Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

Kristin  M. Riching; Sarah  D. Mahan; Marjeta Urh; Danette  L. Daniels

doi:10.3791/61787

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

DOI:

10.3791/61787

⸱

9 listopada 2020

Kristin M. Riching¹ , Sarah D. Mahan¹ , Marjeta Urh¹ , Danette L. Daniels¹

¹Promega Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC₅₀ i Dmax₅₀.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowane związki degradacji białek, w tym kleje molekularne lub chimery ukierunkowane na proteolizę, są ekscytującą nową metodą terapeutyczną w odkrywaniu leków małocząsteczkowych. Ta klasa związków indukuje degradację białek poprzez zbliżenie białka docelowego i białek maszynerii ligazy E3 wymaganych do ubikwitynacji i ostatecznie degradacji białka docelowego poprzez szlak ubikwityna-proteasomal (UPP). Profilowanie degradacji białka docelowego w sposób wysokoprzepustowy pozostaje jednak dużym wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność szlaków komórkowych wymaganych do osiągnięcia degradacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół i strategię badań przesiewowych opartą na zastosowaniu endogennego znakowania białek docelowych CRISPR/Cas9 za pomocą 11-aminokwasowego znacznika HiBiT, który uzupełnia się z wysokim powinowactwem do białka LgBiT, w celu wytworzenia białka luminescencyjnego. Te ukierunkowane na CRISPR linie komórkowe z endogennymi znacznikami mogą być używane do pomiaru degradacji indukowanej związkami w czasie rzeczywistym, kinetycznych żywych komórkach lub w trybie litycznym punktu końcowego poprzez monitorowanie sygnału luminescencyjnego za pomocą czytnika opartego na płytce luminescencyjnej. W tym miejscu przedstawiamy zalecane protokoły badań przesiewowych dla różnych formatów, a także opisujemy obliczanie kluczowych parametrów degradacji szybkości, Dmax, DC₅₀, Dmax₅₀, a także multipleksowanie z testami żywotności komórek. Podejścia te umożliwiają szybkie odkrywanie i klasyfikację związków we wczesnym stadium przy jednoczesnym utrzymaniu endogennej ekspresji i regulacji białek docelowych w odpowiednich tłach komórkowych, co pozwala na skuteczną optymalizację wiodących związków terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowana degradacja białek stała się jednym z najszybciej rozwijających się obszarów w odkrywaniu leków małocząsteczkowych, znacznie wzmocnionym przez sukces terapeutyczny immunomodulujących molekularnych związków kleju (np. IMiD) w leczeniu raka, oraz obiecujące wczesne dane z badań klinicznych związków chimery ukierunkowanych na proteolizę¹^,^2,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Ukierunkowane związki degradacji białek działają poprzez zbliżenie docelowego białka z białkami maszynowymi ligazy E3¹^,^2,^3,⁴^,⁵^,⁶^,7^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Ta indukowana związkiem rekrutacja białka docelowego do ligazy E3 prowadzi do ubikwitynacji i degradacji białka docelowego poprzez szlak proteasomalny ubikwityny (UPP)¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Historycznie rzecz biorąc, programy badań przesiewowych w celu odkrywania leków małocząsteczkowych opierały się na wstępnych testach biochemicznych w celu oceny aktywności i uszeregowania związków rzędu. Stanowi to jednak poważne wyzwanie dla docelowych degraderów białek, których ostateczna aktywność, degradacja przez proteasom, zależy od kaskady zdarzeń komórkowych¹^,²,⁴^,5^,⁶^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Mnogość szlaków i złożoność kompleksów białkowych wymaganych do pomyślnej degradacji celu wymaga podejść do testów komórkowych w celu wczesnego badania przesiewowego i selekcji początkowych związków. Obecnie zdecydowanie brakuje technologii monitorowania degradacji białek docelowych w sposób wysokoprzepustowy w kontekście środowiska komórkowego¹⁴. Tutaj przedstawimy protokoły do oceny aktywności degradacji litycznej żywej żywej komórki lub punktu końcowego w czasie rzeczywistym przy użyciu CRISPR/Cas9 endogennie oznakowanych docelowych linii komórkowych HiBiT¹⁸^,¹⁹^,²⁰ do monitorowania utraty docelowego białka za pomocą pomiaru luminescencyjnego po leczeniu związkami degradującymi¹⁰^,¹¹^,¹⁸^,¹⁹.

Aby osiągnąć skuteczną degradację celów terapeutycznych i rozszerzyć proteom ulegający leczeniu, pojawiły się liczne podejścia i typy degraderów, które mogą celować w szeroki zakres białek do zniszczenia, w tym te zlokalizowane na lub w błonie plazmatycznej, lizosomach, błonach mitochondrialnych, cytoplazmie i jądrze²¹^–⁵⁷. Dwie podstawowe klasy najczęściej badanych związków to kleje molekularne i białka ukierunkowane na cimeras²^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,¹²^,²⁶. Kleje molekularne są monowalentne, a więc zazwyczaj mają mniejszy rozmiar i ułatwiają nowy interfejs interakcji białko-białko z białkiem docelowym po związaniu ze składnikiem ligazy E3²^,¹²^,²⁶. Są to najczęściej degradery, które wiążą się ze składnikiem ligazy Cereblon (CRBN) E3²^,¹²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷. Ostatnio jednak ekscytujące nowe przykłady wykorzystujące inne maszyny ligazy E3, takie jak DCAF15⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰ i rekrutacja CDK/Cyclin do DDB1⁴⁵ pokazują potencjał ekspansji tej klasy związków. W przeciwieństwie do tego, PROTAC są większymi, dwuwartościowymi cząsteczkami, składającymi się z docelowego liganda wiążącego, najczęściej inhibitora, połączonego za pomocą łącznika chemicznego z ligazą E3 uchwyt¹^,³^,⁴^,⁵^,⁷^,¹³. W związku z tym związki te są zdolne do bezpośredniego wiązania się zarówno z ligazą E3, jak i z białkiem docelowym¹^,³^,⁴^,⁵^,⁷^,¹³. Wykazano, że liczne białka są degradowane przez te dwuwartościowe cząsteczki, a najczęściej używane uchwyty ligazy E3 rekrutują się do CRBN lub Von Hippel Lindau (VHL)¹^,³^,⁴^,5^,⁷^,¹³. Jednak liczba dostępnych uchwytów do rekrutacji ligazy E3 w chimerach ukierunkowanych na projekt proteolizy szybko rośnie, rozszerzając możliwości tej klasy związków o potencjał degradacji różnych klas docelowych, a także zwiększenia swoistości komórek lub typów tkanek²⁴^,⁴⁸^,⁶¹^,⁶². W połączeniu z minimalnym wymogiem angażowania białka docelowego, nawet przy marginalnym powinowactwie, związki degradacyjne dają nadzieję na rozszerzenie proteomu podatnego na działanie leków.

Scharakteryzowanie komórkowej dynamiki utraty białka, jak również potencjalnej regeneracji białka po leczeniu, jest kluczowe dla zrozumienia funkcji i skuteczności związku degradacji. Chociaż możliwe jest badanie zmian poziomu białka endogennego w odpowiednich układach komórkowych za pomocą testów przeciwciał Western blot lub spektrometrii mas, podejścia te są trudne do dostosowania do formatów badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, mają ograniczoną zdolność kwantyfikacji lub zdolność do pomiaru zmian kinetycznych w wielu punktach czasowych¹⁴. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy komórkowy system luminescencyjny oparty na płytkach do monitorowania zmian poziomów białek endogennych, który wykorzystuje insercję genomową za pośrednictwem CRISPR/Cas9 znacznika 11 aminokwasów, HiBiT, do loci dowolnych kluczowych celów degradacji¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Peptyd ten uzupełnia się z wysokim powinowactwem do swojego partnera wiążącego, LgBiT, aby wytworzyć jasną luminescencję w obecności swojego substratu¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁶³, dzięki czemu te oznaczone endogenne białka świecą w komórkach lub lizatach¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁶³. Względne jednostki światła (RLU) mierzone za pomocą luminometru są wprost proporcjonalne do oznaczonych docelowych poziomów białka¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,⁶³. Wraz z rozwojem stabilizowanych substratów lucyferazy, możliwe są pomiary poziomu białka kinetycznego w czasie rzeczywistym w przedziałach czasowych 24-48 godzin¹⁸^,⁵³^,⁶⁴. Pozwala to na określenie pełnego profilu degradacji dla dowolnego celu przy dowolnym stężeniu związku, w tym analizę ilościową początkowej szybkości degradacji, maksimum degradacji (Dmax) i odzysku po traktowaniu związkiem¹⁸^,⁵³. Jednak w przypadku badań przesiewowych dużych bibliotek związków degradacyjnych analizę punktów końcowych można również łatwo przeprowadzić w formacie 384-dołkowym przy różnych stężeniach leku i wyznaczonych porach.

Protokoły przedstawione w tym manuskrypcie reprezentują strategie badań przesiewowych komórek dla ukierunkowanych związków degradacji białek, mające zastosowanie do wszystkich typów degraderów. Wykorzystanie linii komórkowych HiBiT CRISPR wraz z tymi protokołami nie ogranicza się jednak do degradacji białek, a raczej jest to ogólne narzędzie do monitorowania dowolnego endogennego poziomu białka docelowego, który można modulować po leczeniu w celu zbadania wpływu związków, a nawet mechanizmów oporności²⁰^,⁶⁵^,⁶⁶. Warunkiem wstępnym dla tych metod wykrywania opartych na luminescencji jest endogennie znakowana linia komórek docelowych HiBiT CRISPR, która ma kluczowe znaczenie, ponieważ umożliwia czułe wykrywanie luminescencyjne, przy jednoczesnym zachowaniu endogennej ekspresji celu i natywnej regulacji promotora¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Poczyniono znaczne postępy w wykorzystaniu CRISRP/Cas9 do wstawiania znaczników genomowych, szczególnie w skalowalności²⁰ i wysokiej czułości wykrywania, w różnych formatach, w tym pulach CRISPR lub klonach z heterozygotyczną lub homozygotyczną insercją alleli¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Możliwe jest stosowanie egzogennej ekspresji HiBiT lub innych fuzji reporterowych w komórkach zamiast znakowania endogennego, ale należy zachować znaczną ostrożność przy użyciu systemów z nadekspresją białek¹⁴^,¹⁸. Mogą one prowadzić do artefaktów w zrozumieniu prawdziwej siły działania związku i dynamiki odzyskiwania białek¹⁴^,¹⁸, w tym potencjalne pętle transkrypcyjnego sprzężenia zwrotnego aktywowane po degradacji celu. Ponadto związki we wczesnym stadium o niskiej sile działania mogą zostać pominięte i prezentować się jako fałszywie ujemne wyniki w badaniach przesiewowych. Ponieważ utrata białka może wynikać z toksyczności wywołanej związkiem i śmierci komórki, opisane tutaj protokoły zawierają wysoce zalecane, ale opcjonalne testy żywotności komórek, luminescencyjne lub fluorescencyjne w połączeniu z protokołem degradacji. Protokół składa się z dwóch głównych sekcji: litycznego punktu końcowego i kinetycznego badania przesiewowego żywych komórek. W każdej z tych sekcji znajdują się opcje multipleksowanych pomiarów żywotności komórek w formatach końcowych lub kinetycznych. Monitorowanie zmian znakowanego białka endogennego wymaga uzupełnienia LgBiT w komórkach. W związku z tym sekcja badań przesiewowych kinetycznych odwołuje się do ważnych protokołów dotyczących ich wprowadzenia, co można osiągnąć poprzez przejściową lub stabilną ekspresję i jest niezbędne do wykonywania pomiarów luminescencyjnych na żywych komórkach. Wszystkie przedstawione tutaj podejścia umożliwiają szybkie uporządkowanie rang i ocenę aktywności związków, umożliwiając badania przesiewowe związków na wczesnym etapie i szybszą identyfikację degraderów ołowiu.

Ten protokół jest przeznaczony do badania związków degradacyjnych w połączeniu z linią komórkową HiBiT CRISPR. Protokoły generowania wstawienia HiBiT CRISPR dla wielu celów zostały przedstawione w kilku ostatnich publikacjach¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Badania degradacji punktów końcowych z docelowymi białkami HiBiT CRISPR w formacie litycznym z opcjonalną analizą fluorescencyjną żywotności komórek

Przygotowanie i posiew linii komórkowej przylegającej lub zawiesinowej ssaków
1. Dostosuj gęstość komórek do 2,22 x 10⁵/ml przez rozcieńczenie w odpowiednich pożywkach komórkowych używanych do pasażowania i wzrostu komórek.
2. Dozować komórki do płytek z co najmniej 3 dołkami na warunki doświadczalne i kontrolne. Dozować 90 μl (20 000 komórek) na dołek zawiesiny komórek do 96-dołkowych białych płytek. W przypadku formatu 384-dołkowego należy dozować 36 μl (8 000 komórek) na dołek zawiesiny komórek do 384-dołkowych białych płytek.
Przygotowanie i dodawanie związków
1. Przygotować seryjnie rozcieńczone płytki PROTAC lub degradera o stężeniu końcowym 1,000x w 100% DMSO. Następnie rozcieńczyć go do 10-krotności końcowego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych. Dodać równą objętość DMSO do pożywki, która ma być używana jako bezzłożona kontrola DMSO.
2. W przypadku formatu 96-dołkowego dodaj 10 μl 10x związku i roztworów kontrolnych do 90 μl komórek. W przypadku formatu 384-dołkowego dodaj 4 μl 10x roztworów złożonych i kontrolnych do 36 μl komórek.
3. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez żądany czas lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu.
  UWAGA: Ponieważ jest to test końcowy, testowanie wielu punktów czasowych będzie wymagało przygotowania oddzielnych płytek degradacji dla każdego punktu czasowego, jak opisano w powyższym kroku 1.1.2. Czas inkubacji w celu wykrycia degradacji za pośrednictwem związku jest bardzo zmienny i prawdopodobnie zależy również od stężenia związku. Sugerowane początkowe punkty czasowe to 6 godzin i 24 godziny.
4. W przypadku pomiaru detekcji luminescencyjnej w punkcie końcowym bez opcjonalnego pomiaru żywotności ogniw, przejdź bezpośrednio do kroku 1.3 poniżej. W przypadku wykonywania multipleksowania z pomiarem żywotności komórek, przejdź do następnej sekcji 1.4 poniżej.
Pomiar lityczny komórek
1. Bezpośrednio przed pomiarami litycznymi HiBiT należy przygotować 2x odczynnik do wykrywania litów, dodając 20 μL substratu litycznego i 10 μL białka LgBiT na każdy 1 ml buforu litycznego. Przygotuj wystarczającą ilość 2x odczynnika do wykrywania dla liczby dołków do oznaczenia, w tym dodatkową objętość, aby uwzględnić błąd pipetowania (tj. liczba dołków + 10%).
2. Dodaj przygotowany odczynnik do detekcji litycznej do komórek. W przypadku formatu 96-dołkowego dodaj 100 μl 2x odczynnika do wykrywania litycznego do każdej studzienki zawierającej 100 μl komórek. W przypadku formatu 384-dołkowego dodaj 40 μl 2x odczynnika do wykrywania litycznego do każdej studzienki zawierającej 40 μl komórek. Mieszaj płytkę na mieszalniku wirowym do mikropłytek przez 10-20 minut przy 350 obr./min.
3. Zmierz luminescencję na luminometrze zdolnym do odczytu luminescencji na płytce 96- lub 384-dołkowej.
Opcjonalne multipleksowanie żywotności komórek
UWAGA: Ten krok jest wykonywany przy użyciu dostępnego w handlu zestawu CellTiter-Fluor (CTF) (patrz Tabela materiałów).
1. 30-40 minut przed pożądanym pomiarem końcowym przygotuj 6-krotny roztwór odczynnika do wykrywania żywotności komórek, dodając 10 μl substratu do 2 ml buforu testowego. Przygotuj wystarczającą ilość 6 razy odczynnika dla każdego dołka, który ma być oznaczony, w tym dodatkową objętość na błąd pipetowania (tj. liczba dołków + 10%).
2. Dodaj przygotowany odczynnik do studzienek. W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 20 μl 6x odczynnika do każdego dołka zawierającego już 100 μl objętości. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 8 μl 6x odczynnika do każdego dołka zawierającego 40 μl komórek. Krótko wymieszać na mieszalniku wirowym do mikropłytek, a następnie inkubować płytkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
3. W pożądanym punkcie końcowym pomiaru (tj. 6 lub 24 godziny po poddaniu działaniu substancji, krok 1.2.3) należy zmierzyć fluorescencję na urządzeniu zdolnym do odczytu fluorescencji (380-400 nm_Ex/505 nm_Em) w formacie 96 lub 384 dołków.
4. Przygotować 2x odczynnik do wykrywania lityki, dodając 20 μl substratu litycznego i 10 μl białka LgBiT na 1 ml buforu litycznego. Przygotuj wystarczającą ilość 2x odczynnika do wykrywania dla liczby dołków do oznaczenia, w tym dodatkowej objętości, aby uwzględnić błąd pipetowania (np. liczba dołków + 10%).
5. Dodaj przygotowany odczynnik do wykrywania litycznego do studzienek. W przypadku formatu 96-dołkowego dodać 120 μl 2x odczynnika do wykrywania litycznego do każdej studzienki zawierającej już objętość 120 μl. W przypadku formatu 384-dołkowego dodać 48 μl 2x odczynnika do wykrywania litycznego do każdej studzienki zawierającej już objętość 48 μl. Mieszaj płytkę na mieszalniku wirowym do mikropłytek przez 10-20 minut.
6. Zmierz luminescencję na luminometrze zdolnym do odczytu luminescencji w płytkach 96- lub 384-dołkowych.
Kwantyfikacja degradacji i żywotności komórek
1. Uśrednić względne jednostki światła (RLU) ze sterownika DMSO w zmierzonym punkcie czasowym. Użyć tej wartości jako wyjściowego poziomu białka docelowego do obliczenia degradacji frakcyjnej poprzez normalizację wszystkich innych zabiegów testowanych w tym samym czasie, wskazując na tę wartość. Na przykład, jeśli średnia RLU dla studzienek kontrolnych DMSO po 6 godzinach wynosiła 10 000, a RLU dla danego uzdatniania związku po 6 godzinach wynosiła 5 000, degradacja frakcyjna zostałaby obliczona jako 5 000 ÷ 10 000 = 0,5 (równanie 1).
  Równanie 1:
2. Określ procentową degradację z ułamkowego RLU:
  Równanie 2:
3. Wykreśl frakcję RLU lub % degradacji w określonych punktach czasowych, aby uszeregować aktywność związków.
4. Opcjonalnie można przeanalizować dane względnej jednostki fluorescencji (RFU) dla pomiaru żywotności komórek, porównując wartości ze wszystkich zabiegów z kontrolą DMSO. Jeśli zaobserwuje się znaczny spadek RFU dla któregokolwiek leczenia w stosunku do kontroli DMSO, dane degradacji można dodatkowo znormalizować do danych z testu żywotności komórek w celu określenia zmian poziomu białka w stosunku do strat w żywotności komórek.

2. Degradacja kinetyczna białek docelowych HiBiT CRISPR w czasie rzeczywistym i opcjonalny test luminescencji żywotności komórek

UWAGA: Zdolność do przeprowadzania kinetycznych, przesiewowych i degradacji, wymaga koekspresji białka LgBiT w komórce, co zostało opisane wcześniej¹⁸^,¹⁹^,⁶³. Można to osiągnąć poprzez przejściową transfekcję wektora LgBiT, użycie BacMam LgBiT lub wykonanie insercji HiBiT CRISPR do stabilnej linii komórkowej LgBiT.

Posiewanie przylegających linii komórkowych.
1. Usunąć pożywkę z kolby komórkowej przez aspirację, przemyć komórki DPBS, zdysocjować komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i pozwolić komórkom oddzielić się od dna kolby. W przypadku zawiesinowych linii komórkowych należy przejść do sekcji 2.2.
2. Zneutralizuj trypsynę za pomocą pożywki do hodowli komórkowych zawierającej surowicę, wymieszaj w celu zebrania i ponownego zawieszenia komórek, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki.
3. Wirować komórki w temperaturze 125 x g przez 5 minut. Wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych i ponownie zawiesić w równej objętości świeżej pożywki do hodowli komórkowych.
4. Umieścić komórki na płytkach testowych z minimalną liczbą trzech studzienek na warunki doświadczalne i kontrolne. W przypadku liczenia w formacie 96-dołkowym w celu oszacowania gęstości komórek, dostosuj gęstość do 2 x 10⁵ komórek/ml w pożywce testowej i dozuj 100 μl (20 000 komórek) na dołek na płytkę 96-dołkową. W przypadku liczenia w formacie 384-dołkowym w celu oszacowania gęstości komórek, dostosuj gęstość do 4,44 x 10⁵ komórek/ml w pożywce testowej i dozuj 18 μl (8,000 komórek) na dołek.
5. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu.
Poszycie komórek zawiesinowych
1. Dostosuj gęstość komórek do 2,22 x 10⁵ komórek/ml w pożywce niezależnej od CO₂ uzupełnionej 10% FBS i 1x Endurazine (rozcieńczenie odczynnika podstawowego w stosunku 1:100).
2. Umieścić komórki w płytkach testowych z co najmniej 3 dołkami na warunki doświadczalne i kontrolne. W przypadku formatu 96-dołkowego należy dozować 90 μl (20 000 komórek) na dołek. W przypadku formatu 384-dołkowego dozuj 36 μl (8 000 komórek) na dołek.
  UWAGA: W przypadku linii komórek zawiesinowych, które mają niską luminescencję sygnału do tła (S:B), np. podczas pracy z pulami CRISPR, a nie klonami, możliwe jest zwiększenie luminescencji poprzez zwiększenie liczby platerowanych komórek, do 100 000 komórek/studzienkę w formacie 96-dołkowym lub 40 000 komórek/studzienkę w formacie 384-dołkowym.
Testy degradacji kinetycznej z wykorzystaniem komórek HiBiT CRISPR eksprymujących LgBiT
1. W przypadku komórek zawiesinowych zawierających już endurazynę, która została włączona na etapie posiewu w ppkt 2.2., należy przejść bezpośrednio do etapu 2.3.3. Dla przylegających linii komórkowych przygotuj roztwór Nano-Glo Endurazine. W przypadku formatu 96-dołkowego przygotuj 1x roztwór Endurazine, rozcieńczając odczynnik podstawowy w stosunku 1:100 w pożywce niezależnej od CO₂ uzupełnionej 10% FBS. W przypadku formatu 384-dołkowego przygotuj 2x roztwór Endurazine, rozcieńczając odczynnik podstawowy w stosunku 1:50 do pożywki niezależnej od CO₂ uzupełnionej 10% FBS.
2. Dodaj roztwór endurazyny do każdej studzienki przylegających komórek. W przypadku formatu 96-dołkowego odessać pożywkę i dodać 90 μl 1x roztworu Endurazine. W przypadku formatu 384-dołkowego dodaj 18 μl 2x roztworu endurazyny do 18 μl komórek. Nie odsysać pożywki, ponieważ test degradacji przeprowadza się w mieszaninie pożywki hodowlanej i pożywki niezależnej od CO₂ w proporcji 50:50 w formacie 384-dołkowym.
3. Inkubować zawiesinę lub przylegające płytki komórkowe zawierające endurazynę przez 2,5 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 w} celu zrównoważenia luminescencji.
4. Przygotować 10-krotne stężenie miareczkowania testowego PROTAC w pożywce niezależnej od CO₂ i dodać 10 μl do każdego dołka na płytce 96-dołkowej lub 4 μl na płytce 384-dołkowej. W przypadku związków o nieznanej skuteczności jako punkt wyjścia zaleca się końcowe stężenie 1-10 μM w najwyższym punkcie.
5. Zebrać pomiary kinetyczne luminescencji w luminometrze wstępnie zrównoważonym do 37 °C przez okres od 0 do 48 godzin. Przyrosty czasu pomiaru można dostosować do każdego eksperymentu, ale zalecanym eksperymentem początkowym byłyby pomiary luminescencji co 5-15 minut przez 24 godziny lub żądany czas.
Opcjonalna analiza multipleksowa żywotności komórek w tej samej studni po końcowym pomiarze kinetycznym
UWAGA: Ten test jest wykonywany za pomocą dostępnego w handlu zestawu CellTiter-Glo (KTG) (patrz Tabela materiałów).
1. Zrównoważyć odczynnik KTG do temperatury pokojowej.
2. Po dokonaniu pomiaru degradacji w ostatnim punkcie czasowym analizy kinetycznej, dodać 100 μl (płytka 96-dołkowa) lub 40 μl (płytka 384-dołkowa) odczynnika na dołek płytki i mieszać na wytrząsarce płytkowej z prędkością 500-700 obr./min (płytka 96-dołkowa) lub mieszalniku wirowym do mikropłytek (płytka 384-dołkowa) przez 5 minut.
3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić lizę komórek i wygaszanie sygnału HiBiT.
4. Zmierz całkowitą luminescencję na luminometrze, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
Kwantyfikacja profili degradacji kinetycznej
1. Korzystając z zebranych pomiarów luminescencji kinetycznej, znormalizuj surowe RLU dla każdego stężenia PROTAC do uśrednionego stanu DMSO repliki w każdym punkcie czasowym, aby uwzględnić zmiany stężenia wolnej furimazyny w czasie. Obliczać Ułamkowe RLU za pomocą równania 1.
  Równanie 1:
2. Na podstawie krzywych degradacji dopasuj jednoskładnikowy model rozkładu wykładniczego za pomocą równania 2 do początkowej części degradacji każdej krzywej do punktu, w którym dane osiągną plateau.
  UWAGA: Pomocne może być wykluczenie z dopasowania kilku pierwszych punktów danych, ponieważ może wystąpić krótkie opóźnienie przed zaobserwowaniem degradacji.
  Równanie 2:
3. Z równania 2 wyznacz parametr ƛ, który reprezentuje stałą szybkości degradacji i Plateau, który reprezentuje najniższą pozostałą ilość białka.
4. Obliczyć Dmax, który jest maksymalną frakcjonowaną ilością zdegradowanego białka i jest obliczany jako 1-Plateau.
5. Wykreślić Dmax dla każdego stężenia PROTAC w celu wyznaczenia niezależnej od czasu krzywej siły degradacji.
6. Określić wartość Dmax₅₀ dla wykresu w ppkt 2.3.5 w celu analizy skuteczności związków.
  UWAGA: Aby określić DC₅₀ w określonym punkcie czasowym, należy wykreślić obliczoną procentową degradację dla każdego stężenia w wybranym czasie. Można to określić jako DC₅₀ t=4 h lub DC₅₀ t=12 h.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować analizę degradacji litycznej pojedynczego punktu końcowego, kilka białek docelowych CDK; CDK2, CDK4, CDK7 i CDK10 zostały endogennie oznaczone HiBiT na ich C-końcu w komórkach HEK293 i potraktowane stężeniem 1 μM PROTAC opartego na pankinazie Cereblonu, TL12-186⁵⁴ (Figura 1A). Poziom białka CDK mierzono w różnych punktach czasowych i określono frakcyjne RLU w stosunku do kontroli DMSO (Rysunek 1A). Każde białko CDK wykazywało różny stopień degradacji w odpowiedzi na leczenie związkiem i różne punkty czasowe (Figura 1A). Aby zrozumieć, w jaki sposób białka CDK wypadają ze sobą bezpośrednio pod względem utraty białka, ułamkowe RLU w Rysunek 1A obliczono jako całkowitą % degradacji i wykreślono dla każdego punktu czasowego w Rysunek 1B. Pokazuje to, że nawet we wczesnych punktach czasowych, 2 lub 4 godzinach, niektórzy członkowie rodziny CDK wykazują wysoki poziom degradacji, który z czasem wykazuje tendencję wzrostową (Rysunek 1B).

Aby zademonstrować analizę degradacji kinetycznej, każde z białek należących do rodziny BET; BRD2, BRD3 i BRD4 były endogennie znakowane HiBiT na ich N-końcu w komórkach HEK293 stabilnie eksprymujących białko LgBiT¹⁸. Zostały one następnie potraktowane trzema różnymi stężeniami pan-BET PROTAC; oparty na Cereblonie dBET6⁵⁰ (Rysunek 2A) oraz oparty na VHL ARV-771⁴¹ (Rysunek 2B). Pomiary kinetyczne prowadzono przez okres 24 godzin, a na podstawie profili przy każdym stężeniu można łatwo zauważyć różnice w odpowiedzi członków rodziny BET. Zdolność BRD2 do inicjowania szybszej reakcji na regenerację po degradacji związku (Rysunek 2A,B) była wcześniej obserwowana w przypadku innych PROTAC pan-BET i jest prawdopodobnie spowodowana odpowiedzią na transkrypcyjne sprzężenie zwrotne konkurencyjne w stosunku do procesu degradacji¹⁸.

Zarówno analiza końcowa, jak i kinetyczna mogą być wykonane z pełnym leczeniem dawką złożoną. Pokazane w Rysunek 3 to profile degradacji odpowiedzi na dawkę kinetyczną leczenia komórkami Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat stabilnie eksprymujących białko LgBiT za pomocą czterech różnych molekularnych związków kleju2^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷; lenalidomid (Rysunek 3A), iberdomid (CC-220) (Rycina 3B), talidomid (Figura 3C) i pomalidomid (Rysunek 3D). Degradery te wykazują znaczące różnice w reakcji na degradację między związkami, jak również w całej serii stężeń (Rysunek 3).

Aby ilościowo ocenić degradację i uporządkować związki w Rysunek 3, profile reakcji na dawkę zostały użyte do obliczenia kluczowych parametrów degradacji, w tym szybkości degradacji (Rysunek 4A), Dmax (Rysunek 4B) i wartości Dmax₅₀ (Rysunek 4B). Analizy te pokazują, że iberdomid (CC-220) i pomalidomid mają bardzo podobne szybkie początkowe tempo degradacji (Figura 4A), ale iberdomid (CC-220) ma najwyższą siłę działania, jaką wcześniej obserwowano w badaniach ortogonalnych^55,⁵⁷ (Rysunek 4B). Ponieważ Iberdomid wykazuje tak wysoką siłę działania, a wszystkie badane stężenia wykazują degradację większą niż 50%, wartość Dmax₅₀ uzyskana dla Iberdomidu stanowi wartość szacunkową opartą na ograniczeniu w dokładnym dopasowaniu danych. Z wykresów w Rysunek 3C,D i Rysunek 4B, ani lenalidomid, ani talidomid nie degradują celu Ikaros/IKZF1 do końca przy najwyższych badanych stężeniach. Ze względu na bardzo małą degradację obserwowaną podczas stosowania talidomidu, ślady degradacji nie mogły być dokładnie dopasowane do modelu rozpadu wykładniczego, dlatego nie określono ilościowo szybkości degradacji dla tego leczenia. Dla najsilniejszego degradora, iberdomid (CC-220)⁵⁵^,⁵⁷ (Rysunek 4B). Testy multipleksowe żywotności komórek nie wykazały utraty żywotności komórek dla badanych stężeń (Rysunek 4C).

Kinetyka degradacji CDK, wykres ułamkowego RLU w funkcji czasu oraz wykres słupkowy % degradacji, test HiBiT.
Rysunek 1: Degradacja i toksyczność punktu końcowego CDK z pankinazą PROTAC, TL12-186⁵⁴. (A) Wybierz panel endogennych docelowych białek CDK połączonych z HiBiT na C-końcu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 i ocenionych pod kątem degradacji za pomocą 1 μM TL12-186 PROTAC⁵⁴ po 2 godzinach, 4 godzinach, 8 godzinach i 24 godzinach leczenia. Wartości są reprezentowane jako ułamkowe RLU względem kontrolki DMSO mierzonej w każdym punkcie czasu. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. (B) Procentowa degradacja panelu docelowych białek CDK obliczona na podstawie (A) reprezentującej stopień degradacji każdego członka rodziny obserwowany w 2, 4, 8 i 24 punktach czasowych. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Profile degradacji rodziny BET; wykres dawka-odpowiedź; HiBiT-BRD2/BRD3/BRD4; Porównanie złożone.
Rysunek 2: Profilowanie selektywności degradacji kinetycznej członków rodziny BET z degraderami BET, dBET6⁵⁰ i ARV-771⁴¹. Profile degradacji kinetycznej endogennych członków rodziny BET, BRD2, BRD3 i BRD4, oznaczone HiBiT na N-końcu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 z traktowaniem pojedynczych stężeń 1 nM (po lewej), 10 nM (w środku) lub 100 nM (po prawej) dBET6⁵⁰ (A) lub ARV-771⁴¹ (B) PROTACs. Wartości są reprezentowane jako ułamkowe RLU obliczone na podstawie kontroli DMSO w każdym kinetycznym punkcie czasu. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 4 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ikaros IKZF1-HiBiT tabela odpowiedzi na dawkę; Lenalidomid, Iberdomid, Talidomid, Pomalidomid.
Rysunek 3: Profile odpowiedzi na dawkę degradacji kinetycznej żywych komórek Ikaros/IKZF1-HiBiT z panelem kleju molekularnego²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷. Komórki Jurkat stabilnie eksprymujące białko LgBiT zostały zmodyfikowane przy użyciu CRISPR/Cas9 w celu oznaczenia C-końca Ikaros/IKZF1 peptydem HiBiT. Komórki potraktowano 8-punktową serią stężeń odpowiedzi na dawkę, w tym DMSO czterech różnych molekularnych związków kleju²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷: (A) lenalidomid, (B) iberdomid (CC-220), (C) talidomid, lub (D) pomalidomid. Luminescencję mierzono co 5 minut przez łącznie 19,5 godziny. Dane względnych jednostek światła (RLU) z (A-D) zostały przekonwertowane na ułamkowe RLU, jak opisano w kroku 2.4.1 i przedstawione na wykresie w funkcji czasu. Słupki błędów reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tempo degradacji Ikaros i badanie żywotności komórek: wykresy stężenie-odpowiedź, porównawcza skuteczność leku.
Rysunek 4: Obliczanie szybkości degradacji i Dmax50 dla Ikaros/IKZF1-HiBiT oraz multipleksowanie testów zdrowia komórek. Do obliczenia ilościowych parametrów degradacji wykorzystano dane degradacji kinetycznej z rysunku 3. (A) Szybkości degradacji i (B) maksymalne wartości degradacji (Dmax) są przedstawione na wykresie dla każdego stężenia leku dla wskazanych związków kleju molekularnego²^,²⁶^,⁵⁵^,⁵⁷. (B) Wartości Dmax₅₀ dla każdego związku obliczono przy użyciu modelu dawka-odpowiedź z ograniczonym nachyleniem wzgórza wynoszącym 1, który można wykorzystać do uszeregowania związków degradacji rzędu dla celu. (C) Testy żywotności komórek z iberdomidem (CC-220)⁵⁵^,⁵⁷ odpowiedź na dawkę degradacji z rysunku 3B przeprowadzono jako pomiar końcowy po zakończeniu pomiarów degradacji kinetycznej. Słupki błędów reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj dwie metody przesiewowej aktywności związku degradacji w formacie litycznym punktu końcowego lub w trybie kinetycznym żywych komórek. Podejścia te opierają się na tych samych zasadach pomiaru luminescencyjnego, ale zapewniają różne poziomy szczegółowości i zrozumienia. Wybór któregokolwiek z tych podejść będzie prawdopodobnie zależał od celów przesiewowych i wielkości biblioteki złożonej. W przypadku dużych pokładów przesiewowych związków chemicznych lub przesiewowych wstępnych w celu obserwacji wykrywalnej degradacji, badania przesiewowe lityczne punktów końcowych zapewniają czułą i wydajną kompatybilność o wysokiej przepustowości, podczas gdy inne podejścia do punktów końcowych, takie jak western blot lub spektrometria mas, mogą być albo niepraktyczne, albo trudne do dostosowania¹⁴. Punktem wyjścia dla tych badań przesiewowych można było przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń i punktów czasowych. Zalecane stężenia początkowe do badania mieszczą się w zakresie 100 nM-10 μM, aby uwzględnić początkowe degradery o niskiej sile działania, słabej przepuszczalności lub, w niektórych przypadkach z bardzo silnymi związkami, obecność efektu haka. Ponadto zaleca się zbadanie co najmniej dwóch różnych punktów czasowych w celu ustalenia wczesnego początku degradacji po 4-6 godzinach oraz utajonej lub trwałej degradacji po 18-24 godzinach. Związki, które wykazują wysoką siłę degradacji i mechanizm on-target, są łatwo obserwowane w ciągu 4-6 godzin, podczas gdy degradacja lub pozorna utrata białka obserwowana dopiero w późniejszych punktach czasowych może być spowodowana różnymi mechanizmami. Zdecydowanie zaleca się monitorowanie żywotności komórek zarówno we wczesnym, jak i późnym punkcie czasowym, tak aby utrata białka mogła być oddzielona od utraty spowodowanej śmiercią komórki. Podobnie jak w przypadku każdego rodzaju testu luminescencyjnego lub fluorescencyjnego, istnieje możliwość, że związki w bibliotekach będą zakłócać lub hamować sygnał, dlatego ortogonalne eksperymenty uzupełniające ze związkami ołowiu wykorzystującymi niepowiązane fuzje lub alternatywne podejścia do monitorowania poziomu białka będą ważne dla oceny, czy utrata RLU w tych testach jest bezpośrednio związana z degradacją białka docelowego.

Zdolność do badania przesiewowego w formacie kinetycznym żywej komórki przez dłuższy czas zależy w dużej mierze od sygnału testowego do tła (S:B). Czynniki, które przyczyniają się do S:B, obejmują poziom ekspresji samego białka docelowego, który może obejmować kilka rzędów wielkości, wydajność ekspresji LgBiT w linii komórkowej wybranej do insercji peptydu, oraz dostępność oznaczonego celu do uzupełnienia w jego różnych natywnych kompleksach. Ustaliliśmy ogólny wymóg odcięcia składający się z S:B wynoszącego 15, aby skutecznie zmierzyć degradację w trybie kinetycznym za pomocą endurazyny lub wiwazyny. S: B określa się, mierząc sygnał wyjściowy komórek edytowanych przez HiBiT koeksprymujących LgBiT w stosunku do nieedytowanych komórek rodzicielskich eksprymujących LgBiT samodzielnie w obecności żywych substratów komórkowych endurazyny lub wiwazyny. Wiwazyna wytwarza silniejszy sygnał luminescencyjny, ale zanika szybciej niż endurazyna i może ograniczać akwizycję sygnału do 24 godzin lub mniej. Co więcej, S:B może być również w dużym stopniu zależny od tego, czy używane są pule CRISPR, czy klony. W przypadku celów w liniach komórkowych, które są bardziej podatne i mają wysoką wydajność w inżynierii CRISPR/Cas9, heterogeniczna populacja puli CRISPR edytowanych komórek może mieć wystarczającą ilość S:B do analizy kinetycznej. W przypadku celów w trudniejszych liniach komórkowych, w których mniej wydajna integracja genomowa za pomocą CRISPR skutkuje pulami o niskim S:B, izolacja klonów CRISPR może być konieczna w celu wzbogacenia edytowanych populacji i osiągnięcia wystarczająco wysokiego S:B do analizy kinetycznej. W każdym z tych scenariuszy, jeśli S:B jest mniejsze niż 15 z substratami enduraziny lub wiwazyny, zaleca się badanie przesiewowe lityczne punktu końcowego.

W celu lepszego zrozumienia i scharakteryzowania związków, w tym określenia profilu degradacji z parametrami ilościowymi, zalecanym podejściem przesiewowym jest analiza kinetyczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach^14,18. Podobnie jak omówiona powyżej analiza końcowa, wstępne kinetyczne badania przesiewowe można przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń w zakresie 100nM-10μM w sposób wysokoprzepustowy. W formacie 384-dołkowym ponad 100 związków można łatwo przesiać w trzech egzemplarzach w jednym stężeniu na jednej płytce. Uzyskane w ten sposób profile degradacji dostarczą wskazówek nie tylko co do zaobserwowanego zakresu degradacji, ale także szybkości degradacji, czasu trwania degradacji i potencjalnego odzysku białka^14,18 (Rysunek 2 i Rysunek 3). Kształty profilu degradacji również dostarczają cennych informacji. Specyficzne i silne degradery często wykazują początkową szybką utratę białka docelowego do plateau w ciągu kilku godzin^18,53, podczas gdy inne mechanizmy, takie jak transkrypcyjne sprzężenie zwrotne lub toksyczność związków, zwykle powodują bardziej liniową utratę białka w czasie. Te szczegóły i niuanse są pomijane w analizie litycznej punktów końcowych, a przy analizie w czasie rzeczywistym w ciągu 24-48 godzin nie trzeba przewidywać czasu, aby uchwycić prawdziwy Dmax w zestawach nowych lub nieznanych związków.

Kinetyka w czasie rzeczywistym pozwala również na efektywne badanie przesiewowe odpowiedzi na dawkę w celu lepszego zrozumienia skuteczności związku, jego wpływu na początkową szybkość degradacji oraz oferuje możliwości klasyfikowania związków na podstawie więcej niż jednego parametru. Klasyczne pomiary siły degradacji obejmują obliczenia DC₅₀ w określonym momencie w oparciu o maksima pozornej degradacji. W przeciwieństwie do tego, nasze kinetyczne podejście do oceny siły działania uwzględnia prawdziwe maksimum degradacji przy każdym stężeniu, niezależnie od tego, kiedy występuje w czasie¹⁸. Nazywamy ten pomiar siły degradacji kinetycznej Dmax₅₀¹⁸. Analiza w ten sposób uwzględnia związki, które mogą inicjować degradację wolniej przy niższych stężeniach, a zatem potrzebują więcej czasu po obróbce, aby osiągnąć Dmax. Szczególnie pouczające może być uszeregowanie związków zarówno pod względem szybkości degradacji, jak i Dmax. W przypadku najsilniejszych degraderów spowoduje to dalsze odróżnienie powolnych, ale silnych degraderów od tych, które są zarówno szybkie, jak i silne. Łącznie, zarówno badania przesiewowe lityczne, jak i kinetyczne żywych komórek z wykorzystaniem linii komórkowych HiBiT CRISPR są potężnymi podejściami, które dają bardziej kompleksowy obraz ukierunkowanej degradacji białek, funkcji związków i umożliwiają proces przesiewowy od wstępnej oceny aktywności do dalszej optymalizacji chemicznej poprzez poprawę kluczowych parametrów degradacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Promega Corporation jest właścicielem komercyjnym poprzez cesję patentów na technologie i zastosowania HiBiT i NanoLuc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.M.R, S.D.M., M.U. i D.L.D są pracownikami Promega Corporation

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik CellTiter-Glo 2.0	Promega	G9241	Test luminescencyjny żywotności komórek
Test żywotności komórek CellTiter-Fluor	Promega	G6080	Test fluorescencyjny żywotności komórek
CO₂-independent	ThermoFisher	18045-088	Hodowla komórkowa
DMSO	Sigma Aldrich	D2650	Do rozcieńczania i kontroli związków
DPBS	Gibco	14190	Hodowla komórkowa
Surowica bydlęca	płodu Seradigm	89510-194	Hodowla komórkowa
HEK293 Stabilna linia komórkowa LgBiT	Promega	N2672	Do uzupełnienia HiBiT w celu wytworzenia luminescencji
HiBiT CRISPR linia komórkowa ssaków	Promega		https://www.promega.com/crispr-tpd
Roztwór higromycyny B	Gibco	10-687-010	Hodowla komórkowa
LgBiT BacMam	Promega CS1956C01		Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji
Wektor ekspresji LgBiT	Promega	N2681	Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji
Czytnik			płytek luminometruLuminomenter zdolny do pomiaru luminescencji i fluorescencji (np. GloMax Discover System, Promega GM3000)
NanoGlo Endurazine Żywy	substrat Odczynnik kinetyczny Promega		N2570
NanoGlo Vivazine Żywy substrat Odczynnik	kinetyczny Promega		N2580
NanoGlo HiBiT Lytic System detekcji	Promega	N3030	Enpoint litycznie HiBiT
Opti-MEM Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowej (ThermoFisher)	ThermoFisher	11058-021	Hodowla komórkowa
Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 96-dołkowa	Costar	3917	Hodowla komórkowa
Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 384-dołkowa	Corning	3570	Hodowla komórkowa
Trypsyna/EDTA	Gibco	25300	Hodowla komórkowa

HiBiT

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burslem, G. M., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras as therapeutics and tools for biological discovery. Cell. 181 (1), 102-114 (2020).
Chamberlain, P. P., Hamann, L. G. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nature Chemical Biology. 15 (10), 937-944 (2019).
Churcher, I. Protac-induced protein degradation in drug discovery: Breaking the rules or just making new ones. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 444-452 (2018).
Ciulli, A., Farnaby, W. Protein degradation for drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 1-3 (2019).
Crews, C. M. Inducing protein degradation as a therapeutic strategy. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 403-404 (2018).
Cromm, P. M., Crews, C. M. Targeted protein degradation: from chemical biology to Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1181-1190 (2017).
Deshaies, R. J. Protein degradation: Prime time for PROTACs. Nature Chemical Biology. 11 (9), 634-635 (2015).
Lai, A. C., Crews, C. M. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 101-114 (2017).
Ottis, P., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras: Induced protein degradation as a therapeutic strategy. ACS Chemical Biology. 12 (4), 892-898 (2017).
Wu, T., et al. Targeted protein degradation as a powerful research tool in basic biology and drug target discovery. Nature Structural and Molecular Biology. 27, 605-614 (2020).
Hanan, E. J., et al. Monomeric targeted protein degraders. Journal of Medicinal Chemistry. , (2020).
Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
Carmony, K. C., Kim, K. B. PROTAC-induced proteolytic targeting. Methods in Molecular Biology. 832, 627-638 (2012).
Daniels, D. L., Riching, K. M., Urh, M. Monitoring and deciphering protein degradation pathways inside cells. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 61-68 (2019).
Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An emerging targeting technique for protein degradation in drug discovery. Bioessays. 40 (4), 1700247(2018).
Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology and Therapy. 174, 138-144 (2017).
Raina, K., Crews, C. M. Targeted protein knockdown using small molecule degraders. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 46-53 (2017).
Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
Schwinn, M. K., et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
Schwinn, M. K., Steffen, L. S., Zimmerman, K., Wood, K. V., Machleidt, T. A simple and scalable strategy for analysis of endogenous protein dynamics. Science Reports. 10 (1), 8953(2020).
Bensimon, A., et al. Targeted degradation of SLC transporters reveals amenability of multi-pass transmembrane proteins to ligand-induced proteolysis. Cell Chemical Biology. 27 (6), 728-739 (2020).
Bondeson, D. P., et al. Lessons in PROTAC design from selective degradation with a promiscuous warhead. Cell Chemical Biology. 25 (1), 78-87 (2018).
Buckley, D. L., et al. HaloPROTACS: Use of small molecule PROTACs to induce degradation of HaloTag fusion proteins. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1831-1837 (2015).
Bulatov, E., Ciulli, A. Targeting Cullin-RING E3 ubiquitin ligases for drug discovery: structure, assembly and small-molecule modulation. Biochemical Journal. 467 (3), 365-386 (2015).
Burslem, G. M., et al. The advantages of targeted protein degradation over inhibition: An RTK case study. Cell Chemical Biology. 25 (1), 67-77 (2018).
Chamberlain, P. P., et al. Evolution of cereblon-mediated protein degradation as a therapeutic modality. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (12), 1592-1602 (2019).
Crew, A. P., et al. Identification and characterization of Von Hippel-Lindau-recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 583-598 (2018).
DeMars, K. M., Yang, C., Castro-Rivera, C. I., Candelario-Jalil, E. Selective degradation of BET proteins with dBET1, a proteolysis-targeting chimera, potently reduces pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-activated microglia. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (1), 410-415 (2018).
Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
Farnaby, W., et al. BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nature Chemical Biology. 15 (7), 672-680 (2019).
Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
Gechijian, L. N., et al. Functional TRIM24 degrader via conjugation of ineffectual bromodomain and VHL ligands. Nature Chemical Biology. 14 (4), 405-412 (2018).
Gustafson, J. L., et al. Small-Molecule-Mediated Degradation of the Androgen Receptor through Hydrophobic Tagging. Angewandte Chemie International Edition England. 54 (33), 9659-9662 (2015).
Kerres, N., et al. Chemically induced degradation of the oncogenic transcription factor BCL6. Cell Reports. 20 (12), 2860-2875 (2017).
Lohbeck, J., Miller, A. K. Practical synthesis of a phthalimide-based Cereblon ligand to enable PROTAC development. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 26 (21), 5260-5262 (2016).
Lu, J., et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4. Chemical Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
Lu, M., et al. Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway. Eurupean Journal of Medicinal Chemistry. 146, 251-259 (2018).
Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14, 706-714 (2018).
Powell, C. E., et al. Chemically induced degradation of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (9), 4249-4255 (2018).
Raina, K., et al. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (26), 7124-7129 (2016).
Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceeding National Academy Science. 98 (15), 8554-8559 (2001).
Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular Cell Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
Schiedel, M., et al. Chemically induced degradation of Sirtuin 2 (Sirt2) by a proteolysis targeting chimera (PROTAC) based on sirtuin rearranging ligands (SirReals). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 482-491 (2018).
Slabicki, M., et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature. , (2020).
Smith, B. E., et al. Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase. Nature Communications. 10 (1), 131(2019).
Sun, B., et al. BET protein proteolysis targeting chimera (PROTAC) exerts potent lethal activity against mantle cell lymphoma cells. Leukemia. 32 (2), 343-352 (2018).
Tong, B., et al. A Nimbolide-based kinase degrader preferentially degrades oncogenic BCR-ABL. ACS Chemical Biology. 15 (7), 1788-1794 (2020).
Winter, G. E., et al. Drug Development. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
Winter, G. E., et al. BET Bromodomain proteins function as master transcription elongation factors independent of CDK9 recruitment. Molecular Cell. 67 (1), 5-18 (2017).
Zengerle, M., Chan, K. H., Ciulli, A. Selective Small Molecule Induced Degradation of the BET Bromodomain Protein BRD4. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1770-1777 (2015).
Zhang, C., et al. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) of anaplastic lymphoma kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
Zoppi, V., et al. Iterative design and optimization of initially inactive proteolysis targeting chimeras (PROTACs) identify VZ185 as a potent, fast, and selective von Hippel-Lindau (VHL) based dual degrader probe of BRD9 and BRD7. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (2), 699-726 (2019).
Huang, H. T., et al. A chemoproteomic approach to query the degradable kinome using a multi-kinase degrader. Cell Chemical Biology. 25 (1), 88-99 (2018).
Bjorklund, C. C., et al. Iberdomide (CC-220) is a potent cereblon E3 ligase modulator with antitumor and immunostimulatory activities in lenalidomide- and pomalidomide-resistant multiple myeloma cells with dysregulated CRBN. Leukemia. 34 (4), 1197-1201 (2020).
Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
Matyskiela, M. E., et al. A cereblon modulator (CC-220) with improved degradation of Ikaros and Aiolos. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 535-542 (2018).
Bussiere, D. E., et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex. Nature Chemical Biology. 16 (1), 15-23 (2020).
Du, X., et al. Structural basis and kinetic pathway of RBM39 recruitment to DCAF15 by a sulfonamide molecular glue E7820. Structure. 27 (11), 1625-1633 (2019).
Ting, T. C., et al. Aryl sulfonamides degrade RBM39 and RBM23 by recruitment to CRL4-DCAF15. Cell Reports. 29 (6), 1499-1510 (2019).
Hughes, S. J., Ciulli, A. Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays in Biochemistry. 61 (5), 505-516 (2017).
Schapira, M., Calabrese, M. F., Bullock, A. N., Crews, C. M. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nature Review Drug Discovery. 18 (12), 949-963 (2019).
Dixon, A. S., et al. NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
Gilan, O., et al. Selective targeting of BD1 and BD2 of the BET proteins in cancer and immuno-inflammation. Science. 368 (6489), 387-394 (2020).
Oh-Hashi, K., Furuta, E., Fujimura, K., Hirata, Y. Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells. Biochemical Biophysical Report. 12, 40-45 (2017).
Ottis, P., et al. Cellular resistance mechanisms to targeted protein degradation converge toward impairment of the engaged ubiquitin transfer pathway. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2215-2223 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

HiBiT CRISPR Cell Lines Targeted Protein Degradation PROTAC Compounds Molecular Glues Endogenous Tagging Luminescent Detection Kinetic Degradation Analysis Dose Response Profiling Cell Viability Multiplexing NanoBRET Technology

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły