Artykuł metodologiczny

Jednoetapowe przygotowanie próbki wspomagane nośnikiem do ukierunkowanej analizy proteomicznej niewielkiej liczby komórek ludzkich

DOI:

10.3791/61797

⸱

6 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2NHC Key Laboratory of Cancer Proteomics, Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, 3Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 4Department of Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie jednogarnkowej próbki wspomaganej nośnikiem białka w połączeniu z chromatografią cieczową (LC) - monitorowanie wybranych reakcji (SRM) określane jako cLC-SRM jest wygodną metodą do multipleksowanej ukierunkowanej analizy proteomicznej małych liczb komórek, w tym pojedynczych komórek. Wykorzystuje on wykorzystanie nadmiaru białka egzogennego jako nośnika i LC-SRM o wysokiej specyficzności do ukierunkowanej oceny ilościowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza białek w małej liczbie komórek ludzkich jest przede wszystkim osiągana za pomocą ukierunkowanej proteomiki z testami immunologicznymi opartymi na przeciwciałach, które mają nieodłączne ograniczenia (np. niski multipleks i niedostępność przeciwciał dla nowych białek). Ukierunkowana proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) pojawiła się jako alternatywa, ponieważ jest wolna od przeciwciał, ma wysoki multipleks oraz wysoką swoistość i dokładność ilościową. Najnowsze postępy w oprzyrządowaniu do leczenia stwardnienia rozsianego umożliwiają ukierunkowaną proteomikę opartą na stwardnieniu rozsianym w celu multipleksowanej kwantyfikacji bardzo obfitych białek w pojedynczych komórkach. Istnieje jednak wyzwanie techniczne związane z efektywnym przetwarzaniem pojedynczych komórek przy minimalnych stratach próbki do analizy SM. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy niedawno wygodne, wspomagane nośnikiem białkowe przygotowanie próbki w jednym garnku w połączeniu z chromatografią cieczową (LC) - monitorowanie wybranych reakcji (SRM) określane jako cLC-SRM do ukierunkowanej analizy proteomicznej niewielkiej liczby komórek ludzkich. Metoda ta wykorzystuje połączone nadmierne białko egzogenne jako nośnik i jednogarnkowe przetwarzanie o małej objętości w celu znacznego zmniejszenia strat adsorpcji powierzchniowej, a także LC-SRM o wysokiej specyficzności, aby skutecznie rozwiązać zwiększony zakres stężeń dynamicznych spowodowany dodaniem egzogennego białka nośnikowego. Jego użyteczność została wykazana przez dokładne oznaczanie ilościowe większości umiarkowanie obfitych białek w małej liczbie komórek (np. 10-100 komórek) i bardzo obfitych białek w pojedynczych komórkach. Łatwe do wdrożenia funkcje i brak konieczności stosowania specjalnych urządzeń sprawiają, że metoda ta jest łatwo dostępna dla większości laboratoriów proteomicznych. W niniejszym dokumencie przedstawiliśmy szczegółowy protokół analizy cLC-SRM niewielkiej liczby komórek ludzkich, w tym sortowania komórek, lizy i trawienia komórek, analizy LC-SRM i analizy danych. Konieczna jest dalsza poprawa czułości wykrywania i przepustowości próbek w kierunku ukierunkowanej analizy proteomicznej pojedynczych komórek. Przewidujemy, że cLC-SRM znajdzie szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych i biologii systemowej, z potencjałem ułatwiającym medycynę precyzyjną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najnowsze osiągnięcia technologiczne w genomice (transkryptomice) pozwalają na wszechstronną i precyzyjną analizę genomu (transkryptomu) w pojedynczych komórkach1,2,3. Jednak technologie proteomiki pojedynczej komórki pozostają daleko w tyle, ale są tak samo ważne jak technologie genomiki (transkryptomiki)4,5,6,7,8. Co więcej, obfitość białek niekoniecznie może być wywnioskowana z obfitości mRNA9, a proteom jest bardziej złożony i dynamiczny niż transkryptom10. Biorąc pod uwagę te wyzwania, duża liczba mieszanych populacji komórek (tj. komórek masowych) jest zwykle używana do generowania kompleksowych danych proteomowych11,12,13. Jednak takie masowe pomiary uśredniają stochastyczne zmiany poszczególnych komórek, zasłaniając w ten sposób ważną zmienność między komórkami (tj. niejednorodność komórek)4,14. Ograniczenia takich masowych pomiarów stają się jeszcze bardziej dotkliwe, gdy komórki będące przedmiotem zainteresowania stanowią tylko niewielką część wszystkich populacji komórek (np. rakowe komórki macierzyste w guzach we wczesnym stadium raka). W związku z tym istnieje ogromna luka w wiedzy między proteomiką pojedynczej komórki a genomiką (transkryptomiką).

Testy immunologiczne oparte na przeciwciałach (np. cytometria przepływowa lub masowa) są głównie używane do ukierunkowanej analizy proteomicznej pojedynczych komórek6,7,15,16,17,18. Cierpią jednak z powodu niskiego multipleksu, ograniczonej swoistości i niedostępności przeciwciał dla nowych białek będących przedmiotem zainteresowania. Ukierunkowana proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) stała się alternatywą dla dokładnej kwantyfikacji białek ze względu na to, że nie zawiera przeciwciał, ma wysoki multipleks (≥150 białek w jednej analizie19), wysoką dokładność ilościową (ilości bezwzględne lub stężenia) oraz wysoką swoistość i odtwarzalność (≤10% CV)20,21,22,23. Niedawny znaczący postęp w przygotowywaniu próbek umożliwił proteomikę jednokomórkową opartą na stwardnieniu rozsianym do analizy ilościowej bardzo obfitych białek z pojedynczych komórek ludzkich. Jednak proteomika jednokomórkowa oparta na stwardnieniu rozsianym jest wciąż we wczesnym stadium niemowlęcym. Na przykład najbardziej zaawansowana platforma MS w połączeniu z natężeniami przepływu RPLC o bardzo niskim przepływie może pozwolić na bezznacznikowe wykrywanie i kwantyfikację MS tylko ~670-870 białek z całkowitej liczby ≥12 000 białek w pojedynczych komórkach HeLa24,25.

Obecnie dostępnych jest sześć podejść do proteomiki pojedynczych komórek opartych na MS do analizy pojedynczych komórek ssaków, z czego cztery są przeznaczone do globalnej proteomiki (nanoPOTS: nanowell-based Preparation in One pot for Trace Samples26; iPAD-1: zintegrowane urządzenie do analizy pojedynczych komórek27; Analiza proteomiczna pojedynczych komórek oparta na chipie OAD (oil-air-droplet)28; SCoPE-MS: proteomika pojedynczych komórek metodą spektrometrii mas29), a pozostałe dwie są przeznaczone do proteomiki celowanej (cLC-SRM: chromatografia cieczowa wspomagana nośnikiem (LC) - monitorowanie wybranych reakcji (SRM)30; cPRISM-SRM: wysokociśnieniowe separacje o wysokiej rozdzielczości z inteligentnym wyborem i multipleksowaniem wspomagane nośnikiem sprzężone z SRM31). Jednak wszystkie te podejścia mają wady techniczne. nanoPOTS, iPAD-1 i OAD zmniejszają objętość przetwarzania próbek do 2-200 nL i nie są gotowe do szerokich zastosowań laboratoryjnych26,27,28. W przypadku SCoPE-MS nośnik TMT (tandem mass tag) jest dodawany po przetwarzaniu pojedynczej komórki, więc nie może skutecznie zapobiec stratom adsorpcji powierzchniowej podczas przetwarzania próbki, gdy do przetwarzania pojedynczej komórki używana jest pojedyncza probówka29, co skutkuje niską odtwarzalnością przy współczynniku korelacji wynoszącym zaledwie ~0,2-0,4 między powtórzeniami32. W przypadku cLC-SRM i cPRISM-SRM stosowanie białek egzogennych jako nośnika jest bardziej odpowiednie dla ukierunkowanej proteomiki, ponieważ peptydy z nadmiernej ilości białek egzogennych są często sekwencjonowane przez MS/MS, co znacznie zmniejsza szansę na sekwencjonowanie mało obfitych peptydów endogennych30,31. W przeciwieństwie do globalnej proteomiki do względnej kwantyfikacji, dwa ukierunkowane podejścia proteomiczne mogą zapewnić dokładną lub bezwzględną analizę białek w niewielkiej liczbie komórek z wysoką odtwarzalnością przy użyciu ciężkich wzorców wewnętrznych znakowanych izotopami w znanych stężeniach. W porównaniu z cPRISM-SRM, który wymaga wcześniejszego frakcjonowania PRISM w wysokiej rozdzielczości, co skutkuje wieloma próbkami frakcji, które muszą być analizowane, cLC-SRM ma znaczną przewagę w przepustowości próbek bez frakcjonowania i może jednocześnie oznaczać ilościowo setki białek w jednej analizie, ale ze stosunkowo niższą czułością wykrywania30. Dlatego cLC-SRM jest bardziej dostępny i powinien mieć szersze narzędzia do dokładnej multipleksowanej analizy białek małej liczby komórek, a także próbek o ograniczonej masie.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół do wykonywania cLC-SRM dla wygodnej ukierunkowanej analizy proteomicznej małych liczb komórek ludzkich, w tym pojedynczych komórek. Protokół składa się z następujących głównych kroków: sortowanie komórek za pomocą FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją), liza i trawienie komórek przetwarzane w probówkach do reakcji łańcuchowej (PCR) z pojedynczą polimerazą o małej objętości, zbieranie danych LC-SRM oraz analiza danych SRM przy użyciu publicznie dostępnego oprogramowania Skyline (rysunek 1). Jego szerokie zastosowanie zostało wykazane wraz z naszymi wcześniej dobrze znanymi testami SRM poprzez bezwzględną ukierunkowaną kwantyfikację białek szlaku EGFR / MAPK w komórkach 1-100 MCF7 lub MCF10A i określenie kopii białek szlaku na komórkę w szerokim zakresie stężeń dynamicznych30. Przewidujemy, że dzięki szczegółowemu protokołowi większość badaczy proteomiki może z łatwością wdrożyć cLC-SRM w swoich laboratoriach w celu dokładnej analizy białek w ultramałych próbkach (np. rzadkich komórkach nowotworowych), aby spełnić potrzeby projektu.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd wszystkich etapów w cLC-SRM (przygotowaniepróbek w jednym garnku wspomagane przez liquid chromatography -swybrane działanie monitoring). Trawienie lizatu komórkowego innego niż ludzkie (np. Shewanella oneidensis) jest stosowane do wstępnej obróbki probówek PCR w celu pokrycia powierzchni probówki. Niewielka liczba komórek ludzkich lub pojedynczych komórek posortowanych za pomocą FACS jest zbierana do wstępnie poddanych obróbce probówek PCR. Nośnik białka BSA (lub proteomu lizatu komórkowego innego niż ludzki), ciężki wzorzec wewnętrzny (IS) i TFE (lub DDM) są kolejno dodawane do probówek z próbkami w celu ułatwienia lizy komórek i zmniejszenia strat adsorpcji powierzchniowej. Koncepcyjnie połączony DDM i nośnik proteomu lizatu komórkowego innego niż ludzki będzie dobrze działał w przypadku cLC-SRM. Liza komórek odbywa się przez sonikację, a denaturację białek uzyskuje się przez ogrzewanie w wysokiej temperaturze. Odczynniki DTT i IAA są używane odpowiednio do redukcji i alkilowania (ten krok jest opcjonalny). Trypsyna jest dodawana do trawienia ze znacznie wyższymi stosunkami trypsyny w stosunku do ilości białka niż w przypadku standardowego trawienia trypsyny. Zdejmuje się nakrętkę z probówki z próbką, a następnie probówkę PCR wkłada się do fiolki LC w celu bezpośredniej analizy LC-SRM. Zebrane dane SRM są analizowane za pomocą publicznie dostępnego oprogramowania Skyline. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Analiza cLC-SRM krok po kroku jest pokazana w Rysunek 1.

1. Wstępna obróbka probówek PCR

  1. Dodać 100 μl lizatu komórkowego trawionego przez organizmy inne niż ludzkie (np. Shewanella oneidensis) w stężeniu 0,2 μg/μl do probówek PCR. Inkubować w temperaturze pokojowej przez noc, aby pokryć powierzchnię probówki PCR.
  2. Usunąć lizat komórkowy trawiony przez pipetowanie, przepłukać probówki PCR wodą klasy HPLC 3 razy, a następnie wysuszyć probówki PCR na powietrzu w dygestorium.
  3. Powlekane probówki PCR należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Sortowanie FACS

  1. Wyrównaj aktywowany fluorescencją sortownik komórek (FACS) (patrz tabela materiałów) do 96-dołkowej płytki PCR za pomocą koralików fluorescencyjnych z barwnikami, które mogą być wzbudzane przez źródło lasera, aby zapewnić wiarygodne sygnały referencyjne.
  2. Sprawdź, czy maszyna FACS jest dobrze przystosowana do sortowania komórek na dnie płytek PCR.
    1. Ustaw kąt strumienia sortowania na minimum możliwe, aby zmaksymalizować wskaźnik sukcesu, że komórki zostaną posortowane na dnie studzienek, a nie uderzą w boki.
    2. Aby wycelować maszynę, użyj strumienia testowego do "posortowania" kropelek buforu PBS (np. 100 kropel) na zagłębieniu pustej płytki, aby upewnić się, że zebrane kropelki znajdują się na dnie. Jeśli kropelki nie wylądują we właściwej pozycji, ponownie skalibruj sortownik komórek i powtarzaj, aż kropelki w strumieniu sortowania zostaną prawidłowo zebrane.
  3. Umieść powlekane probówki do PCR w 96-dołkowym stojaku na probówki do PCR.
  4. Posortuj żądaną liczbę ludzkich komórek piersi (MCF7 lub MCF10A) do wstępnie powlekanych probówek PCR.
  5. Natychmiast odwirować posortowane komórki piersi w sile 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby utrzymać je na dnie probówki i uniknąć potencjalnej utraty komórek.
  6. Przechowywać posortowane komórki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

3. Dodanie nośnika białkowego, ciężkie wzorce wewnętrzne i TFE

  1. Dodaj 4 μl 25 mM NH4HCO3 do probówek PCR zawierających zebrane komórki.
  2. Dodać 1 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 10 ng/μl w 25 mM NH4HCO3 do probówek z próbkami.
  3. Dodać 0,3 μl 100 fmol/μL surowych wzorców ciężkich peptydów (łącznie 30 fmol) do probówek z próbkami.
    UWAGA: Podwielokrotności surowych wzorców ciężkich peptydów dla białek szlaku EGFR/MAPK wytwarza się przy nominalnym stężeniu 100 fmol/μL w 25 mM NH4HCO3. Dozować niewielką objętość surowych wzorców ciężkich peptydów o stężeniu 100 fmol/μl do środka roztworu i upewnić się, że na końcówce pipety nie pozostały żadne resztki płynu.
  4. Dodać 9 μL 100% TFE do probówek z próbkami o końcowym stężeniu ~60% TFE.
  5. Wirować przy 1500 x g przez 5 minut, a następnie delikatnie wirować przy 100 x g przez 3 minuty.

4. Liza komórek i denaturacja białek

  1. Sonikuj komórki piersi posortowane FACS na lodzie przez 1 minutę w odstępach 1-minutowych, co daje łącznie 5 cykli przy amplitudzie 70% i 0,5 Hz.
  2. Próbki należy inkubować w temperaturze 90 °C przez 1 godzinę w celu denaturacji białek za pomocą termocyklera PCR z opcją podgrzewanej pokrywy.
    UWAGA: TFE jest lotnym rozpuszczalnikiem o temperaturze wrzenia 74 °C, dlatego opcja z podgrzewaną pokrywą jest wybierana tak, aby uniknąć całkowitego wysuszenia i znacznej utraty próbki.
  3. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej z odwirowaniem przy 1500 x g przez 3 minuty.

5. Redukcja i alkilacja (opcjonalnie)

  1. Dodać 0,6 μl 50 mM naziemnej telewizji cyfrowej, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM.
    UWAGA: Roztwór naziemnej telewizji cyfrowej musi być za każdym razem świeżo przygotowany. Odważyć 77,5 mg naziemnej telewizji cyfrowej, a następnie rozpuścić w 1 ml 25 mM NH4HCO3, aby uzyskać 500 mM naziemnej telewizji cyfrowej. 10 μl 500 mM DTT dodaje się następnie do 90 μL 25 mM NH4HCO3, aby uzyskać 50 mM DTT.
  2. Wirować przy 1500 x g przez 5 minut, a następnie delikatnie mieszać przy 850 obr./min przez 3 min.
  3. Inkubować w temperaturze 56°C przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 100 x g.
  4. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i odwirować przy 1500 x g przez 3 minuty.
  5. Dodać 0,5 μL 60 mM IAA do probówki RT-PCR o końcowym stężeniu ~2 mM.
    UWAGA: Roztwór IAA musi być za każdym razem świeżo przygotowany. Odważyć 74,3 mg IAA, a następnie rozpuścić w 1 ml 25 mM NH4HCO3 w celu uzyskania 400 mM IAA. 15 μl 400 mM IAA dodaje się do 85 μl 25 mM NH4HCO3, aby uzyskać 60 mM IAA.
  6. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze 100 x g.
    UWAGA: Etapy redukcji i alkilacji są opcjonalne, gdy dla białek docelowych nie wybrano peptydów zawierających cysteinę.

6.Trawienie trypsyny

  1. Zmniejszyć objętość próbki do ~4 μL za pomocą koncentratora SpeedVac.
    UWAGA: TFE jest lotnym rozpuszczalnikiem o temperaturze wrzenia 74°C. Wysoki procent TFE hamuje trawienie trypsyny.
  2. Dodać 9 μl 25 mM NH4HCO3 i 1-3 μL 15 ng/μL trypsyny do trawienia przy końcowym stężeniu trypsyny 1-3 ng/μL.
    UWAGA: Dla 10 ludzkich komórek piersi sortowanych przez FACS (~ 1 ng) stosunek enzymu trypsyny do białka jest ≥15:1, 750 razy wyższy niż w standardowym trawieniu trypsyny (stosunek 1:50).
  3. Mieszać delikatnie w 100 x g przez 3 minuty i inkubować przez noc (~16 godzin) w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 0,5 μl 5% kwasu mrówkowego, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
  5. Wirować przez 1 godzinę przy 1500 x g.
  6. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy LC-SRM lub w zamrażarce w temperaturze 4 °C do natychmiastowej analizy.

7. Przygotowanie do bezpośredniej analizy LC-SRM

  1. Zdejmij nakrętkę z probówki PCR, która była używana do pobierania (Krok 2) i przetwarzania (Krok 6) komórek piersi posortowanych metodą FACS.
  2. Włożyć probówkę PCR do fiolki LC.
  3. Zamknąć fiolkę LC do analizy LC-SRM.
    UWAGA: W przypadku niewielkiej liczby komórek przetwarzanych na 96-dołkowej płytce PCR, zostanie dodana matowa osłona w celu uszczelnienia płytki do bezpośredniej analizy LC-SRM.

8. Analiza LC-SRM

  1. Analizuj próbki za pomocą UPLC sprzężonego z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym.
  2. Podłącz kolumny kapilarne C18 (średnica wewnętrzna 75 μm × 20 cm dla standardowego gradientu i 100 μm średnicy wewnętrznej × 10 cm dla krótkiego gradientu) do chemicznie wytrawionego emitera elektrorozpylonego krzemionki o średnicy wewnętrznej 20 μm za pomocą złączki ze stali nierdzewnej.
  3. Użyj pętli próbki o pojemności 20 μl, aby bezpośrednio załadować całą próbkę (łącznie ~15 μl) do kolumny LC, aby zmaksymalizować czułość wykrywania.
  4. Użyj 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie i 0,1% kwasu mrówkowego w 90% acetonitrylu jako faz ruchomych A i B do kapilarnego oddzielania RPLC.
  5. Użyj binarnego gradientu LC przy natężeniach przepływu 300 nL/min dla gradientu standardowego, gdy mierzona jest duża liczba białek docelowych (>10). Gradient standardowy: 5-20% B w 26 min, 20-25% B w 10 min, 25-40% B w 8 min, 40-95% B w 1 min i przy 95% B przez 7 min, co daje łącznie 52 min, a kolumna analityczna ponownie równoważona w 99,5% A przez 8 min.
  6. Użyj binarnego gradientu LC przy natężeniach przepływu 400 nL/min dla krótkiego gradientu, gdy mierzona jest niewielka liczba białek docelowych (≤10). Krótki gradient do szybkiej separacji: 5-95% B w 5 minut, a kolumna analityczna ponownie zrównoważona w 99,5% A przez 5 minut, przy łącznym czasie pracy LC wynoszącym 10 minut.
  7. Spektrometr masowy QQQ może pracować przy napięciach rozpylania jonów od 2 400 ± 100 V, napięciu niezrównoważenia kapilary 35 V, napięciu niezrównoważenia skimmera o napięciu przesunięcia -5 V i temperaturze wlotu kapilary 220° C.
  8. Uzyskaj inne parametry QQQ MS z automatycznego dostrajania i kalibracji bez dalszej optymalizacji.
  9. Zwiększ różne stężenia surowych wzorców ciężkich peptydów do 20-50 ng / μL lizatów komórkowych innych niż ludzkie, trawi się przed analizą LC-SRM próbek w celu określenia czasu retencji LC peptydu (RT) w celu zbudowania zaplanowanej metody SRM i potencjalnych przejść interferencyjnych w celu dokładnej kwantyfikacji.
  10. Użyj zaplanowanego trybu RT SRM do multipleksowanej kwantyfikacji z oknem skanowania ≥6 min.
    UWAGA: Okno skanowania zostanie odpowiednio dostosowane w zależności od liczby przejść w określonym oknie czasowym.
  11. Ustaw całkowity czas cyklu na 1 s, a czas przebywania dla każdego przejścia jest automatycznie dostosowywany w zależności od liczby przejść skanowanych w różnych oknach czasu przechowywania. Minimalny czas przebywania wynoszący 10 ms jest wymagany dla każdego przejścia SRM. Wszystkie białka docelowe mogą być jednocześnie monitorowane w ramach jednej analizy LC-SRM

9. Analiza danych

  1. Zaimportuj surowe pliki danych do publicznie dostępnego oprogramowania Skyline33 w celu wizualizacji danych każdego docelowego peptydu w celu określenia ich wykrywalności.
  2. Użyj dwóch kryteriów, aby określić wykrywanie i integrację pików SRM: 1) ten sam czas retencji LC; 2) w przybliżeniu te same względne współczynniki intensywności pików SRM w wielu przejściach między endogennymi (lekkimi) peptydami a odpowiadającymi im (ciężkimi) wzorcami wewnętrznymi peptydów znakowanymi izotopami.
  3. Sprawdź wszystkie dane SRM ręcznie, aby zapewnić prawidłowe przypisanie piku SRM i granicę piku SRM w celu wiarygodnej kwantyfikacji przy użyciu powyższych dwóch kryteriów.
  4. Użyj najlepszego przejścia z wysokim sygnałem SRM, ale bez zakłóceń matrycy do kwantyfikacji białek, a pozostałe przejścia użyj jako odniesienia.
  5. Użyć wielu powtórzeń w celu uzyskania odchylenia standardowego (SD) i współczynnika zmienności (CV).
  6. Obliczyć stosunek sygnału do szumu (S/N) na podstawie szczytowego natężenia wierzchołkowego w stosunku do średniego szumu tła w obszarze czasu retencji wynoszącym ±15 s dla gradientu standardowego i ±6 s dla krótkiego gradientu. Granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) definiuje się jako najniższe punkty stężenia, w których stosunek sygnału do szumu wynosi odpowiednio co najmniej 3 i 7.
  7. Zastosuj jedno dodatkowe kryterium do konserwatywnego określania wartości LOQ oprócz S/N ≥7: odpowiedź peptydu zastępczego wobec różnych liczb komórek musi mieścić się w liniowym zakresie dynamicznym.
  8. Użyj oprogramowania Excel, aby wykreślić wszystkie krzywe kalibracyjne. Załaduj dane RAW z QQQ MS do publicznie dostępnego oprogramowania Skyline, aby wyświetlić wykresy wyekstrahowanych chromatogramów jonowych (XIC) wielu przejść monitorowanych białek docelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe ilości lizatów komórkowych MCF7 (0,5-20 ng odpowiadające 5-200 komórkom) zostały po raz pierwszy użyte do oceny wydajności cLC-SRM poprzez ukierunkowaną kwantyfikację białek szlaku EGFR/MAPK, ponieważ są one bardziej jednolite z mniejszą liczbą zmian w porównaniu do małej liczby komórek posortowanych przez FACS. Jak pokazano na Rysunek 2A, XICs wyraźnie pokazuje wykrywanie przejść SRM dla ATADDELSFK pochodzących z GRB2 obecnych przy ~220 000 kopii na kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cLC-SRM to wygodna ukierunkowana metoda proteomiczna, która umożliwia dokładną analizę białek multipleksowanych w niewielkiej liczbie komórek, w tym pojedynczych komórek. Metoda ta wykorzystuje jednogarnkowe przygotowanie próbki wspomagane nośnikiem białka, w którym wszystkie etapy, w tym pobieranie komórek, wieloetapowa liza i trawienie komórek oraz transfer trawienia peptydów do kapilarnej kolumny LC w celu analizy MS, są wykonywane w jednym doniczce (np. Pojedynczej probówce lub pojedynczej studzince) (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH Grant R21CA223715 (TS) i UG3CA256967 (TS i HL). Prace eksperymentalne opisane w niniejszym dokumencie zostały przeprowadzone w Laboratorium Środowiskowych Nauk Molekularnych, Pacific Northwest National Laboratory, krajowym ośrodku naukowym sponsorowanym przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych Ameryki w ramach umowy DE-AC05-76RL0 1830.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 ml szklana fiolka LC Microsolv 9502S-WCVNaczynie do przechowywania probówki PCR do wstrzykiwania autopróbki
BSASigma-AldrichP0834-10 i razy; 1 mlBiałko nośnikowe dla znacznego zmniejszenia strat adsorpcji powierzchniowej
DTTThermo ScientificA39255Odczynnik do redukcji
kwasu mrówkowegoThermo Scientific28905Odczynnik do zatrzymania reakcji enzymatycznej
IAAThermo ScientificA39271Odczynnik do alkilacji
Peptyd wewnętrznypeptyduNew EnglandUkierunkowana kwantyfikacja białek szlaku EGFR/MAPK
probówka RT-PCR GeneMate BioexpressT-3035-10,2 ml probówka do PCR do jednogarnkowego przygotowania próbki 
Oprogramowanie SkylineUniwersytet WaszyngtońskiPublicznie dostępne do analizy danych SRM
SonikatorHielscher Technologia ultradźwiękowaUTR200Sonikacja na lodzie do lizy komórek
Szybkość Koncentrator VacThermo ScientificRedukcja procentu TFE dla efektywnego trawienia trypsyny
TFESigma-Aldrich18370-10 razy; 1mL60% TFE do lizy komórek
Termocykler z podgrzewaną pokrywąPeltier Thermal Cycler PTC-200Ogrzewanie do denaturacji białek
Trypsyna GoldPromegaV528AEnzym do trawienia białek 
Kolumna Waters BEH C18Kolumna WatersC18 do separacji peptydów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  2. Miyamoto, D. T., et al. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  3. Wang, Y., Navin, N. E. Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell. 58 (4), 598-609 (2015).
  4. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  5. Gavasso, S., Gullaksen, S. E., Skavland, J., Gjertsen, B. T. Single-cell proteomics: potential implications for cancer diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (5), 579-589 (2016).
  6. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 83-88 (2012).
  7. Hughes, A. J., et al. Single-cell western blotting. Nature Methods. 11 (7), 749-755 (2014).
  8. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  9. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  10. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (6), 427-439 (2010).
  11. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  12. Zhang, H., et al. Integrated Proteogenomic Characterization of Human High-Grade Serous Ovarian Cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  13. Zhang, B., et al. Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 513 (7518), 382-387 (2014).
  14. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining Signaling Pathways with an Expanding Single-Cell Toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  15. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  16. Di Palma, S., Bodenmiller, B. Unraveling cell populations in tumors by single-cell mass cytometry. Current Opinion in Biotechnology. 31, 122-129 (2015).
  17. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 8 Unit 8 11-20 (2012).
  18. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 745-751 (2013).
  19. Lee, J. Y., et al. Detection of Head and Neck Cancer Based on Longitudinal Changes in Serum Protein Abundance. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 29 (8), 1665-1672 (2020).
  20. Shi, T., et al. Advancing the sensitivity of selected reaction monitoring-based targeted quantitative proteomics. Proteomics. 12 (8), 1074-1092 (2012).
  21. Shi, T., et al. Advances in targeted proteomics and applications to biomedical research. Proteomics. 16 (15-16), 2160-2182 (2016).
  22. Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular Systems Biology. 4, 222(2008).
  23. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. 9 (6), 555-566 (2012).
  24. Zhu, Y., et al. Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells Enabled by Microfluidic Nanodroplet Sample Preparation and Ultrasensitive NanoLC-MS. Angewandte Chemie International Edition. 57 (38), 12370-12374 (2018).
  25. Cong, Y., et al. Improved Single-Cell Proteome Coverage Using Narrow-Bore Packed NanoLC Columns and Ultrasensitive Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (3), 2665-2671 (2020).
  26. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9 (1), 882(2018).
  27. Shao, X., et al. Integrated Proteome Analysis Device for Fast Single-Cell Protein Profiling. Analytical Chemistry. 90 (23), 14003-14010 (2018).
  28. Li, Z. Y., et al. Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis. Analytical Chemistry. 90 (8), 5430-5438 (2018).
  29. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  30. Zhang, P., et al. Carrier-Assisted Single-Tube Processing Approach for Targeted Proteomics Analysis of Low Numbers of Mammalian Cells. Analytical Chemistry. 91 (2), 1441-1451 (2019).
  31. Shi, T., et al. Facile carrier-assisted targeted mass spectrometric approach for proteomic analysis of low numbers of mammalian cells. Communications Biology. 1, 103(2018).
  32. Vitrinel, B., Iannitelli, D. E., Mazzoni, E. O., Christiaen, L., Vogel, C. Simple Method to Quantify Protein Abundances from 1000 Cells. ACS Omega. 5 (25), 15537-15546 (2020).
  33. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  34. Shi, T., et al. Conservation of protein abundance patterns reveals the regulatory architecture of the EGFR-MAPK pathway. Science Signaling. 9 (436), 6(2016).
  35. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  36. He, J., et al. Analytical platform evaluation for quantification of ERG in prostate cancer using protein and mRNA detection methods. Journal of Translational Medicine. 13, 54(2015).
  37. Shi, T., et al. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15395-15400 (2012).
  38. Shi, T., et al. Targeted quantification of low ng/mL level proteins in human serum without immunoaffinity depletion. Journal of Proteome Research. 12 (7), 3353-3361 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie pr bek z wykorzystaniem no nikaprzetwarzanie w jednym naczyniu one potanaliza LC SRMproteomika pojedynczych kom rekmetoda no nika bia kowegolizy kom rek i trawienieprotok analizy danychredukcja adsorpcji powierzchniowejegzogenny no nik bia kowy
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły