Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Peptydoglikan jest ważnym składnikiem ścian komórkowych bakterii i częstym celem komórkowym dla środków przeciwdrobnoustrojowych. Chociaż aspekty struktury peptydoglikanu są dość konserwatywne u wszystkich bakterii, istnieją również znaczne różnice między gram-dodatnimi/ujemnymi i między gatunkami. Ponadto istnieje wiele znanych odmian, modyfikacji lub adaptacji peptydoglikanu, które mogą wystąpić w obrębie gatunku bakterii w odpowiedzi na fazę wzrostu i/lub bodźce środowiskowe. Odmiany te wytwarzają wysoce dynamiczną strukturę, o której wiadomo, że uczestniczy w wielu funkcjach komórkowych, w tym we wzroście/podziale, oporności na antybiotyki i unikaniu obrony gospodarza. Aby zrozumieć zmienność w obrębie peptydoglikanu, należy rozłożyć całą strukturę na części składowe (znane jako muropeptydy) i ocenić pod kątem ogólnego składu komórkowego. Peptidoglycomics wykorzystuje zaawansowaną spektrometrię mas w połączeniu z zaawansowaną analizą danych bioinformatycznych o dużej mocy, aby szczegółowo zbadać skład peptydoglikanu. Poniższy protokół opisuje oczyszczanie peptydoglikanu z kultur bakteryjnych, pozyskiwanie danych o intensywności muropeptydów za pomocą chromatografu cieczowego - spektrometru masowego oraz analizę różnicową składu peptydoglikanu przy użyciu bioinformatyki.
Wprowadzenie
Peptydoglikan (PG) jest cechą charakterystyczną bakterii, która służy do utrzymania morfologii komórki, zapewniając jednocześnie wsparcie strukturalne dla białek i innych składników komórkowych1,2. Szkielet PG składa się z naprzemiennie połączonych β-1,4 kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) i N-acetyloglukozaminy (GlcNAc)1,2. Każdy MurNAc posiada krótki peptyd związany z resztą ᴅ-laktylu, który może być usieciowany z sąsiednimi peptydami połączonymi z disacharydem (Rysunek 1A,B). To siec....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki peptydoglikanu
- Wzrost kultur bakteryjnych
UWAGA: Wzrost kultur bakteryjnych będzie się różnił w zależności od gatunku bakterii i badanych warunków wzrostu. Parametry doświadczalne, które mają być badane, określą warunki wzrostu.- Hodować kultury bakteryjne w warunkach wzrostu wymaganych dla szczepu bakteryjnego i projektu eksperymentalnego. Hoduj bakterie w postaci potrójnych kultur (kontrprób biologicznych), tj. trzech oddzielnych kolonii na szczep lub warunek wzrostu.
UWAGA: Wiadomo, że warunki wzrostu i faza wzrostu mają znaczący wpływ na skład PG1,
- Hodować kultury bakteryjne w warunkach wzrostu wymaganych dla szczepu bakteryjnego i projektu eksperymentalnego. Hoduj bakterie w postaci potrójnych kultur (kontrprób biologicznych), tj. trzech oddzielnych kolonii na szczep lub warunek wzrostu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zwiększona czułość detekcji aparatury MS w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do rozpoznawania pików poprawiła możliwość izolowania, monitorowania i analizowania składu substancji w złożonych próbkach z bardzo wysoką szczegółowością. Wykorzystując te postępy technologiczne, w niedawnych badaniach nad składem peptydoglikanu zaczęto stosować zautomatyzowane techniki ekstrakcji cech LC-MS12,13,14,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę oczyszczania peptydoglikanu z kultur bakteryjnych, procesu wykrywania LC-MS i analizy składu przy użyciu technik bioinformatycznych. Tutaj skupiamy się na bakteriach Gram-ujemnych i wymagana będzie niewielka modyfikacja, aby umożliwić analizę bakterii Gram-dodatnich.
Przygotowanie muropeptydów pozostało praktycznie takie samo od czasu jego pierwszej produkcji w latach 60. 9,11,15.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr Jennifer Geddes-McAlister i dr Anthony'emu Clarke'owi za ich wkład w udoskonalenie tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z CIHR przyznane C.M.K (PJT 156111) oraz NSERC Alexander Graham Bell CGS D przyznane E.M.A. Figury powstały w dniu BioRender.com.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| C18 kolumna z odwróconymi fazami - Kolumna peptydowa AdvanceBio (100 mm x 2,1 mm 2,7 µ m) | Akwizycja danych | Agilent | |
| Regulator płaszcza grzewczego, Optichem | Fisher | 50-401-788 | do 4% SDS wrzącego |
| płaszcza grzewczego, 1000 ml półkulisty | CG1000008 | Fishera do 4% inkubatora wrzenia SDS | |
| , 37° C | do oczyszczania sakculi i przygotowywania próbek MS | ||
| Kondensator Leibig, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | do 4% wrzenia SDS |
| Liofilizator | Labconco | do liofilizacji sacculi | |
| Mieszadło magentyczne | Fisher | 90-691-18 | wrzenia 4% SDS |
| Q-Tof model UHD 6530 | Akwizycja danych | Aglient | |
| filtry do mikrowirówek, Nanosep MF 0,2 i mikro; | m Fisher | 50-197-9573 | oczyszczanie próbki przed wstrzyknięciem MS Stojak |
| na retortę | Fisher | 12-000-102 | do wrzenia 4% SDS |
| Zacisk retortowy | Fisher | S02629 | do 4% SDS wrząca |
| kolba okrągłodenna - 1 litr pyrex | Fisher | 07-250-084 | do 4% wrzenia SDS |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | do oczyszczania kości krzyżowej |
| Sonicator - mikro końcówka | Fisher | FB4422 | do oczyszczania sacculi |
| Ultrawirówka | Stopnie mycia sacculi | Beckman | |
| Butelki ultrawirówki, Ti45 | Fisher | NC9691797 | kroki do mycia sacculi |
| wodę | Miasto | dla skraplacza | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | do przewidywania fragmentacji muropeptydów | |
| Excel | Microsoft | przegląda listy adnotowanych muropeptydów, liczebności, wzorców izotopowych itp. | |
| Akwizycja MassHunter | Aglient | z uruchomionym instrumentem QTOF | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Bioinformatyczna analiza różnicowa | Aglient | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | rekurencyjna ekstrakcja cech | |
| MassHunter Analiza jakościowa | Aglient | viewing MS i MS/MS chromatogramy | |
| Prism | Graphpad | Oprogramowanie do tworzenia wykresów | |
| Perseus | Max Plank Instytut Biochemii | Adnotacja | |
| < mocny>Materiał< / mocny> | |||
| Acetonitryl | Fisher | A998-4 | |
| Octan amonu | Fisher | A637 | |
| Amylaza | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Kwas borowy | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Kwas mrówkowy | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS mieszanka tuningowa - HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolizyna ze Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Azot gazowy (czystość >99%) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Kwas fosforowy | Fisher | A242 | |
| Pronase E od Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNaza | Fisher | EN0531 | |
| Azydek sodu | Fisher | S0489 | |
| Borowodorek sodu | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Wodorotlenek sodu | Fisher | S318 | |
| Sód Fosforan (dwuzasadowy) | Fisher | S373 | |
| Fosforan sodu (monozasadowy) | Fisher | S369 | |
| Plamy-wszystko | Sigma-Aldrich | E9379 |
Bibliografia
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
