek/mL w medium niezależnym od CO₂ uzupełnionym o 10% FBS i 1x Endurazine (rozcieńczenie 1:100 roztworu zapasowego).
2. Wysiać komórki na płytki analityczne, zapewniając minimum 3 dołki dla każdego stanu badawczego i kontrolnego. Dla formatu 96-dołkowego nanieść 90 µL (20 000 komórek) na dołek. Dla formatu 384-dołkowego nanieść 36 µL (8 000 komórek) na dołek.
  UWAGA: W przypadku linii komórek w zawiesinie o niskim stosunku sygnału do tła (S:B) luminescencji, np. podczas pracy z pulami CRISPR zamiast klonów, można zwiększyć luminescencję poprzez zwiększenie liczby wysiewanych komórek, do 100 000 komórek/dołek w formacie 96-dołkowym lub 40 000 komórek/dołek w formacie 384-dołkowym.
Kinetyczne analizy degradacji z użyciem komórek HiBiT CRISPR wykazujących ekspresję LgBiT
1. W przypadku komórek w zawiesinie zawierających już Endurazine, który został dodany na etapie wysiewu w punkcie 2.2., przejść bezpośrednio do kroku 2.3.3. Dla linii komórek adherentnych przygotować roztwór Nano-Glo Endurazine. Dla formatu 96-dołkowego przygotować roztwór 1x Endurazine, rozcieńczając odczynnik zapasowy 1:100 w medium niezależnym od CO₂ uzupełnionym o 10% FBS. Dla formatu 384-dołkowego przygotować roztwór 2x Endurazine, rozcieńczając odczynnik zapasowy 1:50 w medium niezależnym od CO₂ uzupełnionym o 10% FBS.
2. Dodać roztwór Endurazine do każdego dołka z komórkami adherentnymi. Dla formatu 96-dołkowego odessać medium i dodać 90 µL roztworu 1x Endurazine. Dla formatu 384-dołkowego dodać 18 µL roztworu 2x Endurazine do 18 µL komórek. Nie odsysać medium, ponieważ analiza degradacji w formacie 384-dołkowym jest przeprowadzana w mieszaninie 50:50 pożywki hodowlanej i medium niezależnego od CO₂.
3. Inkubować płytki z komórkami w zawiesinie lub adherentnymi zawierające Endurazine przez 2,5 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, aby umożliwić wyrównanie poziomu luminescencji.
4. Przygotować 10-krotne stężenie miareczkowania testowanego PROTAC w medium niezależnym od CO₂ i dodać 10 µL do każdego dołka w płytce 96-dołkowej lub 4 µL w płytce 384-dołkowej. Dla związków o nieznanej skuteczności zaleca się stężenie końcowe 1-10 µM w najwyższym punkcie jako punkt wyjścia.
5. Zbierać pomiary kinetyczne luminescencji w lumnometrze uprzednio wyrównanym do 37 °C w okresie od 0 do 48 h. Interwały czasowe pomiarów można dostosować do każdego eksperymentu, ale zalecanym początkowym eksperymentem byłyby pomiary luminescencji co 5-15 min przez 24 h lub wybrany czas.
Opcjonalna analiza multipleksowa żywotności komórek w tym samym dołku po końcowym pomiarze kinetycznym
UWAGA: Analiza ta jest przeprowadzana przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu CellTiter-Glo (CTG) (patrz Tabela materiałów).
1. Dostosować temperaturę odczynnika CTG do temperatury pokojowej.
2. Po pomiarze degradacji w ostatnim punkcie czasowym analizy kinetycznej, dodać 100 µL (płytka 96-dołkowa) lub 40 µL (płytka 384-dołkowa) odczynnika na dołek, a następnie mieszać na potrząsaczu do płytek z prędkością 500-700 rpm (płytka 96-dołkowa) lub w mikropłytkowym wstrząsacu (płytka 384-dołkowa) przez 5 min.
3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić lizę komórek i wygaszenie sygnału HiBiT.
4. Zmierzyć całkowitą luminescencję w lumnometrze zgodnie z zaleceniami producenta.
Kwantyfikacja profilów kinetycznej degradacji
1. Wykorzystując zebrane pomiary kinetyczne luminescencji, znormalizować surowe wartości RLU dla każdego stężenia PROTAC względem średniej wartości dla powtórzeń w warunkach DMSO w każdym punkcie czasowym, aby uwzględnić zmiany stężenia wolnej furimazyny w czasie. Obliczyć ułamkowe RLU zgodnie z Równaniem 1.
  Równanie 1:
2. Na podstawie krzywych degradacji dopasować jednoskładnikowy model wykładniczego zaniku zgodnie z Równaniem 2 do początkowej części degradacji każdej krzywej, aż do punktu, w którym dane osiągną plateau.
  UWAGA: Pomocne może być wykluczenie z dopasowania pierwszych kilku punktów danych, ponieważ może wystąpić krótka faza opóźnienia przed zaobserwowaniem degradacji.
  Równanie 2:
3. Z Równania 2 wyznaczyć parametr ƛ, który reprezentuje stałą szybkości degradacji, oraz Plateau, który reprezentuje najniższą pozostałą ilość białka.
4. Obliczyć Dmax, czyli maksymalną ułamkową ilość zdegradowanego białka, obliczaną jako 1-Plateau.
5. Wykreślić Dmax dla każdego stężenia PROTAC, aby wyznaczyć niezależną od czasu krzywą mocy degradacji.
6. Wyznaczyć wartość Dmax₅₀ dla wykresu z punktu 2.3.5, aby przeanalizować skuteczność związków.
  UWAGA: Aby wyznaczyć DC₅₀ w konkretnym punkcie czasowym, należy wykreślić obliczony procent degradacji dla każdego stężenia w wybranym czasie. Może to być określone jako DC₅₀ t=4 h lub DC₅₀ t=12 h.

Wyniki

Aby zademonstrować analizę litycznej degradacji w punkcie końcowym przy pojedynczym stężeniu, kilka białek docelowych CDK; CDK2, CDK4, CDK7 oraz CDK10 zostało endogennie oznakowane HiBiT na C-końcu w komórkach HEK293 i poddanych działaniu pan-kinazy PROTAC opartego na Cereblonie, TL12-186 w stężeniu 1 µM⁵⁴ (Rysunek 1A). Poziom białek CDK mierzono w różnych punktach czasowych, a następnie określono frakcyjne RLU względem kontroli DMSO (Rysunek 1A). Każde białko CDK wykazało różny stopień degradacji w odpowiedzi na traktowanie związkiem w poszczególnych punktach czasowych (Rysunek 1A). Aby bezpośrednio porównać białka CDK pod kątem utraty białka, frakcyjne RLU z Rysunku 1A przeliczono na całkowity % degradacji i przedstawiono dla każdego punktu czasowego na Rysunku 1B. Pokazuje to, że nawet w wczesnych punktach czasowych, 2 lub 4 h, niektóre członkowie rodziny CDK wykazują wysoki poziom degradacji, który nadal wzrasta w czasie (Rysunek 1B).

Aby zademonstrować analizę kinetyki degradacji, każdy z białek z rodziny BET; BRD2, BRD3 i BRD4 został endogennie oznakowany HiBiT na N-końcu w komórkach HEK293 stabilnie eksponujących białko LgBiT¹⁸. Następnie poddano je działaniu trzech różnych stężeń pan-BET PROTACów; opartego na Cereblonie dBET6⁵⁰ (Rysunek 2A) oraz opartego na VHL ARV-771⁴¹ (Rysunek 2B). Pomiary kinetyczne zbierano przez okres 24 h, a z profili dla każdego stężenia wyraźnie widać różnice w odpowiedzi członków rodziny BET. Zdolność BRD2 do inicjowania szybszej odpowiedzi regeneracyjnej po zastosowaniu związku degradującego (Rysunek 2A,B) była wcześniej obserwowana przy użyciu innych pan-BET PROTACów i prawdopodobnie wynika z transkrypcyjnej odpowiedzi sprzężenia zwrotnego konkurencyjnej wobec procesu degradacji¹⁸.

Zarówno analiza końcowa (endpoint), jak i kinetyczna mogą być przeprowadzone przy zastosowaniu pełnych serii dawek związków. Na Rysunku 3 przedstawiono kinetyczne profile degradacji w odpowiedzi na dawkę podczas traktowania komórek Jurkat Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR stabilnie ekspresujących białko LgBiT czterema różnymi związkami typu „molecular glue”²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷: lenalidomidem (Rysunek 3A), iberdomidem (CC-220) (Rysunek 3B), talidomidem (Rysunek 3C) oraz pomalidomidem (Rysunek 3D). Degradery te wykazują istotne różnice w odpowiedzi degradacyjnej zarówno pomiędzy poszczególnymi związkami, jak i w obrębie serii stężeń (Rysunek 3).

Aby ilościowo ocenić degradację i uszeregować związki przedstawione na Rysunku 3, wykorzystano profile odpowiedzi na dawkę do obliczenia kluczowych parametrów degradacji, w tym szybkości degradacji (Rysunek 4A), wartości Dmax (Rysunek 4B) oraz wartości Dmax₅₀ (Rysunek 4B). Analizy te wykazują, że iberdomid (CC-220) i pomalidomid charakteryzują się bardzo podobnymi, szybkimi początkowymi szybkościami degradacji (Rysunek 4A), jednak iberdomid (CC-220) wykazuje najwyższą aktywność, co potwierdzono we wcześniejszych badaniach ortogonalnych⁵⁵^,⁵⁷ (Rysunek 4B). Ponieważ iberdomid wykazuje tak wysoką aktywność, a wszystkie testowane stężenia powodują degradację przekraczającą 50%, wartość Dmax₅₀ uzyskana dla iberdomidu stanowi szacunek wynikający z ograniczeń w dokładnym dopasowaniu danych. Z wykresów na Rysunku 3C,D oraz Rysunku 4B wynika, że ani lenalidomid, ani talidomid nie degradują celu Ikaros/IKZF1 do końca przy najwyższych testowanych stężeniach. Ze względu na bardzo niską degradację obserwowaną przy zastosowaniu talidomidu, krzywe degradacji nie mogły zostać dokładnie dopasowane do modelu wykładniczego, w związku z czym nie określono ilościowo szybkości degradacji dla tej terapii. Najsilniejszym degraderem okazał się iberdomid (CC-220)⁵⁵^,⁵⁷ (Rysunek 4B). Multiplexowe testy żywotności komórek nie wykazały spadku żywotności komórkowej dla testowanych stężeń (Rysunek 4C).

Degradacja CDK w czasie; wykres liniowy i słupkowy; analiza rozkładu CDK2/4/7/10-HiBiT; badanie proteolizy.
Rycina 1: Degradacja końcowa CDK i toksyczność przy użyciu pan-kinazowego PROTAC, TL12-186⁵⁴. (A) Wybrany panel endogennych białek docelowych CDK z fuzją HiBiT na C-końcu za pomocą CRISPR/Cas9, poddanych ocenie degradacji pod wpływem 1 µM PROTAC TL12-186⁵⁴ po 2 h, 4 h, 8 h i 24 h traktowania. Wartości przedstawiono jako ułamkową liczbę jednostek względnej luminescencji (RLU) w stosunku do kontroli DMSO mierzonej w każdym punkcie czasowym. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. (B) Procent degradacji panelu białek docelowych CDK obliczony na podstawie (A), reprezentujący stopień degradacji każdego członka rodziny zaobserwowany w punktach czasowych 2, 4, 8 i 24 h. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Profile kinetyki degradacji rodziny BET; wykres dla traktowania dBET6 i ARV-771; frakcyjne RLU w funkcji czasu.
Rycina 2: Profilowanie selektywności kinetyki degradacji członków rodziny BET za pomocą degraderów BET, dBET6⁵⁰ oraz ARV-771⁴¹.Profile kinetyki degradacji endogennych członków rodziny BET (BRD2, BRD3 i BRD4), znakowanych HiBiT na N-końcu za pomocą CRISPR/Cas9, po traktowaniu pojedynczymi stężeniami 1 nM (lewo), 10 nM (środek) lub 100 nM (prawo) PROTAC-ów dBET6⁵⁰ (A) lub ARV-771⁴¹ (B). Wartości przedstawiono jako frakcyjne RLU obliczone względem kontroli DMSO dla każdego punktu czasowego kinetyki. Słupki błędów reprezentują SD ze średniej z 4 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy zależności dawka-odpowiedź dla Ikaros IKZF1 dla czterech leków; analiza profilu kinetycznego, ułamkowe RLU w funkcji czasu.
Rysunek 3: Profile zależności dawka-odpowiedź kinetycznej degradacji żywych komórek Ikaros/IKZF1-HiBiT z panelem klejów molekularnych²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷. Komórki Jurkat stabilnie eksponujące białko LgBiT zostały zmodyfikowane za pomocą CRISPR/Cas9 w celu oznakowania końca C Ikaros/IKZF1 peptydem HiBiT. Komórki poddano działaniu serii 8 stężeń w zależności dawka-odpowiedź, w tym DMSO, dla czterech różnych związków z grupy klejów molekularnych²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷: (A) lenalidomidu, (B) iberdomidu (CC-220), (C) talidomidu lub (D) pomalidomidu. Luminescencję mierzono co 5 min przez łącznie 19,5 h. Dane jednostek względnych światła (RLU) z (A-D) przekształcono w ułamkowe RLU zgodnie z opisem w kroku 2.4.1 i przedstawiono na wykresie jako funkcję czasu. Słupki błędów reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy farmakodynamiczne: szybkość degradacji, maksimum oraz wyniki CellTiter Glo dla lenalidomidu.
Rycina 4: Obliczanie szybkości degradacji i Dmax50 dla Ikaros/IKZF1-HiBiT oraz multipleksowe testy kondycji komórek. Dane kinetyki degradacji z Ryciny 3 zostały wykorzystane do obliczenia ilościowych parametrów degradacji. (A) Szybkości degradacji i (B) maksymalne wartości degradacji (Dmax) przedstawiono na wykresach dla każdego stężenia leku w przypadku wskazanych związków typu molecular glue²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷. (B) Wartości Dmax₅₀ dla każdego związku obliczono przy użyciu modelu zależności od dawki z ograniczonym współczynnikiem nachylenia krzywej Hilla wynoszącym 1, co pozwala na uszeregowanie związków degradujących pod kątem konkretnego celu. (C) Testy żywotności komórek dla zależności od dawki degradacji iberdomidu (CC-220)⁵⁵^,⁵⁷ z Ryciny 3B przeprowadzono jako pomiar końcowy po zakończeniu pomiarów kinetyki degradacji. Słupki błędu reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj dwie metody przesiewowej aktywności związku degradacji w formacie litycznym punktu końcowego lub w trybie kinetycznym żywych komórek. Podejścia te opierają się na tych samych zasadach pomiaru luminescencyjnego, ale zapewniają różne poziomy szczegółowości i zrozumienia. Wybór któregokolwiek z tych podejść będzie prawdopodobnie zależał od celów przesiewowych i wielkości biblioteki złożonej. W przypadku dużych pokładów przesiewowych związków chemicznych lub przesiewowych wstępnych w celu obserwacji wykrywalnej degradacji, badania przesiewowe lityczne punktów końcowych zapewniają czułą i wydajną kompatybilność o wysokiej przepustowości, podczas gdy inne podejścia do punktów końcowych, takie jak western blot lub spektrometria mas, mogą być albo niepraktyczne, albo trudne do dostosowania¹⁴. Punktem wyjścia dla tych badań przesiewowych można było przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń i punktów czasowych. Zalecane stężenia początkowe do badania mieszczą się w zakresie 100 nM-10 μM, aby uwzględnić początkowe degradery o niskiej sile działania, słabej przepuszczalności lub, w niektórych przypadkach z bardzo silnymi związkami, obecność efektu haka. Ponadto zaleca się zbadanie co najmniej dwóch różnych punktów czasowych w celu ustalenia wczesnego początku degradacji po 4-6 godzinach oraz utajonej lub trwałej degradacji po 18-24 godzinach. Związki, które wykazują wysoką siłę degradacji i mechanizm on-target, są łatwo obserwowane w ciągu 4-6 godzin, podczas gdy degradacja lub pozorna utrata białka obserwowana dopiero w późniejszych punktach czasowych może być spowodowana różnymi mechanizmami. Zdecydowanie zaleca się monitorowanie żywotności komórek zarówno we wczesnym, jak i późnym punkcie czasowym, tak aby utrata białka mogła być oddzielona od utraty spowodowanej śmiercią komórki. Podobnie jak w przypadku każdego rodzaju testu luminescencyjnego lub fluorescencyjnego, istnieje możliwość, że związki w bibliotekach będą zakłócać lub hamować sygnał, dlatego ortogonalne eksperymenty uzupełniające ze związkami ołowiu wykorzystującymi niepowiązane fuzje lub alternatywne podejścia do monitorowania poziomu białka będą ważne dla oceny, czy utrata RLU w tych testach jest bezpośrednio związana z degradacją białka docelowego.

Zdolność do badania przesiewowego w formacie kinetycznym żywej komórki przez dłuższy czas zależy w dużej mierze od sygnału testowego do tła (S:B). Czynniki, które przyczyniają się do S:B, obejmują poziom ekspresji samego białka docelowego, który może obejmować kilka rzędów wielkości, wydajność ekspresji LgBiT w linii komórkowej wybranej do insercji peptydu, oraz dostępność oznaczonego celu do uzupełnienia w jego różnych natywnych kompleksach. Ustaliliśmy ogólny wymóg odcięcia składający się z S:B wynoszącego 15, aby skutecznie zmierzyć degradację w trybie kinetycznym za pomocą endurazyny lub wiwazyny. S: B określa się, mierząc sygnał wyjściowy komórek edytowanych przez HiBiT koeksprymujących LgBiT w stosunku do nieedytowanych komórek rodzicielskich eksprymujących LgBiT samodzielnie w obecności żywych substratów komórkowych endurazyny lub wiwazyny. Wiwazyna wytwarza silniejszy sygnał luminescencyjny, ale zanika szybciej niż endurazyna i może ograniczać akwizycję sygnału do 24 godzin lub mniej. Co więcej, S:B może być również w dużym stopniu zależny od tego, czy używane są pule CRISPR, czy klony. W przypadku celów w liniach komórkowych, które są bardziej podatne i mają wysoką wydajność w inżynierii CRISPR/Cas9, heterogeniczna populacja puli CRISPR edytowanych komórek może mieć wystarczającą ilość S:B do analizy kinetycznej. W przypadku celów w trudniejszych liniach komórkowych, w których mniej wydajna integracja genomowa za pomocą CRISPR skutkuje pulami o niskim S:B, izolacja klonów CRISPR może być konieczna w celu wzbogacenia edytowanych populacji i osiągnięcia wystarczająco wysokiego S:B do analizy kinetycznej. W każdym z tych scenariuszy, jeśli S:B jest mniejsze niż 15 z substratami enduraziny lub wiwazyny, zaleca się badanie przesiewowe lityczne punktu końcowego.

W celu lepszego zrozumienia i scharakteryzowania związków, w tym określenia profilu degradacji z parametrami ilościowymi, zalecanym podejściem przesiewowym jest analiza kinetyczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach^14,18. Podobnie jak omówiona powyżej analiza końcowa, wstępne kinetyczne badania przesiewowe można przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń w zakresie 100nM-10μM w sposób wysokoprzepustowy. W formacie 384-dołkowym ponad 100 związków można łatwo przesiać w trzech egzemplarzach w jednym stężeniu na jednej płytce. Uzyskane w ten sposób profile degradacji dostarczą wskazówek nie tylko co do zaobserwowanego zakresu degradacji, ale także szybkości degradacji, czasu trwania degradacji i potencjalnego odzysku białka^14,18 (Rysunek 2 i Rysunek 3). Kształty profilu degradacji również dostarczają cennych informacji. Specyficzne i silne degradery często wykazują początkową szybką utratę białka docelowego do plateau w ciągu kilku godzin^18,53, podczas gdy inne mechanizmy, takie jak transkrypcyjne sprzężenie zwrotne lub toksyczność związków, zwykle powodują bardziej liniową utratę białka w czasie. Te szczegóły i niuanse są pomijane w analizie litycznej punktów końcowych, a przy analizie w czasie rzeczywistym w ciągu 24-48 godzin nie trzeba przewidywać czasu, aby uchwycić prawdziwy Dmax w zestawach nowych lub nieznanych związków.

Kinetyka w czasie rzeczywistym pozwala również na efektywne badanie przesiewowe odpowiedzi na dawkę w celu lepszego zrozumienia skuteczności związku, jego wpływu na początkową szybkość degradacji oraz oferuje możliwości klasyfikowania związków na podstawie więcej niż jednego parametru. Klasyczne pomiary siły degradacji obejmują obliczenia DC₅₀ w określonym momencie w oparciu o maksima pozornej degradacji. W przeciwieństwie do tego, nasze kinetyczne podejście do oceny siły działania uwzględnia prawdziwe maksimum degradacji przy każdym stężeniu, niezależnie od tego, kiedy występuje w czasie¹⁸. Nazywamy ten pomiar siły degradacji kinetycznej Dmax₅₀¹⁸. Analiza w ten sposób uwzględnia związki, które mogą inicjować degradację wolniej przy niższych stężeniach, a zatem potrzebują więcej czasu po obróbce, aby osiągnąć Dmax. Szczególnie pouczające może być uszeregowanie związków zarówno pod względem szybkości degradacji, jak i Dmax. W przypadku najsilniejszych degraderów spowoduje to dalsze odróżnienie powolnych, ale silnych degraderów od tych, które są zarówno szybkie, jak i silne. Łącznie, zarówno badania przesiewowe lityczne, jak i kinetyczne żywych komórek z wykorzystaniem linii komórkowych HiBiT CRISPR są potężnymi podejściami, które dają bardziej kompleksowy obraz ukierunkowanej degradacji białek, funkcji związków i umożliwiają proces przesiewowy od wstępnej oceny aktywności do dalszej optymalizacji chemicznej poprzez poprawę kluczowych parametrów degradacji.

Oświadczenia

Promega Corporation jest właścicielem komercyjnym poprzez cesję patentów na technologie i zastosowania HiBiT i NanoLuc.

Podziękowania

K.M.R, S.D.M., M.U. i D.L.D są pracownikami Promega Corporation

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik CellTiter-Glo 2.0	Promega	G9241	Test luminescencyjny żywotności komórek
Test żywotności komórek CellTiter-Fluor	Promega	G6080	Test fluorescencyjny żywotności komórek
CO₂-independent	ThermoFisher	18045-088	Hodowla komórkowa
DMSO	Sigma Aldrich	D2650	Do rozcieńczania i kontroli związków
DPBS	Gibco	14190	Hodowla komórkowa
Surowica bydlęca	płodu Seradigm	89510-194	Hodowla komórkowa
HEK293 Stabilna linia komórkowa LgBiT	Promega	N2672	Do uzupełnienia HiBiT w celu wytworzenia luminescencji
HiBiT CRISPR linia komórkowa ssaków	Promega		https://www.promega.com/crispr-tpd
Roztwór higromycyny B	Gibco	10-687-010	Hodowla komórkowa
LgBiT BacMam	Promega CS1956C01		Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji
Wektor ekspresji LgBiT	Promega	N2681	Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji
Czytnik			płytek luminometruLuminomenter zdolny do pomiaru luminescencji i fluorescencji (np. GloMax Discover System, Promega GM3000)
NanoGlo Endurazine Żywy	substrat Odczynnik kinetyczny Promega		N2570
NanoGlo Vivazine Żywy substrat Odczynnik	kinetyczny Promega		N2580
NanoGlo HiBiT Lytic System detekcji	Promega	N3030	Enpoint litycznie HiBiT
Opti-MEM Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowej (ThermoFisher)	ThermoFisher	11058-021	Hodowla komórkowa
Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 96-dołkowa	Costar	3917	Hodowla komórkowa
Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 384-dołkowa	Corning	3570	Hodowla komórkowa
Trypsyna/EDTA	Gibco	25300	Hodowla komórkowa

HiBiT

Bibliografia

Burslem, G. M., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras as therapeutics and tools for biological discovery. Cell. 181 (1), 102-114 (2020).
Chamberlain, P. P., Hamann, L. G. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nature Chemical Biology. 15 (10), 937-944 (2019).
Churcher, I. Protac-induced protein degradation in drug discovery: Breaking the rules or just making new ones. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 444-452 (2018).
Ciulli, A., Farnaby, W. Protein degradation for drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 1-3 (2019).
Crews, C. M. Inducing protein degradation as a therapeutic strategy. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 403-404 (2018).
Cromm, P. M., Crews, C. M. Targeted protein degradation: from chemical biology to Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1181-1190 (2017).
Deshaies, R. J. Protein degradation: Prime time for PROTACs. Nature Chemical Biology. 11 (9), 634-635 (2015).
Lai, A. C., Crews, C. M. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 101-114 (2017).
Ottis, P., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras: Induced protein degradation as a therapeutic strategy. ACS Chemical Biology. 12 (4), 892-898 (2017).
Wu, T., et al. Targeted protein degradation as a powerful research tool in basic biology and drug target discovery. Nature Structural and Molecular Biology. 27, 605-614 (2020).
Hanan, E. J., et al. Monomeric targeted protein degraders. Journal of Medicinal Chemistry. , (2020).
Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
Carmony, K. C., Kim, K. B. PROTAC-induced proteolytic targeting. Methods in Molecular Biology. 832, 627-638 (2012).
Daniels, D. L., Riching, K. M., Urh, M. Monitoring and deciphering protein degradation pathways inside cells. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 61-68 (2019).
Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An emerging targeting technique for protein degradation in drug discovery. Bioessays. 40 (4), 1700247(2018).
Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology and Therapy. 174, 138-144 (2017).
Raina, K., Crews, C. M. Targeted protein knockdown using small molecule degraders. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 46-53 (2017).
Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
Schwinn, M. K., et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
Schwinn, M. K., Steffen, L. S., Zimmerman, K., Wood, K. V., Machleidt, T. A simple and scalable strategy for analysis of endogenous protein dynamics. Science Reports. 10 (1), 8953(2020).
Bensimon, A., et al. Targeted degradation of SLC transporters reveals amenability of multi-pass transmembrane proteins to ligand-induced proteolysis. Cell Chemical Biology. 27 (6), 728-739 (2020).
Bondeson, D. P., et al. Lessons in PROTAC design from selective degradation with a promiscuous warhead. Cell Chemical Biology. 25 (1), 78-87 (2018).
Buckley, D. L., et al. HaloPROTACS: Use of small molecule PROTACs to induce degradation of HaloTag fusion proteins. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1831-1837 (2015).
Bulatov, E., Ciulli, A. Targeting Cullin-RING E3 ubiquitin ligases for drug discovery: structure, assembly and small-molecule modulation. Biochemical Journal. 467 (3), 365-386 (2015).
Burslem, G. M., et al. The advantages of targeted protein degradation over inhibition: An RTK case study. Cell Chemical Biology. 25 (1), 67-77 (2018).
Chamberlain, P. P., et al. Evolution of cereblon-mediated protein degradation as a therapeutic modality. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (12), 1592-1602 (2019).
Crew, A. P., et al. Identification and characterization of Von Hippel-Lindau-recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 583-598 (2018).
DeMars, K. M., Yang, C., Castro-Rivera, C. I., Candelario-Jalil, E. Selective degradation of BET proteins with dBET1, a proteolysis-targeting chimera, potently reduces pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-activated microglia. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (1), 410-415 (2018).
Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
Farnaby, W., et al. BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nature Chemical Biology. 15 (7), 672-680 (2019).
Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
Gechijian, L. N., et al. Functional TRIM24 degrader via conjugation of ineffectual bromodomain and VHL ligands. Nature Chemical Biology. 14 (4), 405-412 (2018).
Gustafson, J. L., et al. Small-Molecule-Mediated Degradation of the Androgen Receptor through Hydrophobic Tagging. Angewandte Chemie International Edition England. 54 (33), 9659-9662 (2015).
Kerres, N., et al. Chemically induced degradation of the oncogenic transcription factor BCL6. Cell Reports. 20 (12), 2860-2875 (2017).
Lohbeck, J., Miller, A. K. Practical synthesis of a phthalimide-based Cereblon ligand to enable PROTAC development. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 26 (21), 5260-5262 (2016).
Lu, J., et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4. Chemical Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
Lu, M., et al. Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway. Eurupean Journal of Medicinal Chemistry. 146, 251-259 (2018).
Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14, 706-714 (2018).
Powell, C. E., et al. Chemically induced degradation of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (9), 4249-4255 (2018).
Raina, K., et al. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (26), 7124-7129 (2016).
Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceeding National Academy Science. 98 (15), 8554-8559 (2001).
Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular Cell Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
Schiedel, M., et al. Chemically induced degradation of Sirtuin 2 (Sirt2) by a proteolysis targeting chimera (PROTAC) based on sirtuin rearranging ligands (SirReals). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 482-491 (2018).
Slabicki, M., et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature. , (2020).
Smith, B. E., et al. Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase. Nature Communications. 10 (1), 131(2019).
Sun, B., et al. BET protein proteolysis targeting chimera (PROTAC) exerts potent lethal activity against mantle cell lymphoma cells. Leukemia. 32 (2), 343-352 (2018).
Tong, B., et al. A Nimbolide-based kinase degrader preferentially degrades oncogenic BCR-ABL. ACS Chemical Biology. 15 (7), 1788-1794 (2020).
Winter, G. E., et al. Drug Development. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
Winter, G. E., et al. BET Bromodomain proteins function as master transcription elongation factors independent of CDK9 recruitment. Molecular Cell. 67 (1), 5-18 (2017).
Zengerle, M., Chan, K. H., Ciulli, A. Selective Small Molecule Induced Degradation of the BET Bromodomain Protein BRD4. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1770-1777 (2015).
Zhang, C., et al. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) of anaplastic lymphoma kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
Zoppi, V., et al. Iterative design and optimization of initially inactive proteolysis targeting chimeras (PROTACs) identify VZ185 as a potent, fast, and selective von Hippel-Lindau (VHL) based dual degrader probe of BRD9 and BRD7. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (2), 699-726 (2019).
Huang, H. T., et al. A chemoproteomic approach to query the degradable kinome using a multi-kinase degrader. Cell Chemical Biology. 25 (1), 88-99 (2018).
Bjorklund, C. C., et al. Iberdomide (CC-220) is a potent cereblon E3 ligase modulator with antitumor and immunostimulatory activities in lenalidomide- and pomalidomide-resistant multiple myeloma cells with dysregulated CRBN. Leukemia. 34 (4), 1197-1201 (2020).
Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
Matyskiela, M. E., et al. A cereblon modulator (CC-220) with improved degradation of Ikaros and Aiolos. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 535-542 (2018).
Bussiere, D. E., et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex. Nature Chemical Biology. 16 (1), 15-23 (2020).
Du, X., et al. Structural basis and kinetic pathway of RBM39 recruitment to DCAF15 by a sulfonamide molecular glue E7820. Structure. 27 (11), 1625-1633 (2019).
Ting, T. C., et al. Aryl sulfonamides degrade RBM39 and RBM23 by recruitment to CRL4-DCAF15. Cell Reports. 29 (6), 1499-1510 (2019).
Hughes, S. J., Ciulli, A. Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays in Biochemistry. 61 (5), 505-516 (2017).
Schapira, M., Calabrese, M. F., Bullock, A. N., Crews, C. M. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nature Review Drug Discovery. 18 (12), 949-963 (2019).
Dixon, A. S., et al. NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
Gilan, O., et al. Selective targeting of BD1 and BD2 of the BET proteins in cancer and immuno-inflammation. Science. 368 (6489), 387-394 (2020).
Oh-Hashi, K., Furuta, E., Fujimura, K., Hirata, Y. Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells. Biochemical Biophysical Report. 12, 40-45 (2017).
Ottis, P., et al. Cellular resistance mechanisms to targeted protein degradation converge toward impairment of the engaged ubiquitin transfer pathway. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2215-2223 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

związki PROTAC kleje molekularne znakowanie endogenne detekcja luminescencyjna kinetyczna analiza degradacji profilowanie odpowiedzi na dawkę multipleksowa ocena żywotności komórek technologia NanoBRET

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR