Artykuł metodologiczny

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

DOI:

10.3791/61799

⸱

13 października 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydoglikan jest ważnym składnikiem ścian komórkowych bakterii i częstym celem komórkowym dla środków przeciwdrobnoustrojowych. Chociaż aspekty struktury peptydoglikanu są dość konserwatywne u wszystkich bakterii, istnieją również znaczne różnice między gram-dodatnimi/ujemnymi i między gatunkami. Ponadto istnieje wiele znanych odmian, modyfikacji lub adaptacji peptydoglikanu, które mogą wystąpić w obrębie gatunku bakterii w odpowiedzi na fazę wzrostu i/lub bodźce środowiskowe. Odmiany te wytwarzają wysoce dynamiczną strukturę, o której wiadomo, że uczestniczy w wielu funkcjach komórkowych, w tym we wzroście/podziale, oporności na antybiotyki i unikaniu obrony gospodarza. Aby zrozumieć zmienność w obrębie peptydoglikanu, należy rozłożyć całą strukturę na części składowe (znane jako muropeptydy) i ocenić pod kątem ogólnego składu komórkowego. Peptidoglycomics wykorzystuje zaawansowaną spektrometrię mas w połączeniu z zaawansowaną analizą danych bioinformatycznych o dużej mocy, aby szczegółowo zbadać skład peptydoglikanu. Poniższy protokół opisuje oczyszczanie peptydoglikanu z kultur bakteryjnych, pozyskiwanie danych o intensywności muropeptydów za pomocą chromatografu cieczowego - spektrometru masowego oraz analizę różnicową składu peptydoglikanu przy użyciu bioinformatyki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydoglikan (PG) jest cechą charakterystyczną bakterii, która służy do utrzymania morfologii komórki, zapewniając jednocześnie wsparcie strukturalne dla białek i innych składników komórkowych1,2. Szkielet PG składa się z naprzemiennie połączonych β-1,4 kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) i N-acetyloglukozaminy (GlcNAc)1,2. Każdy MurNAc posiada krótki peptyd związany z resztą ᴅ-laktylu, który może być usieciowany z sąsiednimi peptydami połączonymi z disacharydem (Rysunek 1A,B). To sieciowanie tworzy strukturę przypominającą siatkę, która obejmuje całą komórkę i jest często określana jako worek (Rysunek 1C). Podczas syntezy PG prekursory są generowane w cytoplazmie i transportowane przez błonę cytoplazmatyczną przez flippazy. Prekursory są następnie włączane do dojrzałego PG przez enzymy transglikozylazy i transpeptydazy, które wytwarzają odpowiednio wiązania glikozydowe i peptydowe3. Jednak po złożeniu bakterie wytwarzają liczne enzymy, które modyfikują i/lub degradują PG w celu przeprowadzenia szeregu procesów komórkowych, w tym wzrostu i podziału. Ponadto wykazano, że różne modyfikacje PG nadają adaptacje specyficzne dla szczepu, warunków wzrostu i stresu środowiskowego, które są związane z sygnalizacją komórkową, opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe i unikaniem odporności gospodarza4. Na przykład powszechną modyfikacją jest dodanie grupy acetylowej C6 do MurNAc, która nadaje odporność poprzez ograniczenie dostępu do wiązań glikanowych β-1,4 do enzymów lizozymowych wytwarzanych przez gospodarza, które degradują PG4,5,6. W enterokokach zastąpienie końcowego ᴅ-Ala łańcucha bocznego peptydu przez ᴅ-Lac nadaje większą odporność na środek przeciwdrobnoustrojowy, wankomycyna7,8.

Ogólna procedura izolacji i oczyszczania PG pozostała względnie niezmieniona od czasu, gdy została opisana w latach 60. XX wieku9. Błony bakteryjne rozpuszcza się poprzez obróbkę cieplną SDS, a następnie enzymatyczne usuwanie związanych białek, glikolipidów i pozostałego DNA. Oczyszczony nienaruszony woreczek może być następnie trawiony na poszczególne składniki w wyniku hydrolizy wiązania β-1,4 między GlcNAc i MurNAc. W wyniku tego trawienia powstają disacharydy GlcNAc-MurNAc z nienaruszonymi modyfikacjami strukturalnymi i/lub usieciowaniami krzyżowymi, nazywane są muropeptydami (Rysunek 1B).

Analiza składu PG została początkowo przeprowadzona za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) w celu oczyszczenia każdego muropeptydu, a następnie ręcznej identyfikacji muropeptydów10,11. Od tego czasu została ona zastąpiona przez tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej (LC-MS), która zwiększa czułość wykrywania i zmniejsza nakład pracy ręcznej związanej z oczyszczaniem każdego pojedynczego muropeptydu. Jednak czasochłonny i złożony charakter ręcznej identyfikacji muropeptydów pozostał czynnikiem ograniczającym, zmniejszając liczbę prowadzonych badań. W ostatnich latach, wraz z pojawieniem się technologii "omicznych", zautomatyzowana ekstrakcja cech LC-MS stała się potężnym narzędziem, pozwalającym na szybkie wykrywanie i identyfikację pojedynczych związków w złożonych próbkach z bardzo dużych zbiorów danych. Po zidentyfikowaniu cech oprogramowanie bioinformatyczne statystycznie porównuje różnice między próbkami za pomocą analizy różnicowej, izolując nawet minimalne różnice w złożonym zbiorze danych i wyświetlając je graficznie użytkownikowi. Dopiero zaczęto badać zastosowanie oprogramowania do ekstrakcji cech do analizy składu PG12,13,14 i sprzężone z analizą bioinformatyczną12. W przeciwieństwie do analizy proteomicznej, która korzysta z łatwo dostępnych baz danych białek, które przewidują fragmentację peptydów, co pozwala na w pełni zautomatyzowaną identyfikację, obecnie nie istnieje biblioteka fragmentacji dla peptydoglikomiksów. Jednak ekstrakcja cech może być połączona ze znanymi i przewidywanymi strukturalnymi bazami danych w celu przewidywania identyfikacji muropeptydów12. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania ekstrakcji cech opartej na LC-MS w połączeniu z biblioteką muropeptydów do automatycznej identyfikacji i bioinformatycznej analizy różnicowej składu PG (Rysunek 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki peptydoglikanu

  1. Wzrost kultur bakteryjnych
    UWAGA: Wzrost kultur bakteryjnych będzie się różnił w zależności od gatunku bakterii i badanych warunków wzrostu. Parametry doświadczalne, które mają być badane, określą warunki wzrostu.
    1. Hodować kultury bakteryjne w warunkach wzrostu wymaganych dla szczepu bakteryjnego i projektu eksperymentalnego. Hoduj bakterie w postaci potrójnych kultur (kontrprób biologicznych), tj. trzech oddzielnych kolonii na szczep lub warunek wzrostu.
      UWAGA: Wiadomo, że warunki wzrostu i faza wzrostu mają znaczący wpływ na skład PG1,2,10. Należy dołożyć wszelkich starań, aby utrzymać spójność między kulturami i kontrpróbami, aby zapewnić, że zmiany w składzie wynikają z parametrów doświadczalnych, a nie z błędu doświadczalnego.
    2. Szybko schłodzić kulturę do temperatury 4 °C, zebrać przez odwirowanie (11 000 x g, 10 min, 4 °C) i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -20 °C. Przed zamrożeniem przemyć osad komórkowy wstępnie schłodzonym fosforanem sodu o pH 6,5 w temperaturze 4 °C i 20 mM. Produkcja osadów z zamrożonych komórek powinna odbywać się tak szybko i konsekwentnie między próbkami, jak to możliwe, w celu ograniczenia aktywności enzymów, które mogłyby modyfikować i/lub rozkładać PG podczas procesu pobierania. Próbki mogą być przetwarzane bezpośrednio w procesie ekstrakcji (sekcja 1.2) bez zamrażania; Należy jednak upewnić się, że wszystkie próbki są przetwarzane w podobny sposób.
      UWAGA: Aby zapewnić wystarczającą ilość produktu do późniejszych etapów, stosuje się znacznych rozmiarów granulki o mokrych komórkach. W ten sposób powstaje wystarczająco duża osadka sacculus, którą można łatwo uwidocznić i utrzymać podczas powtarzających się etapów mycia (sekcja 1.2.5 i 1.2.14) bez znacznych strat produktu. W zależności od bakterii i warunków wzrostu plon ten będzie się prawdopodobnie różnił. W przypadku bakterii Gram-ujemnej Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 l kultury 0,5 OD600 wytworzyły 3-4 g osadu komórkowego i były wystarczające do wytworzenia ~ 10 mg oczyszczonych woreczków (sekcja 1.2.17)12. Jest to duży nadmiar worków niż jest to wymagane dla LC-MS (sekcja 2); Pomoże to jednak w dokładności pomiaru (sekcja 1.2.17) i normalizacji (sekcja 1.3).
  2. Ekstrakcja peptydoglikanu workowatego
    UWAGA: Protokół ekstrakcji PG jest zaadaptowany z ref.9,11,15. Protokół ten wyekstrahuje PG z pojedynczych komórek bakteryjnych jako całego worka, wolnego od innych składników komórkowych. Protokół może być stosowany zarówno w przypadku bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich. Jednak w przypadku komórek Gram-dodatnich może być konieczne dostosowanie w celu wyizolowania grubszej struktury PG i usunięcia polimerów związanych ze ścianą komórkową; takich jak kwasy tejchojowe.
    1. Zawiesić zamrożone osady komórkowe w stosunku około 1:10 pierwotnej objętości kultury 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5. Wykonaj ten krok w temperaturze 4 °C (może to być 1–8 mg masy granulek mokrych komórek na ml buforu11,12).
      UWAGA: Aby utrzymać stan acetylacji PG, wymagane jest pH 6,5 lub niższe15,16.
    2. Dodawać zawiesinę komórkową kroplami do wrzącego 8% dodecylosiarczanu sodu (SDS) 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5 dla końcowej objętości 1:1 (tj. stężenie końcowe wynosi 4% SDS), delikatnie mieszając w kolbie okrągłodennej wyposażonej w skraplacz chłodzony wodą. (Rysunek 2, krok 2)
    3. Utrzymuj delikatne gotowanie przez 30 minut do 3 godzin, mieszając, aby zapewnić całkowitą dysocjację membrany. Upewnij się, że powstała mieszanina jest całkowicie klarowna, bez pozostałych grudek komórek lub lepkości. Preferowane jest dłuższe gotowanie, aby zagwarantować całkowitą dysocjację.
    4. Pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Próbkę można pozostawić na noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Gdy SDS jest obecny, utrzymuj próbki w temperaturze pokojowej, aby utrzymać SDS w roztworze.
    5. Zebrać woreczki w postaci osadów przez ultrawirowanie w temperaturze 70 000 x g przez 40 minut (lub czas wymagany do całkowitego osadzenia woreczków) w temperaturze 25 °C.
    6. Powtarzalnie przemywać woreczki przez kolejne ultrawirowanie (sekcja 1.2.5) i zawiesinę w ~50 ml o temperaturze pokojowej 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5, aż bufor płuczący osiągnie stężenie SDS ~0,001%. Zazwyczaj wystarczy od 5 do 7 prań.
      UWAGA: Aby przetestować stężenie pozostałej karty charakterystyki w buforze do mycia, użyj barwnika kolorymetrycznego, Stains-all17.
    7. Ponownie zawiesić sacculus w 5–10 ml o temperaturze pokojowej 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5.
    8. Krótko poddać próbkę sonikacji (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) w temperaturze pokojowej, aby rozproszyć grudki.
      UWAGA: Rozszerzona sonikacja spowoduje mechaniczne ścinanie PG structure18.
    9. Uzupełnij próbkę po 50 μg/ml amylazy, DNazy i RNazy, 10 mM siarczanu magnezu i trawij w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z mieszaniem lub nutacją.
      UWAGA: Trawienie amylazą usuwa resztki glikogenu uwięzionego w saculi11.
    10. Dodać 100 μg/ml pronazy i trawić w temperaturze 37 °C przez noc z mieszaniem lub nutacją i ~0,02% azydku sodu.
      UWAGA: Trawienie pronazy usuwa dodane enzymy (z sekcji 1.2.9) i usuwa lipoproteiny, które są kowalencyjnie połączone z PG.
      UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny i wymaga odpowiednich metod użycia/utylizacji.
    11. Ultrawirować przy 70 000 x g przez 40 minut (lub czas wymagany do całkowitego osadzenia woreczków) w temperaturze 25 °C w celu usunięcia azydku sodu.
    12. Zawiesić osad w 25 ml 2% SDS 20 mM fosforan sodu o pH 6,5.
    13. Gotować przez 1 godzinę w parowarze lub kolbie okrągłodennej ze skraplaczem chłodzonym wodą (sekcja 1.2.2).
      UWAGA: Drugi etap gotowania SDS usuwa wszystkie pozostałe białka i zanieczyszczenia z woreczków.
    14. Powtórzyć płukanie woreczkami (sekcja 1.2.6) z ~50 ml podwójnie destylowanej wody o temperaturze pokojowej (ddH2O), aż stężenie SDS osiągnie ~0,001%.
    15. Zawiesić osad w wystarczającej ilości ddH2O do zawieszenia woreczków, a także umyć pojemnik (np. 25 ml) i zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C. Objętość może się różnić, ponieważ próbka zostanie poddana liofilizacji w następnym etapie, chociaż mniejsze objętości wymagają mniej czasu na liofilizację.
    16. Następnego dnia zawiesinę należy liofilizować i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    17. Zmierzyć ilość liofilizowanych woreczków otrzymanych na wadze analitycznej.
    18. Rozcieńczyć woreczki w ddH2O do 10 mg/ml i krótko wykonać sonikę w celu rozbicia grudek przed dalszą analizą.
  3. Oznaczanie ilościowe oczyszczonego peptydoglikanu
    1. Określić ilościowo ilość oczyszczonych worków workowych z ppkt 1.2.18, aby zapewnić wyrównanie danych dotyczących specyfikacji masy podczas analizy różnicowej (ppkt 3.2). Postępuj zgodnie ze szczegółową metodologią opisaną w Reference15.
      UWAGA: Oczyszczone woreczki (sekcja 1.2.18) są rozkładane na poszczególne składniki cukrowe i aminokwasowe w procesie hydrolizy kwasowej. Poszczególne składniki są rozdzielane i oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii anionowymiennej z wykorzystaniem detekcji pulsacyjno-amperometrycznej. Biorąc pod uwagę strukturę PG (Rysunek 1), poszczególne muropeptydy składają się z pojedynczej reszty MurNAc i pojedynczej reszty GlcNAc. W związku z tym ilościowe określenie stężenia każdej z pozostałości odpowiada ilości muropeptydów w stosunku 1:1 w próbce. MurNAc jest preferowany ze względu na czystą separację pików od innych składników PG podczas chromatografii16.

2. Akwizycja danych ze spektrometrii mas

  1. Otrzymywanie muropeptydów do spektrometrii mas
    1. Uzupełnij 800 μg oczyszczonych woreczków 100 μg/ml mutanolizyny, 100 mM octanu amonu o pH 5,5 i 50 mM chlorku magnezu w 100 μl reakcji.
    2. Trawić w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Dodać 1:1 objętość 0,5 M buforu boranowego pH 9,0 i uzupełnić ~10 mg/ml borowodorku sodu (NaBH4).
      UWAGA: Mutarotacja cyklicznych cukrów między α a β formami anomerycznymi spowoduje wielokrotne tworzenie się pików podczas rozdzielania muropeptydów metodą chromatografii cieczowej. Leczenie NaBH4 eliminuje wzajemną konwersję między tymi dwiema formami poprzez redukcję MurNAc do muramitol11. Zabieg nie powoduje redukcji 1,6-anhydro MurNAc ani 1,4-sprzężonych pozostałości cukrowych.
      UWAGA: W wyniku reakcji NaBH4 powstają niewielkie ilości wodoru gazowego. Reakcja NaBH4 spowoduje powstanie pęcherzyków, a rurki do mikrofug powinny być otwarte, aby umożliwić ucieczkę gazu.
    4. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez ~20–30 min.
    5. Odwirować na krótko, aby umieścić próbkę w probówce do mikrofuge i usunąć pęcherzyki.
    6. Dostosuj pH do <4,0 za pomocą kwasu fosforowego w proporcji 1:5, dodawanego w odstępach co 5 μl. Przetestuj pH za pomocą pasków testowych lakmusu pH.
    7. Wirować przy ~17 000 x g przez 1 minutę w celu osadzenia pozostałego nierozpuszczalnego materiału.
    8. Filtrować za pomocą filtrów mikrowirówkowych 0,2 μm.
    9. Próbki są odwirowywane przez 10 minut przy 30 000 x g przed wstrzyknięciem do LC-MS, aby upewnić się, że żadne cząstki nie zostaną wstrzyknięte do MS.
  2. Konfiguracja LC-MS
    1. Podłączyć kolumnę C18 z powierzchownie porowatymi cząstkami (100 mm x 2,1 mm, wielkość porów <3 μm) do spektrometru mas z kwadrupolowym czasem przelotu (QTOF) o dokładności wykrywania co najmniej czterech miejsc po przecinku m/z.
    2. Przeprowadzić separację muropeptydów metodą chromatografii cieczowej
      UWAGA: Każdy trilikat biologiczny (sekcja 1.1.1) powinien być przepuszczony przez LC-MS (sekcja 2.2.2 do 2.2.3) trzy razy (potrójny egzemplarz techniczny). W związku z tym każdy testowany warunek będzie zawierał łącznie dziewięć plików danych LC-MS. Akwizycji danych dokonano przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Jednak oprogramowanie do akwizycji powinno być wybrane w oparciu o maszyny MS. Poniżej znajduje się przewodnik dotyczący konfigurowania MS z parametrami specyficznymi dla uruchamiania tego protokołu. Szczegółowy opis znajduje się w instrukcji producenta.
      1. Do rozdzielania chromatograficznego przygotować następujące rozpuszczalniki: 0,1% kwas mrówkowy (A) i acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (B).
      2. Ustawić metodę rozdzielania chromatograficznego, używając następujących parametrów.
      3. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 ml/min.
      4. Kondycjonuj kolumnę przez 10 minut w temperaturze 2% B (~24 objętości kolumny).
      5. Za pomocą automatycznego podajnika próbek wstrzyknąć 10 μl próbki z sekcji 2.1.9.
        UWAGA: Przed rozpoczęciem zbierania danych należy przepuścić jedną próbkę początkową przez protokół LC-MS. Ten przebieg nie jest używany do danych, ale w celu zwiększenia odtwarzalności czasu przechowywania dla wszystkich kolejnych przebiegów. Odtwarzalność czasu retencji jest wymagana podczas przetwarzania spektralnego (sekcja 3.1) w celu dokładnej identyfikacji i grupowania pików stosunku masy do ładunku (m/z).
      6. Oddziel muropeptydy za pomocą 2% B przez 5 minut (~12 objętości kolumn), następnie zwiększ do 15% B w ciągu 13 minut (~30 objętości kolumn), dalej zwiększając do 50% B w ciągu 10 minut (~24 objętości kolumn), a na koniec zwiększając do 98% B w ciągu 2 minut (~5 objętości kolumn).
        UWAGA: Wyrzuć (wyślij do kosza) pierwsze 2 minuty i ostatnie 5 minut gradientu.
      7. Zakończ płukaniem kolumny w temperaturze 98% B przez 6 minut (~14 objętości kolumny) i 20 minut (~47 objętości kolumny) ponownego równoważenia.
    3. Wykonywanie detekcji muropeptydów za pomocą spektrometrii mas
      1. Skalibrować oś masy w trybie dodatnim za pomocą mieszanki strojeniowej z acetonitrylu zawierającej wzorce masy odniesienia LC-MS zgodnie z instrukcjami producenta MS.
        UWAGA: MS jest strojony przed rozpoczęciem serii chromatograficznych (sekcja 2.2.2.1).
      2. Skonfiguruj metodę pozyskiwania danych MS przy użyciu następujących parametrów.
        UWAGA: Dane MS i MS/MS są zbierane (sekcje 2.2.3.2-2.2.3.6) jednocześnie z chromatograficznym rozdzielaniem muropeptydów (sekcje 2.2.2.4 i 2.2.2.5). Zarówno parametry chromatograficzne, jak i parametry MS (sekcje 2.2.2.2 i 2.2.3.2) są pojedynczą metodą, która jest dodawana podczas tworzenia listy roboczej do sekwencyjnego badania wielu próbek.
      3. Ustawić napięcie kapilary elektronatrysku na 4,0 kV, a temperaturę gazu suszącego na 350°C przy natężeniu przepływu 13 l/min.
        UWAGA: Azot (czystość >99%) powinien być używany jako gaz nebulizujący, suszący i zderzeniowy podczas zbierania wszystkich danych spektrometrii mas.
      4. Ustaw ciśnienie w nebulizatorze na 40 psi i ustaw fragmentor na 150 V.
      5. Ustaw dyszę, skimmer i oktapol RF voltages odpowiednio na 1000 V, 65 V i 750 V.
      6. Ustaw zakres skanowania na 300–2 000 m/z w trybie jonów dodatnich 4 GHz (rozszerzony zakres dynamiki).
      7. Zestaw zbierania danych przy użyciu akwizycji MS/MS zależnej od danych z szybkością skanowania MS i MS/MS wynoszącą 1 widmo na sekundę. Wybierz pięć mas prekursorowych na cykl, w kolejności pojedynczo, podwójnie i potrójnie naładowanych.
      8. Ustaw energie zderzeń fragmentacyjnych MS/MS na 15, 20 i 30 eV.

3. Analiza różnicowa obfitości muropeptydów

  1. Przetwarzanie spektralne chromatogramu LC-MS
    UWAGA: Ekstrakcja cech rekurencyjnych została przeprowadzona przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania (patrz Spis materiałów). Można użyć innego oprogramowania do wyodrębniania cech. Jednak inne programy mogą wymagać dodatkowego ręcznego przetwarzania danych w celu uzyskania wysoce niezawodnej ekstrakcji rekurencyjnej. Różne programy używają terminologii cecha, jednostka i związek prawie zamiennie. W przypadku analizy PG wszystkie odnoszą się do identyfikacji chromatogramu jonowego LC-MS reprezentatywnego dla pojedynczego muropeptydu (np. Rysunek 3). Podczas przetwarzania spektralnego (sekcja 3.1), cecha reprezentuje wiele pików m/z, które obejmują wiele możliwych form jonów pojedynczego muropeptydu, które są zgrupowane razem pod jednym znacznikiem związku.
    1. W obszarze Plik rozpocznij nowy projekt.
    2. Dodaj pliki danych LC-MS QTOF i przypisz poszczególne pliki danych do warunku / grupy eksperymentalnej, np. dwóch różnych warunków wzrostu.
    3. Uruchom kreatora przetwarzania danych Wsadowa rekurencyjna ekstrakcja cech (małe cząsteczki/peptydy) i ustaw filtry przetwarzania danych tak, aby odpowiadały parametrom warunków LC-MS i oprzyrządowania, aby dokładnie zidentyfikować, pogrupować i zweryfikować piki m/z reprezentujące poszczególne muropeptydy. Na podstawie chromatogramu zbadaj dryft czasu retencji i zmienność m/z znanych podobnych pików, aby ustawić początkowe parametry filtra.
      UWAGA: Rekurencyjna ekstrakcja cech wykorzystuje początkowy algorytm ekstrakcji cech molekularnych bez ukierunkowania do identyfikacji i wyrównania cech chromatogramu (pików m/z) we wszystkich plikach danych. Po utworzeniu cechy te są wykorzystywane do ponownej oceny oryginalnych plików danych (rekurencyjnych) za pomocą ukierunkowanego algorytmu ekstrakcji cech molekularnych w celu poprawy wiarygodności i dokładności zidentyfikowanych cech. Najlepiej jest ustawić początkową ekstrakcję nieukierunkowaną z wąskim oknem wykrywania i użyć szerszych parametrów wykrywania dla ekstrakcji rekurencyjnej w celu zidentyfikowania pików we wszystkich plikach danych, których może brakować w początkowej ekstrakcji. Uruchamianie cyklicznego wyodrębniania funkcji może potrwać wiele godzin, w zależności od liczby próbek, złożoności danych i obecnego sprzętu komputerowego
    4. Przejrzyj wyniki wyodrębniania funkcji. Jeśli znaczna liczba obiektów nie została wyrównana w grupie, dostosuj parametry filtrowania cyklicznego, aby poszerzyć/ograniczyć okno wykrywania zgodnie z wymaganiami. Aby to osiągnąć, należy sprawdzić chromatogram i profil izotopowy każdej wyodrębnionej cechy, aby upewnić się, że wykrywanie cech zostało przeprowadzone w podobny sposób we wszystkich plikach danych. Ponadto dla każdej zidentyfikowanej funkcji w pliku danych należy sprawdzić wynik, wszelkie ostrzeżenia oraz to, czy obiekt przeszedł wybrane parametry filtru.
      UWAGA: Należy zadbać o to, aby okna wykrywania były na tyle wąskie, aby poszczególne obiekty nie zostały omyłkowo zgrupowane. Jest to często sygnalizowane przez rozbieżne profile izotopowe między plikami danych lub znaczne różnice w czasie m/z / przechowywania. I odwrotnie, jeśli istnieje wiele cech o podobnych czasach m/z i przechowywania, możliwe jest, że parametry filtra były zbyt rygorystyczne, co spowodowało, że jeden pik MS został podzielony na dwie cechy. W związku z tym należy ponownie uruchomić wyodrębnianie cech (sekcja 3.1.3) z dostosowanymi parametrami filtru czasu przechowywania, aby umożliwić lepsze grupowanie tych cech. Wizualizacja najniższych szczytów liczebności wskaże, czy zastosowane filtry (sekcja 3.1.3) dokładnie zidentyfikowały piki powyżej szumu tła. Jeśli szczyty najniższej liczebności są podobne do tła, uruchom ponownie wyodrębnianie funkcji z nowymi parametrami filtru tła.
    5. Eksportuj dane w postaci pliku wymiany złożonej (.cef) (format zgodny z oprogramowaniem statystycznym) lub pliku oddzielonego kolumnami (.csv), który zawiera masę, czas retencji i obfitość każdej cechy dla każdej próbki.
  2. Analiza różnicowa cech spektralnych
    UWAGA: Analizę różnicową przeprowadzono przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania (patrz Tabela Materiałów). Można korzystać z innego oprogramowania bioinformatycznego.
    1. Otwórz program i po otrzymaniu instrukcji rozpocznij nowy projekt.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi importowania i analizowania danych. Podczas importowania danych prześlij wyodrębnione pliki (sekcja 3.1). Podczas analizy danych wybierz istotność i zmianę krotności dla analizy różnicowej i wybierz linię bazową danych do mediany intensywności we wszystkich plikach danych. Nie ustawiaj żadnych filtrów danych (jeśli zostało to zrobione w poprzednim kroku przetwarzania widm (sekcja 3.1)), ponieważ ponowne zastosowanie filtrów zanegowałoby solidną ekstrakcję cech rekurencyjnych. Jednak, podobnie jak w przypadku ekstrakcji cech, analiza różnicowa musi być dostosowana w oparciu o masę (m/z) i czas retencji z powodu dryfu w zbiorze danych LC-MS. Użyć parametrów określonych podczas wyodrębniania cech (sekcja 3.1).
      UWAGA: Normalizować między plikami danych za pomocą oceny ilościowej muropeptydu (sekcja 1.3), aby upewnić się, że różnice wynikają z parametrów eksperymentalnych, a nie z różnic w oczyszczaniu kości krzyżowej (sekcja 1.2). Użyj opcji skalera zewnętrznego, aby dostosować każdy plik danych pod kątem różnic w stężeniu MurNAc w próbce.
    3. Po zakończeniu analizy należy zapoznać się z wynikającymi analizami graficznymi i statystycznymi w celu zidentyfikowania muropeptydów, które wykazują znaczącą zmianę liczebności między badanymi warunkami eksperymentalnymi.
    4. W nawigatorze projektu kliknij prawym przyciskiem myszy różne analizy i wybierz opcję eksportu, aby zapisać szczegóły elementu jako plik danych rozdzielonych kolumnami (.csv), który zawiera m/z, czas przechowywania, surowe i znormalizowane wartości intensywności, wartość p, FDR i zmiany zagięcia dla każdej cechy. Aby uzyskać wszystkie istotne dane, należy zapisać wiele analiz.
    5. Eksportuj drugi plik .csv zawierający tylko te muropeptydy, które przekroczyły analizy statystyczne, w tym wartość p <0,05 i zmianę krotności >2.
  3. Adnotacja tożsamości muropeptydu do cech spektralnych
    UWAGA: Każda zidentyfikowana cecha musi mieć przypisaną przewidywaną strukturę muropeptydową na podstawie m/z, a adnotacja ta musi zostać potwierdzona przez badanie fragmentacji MS/MS. Po potwierdzeniu adnotacji może być konieczne przeprowadzenie i doprecyzowanie analizy różnicowej (sekcja 3.2).
    1. W oprogramowaniu do analizy różnicowej, w obszarze Interpretacja wyników, wybierz opcję Przeglądarka identyfikatorów. Dodaj bibliotekę oczekiwanych struktur muropeptydowych i wybierz parametry podobne do używanych wcześniej (sekcja 3.1.3). W ten sposób zostanie wygenerowana przewidywana adnotacja muropeptydu dla każdej zidentyfikowanej cechy. Biblioteka struktur muropeptydowych może być tworzona przy użyciu m/z dla przewidywanych struktur muropeptydowych i oprogramowania bazodanowego MS (patrz tabela materiałów). Jednak bibliotekę m/z zawierającą >6 000 możliwych muropeptydów można znaleźć w Reference12.
    2. Wybierz przewidywaną adnotację muropeptydu na podstawie pasującego wyniku i biologicznego znaczenia przewidywanego muropeptydu, tj. wybierz najbardziej prawdopodobny muropeptyd obecny w próbce biologicznej.
    3. Ręcznie potwierdź przewidywaną adnotację muropeptydu, porównując piki m/z chromatogramu MS/MS z przewidywanymi m/z wszystkich możliwych fragmentacji znanej struktury muropeptydowej (np. Rysunek 4).
      1. Przeglądaj dane MS i MS/MS za pomocą programu do przeglądania chromatogramów (patrz Tabela materiałów, Rysunek 4).
      2. Narysuj przewidywaną strukturę muropeptydu za pomocą edytora molekularnego (program do rysowania struktury chemicznej) (patrz Tabela materiałów, Rysunek 4, szara wstawka). Użyj narzędzia do fragmentacji masowej, aby pokazać m/z fragmentów MS, gdy każde wiązanie jest zrywane pojedynczo lub w połączeniu.
        UWAGA: W zależności od energii fragmentacji użytej do MS/MS, fragmentacja może wystąpić przy dowolnym wiązaniu w strukturze muropeptydu. Jednak niektóre wiązania są łatwiej / częściej fragmentowane na niższych poziomach energii. Na przykład fragmentacja w łańcuchu bocznym peptydu zachodzi najczęściej na wiązaniu amidowym między aminokwasami. Oceniając fragmentację, należy zauważyć, że reszty GlcNAc są bardzo łatwo fragmentowane od muropeptydu. W związku z tym fragmentację znanej struktury muropeptydu należy oceniać z GlcNAc i bez niego. Ze względu na fragmentację GlcNAc w źródle, kilka cech wyodrębnionych w przetwarzaniu spektralnym (sekcja 3.1) może reprezentować pojedynczą strukturę muropeptydu. W przypadku znalezienia tych cech należy je połączyć, a analiza różnicowa ponownie ocenić.
      3. Porównać wszystkie możliwe fragmentacje struktury muropeptydu, które zostały określone (sekcja 3.3.3.2) z chromatogramem MS/MS (sekcja 3.3.3.1). Aby potwierdzić adnotację muropeptydu, piki m/z wielu fragmentów powinny być znalezione na chromatogramie MS/MS z bardzo minimalnym oknem wyrównania m/z (Rysunek 4).
      4. W celu wyjaśnienia tożsamości muropeptydu w przypadku niejednoznacznej fragmentacji MS/MS, należy powtórzyć sekcje od 2.2.2 do 2.2.3 z próbkami (sekcja 2.1.9) w celu dodatkowego pozyskania danych MS/MS zawierających preferowaną listę prekursorów m/z i czas retencji z dodatkowymi energiami zderzenia fragmentacji MS/MS.
    4. W przypadku jednostek współeluujących, które zostały oznaczone jako ten sam muropeptyd, ponownie uruchom analizę różnicową (sekcja 3.2.2) i połącz wyodrębnione cechy.
  4. Ocena globalnych zmian w modyfikacjach muropeptydów
    1. Edytuj plik .csv (sekcja 3.2.4) statystycznie istotnych muropeptydów o dużej krotności, aby uwzględnić pojedynczą kolumnę dla każdej modyfikacji muropeptydu. Wypełnić tę kolumnę oznaczeniem dla każdego muropeptydu z adnotacją (sekcja 3.3) (np. acetylowany kontra de-N-acetylowany GlcNAc lub MurNAc).
    2. Prześlij zmodyfikowany plik .csv do Perseus22,23. Zaimportuj znormalizowane wartości intensywności do pola Import główny i zaimportuj oznaczenie modyfikacji do pola Import kategorii.
    3. W obszarze Dodawanie adnotacji do wierszy kliknij pozycję Kategorycznie adnotuj wiersze i dodaj pliki danych do każdego parametru eksperymentalnego.
    4. W obszarze test kliknij dwa przykładowe testy, aby wykonać test t studenta (wartość p < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Kliknij na 1D, aby wykonać adnotację 1D22,23. Adnotacja 1D FDR < 0,05 wskazuje na istotną zmianę liczebności modyfikacji muropeptydu między badanymi parametrami eksperymentalnymi. Ustawienie wartości progowej (s0) = 1 spowoduje wyświetlenie wyników FDR adnotacji 1D dla wszystkich muropeptydów.
    6. W oprogramowaniu do tworzenia wykresów (patrz Tabela materiałów) utwórz mapę cieplną zmiany krotności obfitości dla każdej modyfikacji muropeptydu i pokaż wynik adnotacji 1D, aby zademonstrować istotność (Rysunek 5B). Zmianę krotności każdej modyfikacji muropeptydu można uzyskać w programie Microsoft Excel przy użyciu surowych intensywności wszystkich pojedynczych muropeptydów, które zawierają modyfikację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwiększona czułość wykrywania maszyn MS w połączeniu z oprogramowaniem do rozpoznawania pików o dużej mocy poprawiła możliwość izolowania, monitorowania i analizowania składu substancji złożonych próbek w najdrobniejszych szczegółach. Korzystając z tych osiągnięć technologicznych, ostatnie badania nad składem peptydoglikanu zaczęły wykorzystywać techniki automatycznej ekstrakcji cech LC-MS12,13,14,24...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę oczyszczania peptydoglikanu z kultur bakteryjnych, procesu wykrywania LC-MS i analizy składu przy użyciu technik bioinformatycznych. Tutaj skupiamy się na bakteriach Gram-ujemnych i wymagana będzie niewielka modyfikacja, aby umożliwić analizę bakterii Gram-dodatnich.

Przygotowanie muropeptydów pozostało praktycznie takie samo od czasu jego pierwszej produkcji w latach 60. 9,11,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Jennifer Geddes-McAlister i dr Anthony'emu Clarke'owi za ich wkład w udoskonalenie tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z CIHR przyznane C.M.K (PJT 156111) oraz NSERC Alexander Graham Bell CGS D przyznane E.M.A. Figury powstały w dniu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
C18 kolumna z odwróconymi fazami - Kolumna peptydowa AdvanceBio (100 mm x 2,1 mm 2,7 µ m)Akwizycja danychAgilent
Regulator płaszcza grzewczego, OptichemFisher50-401-788do 4% SDS wrzącego
płaszcza grzewczego, 1000 ml półkulistyCG1000008Fishera do 4% inkubatora wrzenia SDS
, 37° Cdo oczyszczania sakculi i przygotowywania próbek MS
Kondensator Leibig, 300MM 24/40,FisherCG121805do 4% wrzenia SDS
LiofilizatorLabconcodo liofilizacji sacculi
Mieszadło magentyczneFisher90-691-18wrzenia 4% SDS
Q-Tof model UHD 6530Akwizycja danychAglient
filtry do mikrowirówek, Nanosep MF 0,2 i mikro; m Fisher50-197-9573oczyszczanie próbki przed wstrzyknięciem MS Stojak
na retortęFisher12-000-102do wrzenia 4% SDS
Zacisk retortowyFisherS02629do 4% SDS wrząca
kolba okrągłodenna - 1 litr pyrexFisher07-250-084do 4% wrzenia SDS
Sonicator model 120FisherFB120do oczyszczania kości krzyżowej
Sonicator - mikro końcówkaFisherFB4422do oczyszczania sacculi
UltrawirówkaStopnie mycia sacculiBeckman
Butelki ultrawirówki, Ti45FisherNC9691797kroki do mycia sacculi
wodęMiastodla skraplacza
Software
ChemdrawCambridgesoftdo przewidywania fragmentacji muropeptydów
ExcelMicrosoftprzegląda listy adnotowanych muropeptydów, liczebności, wzorców izotopowych itp.
Akwizycja MassHunterAglientz uruchomionym instrumentem QTOF
MassHunter Mass Profiler ProfessionalBioinformatyczna analiza różnicowaAglient
MassHunter Personal Compound Database and Library ManagerAglientmuropeptide m/z MS database
MassHunter ProfinderAglientrekurencyjna ekstrakcja cech
MassHunter Analiza jakościowaAglientviewing MS i MS/MS chromatogramy
PrismGraphpadOprogramowanie do tworzenia wykresów
PerseusMax Plank Instytut BiochemiiAdnotacja
< mocny>Materiał< / mocny>
AcetonitrylFisherA998-4
Octan amonuFisherA637
AmylazaSigma-AldrichA6380
Kwas borowyFisherBP168-1
DNaseFisherEN0521
Kwas mrówkowySigma-Aldrich27001-500ML-R
LC-MS mieszanka tuningowa - HP0321AgilentG1969-85000
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506
Mutanolizyna ze Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Azot gazowy (czystość >99%)PraxairNI 5.0UH-T
Kwas fosforowyFisherA242
Pronase E od Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
RNazaFisherEN0531
Azydek soduFisherS0489
Borowodorek soduSigma-Aldrich452890
Dodecylosiarczan sodu (SDS)FisherBP166
Wodorotlenek soduFisherS318
Sód Fosforan (dwuzasadowy)FisherS373
Fosforan sodu (monozasadowy)FisherS369
Plamy-wszystkoSigma-AldrichE9379
LC-MS do spektrometru mas LC-MSZaopatrzenie w chłodzonego wodą Edytor molekularny 1D

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94(2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza peptydoglikanubioinformatyczna analiza danychsk ad muropeptyd woczyszczanie peptydoglikanuekstrakcja sakuliultrawirowanietrawienie enzymatyczneekstrakcja cechanaliza r nicowa

Powiązane artykuły