Jednoetapowe przygotowanie próbki wspomagane nośnikiem do ukierunkowanej analizy proteomicznej niewielkiej liczby komórek ludzkich

Podsumowanie

Przygotowanie jednogarnkowej próbki wspomaganej nośnikiem białka w połączeniu z chromatografią cieczową (LC) - monitorowanie wybranych reakcji (SRM) określane jako cLC-SRM jest wygodną metodą do multipleksowanej ukierunkowanej analizy proteomicznej małych liczb komórek, w tym pojedynczych komórek. Wykorzystuje on wykorzystanie nadmiaru białka egzogennego jako nośnika i LC-SRM o wysokiej specyficzności do ukierunkowanej oceny ilościowej.

Streszczenie

Analiza białek w małej liczbie komórek ludzkich jest przede wszystkim osiągana za pomocą ukierunkowanej proteomiki z testami immunologicznymi opartymi na przeciwciałach, które mają nieodłączne ograniczenia (np. niski multipleks i niedostępność przeciwciał dla nowych białek). Ukierunkowana proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) pojawiła się jako alternatywa, ponieważ jest wolna od przeciwciał, ma wysoki multipleks oraz wysoką swoistość i dokładność ilościową. Najnowsze postępy w oprzyrządowaniu do leczenia stwardnienia rozsianego umożliwiają ukierunkowaną proteomikę opartą na stwardnieniu rozsianym w celu multipleksowanej kwantyfikacji bardzo obfitych białek w pojedynczych komórkach. Istnieje jednak wyzwanie techniczne związane z efektywnym przetwarzaniem pojedynczych komórek przy minimalnych stratach próbki do analizy SM. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy niedawno wygodne, wspomagane nośnikiem białkowe przygotowanie próbki w jednym garnku w połączeniu z chromatografią cieczową (LC) - monitorowanie wybranych reakcji (SRM) określane jako cLC-SRM do ukierunkowanej analizy proteomicznej niewielkiej liczby komórek ludzkich. Metoda ta wykorzystuje połączone nadmierne białko egzogenne jako nośnik i jednogarnkowe przetwarzanie o małej objętości w celu znacznego zmniejszenia strat adsorpcji powierzchniowej, a także LC-SRM o wysokiej specyficzności, aby skutecznie rozwiązać zwiększony zakres stężeń dynamicznych spowodowany dodaniem egzogennego białka nośnikowego. Jego użyteczność została wykazana przez dokładne oznaczanie ilościowe większości umiarkowanie obfitych białek w małej liczbie komórek (np. 10-100 komórek) i bardzo obfitych białek w pojedynczych komórkach. Łatwe do wdrożenia funkcje i brak konieczności stosowania specjalnych urządzeń sprawiają, że metoda ta jest łatwo dostępna dla większości laboratoriów proteomicznych. W niniejszym dokumencie przedstawiliśmy szczegółowy protokół analizy cLC-SRM niewielkiej liczby komórek ludzkich, w tym sortowania komórek, lizy i trawienia komórek, analizy LC-SRM i analizy danych. Konieczna jest dalsza poprawa czułości wykrywania i przepustowości próbek w kierunku ukierunkowanej analizy proteomicznej pojedynczych komórek. Przewidujemy, że cLC-SRM znajdzie szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych i biologii systemowej, z potencjałem ułatwiającym medycynę precyzyjną.

Wprowadzenie

Ostatnie postępy technologiczne w genomice (transkryptomice) pozwalają na kompleksową i precyzyjną analizę genomu (transkryptomu) w pojedynczych komórkach^1,2,3. Jednak technologie proteomiki pojedynczych komórek pozostają daleko w tyle, mimo że są równie istotne jak technologie genomiki (transkryptomiki)^4,5,6,7,8. Co więcej, poziomu białek nie zawsze można wnioskować z poziomu mRNA⁹, a prote....

Protokół

UWAGA: Analiza cLC-SRM krok po kroku jest pokazana w Rysunek 1.

1. Wstępna obróbka probówek PCR

1. Dodać 100 μl lizatu komórkowego trawionego przez organizmy inne niż ludzkie (np. Shewanella oneidensis) w stężeniu 0,2 μg/μl do probówek PCR. Inkubować w temperaturze pokojowej przez noc, aby pokryć powierzchnię probówki PCR.
2. Usunąć lizat komórkowy trawiony przez pipetowanie, przepłukać probówki PCR wodą klasy HPLC 3 razy, a następnie wysuszyć probówki PCR na powietrzu w dygestorium.
3. Powlekane probówki PCR należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze 4 °C do czasu dalszego ....

Wyniki

Niewielkie ilości lizatów komórek MCF7 (0,5-20 ng, co odpowiada 5-200 komórkom) zostały początkowo wykorzystane do oceny wydajności metody cLC-SRM poprzez ukierunkowane oznaczanie ilościowe białek szlaku EGFR/MAPK, ponieważ wykazują one większą jednorodność i mniejszą zmienność w porównaniu z niewielkimi liczbami komórek sortowanych metodą FACS. Jak pokazano na Rysunku 2A, chromatogramy jonów wyekstrahowanych (XIC) wyraźnie wskazują detekcję przejść SRM dla s.......

Dyskusja

cLC-SRM to wygodna ukierunkowana metoda proteomiczna, która umożliwia dokładną analizę białek multipleksowanych w niewielkiej liczbie komórek, w tym pojedynczych komórek. Metoda ta wykorzystuje jednogarnkowe przygotowanie próbki wspomagane nośnikiem białka, w którym wszystkie etapy, w tym pobieranie komórek, wieloetapowa liza i trawienie komórek oraz transfer trawienia peptydów do kapilarnej kolumny LC w celu analizy MS, są wykonywane w jednym doniczce (np. Pojedynczej probówce lub pojedynczej studzince) (

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 ml szklana fiolka LC Microsolv		9502S-WCV	Naczynie do przechowywania probówki PCR do wstrzykiwania autopróbki
BSA	Sigma-Aldrich	P0834-10 i razy; 1 ml	Białko nośnikowe dla znacznego zmniejszenia strat adsorpcji powierzchniowej
DTT	Thermo Scientific	A39255	Odczynnik do redukcji
kwasu mrówkowego	Thermo Scientific	28905	Odczynnik do zatrzymania reakcji enzymatycznej
IAA	Thermo Scientific	A39271	Odczynnik do alkilacji
Peptyd wewnętrzny	peptydu		New EnglandUkierunkowana kwantyfikacja białek szlaku EGFR/MAPK
probówka RT-PCR	GeneMate Bioexpress	T-3035-1	0,2 ml probówka do PCR do jednogarnkowego przygotowania próbki
Oprogramowanie Skyline	Uniwersytet Waszyngtoński		Publicznie dostępne do analizy danych SRM
Sonikator	Hielscher Technologia ultradźwiękowa	UTR200	Sonikacja na lodzie do lizy komórek
Szybkość Koncentrator Vac	Thermo Scientific		Redukcja procentu TFE dla efektywnego trawienia trypsyny
TFE	Sigma-Aldrich	18370-10 razy; 1mL	60% TFE do lizy komórek
Termocykler z podgrzewaną pokrywą	Peltier Thermal Cycler	PTC-200	Ogrzewanie do denaturacji białek
Trypsyna Gold	Promega	V528A	Enzym do trawienia białek
Kolumna Waters BEH C18	Kolumna Waters		C18 do separacji peptydów