Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61787

⸱

9 listopada 2020

 ,  ,  , 
1Promega Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC50 i Dmax50.

Streszczenie

Ukierunkowane związki degradacji białek, w tym kleje molekularne lub chimery ukierunkowane na proteolizę, są ekscytującą nową metodą terapeutyczną w odkrywaniu leków małocząsteczkowych. Ta klasa związków indukuje degradację białek poprzez zbliżenie białka docelowego i białek maszynerii ligazy E3 wymaganych do ubikwitynacji i ostatecznie degradacji białka docelowego poprzez szlak ubikwityna-proteasomal (UPP). Profilowanie degradacji białka docelowego w sposób wysokoprzepustowy pozostaje jednak dużym wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność szlaków komórkowych wymaganych do osiągnięcia degradacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół i strategię badań przesiewowych opartą na zastosowaniu endogennego znakowania białek docelowych CRISPR/Cas9 za pomocą 11-aminokwasowego znacznika HiBiT, który uzupełnia się z wysokim powinowactwem do białka LgBiT, w celu wytworzenia białka luminescencyjnego. Te ukierunkowane na CRISPR linie komórkowe z endogennymi znacznikami mogą być używane do pomiaru degradacji indukowanej związkami w czasie rzeczywistym, kinetycznych żywych komórkach lub w trybie litycznym punktu końcowego poprzez monitorowanie sygnału luminescencyjnego za pomocą czytnika opartego na płytce luminescencyjnej. W tym miejscu przedstawiamy zalecane protokoły badań przesiewowych dla różnych formatów, a także opisujemy obliczanie kluczowych parametrów degradacji szybkości, Dmax, DC50, Dmax50, a także multipleksowanie z testami żywotności komórek. Podejścia te umożliwiają szybkie odkrywanie i klasyfikację związków we wczesnym stadium przy jednoczesnym utrzymaniu endogennej ekspresji i regulacji białek docelowych w odpowiednich tłach komórkowych, co pozwala na skuteczną optymalizację wiodących związków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Ukierunkowana degradacja białek stała się jednym z najszybciej rozwijających się obszarów w odkrywaniu leków małocząsteczkowych, znacznie wzmocnionym przez sukces terapeutyczny immunomodulujących molekularnych związków kleju (np. IMiD) w leczeniu raka, oraz obiecujące wczesne dane z badań klinicznych związków chimery ukierunkowanych na proteolizę1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Ukierunkowane związki degradacji białek działają poprzez zbliżenie docelowego białka z białkami maszynowymi ligazy E31,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Ta indukowana związkiem rekrutacja białka docelowego do ligazy E3 prowadzi do ubikwitynacji i degradacji białka docelowego poprzez szlak proteasomalny ubikwityny (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Historycznie rzecz biorąc, programy badań przesiewowych w celu odkrywania leków małocząsteczkowych opierały się na wstępnych testach biochemicznych w celu oceny aktywności i uszeregowania związków rzędu. Stanowi to jednak poważne wyzwanie dla docelowych degraderów białek, których ostateczna aktywność, degradacja przez proteasom, zależy od kaskady zdarzeń komórkowych1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17,18. Mnogość szlaków i złożoność kompleksów białkowych wymaganych do pomyślnej degradacji celu wymaga podejść do testów komórkowych w celu wczesnego badania przesiewowego i selekcji początkowych związków. Obecnie zdecydowanie brakuje technologii monitorowania degradacji białek docelowych w sposób wysokoprzepustowy w kontekście środowiska komórkowego14. Tutaj przedstawimy protokoły do oceny aktywności degradacji litycznej żywej żywej komórki lub punktu końcowego w czasie rzeczywistym przy użyciu CRISPR/Cas9 endogennie oznakowanych docelowych linii komórkowych HiBiT18,19,20 do monitorowania utraty docelowego białka za pomocą pomiaru luminescencyjnego po leczeniu związkami degradującymi10,11,18,19.

Aby osiągnąć skuteczną degradację celów terapeutycznych i rozszerzyć proteom ulegający leczeniu, pojawiły się liczne podejścia i typy degraderów, które mogą celować w szeroki zakres białek do zniszczenia, w tym te zlokalizowane na lub w błonie plazmatycznej, lizosomach, błonach mitochondrialnych, cytoplazmie i jądrze21–57. Dwie podstawowe klasy najczęściej badanych związków to kleje molekularne i białka ukierunkowane na cimeras2,4,5,6,7,12,26. Kleje molekularne są monowalentne, a więc zazwyczaj mają mniejszy rozmiar i ułatwiają nowy interfejs interakcji białko-białko z białkiem docelowym po związaniu ze składnikiem ligazy E32,12,26. Są to najczęściej degradery, które wiążą się ze składnikiem ligazy Cereblon (CRBN) E32,12,26,55,56,57. Ostatnio jednak ekscytujące nowe przykłady wykorzystujące inne maszyny ligazy E3, takie jak DCAF1558,59,60 i rekrutacja CDK/Cyclin do DDB145 pokazują potencjał ekspansji tej klasy związków. W przeciwieństwie do tego, PROTAC są większymi, dwuwartościowymi cząsteczkami, składającymi się z docelowego liganda wiążącego, najczęściej inhibitora, połączonego za pomocą łącznika chemicznego z ligazą E3 uchwyt1,3,4,5,7,13. W związku z tym związki te są zdolne do bezpośredniego wiązania się zarówno z ligazą E3, jak i z białkiem docelowym1,3,4,5,7,13. Wykazano, że liczne białka są degradowane przez te dwuwartościowe cząsteczki, a najczęściej używane uchwyty ligazy E3 rekrutują się do CRBN lub Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Jednak liczba dostępnych uchwytów do rekrutacji ligazy E3 w chimerach ukierunkowanych na projekt proteolizy szybko rośnie, rozszerzając możliwości tej klasy związków o potencjał degradacji różnych klas docelowych, a także zwiększenia swoistości komórek lub typów tkanek24,48,61,62. W połączeniu z minimalnym wymogiem angażowania białka docelowego, nawet przy marginalnym powinowactwie, związki degradacyjne dają nadzieję na rozszerzenie proteomu podatnego na działanie leków.

Scharakteryzowanie komórkowej dynamiki utraty białka, jak również potencjalnej regeneracji białka po leczeniu, jest kluczowe dla zrozumienia funkcji i skuteczności związku degradacji. Chociaż możliwe jest badanie zmian poziomu białka endogennego w odpowiednich układach komórkowych za pomocą testów przeciwciał Western blot lub spektrometrii mas, podejścia te są trudne do dostosowania do formatów badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, mają ograniczoną zdolność kwantyfikacji lub zdolność do pomiaru zmian kinetycznych w wielu punktach czasowych14. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy komórkowy system luminescencyjny oparty na płytkach do monitorowania zmian poziomów białek endogennych, który wykorzystuje insercję genomową za pośrednictwem CRISPR/Cas9 znacznika 11 aminokwasów, HiBiT, do loci dowolnych kluczowych celów degradacji18,19,20. Peptyd ten uzupełnia się z wysokim powinowactwem do swojego partnera wiążącego, LgBiT, aby wytworzyć jasną luminescencję w obecności swojego substratu18,19,20,63, dzięki czemu te oznaczone endogenne białka świecą w komórkach lub lizatach18,19,20,63. Względne jednostki światła (RLU) mierzone za pomocą luminometru są wprost proporcjonalne do oznaczonych docelowych poziomów białka18,19,20,63. Wraz z rozwojem stabilizowanych substratów lucyferazy, możliwe są pomiary poziomu białka kinetycznego w czasie rzeczywistym w przedziałach czasowych 24-48 godzin18,53,64. Pozwala to na określenie pełnego profilu degradacji dla dowolnego celu przy dowolnym stężeniu związku, w tym analizę ilościową początkowej szybkości degradacji, maksimum degradacji (Dmax) i odzysku po traktowaniu związkiem18,53. Jednak w przypadku badań przesiewowych dużych bibliotek związków degradacyjnych analizę punktów końcowych można również łatwo przeprowadzić w formacie 384-dołkowym przy różnych stężeniach leku i wyznaczonych porach.

Protokoły przedstawione w tym manuskrypcie reprezentują strategie badań przesiewowych komórek dla ukierunkowanych związków degradacji białek, mające zastosowanie do wszystkich typów degraderów. Wykorzystanie linii komórkowych HiBiT CRISPR wraz z tymi protokołami nie ogranicza się jednak do degradacji białek, a raczej jest to ogólne narzędzie do monitorowania dowolnego endogennego poziomu białka docelowego, który można modulować po leczeniu w celu zbadania wpływu związków, a nawet mechanizmów oporności20,65,66. Warunkiem wstępnym dla tych metod wykrywania opartych na luminescencji jest endogennie znakowana linia komórek docelowych HiBiT CRISPR, która ma kluczowe znaczenie, ponieważ umożliwia czułe wykrywanie luminescencyjne, przy jednoczesnym zachowaniu endogennej ekspresji celu i natywnej regulacji promotora18,19,20. Poczyniono znaczne postępy w wykorzystaniu CRISRP/Cas9 do wstawiania znaczników genomowych, szczególnie w skalowalności20 i wysokiej czułości wykrywania, w różnych formatach, w tym pulach CRISPR lub klonach z heterozygotyczną lub homozygotyczną insercją alleli18,19,20. Możliwe jest stosowanie egzogennej ekspresji HiBiT lub innych fuzji reporterowych w komórkach zamiast znakowania endogennego, ale należy zachować znaczną ostrożność przy użyciu systemów z nadekspresją białek14,18. Mogą one prowadzić do artefaktów w zrozumieniu prawdziwej siły działania związku i dynamiki odzyskiwania białek14,18, w tym potencjalne pętle transkrypcyjnego sprzężenia zwrotnego aktywowane po degradacji celu. Ponadto związki we wczesnym stadium o niskiej sile działania mogą zostać pominięte i prezentować się jako fałszywie ujemne wyniki w badaniach przesiewowych. Ponieważ utrata białka może wynikać z toksyczności wywołanej związkiem i śmierci komórki, opisane tutaj protokoły zawierają wysoce zalecane, ale opcjonalne testy żywotności komórek, luminescencyjne lub fluorescencyjne w połączeniu z protokołem degradacji. Protokół składa się z dwóch głównych sekcji: litycznego punktu końcowego i kinetycznego badania przesiewowego żywych komórek. W każdej z tych sekcji znajdują się opcje multipleksowanych pomiarów żywotności komórek w formatach końcowych lub kinetycznych. Monitorowanie zmian znakowanego białka endogennego wymaga uzupełnienia LgBiT w komórkach. W związku z tym sekcja badań przesiewowych kinetycznych odwołuje się do ważnych protokołów dotyczących ich wprowadzenia, co można osiągnąć poprzez przejściową lub stabilną ekspresję i jest niezbędne do wykonywania pomiarów luminescencyjnych na żywych komórkach. Wszystkie przedstawione tutaj podejścia umożliwiają szybkie uporządkowanie rang i ocenę aktywności związków, umożliwiając badania przesiewowe związków na wczesnym etapie i szybszą identyfikację degraderów ołowiu.

Ten protokół jest przeznaczony do badania związków degradacyjnych w połączeniu z linią komórkową HiBiT CRISPR. Protokoły generowania wstawienia HiBiT CRISPR dla wielu celów zostały przedstawione w kilku ostatnich publikacjach18,19,20.

Protokół

1. Badania degradacji końcowej z wykorzystaniem białek docelowych CRISPR z tagiem HiBiT w formacie litycznym z opcjonalną fluorescencyjną analizą żywotności komórek

  1. Przygotowanie i wysiew linii komórkowych ssaków (adherentnych lub w zawiesinie)
    1. Dostosować gęstość komórek do poziomu 2,2 x 105/mL poprzez rozcieńczenie w odpowiednim medium komórkowym stosowanym do pasażowania i wzrostu komórek.
    2. Rozdzielić komórki do płytek w ilości co najmniej 3 studzienek na każdą warunkiem eksperymentalnym i kontrolnym. Do białych płytek 96-dołkowych nanieść 90 µL (20 0 komórek) zawiesiny komórkowej na studzienkę. W przypadku formatu 384-dołkowego, do białych płytek 384-dołkowych nanieść 36 µL (8 0 komórek) zawiesiny komórkowej na studzienkę.
  2. Przygotowanie i dodanie związków
    1. Przygotować płytki z szeregowymi rozcieńczeniami badanego związku PROTAC lub degradera w 10% DMSO w stężeniu 1 0-krotnie wyższym od stężenia końcowego. Następnie rozcieńczyć go w medium hodowlanym do 10-krotnego stężenia końcowego. Do medium dodać taką samą objętość DMSO, aby służyło ono jako kontrola DMSO bez związku.
    2. W formacie 96-dołkowym dodać 10 µL 10-krotnych roztworów związku i kontroli do 90 µL komórek. W formacie 384-dołkowym dodać 4 µL 10-krotnych roztworów związku i kontroli do 36 µL komórek.
    3. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez pożądany czas lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu.
      UWAGA: Ponieważ jest to analiza punktu końcowego, testowanie wielu punktów czasowych będzie wymagało przygotowania oddzielnych płytek degradacji dla każdego punktu czasowego, zgodnie z opisem w kroku 1.1.2 powyżej. Czas inkubacji potrzebny do wykrycia degradacji indukowanej związkiem jest bardzo zmienny i prawdopodobnie zależy od stężenia związku. Sugerowane początkowe punkty czasowe to 6 h i 24 h.
    4. W przypadku pomiaru luminescencyjnego punktu końcowego bez opcjonalnego pomiaru żywotności komórek, przejść bezpośrednio do kroku 1.3 poniżej. W przypadku przeprowadzania analizy multipleksowej z pomiarem żywotności komórek, przejść do następnej sekcji 1.4 poniżej.
  3. Pomiar lityczny komórek
    1. Bezpośrednio przed pomiarami litycznymi HiBiT przygotować 2-krotny odczynnik detekcyjny lityczny, dodając 20 µL substratu litycznego i 10 µL białka LgBiT na każdy 1 mL buforu litycznego. Przygotować ilość 2-krotnego odczynnika detekcyjnego odpowiadającą liczbie badanych studzienek, uwzględniając dodatkową objętość na błędy pipetowania (tj. liczba studzienek + 10%).
    2. Dodać przygotowany lityczny odczynnik detekcyjny do komórek. W formacie 96-dołkowym dodać 100 µL 2-krotnego litycznego odczynnika detekcyjnego do każdej studzienki zawierającej 10 µL komórek. W formacie 384-dołkowym dodać 40 µL 2-krotnego litycznego odczynnika detekcyjnego do każdej studzienki zawierającej 40 µL komórek. Mieszać płytkę na mikropłytkowym mieszalniku wortex przez 10-20 min przy 350 rpm.
    3. Zmierz luminescencję za pomocą luminometru zdolnego do odczytu luminescencji w płytkach 96- lub 384-dołkowych.
  4. Opcjonalny multipleks z żywotnością komórek
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu CellTiter-Fluor (CTF) (patrz Tabela materiałów).
    1. Na 30-40 min przed pożądanym pomiarem punktu końcowego przygotować 6-krotny roztwór odczynnika do detekcji żywotności komórek, dodając 10 µL substratu do 2 mL buforu analitycznego. Przygotować ilość 6-krotnego odczynnika dla każdej badanej studzienki, uwzględniając dodatkową objętość na błędy pipetowania (tj. liczba studzienek + 10%).
    2. Dodać przygotowany odczynnik do studzienek. W formacie 96-dołkowym dodać 20 µL 6-krotnego odczynnika do każdej studzienki zawierającej już objętość 10 µL. W formacie 384-dołkowym dodać 8 µL 6-krotnego odczynnika do każdej studzienki zawierającej 40 µL komórek. Krótko mieszać na mikropłytkowym mieszalniku wortex, a następnie inkubować płytkę przez 30 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    3. W pożądanym punkcie końcowym pomiaru (tj. 6 lub 24 h po traktowaniu, krok 1.2.3) zmierzyć fluorescencję za pomocą urządzenia zdolnego do odczytu fluorescencji (380-40nmEx/505nmEm) w formacie 96- lub 384-dołkowym.
    4. Przygotować 2-krotny lityczny odczynnik detekcyjny, dodając 20 µL substratu litycznego i 10 µL białka LgBiT na 1 mL buforu litycznego. Przygotować ilość 2-krotnego odczynnika detekcyjnego odpowiadającą liczbie badanych studzienek, uwzględniając dodatkową objętość na błędy pipetowania (np. liczba studzienek + 10%).
    5. Dodać przygotowany lityczny odczynnik detekcyjny do studzienek. W formacie 96-dołkowym dodać 120 µL 2-krotnego litycznego odczynnika detekcyjnego do każdej studzienki zawierającej już objętość 120 µL. W formacie 384-dołkowym dodać 48 µL 2-krotnego litycznego odczynnika detekcyjnego do każdej studzienki zawierającej już objętość 48 µL. Mieszać płytkę na mikropłytkowym mieszalniku wortex przez 10-20 min.
    6. Zmierz luminescencję za pomocą luminometru zdolnego do odczytu luminescencji w płytkach 96- lub 384-dołkowych.
  5. Kwantyfikacja degradacji i żywotności komórek
    1. Obliczyć średnią wartość względnych jednostek światła (RLU) dla kontroli DMSO w zmierzonym punkcie czasowym. Wartość tę należy przyjąć jako bazowy poziom białka celu w celu obliczenia frakcyjnej degradacji poprzez normalizację wszystkich pozostałych traktowań testowanych w tym samym punkcie czasowym względem tej wartości. Na przykład, jeśli średnia wartość RLU dla studzienek kontrolnych DMSO po 6 h wynosiła 10 00, a RLU dla danego związku po 6 h wynosiła 5 0, frakcyjna degradacja zostanie obliczona jako 5 0 ÷ 10 0 = 0,5 (Równanie 1).
      Równanie 1: figure-protocol-1
    2. Wyznaczyć procentową degradację na podstawie frakcyjnego RLU:
      Równanie 2: figure-protocol-2
    3. Narysować wykres frakcyjnego RLU lub % degradacji w określonych punktach czasowych, aby uszeregować aktywność związków.
    4. Opcjonalnie przeanalizować dane względnych jednostek fluorescencji (RFU) z pomiaru żywotności komórek, porównując wartości ze wszystkich traktowań do kontroli DMSO. Jeśli w przypadku któregokolwiek z traktowań zaobserwowano istotny spadek RFU względem kontroli DMSO, dane o degradacji można dodatkowo znormalizować do danych z testu żywotności komórek, aby określić zmiany poziomu białka w stosunku do utraty żywotności komórek.

2. Kinetyka degradacji białek docelowych CRISPR z tagiem HiBiT w czasie rzeczywistym oraz opcjonalny luminescencyjny test żywotności komórek

UWAGA: Możliwość przeprowadzania przesiewania kinetycznego i badania degradacji wymaga koekspresji białka LgBiT w komórce, co zostało opisane wcześniej18,19,63. Można to osiągnąć poprzez przejściową transfekcję wektora LgBiT, zastosowanie BacMam LgBiT lub przeprowadzenie insercji HiBiT metodą CRISPR w stabilnej linii komórkowej LgBiT.

  1. Wysiewanie linii komórek adherentnych.
    1. Usunąć medium z kolby komórkowej poprzez aspirację, przemyć komórki DPBS, zdysocjować komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i pozwolić komórkom na oddzielenie się od dna kolby. W przypadku linii komórek w zawiesinie przejść do sekcji 2.2.
    2. Zneutralizować trypsynę, używając medium hodowlanego z surowicą, wymieszać w celu zebrania i resuspensji komórek, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej.
    3. Odwirować komórki przy 125 x g przez 5 min. Odlać medium hodowlane i resuspenderć w równej objętości świeżego medium hodowlanego.
    4. Wysiać komórki na płytki testowe w minimum trzech powtórzeniach na każdy wariant doświadczalny i kontrolny. Dla formatu 96-dołkowego wykonać odczyt w celu oszacowania gęstości komórek, dostosować gęstość do 2 x 105 komórek/mL w medium testowym i nanieść 10 µL (20 0 komórek) na dołek w płytce 96-dołkowej. Dla formatu 384-dołkowego wykonać odczyt w celu oszacowania gęstości komórek, dostosować gęstość do 4,44 x 105 komórek/mL w medium testowym i nanieść 18 µL (8 0 komórek) na dołek.
    5. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez noc lub w warunkach optymalnych dla ich wzrostu.
  2. Wysiewanie komórek w zawiesinie
    1. Dostosować gęstość komórek do 2,2 x 105 komórek/mL w medium niezależnym od CO2, uzupełnionym o 10% FBS i 1x Endurazine (rozcieńczenie 1:10 roztworu zapasowego).
    2. Wysiać komórki na płytki testowe w minimum 3 dołkach na każdy wariant doświadczalny i kontrolny. Dla formatu 96-dołkowego nanieść 90 µL (20 0 komórek) na dołek. Dla formatu 384-dołkowego nanieść 36 µL (8 0 komórek) na dołek.
      UWAGA: Dla linii komórek w zawiesinie o niskim stosunku sygnału do tła (S:B) luminescencji, np. podczas pracy z pulami CRISPR zamiast klonów, można zwiększyć luminescencję poprzez zwiększenie liczby wysianych komórek, do 10 00 komórek/dołek w formacie 96-dołkowym lub 40 0 komórek/dołek w formacie 384-dołkowym.
  3. Kinetyczne testy degradacji z użyciem komórek HiBiT CRISPR wykazujących ekspresję LgBiT
    1. W przypadku komórek w zawiesinie zawierających już Endurazine, która została dodana na etapie wysiewania w punkcie 2.2., przejść bezpośrednio do kroku 2.3.3. Dla linii komórek adherentnych przygotować roztwór Nano-Glo Endurazine. Dla formatu 96-dołkowego przygotować roztwór 1x Endurazine poprzez rozcieńczenie odczynnika zapasowego 1:10 w medium niezależnym od CO2 uzupełnionym o 10% FBS. Dla formatu 384-dołkowego przygotować roztwór 2x Endurazine poprzez rozcieńczenie odczynnika zapasowego 1:50 w medium niezależnym od CO2 uzupełnionym o 10% FBS.
    2. Dodać roztwór Endurazine do każdego dołka z komórkami adherentnymi. Dla formatu 96-dołkowego aspirujemy medium i dodajemy 90 µL roztworu 1x Endurazine. Dla formatu 384-dołkowego dodać 18 µL roztworu 2x Endurazine do 18 µL komórek. Nie aspirujemy medium, ponieważ test degradacji w formacie 384-dołkowym jest przeprowadzany w mieszaninie 50:50 medium hodowlanego i medium niezależnego od CO2.
    3. Inkubować płytki z komórkami w zawiesinie lub adherentnymi zawierające Endurazine przez 2,5 h w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2, aby umożliwić wyrównanie poziomu luminescencji.
    4. Przygotować 10-krotne stężenie miareczkowania testowego PROTAC w medium niezależnym od CO2 i dodać 10 µL do każdego dołka płytki 96-dołkowej lub 4 µL dla płytki 384-dołkowej. Dla związków o nieznanej skuteczności zaleca się stężenie końcowe 1-10 µM w najwyższym punkcie jako punkt wyjścia.
    5. Zbierać kinetyczne pomiary luminescencji w luminometrze uprzednio wyrównanym do 37 °C w okresie od 0 do 48 h. Interwały czasowe pomiarów można dostosować do każdego eksperymentu, ale zalecanym początkowym eksperymentem byłyby pomiary luminescencji co 5-15 min przez 24 h lub przez pożądany czas.
  4. Opcjonalna multipleksowa analiza żywotności komórek w tym samym dołku po końcowym pomiarze kinetycznym
    UWAGA: Ten test jest przeprowadzany z użyciem dostępnego komercyjnie zestawu CellTiter-Glo (CTG) (patrz Tabela materiałów).
    1. Wyrównać temperaturę odczynnika CTG do temperatury pokojowej.
    2. Po pomiarze degradacji w ostatnim punkcie czasowym analizy kinetycznej dodać 10 µL (płytka 96-dołkowa) lub 40 µL (płytka 384-dołkowa) odczynnika na każdy dołek płytki i mieszać na wstrząsarku do płytek przy 50-70 rpm (płytka 96-dołkowa) lub w mikropłytkowym mikserze wortexowym (płytka 384-dołkowa) przez 5 min.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić lizę komórek i wygaszenie sygnału HiBiT.
    4. Zmierzyć całkowitą luminescencję w luminometrze zgodnie z zaleceniami producenta.
  5. Kwantyfikacja kinetycznych profili degradacji
    1. Wykorzystując zebrane kinetyczne pomiary luminescencji, znormalizować surowe wartości RLU dla każdego stężenia PROTAC względem średniej z powtórzeń w warunkach DMSO w każdym punkcie czasowym, aby uwzględnić zmiany stężenia wolnej furimazyny w czasie. Obliczyć ułamkową wartość RLU za pomocą Równania 1.
      Równanie 1: figure-protocol-3
    2. Na podstawie krzywych degradacji dopasować jednoskładnikowy model wykładniczego zaniku za pomocą Równania 2 do początkowej części degradacji każdej krzywej, aż do punktu, w którym dane osiągną plateau.
      UWAGA: Pomocne może być wykluczenie z dopasowania pierwszych kilku punktów danych, ponieważ przed zaobserwowaniem degradacji może wystąpić krótka faza opóźnienia.
      Równanie 2: figure-protocol-4
    3. Na podstawie Równania 2 wyznaczyć parametr ƛ, który reprezentuje stałą szybkości degradacji, oraz Plateau, który reprezentuje najniższą pozostałą ilość białka.
    4. Obliczyć Dmax, czyli maksymalną ułamkową ilość zdegradowanego białka, obliczaną jako 1-Plateau.
    5. Wykreślić Dmax dla każdego stężenia PROTAC, aby wyznaczyć niezależną od czasu krzywą potencji degradacji.
    6. Wyznaczyć wartość Dmax50 dla wykresu z punktu 2.3.5, aby przeanalizować skuteczność związków.
      UWAGA: Aby wyznaczyć DC50 w konkretnym punkcie czasowym, należy wykreślić obliczony procent degradacji dla każdego stężenia w wybranym czasie. Można to określić jako DC50 t=4 h lub DC50 t=12 h.

Wyniki

Aby zademonstrować analizę degradacji litycznej w punkcie końcowym dla pojedynczej koncentracji, kilka białek docelowych CDK; CDK2, CDK4, CDK7 i CDK10 zostało endogennie oznakowane HiBiT na ich C-końcu w komórkach HEK293, a następnie poddano je działaniu pan-kinazowego PROTAC-u opartego na Cereblonie, TL12-186, w stężeniu 1 µM54 (Rycina 1A). Poziom białek CDK mierzono w różnych punktach czasowych i wyznaczono frakcyjne RLU w stosunku do kontroli DMSO (Rycina 1A). Każde białko CDK wykazało różny stopień degradacji w odpowiedzi na traktowanie związkiem w różnych punktach czasowych (Rycina 1A). Aby bezpośrednio porównać białka CDK pod kątem utraty białka, frakcyjne wartości RLU z Rycyny 1A przeliczono na całkowity % degradacji i przedstawiono dla każdego punktu czasowego na Rycynie 1B. Wykazuje to, że nawet we wczesnych punktach czasowych, 2 lub 4 h, niektóre z członków rodziny CDK wykazują wysoki poziom degradacji, który nadal rośnie w czasie (Rycina 1B).

Aby zademonstrować analizę kinetyki degradacji, każde z białek rodziny BET – BRD2, BRD3 i BRD4 – zostało endogennie oznakowane HiBiT na N-końcu w komórkach HEK293 stabilnie eksponujących białko LgBiT18. Następnie poddano je działaniu trzech różnych stężeń pan-BET PROTAC: opartego na Cereblonie dBET650 (Rycina 2A) oraz opartego na VHL ARV-7141 (Rycina 2B). Pomiary kinetyczne zbierano przez okres 24 h, a z profili dla każdego stężenia wyraźnie wynikają różnice w odpowiedzi członków rodziny BET. Zdolność BRD2 do szybszej odpowiedzi regeneracyjnej po zastosowaniu związku degradującego (Rycina 2A,B) była wcześniej obserwowana przy użyciu innych pan-BET PROTAC i prawdopodobnie wynika z odpowiedzi sprzężenia zwrotnego na poziomie transkrypcyjnym, która konkuruje z procesem degradacji18.

Zarówno analiza końcowa, jak i kinetyczna mogą być przeprowadzone przy zastosowaniu pełnych traktowań z odpowiedzią na dawkę związku. Na Rysunku 3 przedstawiono kinetyczne profile degradacji w odpowiedzi na dawkę podczas traktowania komórek Jurkat Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR stabilnie wykazujących ekspresję białka LgBiT czterema różnymi związkami typu „molecular glue”2,26,5,57: lenalidomidą (Rysunek 3A), iberdomidą (CC-20) (Rysunek 3B), talidomidą (Rysunek 3C) oraz pomalidomidą (Rysunek 3D). Degradery te wykazują istotne różnice w odpowiedzi degradacyjnej pomiędzy związkami, a także w obrębie serii stężeń (Rysunek 3).

Aby ilościowo ocenić degradację i uszeregować związki przedstawione na Ryc. 3, wykorzystano profile odpowiedzi na dawkę do obliczenia kluczowych parametrów degradacji, w tym szybkości degradacji (Ryc. 4A), Dmax (Ryc. 4B) oraz wartości Dmax50 (Ryc. 4B). Analizy te wykazują, że iberdomid (CC-20) i pomalidomid charakteryzują się bardzo zbliżonymi, szybkimi początkowymi szybkościami degradacji (Ryc. 4A), jednak iberdomid (CC-20) wykazuje najwyższą aktywność, co obserwowano wcześniej w badaniach ortogonalnych5,57 (Ryc. 4B). Ponieważ iberdomid wykazuje tak wysoką aktywność i we wszystkich testowanych stężeniach odnotowano degradację przekraczającą 50%, wartość Dmax50 uzyskana dla iberdomidu stanowi szacunek wynikający z ograniczeń w dokładnym dopasowaniu danych. Z wykresów na Ryc. 3C,D oraz Ryc. 4B wynika, że ani lenalidomid, ani talidomid nie powodują całkowitej degradacji celu Ikaros/IKZF1 przy najwyższych testowanych stężeniach. Ze względu na bardzo niewielką degradację obserwowaną przy zastosowaniu talidomidu, krzywe degradacji nie mogły zostać dokładnie dopasowane do modelu wykładniczego, w związku z czym nie wyznaczono ilościowo szybkości degradacji dla tej kuracji. W przypadku najsilniejszego degradera, iberdomidu (CC-20)5,57 (Ryc. 4B). Multiplexowe testy żywotności komórek nie wykazały spadku żywotności komórek dla testowanych stężeń (Ryc. 4C).

figure-results-1
Rycina 1: Degradacja końcowa i toksyczność CDK przy użyciu pan-kinazowego PROTAC, TL12-18654. (A) Wybrany panel endogennych białek docelowych CDK z fuzją HiBiT na C-końcu za pomocą CRISPR/Cas9 i ocena degradacji przy zastosowaniu 1 µM PROTAC TL12-18654 po 2 h, 4 h, 8 h i 24 h traktowania. Wartości przedstawiono jako ułamkową wartość RLU względem kontroli DMSO zmierzonej w każdym punkcie czasowym. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. (B) Procent degradacji panelu białek docelowych CDK obliczony na podstawie (A), reprezentujący stopień degradacji każdego członka rodziny zaobserwowany w punktach czasowych 2, 4, 8 i 24 h. Słupki błędów reprezentują SD średniej z 3 powtórzeń technicznych. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-2
Rycina 2: Profilowanie kinetycznej selektywności degradacji członków rodziny BET za pomocą degraderów BET, dBET650 i ARV-7141. Profile kinetycznej degradacji endogennych członków rodziny BET: BRD2, BRD3 i BRD4, znakowanych HiBiT na N-końcu za pomocą CRISPR/Cas9, po zastosowaniu pojedynczych stężeń 1 nM (lewo), 10 nM (środek) lub 10 nM (prawo) PROTAC-ów dBET650 (A) lub ARV-7141 (B). Wartości przedstawiono jako ułamkowe RLU obliczone względem kontroli DMSO dla każdego punktu czasowego kinetyki. Słupki błędów reprezentują SD ze średniej z 4 powtórzeń technicznych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Profile odpowiedzi na dawkę kinetycznej degradacji żywych komórek dla Ikaros/IKZF1-HiBiT z panelem klejów molekularnych2,26,5,57. Komórki Jurkat stabilnie ekspresujące białko LgBiT zostały zmodyfikowane za pomocą CRISPR/Cas9, aby oznakować koniec C-końca Ikaros/IKZF1 peptydem HiBiT. Komórki poddano działaniu 8-punktowej serii stężeń odpowiedzi na dawkę, w tym DMSO, dla czterech różnych związków będących klejami molekularnymi2,26,5,57: (A) lenalidomidu, (B) iberdomidu (CC-20), (C) talidomidu lub (D) pomalidomidu. Luminescencję mierzono co 5 min przez łącznie 19,5 h. Dane jednostek względnych światła (RLU) z (A-D) przekształcono w ułamkowe RLU zgodnie z opisem w kroku 2.4.1 i przedstawiono na wykresie jako funkcję czasu. Słupki błędów reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Obliczanie szybkości degradacji i Dmax50 dla Ikaros/IKZF1-HiBiT oraz multipleksowe testy stanu zdrowia komórek. Dane dotyczące kinetyki degradacji z Rysunku 3 zostały wykorzystane do obliczenia ilościowych parametrów degradacji. (A) Szybkości degradacji i (B) maksymalne wartości degradacji (Dmax) przedstawiono na wykresach dla każdego stężenia leku w przypadku wskazanych związków typu „molecular glue”2,26,5,57. (B) Wartości Dmax50 dla każdego związku obliczono przy użyciu modelu zależności od dawki z ograniczonym nachyleniem krzywej Hilla równym 1, co pozwala na uszeregowanie związków degradujących pod kątem konkretnego celu. (C) Testy żywotności komórek dla odpowiedzi na dawkę degradującą przez iberdomid (CC-20)5,57 z Rysunku 3B przeprowadzono jako pomiar końcowy po zakończeniu pomiarów kinetyki degradacji. Słupki błędu reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj dwie metody przesiewowej aktywności związku degradacji w formacie litycznym punktu końcowego lub w trybie kinetycznym żywych komórek. Podejścia te opierają się na tych samych zasadach pomiaru luminescencyjnego, ale zapewniają różne poziomy szczegółowości i zrozumienia. Wybór któregokolwiek z tych podejść będzie prawdopodobnie zależał od celów przesiewowych i wielkości biblioteki złożonej. W przypadku dużych pokładów przesiewowych związków chemicznych lub przesiewowych wstępnych w celu obserwacji wykrywalnej degradacji, badania przesiewowe lityczne punktów końcowych zapewniają czułą i wydajną kompatybilność o wysokiej przepustowości, podczas gdy inne podejścia do punktów końcowych, takie jak western blot lub spektrometria mas, mogą być albo niepraktyczne, albo trudne do dostosowania14. Punktem wyjścia dla tych badań przesiewowych można było przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń i punktów czasowych. Zalecane stężenia początkowe do badania mieszczą się w zakresie 100 nM-10 μM, aby uwzględnić początkowe degradery o niskiej sile działania, słabej przepuszczalności lub, w niektórych przypadkach z bardzo silnymi związkami, obecność efektu haka. Ponadto zaleca się zbadanie co najmniej dwóch różnych punktów czasowych w celu ustalenia wczesnego początku degradacji po 4-6 godzinach oraz utajonej lub trwałej degradacji po 18-24 godzinach. Związki, które wykazują wysoką siłę degradacji i mechanizm on-target, są łatwo obserwowane w ciągu 4-6 godzin, podczas gdy degradacja lub pozorna utrata białka obserwowana dopiero w późniejszych punktach czasowych może być spowodowana różnymi mechanizmami. Zdecydowanie zaleca się monitorowanie żywotności komórek zarówno we wczesnym, jak i późnym punkcie czasowym, tak aby utrata białka mogła być oddzielona od utraty spowodowanej śmiercią komórki. Podobnie jak w przypadku każdego rodzaju testu luminescencyjnego lub fluorescencyjnego, istnieje możliwość, że związki w bibliotekach będą zakłócać lub hamować sygnał, dlatego ortogonalne eksperymenty uzupełniające ze związkami ołowiu wykorzystującymi niepowiązane fuzje lub alternatywne podejścia do monitorowania poziomu białka będą ważne dla oceny, czy utrata RLU w tych testach jest bezpośrednio związana z degradacją białka docelowego.

Zdolność do badania przesiewowego w formacie kinetycznym żywej komórki przez dłuższy czas zależy w dużej mierze od sygnału testowego do tła (S:B). Czynniki, które przyczyniają się do S:B, obejmują poziom ekspresji samego białka docelowego, który może obejmować kilka rzędów wielkości, wydajność ekspresji LgBiT w linii komórkowej wybranej do insercji peptydu, oraz dostępność oznaczonego celu do uzupełnienia w jego różnych natywnych kompleksach. Ustaliliśmy ogólny wymóg odcięcia składający się z S:B wynoszącego 15, aby skutecznie zmierzyć degradację w trybie kinetycznym za pomocą endurazyny lub wiwazyny. S: B określa się, mierząc sygnał wyjściowy komórek edytowanych przez HiBiT koeksprymujących LgBiT w stosunku do nieedytowanych komórek rodzicielskich eksprymujących LgBiT samodzielnie w obecności żywych substratów komórkowych endurazyny lub wiwazyny. Wiwazyna wytwarza silniejszy sygnał luminescencyjny, ale zanika szybciej niż endurazyna i może ograniczać akwizycję sygnału do 24 godzin lub mniej. Co więcej, S:B może być również w dużym stopniu zależny od tego, czy używane są pule CRISPR, czy klony. W przypadku celów w liniach komórkowych, które są bardziej podatne i mają wysoką wydajność w inżynierii CRISPR/Cas9, heterogeniczna populacja puli CRISPR edytowanych komórek może mieć wystarczającą ilość S:B do analizy kinetycznej. W przypadku celów w trudniejszych liniach komórkowych, w których mniej wydajna integracja genomowa za pomocą CRISPR skutkuje pulami o niskim S:B, izolacja klonów CRISPR może być konieczna w celu wzbogacenia edytowanych populacji i osiągnięcia wystarczająco wysokiego S:B do analizy kinetycznej. W każdym z tych scenariuszy, jeśli S:B jest mniejsze niż 15 z substratami enduraziny lub wiwazyny, zaleca się badanie przesiewowe lityczne punktu końcowego.

W celu lepszego zrozumienia i scharakteryzowania związków, w tym określenia profilu degradacji z parametrami ilościowymi, zalecanym podejściem przesiewowym jest analiza kinetyczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach14,18. Podobnie jak omówiona powyżej analiza końcowa, wstępne kinetyczne badania przesiewowe można przeprowadzić przy ograniczonej liczbie stężeń w zakresie 100nM-10μM w sposób wysokoprzepustowy. W formacie 384-dołkowym ponad 100 związków można łatwo przesiać w trzech egzemplarzach w jednym stężeniu na jednej płytce. Uzyskane w ten sposób profile degradacji dostarczą wskazówek nie tylko co do zaobserwowanego zakresu degradacji, ale także szybkości degradacji, czasu trwania degradacji i potencjalnego odzysku białka14,18 (Rysunek 2 i Rysunek 3). Kształty profilu degradacji również dostarczają cennych informacji. Specyficzne i silne degradery często wykazują początkową szybką utratę białka docelowego do plateau w ciągu kilku godzin18,53, podczas gdy inne mechanizmy, takie jak transkrypcyjne sprzężenie zwrotne lub toksyczność związków, zwykle powodują bardziej liniową utratę białka w czasie. Te szczegóły i niuanse są pomijane w analizie litycznej punktów końcowych, a przy analizie w czasie rzeczywistym w ciągu 24-48 godzin nie trzeba przewidywać czasu, aby uchwycić prawdziwy Dmax w zestawach nowych lub nieznanych związków.

Kinetyka w czasie rzeczywistym pozwala również na efektywne badanie przesiewowe odpowiedzi na dawkę w celu lepszego zrozumienia skuteczności związku, jego wpływu na początkową szybkość degradacji oraz oferuje możliwości klasyfikowania związków na podstawie więcej niż jednego parametru. Klasyczne pomiary siły degradacji obejmują obliczenia DC50 w określonym momencie w oparciu o maksima pozornej degradacji. W przeciwieństwie do tego, nasze kinetyczne podejście do oceny siły działania uwzględnia prawdziwe maksimum degradacji przy każdym stężeniu, niezależnie od tego, kiedy występuje w czasie18. Nazywamy ten pomiar siły degradacji kinetycznej Dmax5018. Analiza w ten sposób uwzględnia związki, które mogą inicjować degradację wolniej przy niższych stężeniach, a zatem potrzebują więcej czasu po obróbce, aby osiągnąć Dmax. Szczególnie pouczające może być uszeregowanie związków zarówno pod względem szybkości degradacji, jak i Dmax. W przypadku najsilniejszych degraderów spowoduje to dalsze odróżnienie powolnych, ale silnych degraderów od tych, które są zarówno szybkie, jak i silne. Łącznie, zarówno badania przesiewowe lityczne, jak i kinetyczne żywych komórek z wykorzystaniem linii komórkowych HiBiT CRISPR są potężnymi podejściami, które dają bardziej kompleksowy obraz ukierunkowanej degradacji białek, funkcji związków i umożliwiają proces przesiewowy od wstępnej oceny aktywności do dalszej optymalizacji chemicznej poprzez poprawę kluczowych parametrów degradacji.

Oświadczenia

Promega Corporation jest właścicielem komercyjnym poprzez cesję patentów na technologie i zastosowania HiBiT i NanoLuc.

Podziękowania

K.M.R, S.D.M., M.U. i D.L.D są pracownikami Promega Corporation

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik CellTiter-Glo 2.0PromegaG9241Test luminescencyjny żywotności komórek
Test żywotności komórek CellTiter-FluorPromegaG6080Test fluorescencyjny żywotności komórek
CO2-independentThermoFisher18045-088Hodowla komórkowa
DMSOSigma AldrichD2650Do rozcieńczania i kontroli związków
DPBSGibco14190Hodowla komórkowa
Surowica bydlęcapłodu Seradigm89510-194Hodowla komórkowa
HEK293 Stabilna linia komórkowa LgBiTPromegaN2672Do uzupełnienia HiBiT w celu wytworzenia luminescencji
HiBiT CRISPR linia komórkowa ssakówPromegahttps://www.promega.com/crispr-tpd
Roztwór higromycyny BGibco10-687-010Hodowla komórkowa
LgBiT BacMamPromega CS1956C01Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji
Wektor ekspresji LgBiTPromegaN2681Do uzupełnienia HiBiT w celu wygenerowania luminescencji
Czytnikpłytek luminometruLuminomenter zdolny do pomiaru luminescencji i fluorescencji (np. GloMax Discover System, Promega GM3000)
NanoGlo Endurazine Żywysubstrat Odczynnik kinetyczny PromegaN2570
NanoGlo Vivazine Żywy substrat Odczynnikkinetyczny PromegaN2580
NanoGlo HiBiT Lytic System detekcjiPromegaN3030Enpoint litycznie HiBiT
Opti-MEM Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowej (ThermoFisher)ThermoFisher11058-021Hodowla komórkowa
Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 96-dołkowaCostar3917Hodowla komórkowa
Płytki do hodowli tkankowych, białe, płytka 384-dołkowaCorning3570Hodowla komórkowa
Trypsyna/EDTAGibco25300Hodowla komórkowa
HiBiT

Bibliografia

  1. Burslem, G. M., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras as therapeutics and tools for biological discovery. Cell. 181 (1), 102-114 (2020).
  2. Chamberlain, P. P., Hamann, L. G. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nature Chemical Biology. 15 (10), 937-944 (2019).
  3. Churcher, I. Protac-induced protein degradation in drug discovery: Breaking the rules or just making new ones. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 444-452 (2018).
  4. Ciulli, A., Farnaby, W. Protein degradation for drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 1-3 (2019).
  5. Crews, C. M. Inducing protein degradation as a therapeutic strategy. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 403-404 (2018).
  6. Cromm, P. M., Crews, C. M. Targeted protein degradation: from chemical biology to Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1181-1190 (2017).
  7. Deshaies, R. J. Protein degradation: Prime time for PROTACs. Nature Chemical Biology. 11 (9), 634-635 (2015).
  8. Lai, A. C., Crews, C. M. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 101-114 (2017).
  9. Ottis, P., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras: Induced protein degradation as a therapeutic strategy. ACS Chemical Biology. 12 (4), 892-898 (2017).
  10. Wu, T., et al. Targeted protein degradation as a powerful research tool in basic biology and drug target discovery. Nature Structural and Molecular Biology. 27, 605-614 (2020).
  11. Hanan, E. J., et al. Monomeric targeted protein degraders. Journal of Medicinal Chemistry. , (2020).
  12. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  13. Carmony, K. C., Kim, K. B. PROTAC-induced proteolytic targeting. Methods in Molecular Biology. 832, 627-638 (2012).
  14. Daniels, D. L., Riching, K. M., Urh, M. Monitoring and deciphering protein degradation pathways inside cells. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 61-68 (2019).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An emerging targeting technique for protein degradation in drug discovery. Bioessays. 40 (4), 1700247(2018).
  16. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology and Therapy. 174, 138-144 (2017).
  17. Raina, K., Crews, C. M. Targeted protein knockdown using small molecule degraders. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 46-53 (2017).
  18. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  19. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  20. Schwinn, M. K., Steffen, L. S., Zimmerman, K., Wood, K. V., Machleidt, T. A simple and scalable strategy for analysis of endogenous protein dynamics. Science Reports. 10 (1), 8953(2020).
  21. Bensimon, A., et al. Targeted degradation of SLC transporters reveals amenability of multi-pass transmembrane proteins to ligand-induced proteolysis. Cell Chemical Biology. 27 (6), 728-739 (2020).
  22. Bondeson, D. P., et al. Lessons in PROTAC design from selective degradation with a promiscuous warhead. Cell Chemical Biology. 25 (1), 78-87 (2018).
  23. Buckley, D. L., et al. HaloPROTACS: Use of small molecule PROTACs to induce degradation of HaloTag fusion proteins. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1831-1837 (2015).
  24. Bulatov, E., Ciulli, A. Targeting Cullin-RING E3 ubiquitin ligases for drug discovery: structure, assembly and small-molecule modulation. Biochemical Journal. 467 (3), 365-386 (2015).
  25. Burslem, G. M., et al. The advantages of targeted protein degradation over inhibition: An RTK case study. Cell Chemical Biology. 25 (1), 67-77 (2018).
  26. Chamberlain, P. P., et al. Evolution of cereblon-mediated protein degradation as a therapeutic modality. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (12), 1592-1602 (2019).
  27. Crew, A. P., et al. Identification and characterization of Von Hippel-Lindau-recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 583-598 (2018).
  28. DeMars, K. M., Yang, C., Castro-Rivera, C. I., Candelario-Jalil, E. Selective degradation of BET proteins with dBET1, a proteolysis-targeting chimera, potently reduces pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-activated microglia. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (1), 410-415 (2018).
  29. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  30. Farnaby, W., et al. BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nature Chemical Biology. 15 (7), 672-680 (2019).
  31. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  32. Gechijian, L. N., et al. Functional TRIM24 degrader via conjugation of ineffectual bromodomain and VHL ligands. Nature Chemical Biology. 14 (4), 405-412 (2018).
  33. Gustafson, J. L., et al. Small-Molecule-Mediated Degradation of the Androgen Receptor through Hydrophobic Tagging. Angewandte Chemie International Edition England. 54 (33), 9659-9662 (2015).
  34. Kerres, N., et al. Chemically induced degradation of the oncogenic transcription factor BCL6. Cell Reports. 20 (12), 2860-2875 (2017).
  35. Lohbeck, J., Miller, A. K. Practical synthesis of a phthalimide-based Cereblon ligand to enable PROTAC development. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 26 (21), 5260-5262 (2016).
  36. Lu, J., et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4. Chemical Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  37. Lu, M., et al. Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway. Eurupean Journal of Medicinal Chemistry. 146, 251-259 (2018).
  38. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  39. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14, 706-714 (2018).
  40. Powell, C. E., et al. Chemically induced degradation of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (9), 4249-4255 (2018).
  41. Raina, K., et al. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (26), 7124-7129 (2016).
  42. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceeding National Academy Science. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  43. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular Cell Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  44. Schiedel, M., et al. Chemically induced degradation of Sirtuin 2 (Sirt2) by a proteolysis targeting chimera (PROTAC) based on sirtuin rearranging ligands (SirReals). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 482-491 (2018).
  45. Slabicki, M., et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature. , (2020).
  46. Smith, B. E., et al. Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase. Nature Communications. 10 (1), 131(2019).
  47. Sun, B., et al. BET protein proteolysis targeting chimera (PROTAC) exerts potent lethal activity against mantle cell lymphoma cells. Leukemia. 32 (2), 343-352 (2018).
  48. Tong, B., et al. A Nimbolide-based kinase degrader preferentially degrades oncogenic BCR-ABL. ACS Chemical Biology. 15 (7), 1788-1794 (2020).
  49. Winter, G. E., et al. Drug Development. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  50. Winter, G. E., et al. BET Bromodomain proteins function as master transcription elongation factors independent of CDK9 recruitment. Molecular Cell. 67 (1), 5-18 (2017).
  51. Zengerle, M., Chan, K. H., Ciulli, A. Selective Small Molecule Induced Degradation of the BET Bromodomain Protein BRD4. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1770-1777 (2015).
  52. Zhang, C., et al. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) of anaplastic lymphoma kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  53. Zoppi, V., et al. Iterative design and optimization of initially inactive proteolysis targeting chimeras (PROTACs) identify VZ185 as a potent, fast, and selective von Hippel-Lindau (VHL) based dual degrader probe of BRD9 and BRD7. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (2), 699-726 (2019).
  54. Huang, H. T., et al. A chemoproteomic approach to query the degradable kinome using a multi-kinase degrader. Cell Chemical Biology. 25 (1), 88-99 (2018).
  55. Bjorklund, C. C., et al. Iberdomide (CC-220) is a potent cereblon E3 ligase modulator with antitumor and immunostimulatory activities in lenalidomide- and pomalidomide-resistant multiple myeloma cells with dysregulated CRBN. Leukemia. 34 (4), 1197-1201 (2020).
  56. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  57. Matyskiela, M. E., et al. A cereblon modulator (CC-220) with improved degradation of Ikaros and Aiolos. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 535-542 (2018).
  58. Bussiere, D. E., et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex. Nature Chemical Biology. 16 (1), 15-23 (2020).
  59. Du, X., et al. Structural basis and kinetic pathway of RBM39 recruitment to DCAF15 by a sulfonamide molecular glue E7820. Structure. 27 (11), 1625-1633 (2019).
  60. Ting, T. C., et al. Aryl sulfonamides degrade RBM39 and RBM23 by recruitment to CRL4-DCAF15. Cell Reports. 29 (6), 1499-1510 (2019).
  61. Hughes, S. J., Ciulli, A. Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays in Biochemistry. 61 (5), 505-516 (2017).
  62. Schapira, M., Calabrese, M. F., Bullock, A. N., Crews, C. M. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nature Review Drug Discovery. 18 (12), 949-963 (2019).
  63. Dixon, A. S., et al. NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  64. Gilan, O., et al. Selective targeting of BD1 and BD2 of the BET proteins in cancer and immuno-inflammation. Science. 368 (6489), 387-394 (2020).
  65. Oh-Hashi, K., Furuta, E., Fujimura, K., Hirata, Y. Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells. Biochemical Biophysical Report. 12, 40-45 (2017).
  66. Ottis, P., et al. Cellular resistance mechanisms to targeted protein degradation converge toward impairment of the engaged ubiquitin transfer pathway. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2215-2223 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

zwi zki PROTACkleje molekularneznakowanie endogennedetekcja luminescencyjnakinetyczna analiza degradacjiprofilowanie odpowiedzi na dawkmultipleksowa ocena ywotno ci kom rektechnologia NanoBRET

Powiązane artykuły