Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Streszczenie

Zmiany w lokalizacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i jego efektora RAS w błonie komórkowej są związane z wieloma chorobami, w tym z rakiem. Wolno żyjący nicień C. elegans posiada ewolucyjną i funkcjonalnie zachowaną kaskadę sygnałową EGFR-RAS-ERK MAP, która ma kluczowe znaczenie dla rozwoju sromu. Mutacje wzmocnienia funkcji w homologu RAS LET-60 i homologu EGFR LET-23 indukują wytwarzanie widocznego, niefunkcjonalnego ektopowego sromu rzekomego wzdłuż brzusznej ściany ciała tych robaków. Wcześniej wykazano, że fenotyp wielosromu (Muv) u tych robaków jest hamowany przez małe cząsteczki chemiczne. W tym miejscu opisujemy protokół użycia robaka w teście na bazie płynu w celu identyfikacji inhibitorów, które znoszą aktywność białek EGFR i RAS. Korzystając z tego testu, pokazujemy, że R-fendylina, pośredni inhibitor K-RAS, hamuje fenotyp Muv wyrażony w zmutowanych robakach let-60 (n1046) i let-23 (sa62). Test jest prosty, niedrogi, nie jest czasochłonny w konfiguracji i może być wykorzystany jako wstępna platforma do odkrycia terapii przeciwnowotworowych.

Wprowadzenie

Szlaki komórkowe, które regulują procesy rozwojowe w organizmach, są wysoce zachowane wśród wszystkich metazoan. Jednym z takich szlaków jest kaskada sygnalizacyjna kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) EGFR-RAS-ERK, która jest krytycznym szlakiem regulującym proliferację, różnicowanie, migrację i przeżycie komórek^1,2. Defekty w tym szlaku sygnałowym mogą prowadzić do stanów patologicznych lub chorobowych, takich jak rak. Wykazano, że receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) ulega silnej ekspresji w ludzkich nowotworach, w tym w 50% raków płaskonabłonkowych jamy ustnej, i przyczynia się do rozwoju nowotworów złośliwych^3,4,5. Natomiast mutacje w trzech izoformach RAS, H-, K i N-RAS, są głównymi czynnikami powodującymi złośliwe przemiany w wielu nowotworach u ludzi. Spośród tych trzech izoform RAS, mutacje onkogenne w K-RAS są najbardziej rozpowszechnione^6,7,8. Aby EGFR i RAS działały, muszą zlokalizować się w błonie komórkowej (PM). Zapobieganie lokalizacji tych cząsteczek w PM może całkowicie znieść aktywność biologiczną tego szlaku sygnałowego^9,10. W związku z tym hamowanie lokalizacji tych białek w PM jest strategią terapeutyczną mającą na celu zablokowanie dalszej sygnalizacji i wynikających z niej niekorzystnych wyników. Za pomocą testu przesiewowego o wysokiej zawartości fendyliny, blokera kanału wapniowego typu L, zidentyfikowano jako inhibitor aktywności K-RAS¹¹. Nanogrupowanie K-RAS do wewnętrznej ulotki PM jest znacznie zmniejszone w obecności fendyliny. Ponadto K-RAS jest redystrybuowany z błony plazmatycznej do retikulum endoplazmatycznego (ER), aparatu Golgiego, endosomów i cytozolu. Co ważniejsze, proliferacja linii komórkowych raka trzustki, okrężnicy, płuc i endometrium wykazujących ekspresję onkogennego mutanta K-RAS jest blokowana przez hamowanie dalszej sygnalizacji przez fendiline¹¹. Dane te sugerują, że fendylina funkcjonuje jako specyficzny lek przeciwnowotworowy K-RAS, który powoduje nieprawidłową lokalizację białka RAS w PM.

Nicień Caenorhabditis elegans został dokładnie przebadany w kontekście rozwoju. Wiele ścieżek sygnałowych, które rządzą rozwojem robaka, jest ewolucyjnych i funkcjonalnie zachowanych. Na przykład, aktywacja RAS za pośrednictwem EGFR i następująca po niej aktywacja kaskady sygnałów ERK MAPK są zachowane w worm¹². Kaskada jest reprezentowana przez następujące białka: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 jest homologiczny do RAS, podczas gdy LET-23 jest homologiczny do EGFR. U robaka szlak ten reguluje rozwój sromu¹³. Srom to otwór nabłonkowy na brzusznej ścianie ciała robaka, który umożliwia składanie zapłodnionych jaj. Tworzenie się sromu u robaka zależy od ekspozycji komórek prekursorowych sromu (VPC) na gradient aktywacji kaskady sygnałowej EGFR-RAS-MAPK. Podczas normalnego rozwoju proksymalne VPC otrzymują silne sygnały z komórek kotwiczących gonad, aby różnicować się w losy komórek 1° i 2°, które dają początek funkcjonalnemu sromowi¹². Natomiast dystalne VPC różnicują się w losy komórek 3°, które łączą się z syncytium podskórnym i nie tworzą sromu z powodu zubożonej sygnalizacji. W przypadku braku sygnalizacji wszystkie VPC różnicują się w losy komórek 3°, co prowadzi do braku sromu. Jednak sygnalizacja konstytutywna prowadzi do powstania jednego lub więcej niefunkcjonalnych sromów w wyniku indukcji wszystkich VPC do przyjmowania losów komórek 1° i 2°.

Mutacje, które powodują wadliwą lub nadmierną indukcję sromu, zostały zidentyfikowane dla wielu genów kodujących białka reprezentujące ten szlak. Wadliwa indukcja sromu skutkuje fenotypem bezsromowym (Vul), podczas gdy nadmierna indukcja sromu powoduje fenotyp wielosromowy (Muv), który jest reprezentowany przez rozwój licznych niefunkcjonalnych ektopowych pseudosromów w całej brzusznej ścianie ciała. Fenotyp Muv wyrażony przez szczep let-60 (n1046) jest spowodowany mutacją wzmocnienia funkcji w RAS, podczas gdy w szczepie let-23 (sa62) jest spowodowany mutacją aktywującą w EGFR^14,15. Wykazano, że silny fenotyp Muv w tych zmutowanych szczepach jest zaburzony przez interwencje farmakologiczne, jak wykazano w leczeniu robaków let-60 (n1046) inhibitorem MEK-1 U0126^16,17. Co ciekawe, wykazaliśmy, że R-fendylina i inhibitory wpływające na metabolizm sfingomieliny hamują fenotyp Muv u robaka¹⁸. Aby zademonstrować, że te inhibitory blokują sygnalizację let-60 na poziomie RAS, wykorzystano szczep zerowy lin-1¹⁷. Lin-1 jest hamującym czynnikiem transkrypcyjnym podobnym do Ets, który działa jako represor w rozwoju sromu¹⁹. Silna rewersja fenotypu Muv u robaków let-60(n1046) i brak wpływu na robaki zerowe lin-1 sugerują, że hamowania te występują na poziomie RAS.

W tym protokole demonstrujemy użycie C. elegans jako modelu do identyfikacji inhibitorów białek RAS i EGFR. Korzystając z testu na bazie cieczy, wykazujemy hamujące działanie R-fendyliny poprzez tłumienie fenotypów Muv w zmutowanych szczepach let-60 (n1046) i let-23 (sa62) C. elegans. Test ten potwierdza zastosowanie C. elegans jako narzędzia w początkowej fazie odkrywania leków przeciwnowotworowych.

Protokół

1. Przygotowanie płytki z podłożem do wzrostu nicieni (NGM)

1. Dodać 2,5 g peptonu i 3 g NaCl do 970 ml wody dejonizowanej znajdującej się w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 l. Wymieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie dodać 20 g agaru do kolby. Zawartość kolby należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 15 funtów/^cal2 przez 30 minut. Po sterylizacji umieścić kolbę na płytce mieszającej i pozostawić pożywkę do ostygnięcia, aż temperatura osiągnie 50 °C.
2. Aby przygotować płytki NGM, dodać następujące odczynniki do schłodzonego podłoża: 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH = 6,0), 1 ml 1 M_MgSO4, 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml (5 mg/ml w 95% etanolu) cholesterolu, 1 ml (10% m/w etanolu) nystatyny, i 1 ml streptomycyny w stężeniu 25 mg/ml.
3. Pod przepływem laminarnym wlać schłodzone podłoże do sterylnych szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm. Pozwól talerzom zastygnąć przez 2 godziny. Płytki te można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.

2. Rozmnażanie C. elegans

1. Umieść 100 μl wyhodowanej przez noc E. coli OP50 na środku każdej płytki NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia przez 24 godziny w okapie laminarnym. Następnie płyty można przechowywać w pojemniku styropianowym.
   UWAGA: Kultura E. coli OP50 jest uprawiana na pożywce Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C przed wysiewem płytek. Kultura może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1–2 miesiące i używana do okresowego wysiewu talerzy.
2. Za pomocą sterylnego kilofa do robaków zbierz 10–12 ciężarnych dorosłych robaków z wcześniej wyhodowanej płytki pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieść te robaki na świeżą płytkę NGM z wysianą E. coli OP50 i inkubować szalkę przez 24 godziny w temperaturze 20 °C.
3. Po 24 godzinach za pomocą sterylnego wykałacza do robaków należy usunąć dorosłe robaki z płytek. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez ~ 3 dni. Zarodki rozwiną się w grawitacyjne dorosłe robaki.

3. Przygotowanie synchronicznej kultury C. elegans

1. Zebrać dorosłe robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, myjąc 2–4 płytki M9W.
   1. Przygotowanie M9W: Rozpuścić 5 g NaCl, 6 g Na₂HPO₄ i 3 g KH₂PO₄ w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 L. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 lb/in² przez 30 min. Do schłodzonego roztworu dodać 1 ml 1 M_MgSO4
   .
2. Osadzać robaki przez odwirowanie probówki o stężeniu 450 x g przez 1 min. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu robaka.
3. Przygotuj roztwór do lizy robaków, łącząc 400 μl 8,25% podchlorynu sodu (wybielacz domowy) i 100 μl 5 N NaOH. Dodaj ten roztwór do osadu robaka i przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość probówki. Zapobiegaj nadmiernemu bieleniu zarodków w probówce, obserwując lizę robaków pod mikroskopem preparacyjnym
.
4. Dodaj 10 ml M9W do stożkowej probówki, aby rozcieńczyć mieszaninę do lizy, gdy 70% dorosłych robaków uległo lizie.
5. Odwirować probówkę o sile 450 x g przez 1 minutę. Zastąp supernatant 10 ml M9W.
6. Powtórz krok 3.5 dwa razy.
7. Po zakończeniu etapów mycia dodaj 3–5 ml M9W, aby ponownie zawiesić osad jajeczny. Obracaj rurkę przez noc z prędkością 18 obr./min na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej (RT).
8. Po całonocnej inkubacji wyjąć probówkę z rotatora, osadzać larwy L1 przez odwirowanie probówki przy 450 x g przez 1 min. Zassać M9W, aż w probówce pozostanie 250 μl.
9. Potrząśnij rurką, aby ponownie zawiesić larwy. Dodać trzy krople o pojemności 5 μl zawierające larwy na pokrywkę szalki Petriego. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz liczbę robaków w każdej kropli i określ liczbę robaków w 1 μl.

4. Przygotowanie testów leków

UWAGA: Kroki w tym teście są pokazane w Rysunek 1.

1. Hodować 30 ml E. coli OP50 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C przez noc w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min.
2. Wirować wyhodowaną przez noc kulturę E. coli OP50 przy 4,000 x g przez 10 minut, aby zagnieździć komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml M9W w celu zagęszczenia kultury.
3. Przed przygotowaniem roztworów roboczych do testu leku należy dodać 0,1 ml (5 mg/ml w 95% etanolu) cholesterolu do 100 ml M9W.
4. Przygotować roztwory robocze każdego eksperymentalnego leku, rozcieńczając każdy lek wraz z nośnikiem (dimetylosulfotlenek; DMSO) w 4,8 ml M9W uzupełniony cholesterolem w celu uzyskania odpowiednich stężeń. Rozpuść DMSO w 4,8 ml M9W uzupełnionym cholesterolem, aby przygotować kontrolę pojazdu.
5. Dodać 200 μl skoncentrowanej kultury E. coli OP50 do każdej probówki zawierającej kontrolę nośnika lub probówki wirowe, aby upewnić się, że są wymieszane.
6. Aby przeprowadzić eksperyment, dodaj 2 ml każdego roztworu leku roboczego lub kontrolnego nośnika do każdego dołka w 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Przetestuj każde stężenie leku i kontrolę nośnika w dwóch egzemplarzach.
7. Dodać ~100 larw L1 na studzienkę (patrz etapy synchronicznej hodowli C. elegans) za pomocą sterylnej mikropipety. Ogranicz objętość robaków do 10 μl.
8. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C.
9. W razie potrzeby uzupełnij studzienki 50 μl 10x skoncentrowanej E. coli OP50 w 3. dniu testu.

5. Preparat z agarozy do mikroskopii

1. Przygotuj 2% w/v roztwór agarozy, rozpuszczając 0,1 g agarozy w 5 ml wody dejonizowanej. Podgrzej zawartość w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Z 5 ml roztworu agarozy można przygotować 20 szkiełek.
2. Umieść paski taśmy laboratoryjnej wzdłuż dwóch szklanych szkiełek. Taśma będzie pełniła rolę przekładek ograniczających grubość podkładek agarozowych. Następnie umieść trzecie czyste szkiełko między zaklejonymi taśmą szkiełkami.
3. Aby zrobić podkładkę agarozową, umieść 100 μl stopionej agarozy na środku czystego szkiełka. Umieść kolejne czyste szkiełko w poprzek i na wierzchu agarozy i delikatnie dociśnij, aby utworzyć podkładkę. Zdejmij górny suwak, gdy podkładka zastygnie.

6. Obserwacja fenotypu Muv w szczepach let-60, let-23 i lin-1

UWAGA: Tylko potencjalne leki, które hamują fenotypy Muv w szczepach let-23 i let-60, będą badane przy użyciu szczepu lin-1 w celu określenia, czy zahamowanie występuje na poziomie RAS czy EGFR.

1. Po osiągnięciu odpowiedniego etapu cyklu życiowego (3 dni dla szczepów let-60 i let-23, 5 dni dla szczepu lin-1), należy wyjąć płytki z inkubatora i zebrać robaki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml za pomocą pipety.
2. Odwirować probówki o sile 450 x g przez 1 minutę. Usunąć M9W bez naruszania osadu robaka i dodać 5 ml świeżego M9W.
3. Powtórz krok 6.2 dwa razy.
4. Nie naruszając granulki robaka, usuń wszystkie pozostałe M9W przez aspirację. Następnie dodać 500 μl 2 mM azydku sodu lub 2 mM chlorowodorku tetraizolu. Pozostaw probówki do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. 2 mM azydku sodu lub 2 mM chlorowodorku tetramizolu znieczuli robaki do obrazowania.
   UWAGA: Upewnij się, że nosisz środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z azydkiem sodu. Roztwór należy przygotować pod maską chemiczną.
5. Dodać 10 μl znieczulonej zawiesiny ślimakowej na środek podkładki agarozowej. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe #1.5 na zawiesinie ślimaka. W razie potrzeby przymocuj szkiełko nakrywkowe odrobiną lakieru do paznokci, aby zapobiec wysychaniu.
6. Użyj mikroskopu DIC, aby obserwować szczepy let-60(n1046), let-23(sa62) i lin-1(sy254). Wyobraź sobie robaki w powiększeniach 10x i 20x.
7. W przypadku let-60(n1046) i let-23(sa62) oceń dorosłe robaki na podstawie obecności lub braku fenotypu Muv. Natomiast w przypadku szczepu lin-1 należy policzyć liczbę VPC, które przyjęły losy komórek 1° lub 2° po brzusznej stronie larw L4, za pomocą mikroskopu DIC o wysokiej rozdzielczości.
8. Po nacięciu mikrofotografii dla każdego szczepu i leczenia farmakologicznego, wykonaj test t Studenta, aby określić różnice statystyczne między terapiami.

Wyniki

W pierwszej kolejności wykazaliśmy, że R-fendilina jest w stanie zahamować fenotyp Muv w szczepie mutantów let-60(n1046) w porównaniu do nicieni traktowanych DMSO. Nasze dane pokazują, że R-fendilina blokuje fenotyp Muv w let-60(n1046) w sposób zależny od dawki (Rycina 2A,B). Jednak w szczepie mutantów null lin-1 zaobserwowano brak odwrócenia fenotypu Muv w odpowiedzi na zwiększające się stężenia R-fendiliny (Rycina 2B...

Dyskusja

Testy, które opisujemy przy użyciu robaka, są proste i niedrogie do zidentyfikowania inhibitorów funkcji EGFR i RAS. C. elegans jest atrakcyjnym modelem do odkrywania leków, ponieważ jest łatwy w hodowli w laboratorium ze względu na krótki cykl życia (3 dni w temperaturze 20 °C) i zdolność do generowania dużej liczby larw. Co ważniejsze, szlak EGFR-RAS-ERK MAPK jest ewolucyjnie i funkcjonalnie zachowany, a ssaki zapewniają genetycznie podatny system do analizy wpływu inhibitorów EGFR i RAS. Co więcej, przezroczy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Media i chemikalia
Agaroza	Millipore Sigma	A9539-50G
Pepton baktowy	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Bulion	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Chlorek wapnia	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Siarczan magnezu	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatyna	Acros organiczna
Fosforan potasu dwuzasadowy	Fisher Scientific	BP363-500
Fosforan potasu jednozasadowy	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendylina			komercyjnie syntetyzowana (klasa farmaceutyczna)
Azydek sodu	Millipore Sigma	S2002-25G
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-1
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	SS266-1
8,25% podchloryn sodu			Wybielacz
Fosforan sodu dwuzasadowy	Fisher Scientific	BP332-500
Siarczan streptomycyny	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Chlorowodorek tetramizolu	Millipore Sigma	L9756
UO126 (inhibitor MEK)	Millipore Sigma	19-147
materiały eksploatacyjne
15mL stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu	Fisher Scientific	12-565-269
50 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe	Fisher Scientific	12-565-271
Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 10 ml	Fisher Scientific	07-200-574
Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 25 ml	Fisher Scientific	07-200-575
Nr 1,5  18 mm X 18 mm Szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12-541A
Szalka Petriego z przezroczystą pokrywką (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Szkiełka mikroskopowe ze zwykłego szkła (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Szczepy bakteryjne
E. coli OP50
Worm Szczepy
Szczep	Genotyp	Transgene<	strong>Źródło
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC

AC455500050