Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Peptydoglikan (PG) jest cechą charakterystyczną bakterii, która służy do utrzymania morfologii komórki, zapewniając jednocześnie wsparcie strukturalne dla białek i innych składników komórkowych^1,2. Szkielet PG składa się z naprzemiennie połączonych β-1,4 kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) i N-acetyloglukozaminy (GlcNAc)^1,2. Każdy MurNAc posiada krótki peptyd związany z resztą ᴅ-laktylu, który może być usieciowany z sąsiednimi peptydami połączonymi z disacharydem (Rysunek 1A,B). To sieciowanie tworzy strukturę przypominającą siatkę, która obejmuje całą komórkę i jest często określana jako worek (Rysunek 1C). Podczas syntezy PG prekursory są generowane w cytoplazmie i transportowane przez błonę cytoplazmatyczną przez flippazy. Prekursory są następnie włączane do dojrzałego PG przez enzymy transglikozylazy i transpeptydazy, które wytwarzają odpowiednio wiązania glikozydowe i peptydowe³. Jednak po złożeniu bakterie wytwarzają liczne enzymy, które modyfikują i/lub degradują PG w celu przeprowadzenia szeregu procesów komórkowych, w tym wzrostu i podziału. Ponadto wykazano, że różne modyfikacje PG nadają adaptacje specyficzne dla szczepu, warunków wzrostu i stresu środowiskowego, które są związane z sygnalizacją komórkową, opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe i unikaniem odporności gospodarza⁴. Na przykład powszechną modyfikacją jest dodanie grupy acetylowej C6 do MurNAc, która nadaje odporność poprzez ograniczenie dostępu do wiązań glikanowych β-1,4 do enzymów lizozymowych wytwarzanych przez gospodarza, które degradują PG^4,5,6. W enterokokach zastąpienie końcowego ᴅ-Ala łańcucha bocznego peptydu przez ᴅ-Lac nadaje większą odporność na środek przeciwdrobnoustrojowy, wankomycyna^7,8.

Ogólna procedura izolacji i oczyszczania PG pozostała względnie niezmieniona od czasu, gdy została opisana w latach 60. XX wieku⁹. Błony bakteryjne rozpuszcza się poprzez obróbkę cieplną SDS, a następnie enzymatyczne usuwanie związanych białek, glikolipidów i pozostałego DNA. Oczyszczony nienaruszony woreczek może być następnie trawiony na poszczególne składniki w wyniku hydrolizy wiązania β-1,4 między GlcNAc i MurNAc. W wyniku tego trawienia powstają disacharydy GlcNAc-MurNAc z nienaruszonymi modyfikacjami strukturalnymi i/lub usieciowaniami krzyżowymi, nazywane są muropeptydami (Rysunek 1B).

Analiza składu PG została początkowo przeprowadzona za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) w celu oczyszczenia każdego muropeptydu, a następnie ręcznej identyfikacji muropeptydów^10,11. Od tego czasu została ona zastąpiona przez tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej (LC-MS), która zwiększa czułość wykrywania i zmniejsza nakład pracy ręcznej związanej z oczyszczaniem każdego pojedynczego muropeptydu. Jednak czasochłonny i złożony charakter ręcznej identyfikacji muropeptydów pozostał czynnikiem ograniczającym, zmniejszając liczbę prowadzonych badań. W ostatnich latach, wraz z pojawieniem się technologii "omicznych", zautomatyzowana ekstrakcja cech LC-MS stała się potężnym narzędziem, pozwalającym na szybkie wykrywanie i identyfikację pojedynczych związków w złożonych próbkach z bardzo dużych zbiorów danych. Po zidentyfikowaniu cech oprogramowanie bioinformatyczne statystycznie porównuje różnice między próbkami za pomocą analizy różnicowej, izolując nawet minimalne różnice w złożonym zbiorze danych i wyświetlając je graficznie użytkownikowi. Dopiero zaczęto badać zastosowanie oprogramowania do ekstrakcji cech do analizy składu PG^12,13,14 i sprzężone z analizą bioinformatyczną¹². W przeciwieństwie do analizy proteomicznej, która korzysta z łatwo dostępnych baz danych białek, które przewidują fragmentację peptydów, co pozwala na w pełni zautomatyzowaną identyfikację, obecnie nie istnieje biblioteka fragmentacji dla peptydoglikomiksów. Jednak ekstrakcja cech może być połączona ze znanymi i przewidywanymi strukturalnymi bazami danych w celu przewidywania identyfikacji muropeptydów¹². W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania ekstrakcji cech opartej na LC-MS w połączeniu z biblioteką muropeptydów do automatycznej identyfikacji i bioinformatycznej analizy różnicowej składu PG (Rysunek 2).

1. Przygotowanie próbki peptydoglikanu

1. Wzrost kultur bakteryjnych
   UWAGA: Wzrost kultur bakteryjnych będzie się różnił w zależności od gatunku bakterii i badanych warunków wzrostu. Parametry doświadczalne, które mają być badane, określą warunki wzrostu.
   1. Hodować kultury bakteryjne w warunkach wzrostu wymaganych dla szczepu bakteryjnego i projektu eksperymentalnego. Hoduj bakterie w postaci potrójnych kultur (kontrprób biologicznych), tj. trzech oddzielnych kolonii na szczep lub warunek wzrostu.
      UWAGA: Wiadomo, że warunki wzrostu i faza wzrostu mają znaczący wpływ na skład PG^1,2,10. Należy dołożyć wszelkich starań, aby utrzymać spójność między kulturami i kontrpróbami, aby zapewnić, że zmiany w składzie wynikają z parametrów doświadczalnych, a nie z błędu doświadczalnego.
   2. Szybko schłodzić kulturę do temperatury 4 °C, zebrać przez odwirowanie (11 000 x g, 10 min, 4 °C) i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -20 °C. Przed zamrożeniem przemyć osad komórkowy wstępnie schłodzonym fosforanem sodu o pH 6,5 w temperaturze 4 °C i 20 mM. Produkcja osadów z zamrożonych komórek powinna odbywać się tak szybko i konsekwentnie między próbkami, jak to możliwe, w celu ograniczenia aktywności enzymów, które mogłyby modyfikować i/lub rozkładać PG podczas procesu pobierania. Próbki mogą być przetwarzane bezpośrednio w procesie ekstrakcji (sekcja 1.2) bez zamrażania; Należy jednak upewnić się, że wszystkie próbki są przetwarzane w podobny sposób.
      UWAGA: Aby zapewnić wystarczającą ilość produktu do późniejszych etapów, stosuje się znacznych rozmiarów granulki o mokrych komórkach. W ten sposób powstaje wystarczająco duża osadka sacculus, którą można łatwo uwidocznić i utrzymać podczas powtarzających się etapów mycia (sekcja 1.2.5 i 1.2.14) bez znacznych strat produktu. W zależności od bakterii i warunków wzrostu plon ten będzie się prawdopodobnie różnił. W przypadku bakterii Gram-ujemnej Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 l kultury 0,5 OD₆₀₀ wytworzyły 3-4 g osadu komórkowego i były wystarczające do wytworzenia ~ 10 mg oczyszczonych woreczków (sekcja 1.2.17)¹². Jest to duży nadmiar worków niż jest to wymagane dla LC-MS (sekcja 2); Pomoże to jednak w dokładności pomiaru (sekcja 1.2.17) i normalizacji (sekcja 1.3).
2. Ekstrakcja peptydoglikanu workowatego
   UWAGA: Protokół ekstrakcji PG jest zaadaptowany z ref.^9,11,15. Protokół ten wyekstrahuje PG z pojedynczych komórek bakteryjnych jako całego worka, wolnego od innych składników komórkowych. Protokół może być stosowany zarówno w przypadku bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich. Jednak w przypadku komórek Gram-dodatnich może być konieczne dostosowanie w celu wyizolowania grubszej struktury PG i usunięcia polimerów związanych ze ścianą komórkową; takich jak kwasy tejchojowe.
   1. Zawiesić zamrożone osady komórkowe w stosunku około 1:10 pierwotnej objętości kultury 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5. Wykonaj ten krok w temperaturze 4 °C (może to być 1–8 mg masy granulek mokrych komórek na ml buforu^11,12).
      UWAGA: Aby utrzymać stan acetylacji PG, wymagane jest pH 6,5 lub niższe^15,16.
   2. Dodawać zawiesinę komórkową kroplami do wrzącego 8% dodecylosiarczanu sodu (SDS) 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5 dla końcowej objętości 1:1 (tj. stężenie końcowe wynosi 4% SDS), delikatnie mieszając w kolbie okrągłodennej wyposażonej w skraplacz chłodzony wodą. (Rysunek 2, krok 2)
   3. Utrzymuj delikatne gotowanie przez 30 minut do 3 godzin, mieszając, aby zapewnić całkowitą dysocjację membrany. Upewnij się, że powstała mieszanina jest całkowicie klarowna, bez pozostałych grudek komórek lub lepkości. Preferowane jest dłuższe gotowanie, aby zagwarantować całkowitą dysocjację.
   4. Pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Próbkę można pozostawić na noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Gdy SDS jest obecny, utrzymuj próbki w temperaturze pokojowej, aby utrzymać SDS w roztworze.
   5. Zebrać woreczki w postaci osadów przez ultrawirowanie w temperaturze 70 000 x g przez 40 minut (lub czas wymagany do całkowitego osadzenia woreczków) w temperaturze 25 °C.
   6. Powtarzalnie przemywać woreczki przez kolejne ultrawirowanie (sekcja 1.2.5) i zawiesinę w ~50 ml o temperaturze pokojowej 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5, aż bufor płuczący osiągnie stężenie SDS ~0,001%. Zazwyczaj wystarczy od 5 do 7 prań.
      UWAGA: Aby przetestować stężenie pozostałej karty charakterystyki w buforze do mycia, użyj barwnika kolorymetrycznego, Stains-all¹⁷.
   7. Ponownie zawiesić sacculus w 5–10 ml o temperaturze pokojowej 20 mM fosforanu sodu o pH 6,5.
   8. Krótko poddać próbkę sonikacji (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) w temperaturze pokojowej, aby rozproszyć grudki.
      UWAGA: Rozszerzona sonikacja spowoduje mechaniczne ścinanie PG structure¹⁸.
   9. Uzupełnij próbkę po 50 μg/ml amylazy, DNazy i RNazy, 10 mM siarczanu magnezu i trawij w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z mieszaniem lub nutacją.
      UWAGA: Trawienie amylazą usuwa resztki glikogenu uwięzionego w saculi¹¹.
   10. Dodać 100 μg/ml pronazy i trawić w temperaturze 37 °C przez noc z mieszaniem lub nutacją i ~0,02% azydku sodu.
       UWAGA: Trawienie pronazy usuwa dodane enzymy (z sekcji 1.2.9) i usuwa lipoproteiny, które są kowalencyjnie połączone z PG.
       UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny i wymaga odpowiednich metod użycia/utylizacji.
   11. Ultrawirować przy 70 000 x g przez 40 minut (lub czas wymagany do całkowitego osadzenia woreczków) w temperaturze 25 °C w celu usunięcia azydku sodu.
   12. Zawiesić osad w 25 ml 2% SDS 20 mM fosforan sodu o pH 6,5.
   13. Gotować przez 1 godzinę w parowarze lub kolbie okrągłodennej ze skraplaczem chłodzonym wodą (sekcja 1.2.2).
       UWAGA: Drugi etap gotowania SDS usuwa wszystkie pozostałe białka i zanieczyszczenia z woreczków.
   14. Powtórzyć płukanie woreczkami (sekcja 1.2.6) z ~50 ml podwójnie destylowanej wody o temperaturze pokojowej (_ddH2O), aż stężenie SDS osiągnie ~0,001%.
   15. Zawiesić osad w wystarczającej ilości ddH₂O do zawieszenia woreczków, a także umyć pojemnik (np. 25 ml) i zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C. Objętość może się różnić, ponieważ próbka zostanie poddana liofilizacji w następnym etapie, chociaż mniejsze objętości wymagają mniej czasu na liofilizację.
   16. Następnego dnia zawiesinę należy liofilizować i przechowywać w temperaturze pokojowej.
   17. Zmierzyć ilość liofilizowanych woreczków otrzymanych na wadze analitycznej.
   18. Rozcieńczyć woreczki w ddH₂O do 10 mg/ml i krótko wykonać sonikę w celu rozbicia grudek przed dalszą analizą.
3. Oznaczanie ilościowe oczyszczonego peptydoglikanu
   1. Określić ilościowo ilość oczyszczonych worków workowych z ppkt 1.2.18, aby zapewnić wyrównanie danych dotyczących specyfikacji masy podczas analizy różnicowej (ppkt 3.2). Postępuj zgodnie ze szczegółową metodologią opisaną w Reference¹⁵.
      UWAGA: Oczyszczone woreczki (sekcja 1.2.18) są rozkładane na poszczególne składniki cukrowe i aminokwasowe w procesie hydrolizy kwasowej. Poszczególne składniki są rozdzielane i oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii anionowymiennej z wykorzystaniem detekcji pulsacyjno-amperometrycznej. Biorąc pod uwagę strukturę PG (Rysunek 1), poszczególne muropeptydy składają się z pojedynczej reszty MurNAc i pojedynczej reszty GlcNAc. W związku z tym ilościowe określenie stężenia każdej z pozostałości odpowiada ilości muropeptydów w stosunku 1:1 w próbce. MurNAc jest preferowany ze względu na czystą separację pików od innych składników PG podczas chromatografii¹⁶.

2. Akwizycja danych ze spektrometrii mas

1. Otrzymywanie muropeptydów do spektrometrii mas
   1. Uzupełnij 800 μg oczyszczonych woreczków 100 μg/ml mutanolizyny, 100 mM octanu amonu o pH 5,5 i 50 mM chlorku magnezu w 100 μl reakcji.
   2. Trawić w temperaturze 37 °C przez noc.
   3. Dodać 1:1 objętość 0,5 M buforu boranowego pH 9,0 i uzupełnić ~10 mg/ml borowodorku sodu (NaBH₄).
      UWAGA: Mutarotacja cyklicznych cukrów między α a β formami anomerycznymi spowoduje wielokrotne tworzenie się pików podczas rozdzielania muropeptydów metodą chromatografii cieczowej. Leczenie NaBH₄ eliminuje wzajemną konwersję między tymi dwiema formami poprzez redukcję MurNAc do muramitol¹¹. Zabieg nie powoduje redukcji 1,6-anhydro MurNAc ani 1,4-sprzężonych pozostałości cukrowych.
      UWAGA: W wyniku reakcji NaBH₄ powstają niewielkie ilości wodoru gazowego. Reakcja NaBH₄ spowoduje powstanie pęcherzyków, a rurki do mikrofug powinny być otwarte, aby umożliwić ucieczkę gazu.
   4. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez ~20–30 min.
   5. Odwirować na krótko, aby umieścić próbkę w probówce do mikrofuge i usunąć pęcherzyki.
   6. Dostosuj pH do <4,0 za pomocą kwasu fosforowego w proporcji 1:5, dodawanego w odstępach co 5 μl. Przetestuj pH za pomocą pasków testowych lakmusu pH.
   7. Wirować przy ~17 000 x g przez 1 minutę w celu osadzenia pozostałego nierozpuszczalnego materiału.
   8. Filtrować za pomocą filtrów mikrowirówkowych 0,2 μm.
   9. Próbki są odwirowywane przez 10 minut przy 30 000 x g przed wstrzyknięciem do LC-MS, aby upewnić się, że żadne cząstki nie zostaną wstrzyknięte do MS.
2. Konfiguracja LC-MS
   1. Podłączyć kolumnę C18 z powierzchownie porowatymi cząstkami (100 mm x 2,1 mm, wielkość porów <3 μm) do spektrometru mas z kwadrupolowym czasem przelotu (qtof) o dokładności wykrywania co najmniej czterech miejsc po przecinku m/z.
   2. Przeprowadzić separację muropeptydów metodą chromatografii cieczowej
      UWAGA: Każdy trilikat biologiczny (sekcja 1.1.1) powinien być przepuszczony przez LC-MS (sekcja 2.2.2 do 2.2.3) trzy razy (potrójny egzemplarz techniczny). W związku z tym każdy testowany warunek będzie zawierał łącznie dziewięć plików danych LC-MS. Akwizycji danych dokonano przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Jednak oprogramowanie do akwizycji powinno być wybrane w oparciu o maszyny MS. Poniżej znajduje się przewodnik dotyczący konfigurowania MS z parametrami specyficznymi dla uruchamiania tego protokołu. Szczegółowy opis znajduje się w instrukcji producenta.
      1. Do rozdzielania chromatograficznego przygotować następujące rozpuszczalniki: 0,1% kwas mrówkowy (A) i acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (B).
      2. Ustawić metodę rozdzielania chromatograficznego, używając następujących parametrów.
      3. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 ml/min.
      4. Kondycjonuj kolumnę przez 10 minut w temperaturze 2% B (~24 objętości kolumny).
      5. Za pomocą automatycznego podajnika próbek wstrzyknąć 10 μl próbki z sekcji 2.1.9.
         UWAGA: Przed rozpoczęciem zbierania danych należy przepuścić jedną próbkę początkową przez protokół LC-MS. Ten przebieg nie jest używany do danych, ale w celu zwiększenia odtwarzalności czasu przechowywania dla wszystkich kolejnych przebiegów. Odtwarzalność czasu retencji jest wymagana podczas przetwarzania spektralnego (sekcja 3.1) w celu dokładnej identyfikacji i grupowania pików stosunku masy do ładunku (m/z).
      6. Oddziel muropeptydy za pomocą 2% B przez 5 minut (~12 objętości kolumn), następnie zwiększ do 15% B w ciągu 13 minut (~30 objętości kolumn), dalej zwiększając do 50% B w ciągu 10 minut (~24 objętości kolumn), a na koniec zwiększając do 98% B w ciągu 2 minut (~5 objętości kolumn).
         UWAGA: Wyrzuć (wyślij do kosza) pierwsze 2 minuty i ostatnie 5 minut gradientu.
      7. Zakończ płukaniem kolumny w temperaturze 98% B przez 6 minut (~14 objętości kolumny) i 20 minut (~47 objętości kolumny) ponownego równoważenia.
   3. Wykonywanie detekcji muropeptydów za pomocą spektrometrii mas
      1. Skalibrować oś masy w trybie dodatnim za pomocą mieszanki strojeniowej z acetonitrylu zawierającej wzorce masy odniesienia LC-MS zgodnie z instrukcjami producenta MS.
         UWAGA: MS jest strojony przed rozpoczęciem serii chromatograficznych (sekcja 2.2.2.1).
      2. Skonfiguruj metodę pozyskiwania danych MS przy użyciu następujących parametrów.
         UWAGA: Dane MS i MS/MS są zbierane (sekcje 2.2.3.2-2.2.3.6) jednocześnie z chromatograficznym rozdzielaniem muropeptydów (sekcje 2.2.2.4 i 2.2.2.5). Zarówno parametry chromatograficzne, jak i parametry MS (sekcje 2.2.2.2 i 2.2.3.2) są pojedynczą metodą, która jest dodawana podczas tworzenia listy roboczej do sekwencyjnego badania wielu próbek.
      3. Ustawić napięcie kapilary elektronatrysku na 4,0 kV, a temperaturę gazu suszącego na 350°C przy natężeniu przepływu 13 l/min.
         UWAGA: Azot (czystość >99%) powinien być używany jako gaz nebulizujący, suszący i zderzeniowy podczas zbierania wszystkich danych spektrometrii mas.
      4. Ustaw ciśnienie w nebulizatorze na 40 psi i ustaw fragmentor na 150 V.
      5. Ustaw dyszę, skimmer i oktapol RF voltages odpowiednio na 1000 V, 65 V i 750 V.
      6. Ustaw zakres skanowania na 300–2 000 m/z w trybie jonów dodatnich 4 GHz (rozszerzony zakres dynamiki).
      7. Zestaw zbierania danych przy użyciu akwizycji MS/MS zależnej od danych z szybkością skanowania MS i MS/MS wynoszącą 1 widmo na sekundę. Wybierz pięć mas prekursorowych na cykl, w kolejności pojedynczo, podwójnie i potrójnie naładowanych.
      8. Ustaw energie zderzeń fragmentacyjnych MS/MS na 15, 20 i 30 eV.

3. Analiza różnicowa obfitości muropeptydów

1. Przetwarzanie spektralne chromatogramu LC-MS
   UWAGA: Ekstrakcja cech rekurencyjnych została przeprowadzona przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania (patrz Spis materiałów). Można użyć innego oprogramowania do wyodrębniania cech. Jednak inne programy mogą wymagać dodatkowego ręcznego przetwarzania danych w celu uzyskania wysoce niezawodnej ekstrakcji rekurencyjnej. Różne programy używają terminologii cecha, jednostka i związek prawie zamiennie. W przypadku analizy PG wszystkie odnoszą się do identyfikacji chromatogramu jonowego LC-MS reprezentatywnego dla pojedynczego muropeptydu (np. Rysunek 3). Podczas przetwarzania spektralnego (sekcja 3.1), cecha reprezentuje wiele pików m/z, które obejmują wiele możliwych form jonów pojedynczego muropeptydu, które są zgrupowane razem pod jednym znacznikiem związku.
   1. W obszarze Plik rozpocznij nowy projekt.
   2. Dodaj pliki danych LC-MS QTOF i przypisz poszczególne pliki danych do warunku / grupy eksperymentalnej, np. dwóch różnych warunków wzrostu.
   3. Uruchom kreatora przetwarzania danych Wsadowa rekurencyjna ekstrakcja cech (małe cząsteczki/peptydy) i ustaw filtry przetwarzania danych tak, aby odpowiadały parametrom warunków LC-MS i oprzyrządowania, aby dokładnie zidentyfikować, pogrupować i zweryfikować piki m/z reprezentujące poszczególne muropeptydy. Na podstawie chromatogramu zbadaj dryft czasu retencji i zmienność m/z znanych podobnych pików, aby ustawić początkowe parametry filtra.
      UWAGA: Rekurencyjna ekstrakcja cech wykorzystuje początkowy algorytm ekstrakcji cech molekularnych bez ukierunkowania do identyfikacji i wyrównania cech chromatogramu (pików m/z) we wszystkich plikach danych. Po utworzeniu cechy te są wykorzystywane do ponownej oceny oryginalnych plików danych (rekurencyjnych) za pomocą ukierunkowanego algorytmu ekstrakcji cech molekularnych w celu poprawy wiarygodności i dokładności zidentyfikowanych cech. Najlepiej jest ustawić początkową ekstrakcję nieukierunkowaną z wąskim oknem wykrywania i użyć szerszych parametrów wykrywania dla ekstrakcji rekurencyjnej w celu zidentyfikowania pików we wszystkich plikach danych, których może brakować w początkowej ekstrakcji. Uruchamianie cyklicznego wyodrębniania funkcji może potrwać wiele godzin, w zależności od liczby próbek, złożoności danych i obecnego sprzętu komputerowego
   4. Przejrzyj wyniki wyodrębniania funkcji. Jeśli znaczna liczba obiektów nie została wyrównana w grupie, dostosuj parametry filtrowania cyklicznego, aby poszerzyć/ograniczyć okno wykrywania zgodnie z wymaganiami. Aby to osiągnąć, należy sprawdzić chromatogram i profil izotopowy każdej wyodrębnionej cechy, aby upewnić się, że wykrywanie cech zostało przeprowadzone w podobny sposób we wszystkich plikach danych. Ponadto dla każdej zidentyfikowanej funkcji w pliku danych należy sprawdzić wynik, wszelkie ostrzeżenia oraz to, czy obiekt przeszedł wybrane parametry filtru.
      UWAGA: Należy zadbać o to, aby okna wykrywania były na tyle wąskie, aby poszczególne obiekty nie zostały omyłkowo zgrupowane. Jest to często sygnalizowane przez rozbieżne profile izotopowe między plikami danych lub znaczne różnice w czasie m/z / przechowywania. I odwrotnie, jeśli istnieje wiele cech o podobnych czasach m/z i przechowywania, możliwe jest, że parametry filtra były zbyt rygorystyczne, co spowodowało, że jeden pik MS został podzielony na dwie cechy. W związku z tym należy ponownie uruchomić wyodrębnianie cech (sekcja 3.1.3) z dostosowanymi parametrami filtru czasu przechowywania, aby umożliwić lepsze grupowanie tych cech. Wizualizacja najniższych szczytów liczebności wskaże, czy zastosowane filtry (sekcja 3.1.3) dokładnie zidentyfikowały piki powyżej szumu tła. Jeśli szczyty najniższej liczebności są podobne do tła, uruchom ponownie wyodrębnianie funkcji z nowymi parametrami filtru tła.
   5. Eksportuj dane w postaci pliku wymiany złożonej (.cef) (format zgodny z oprogramowaniem statystycznym) lub pliku oddzielonego kolumnami (.csv), który zawiera masę, czas retencji i obfitość każdej cechy dla każdej próbki.
2. Analiza różnicowa cech spektralnych
   UWAGA: Analizę różnicową przeprowadzono przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania (patrz Tabela Materiałów). Można korzystać z innego oprogramowania bioinformatycznego.
   1. Otwórz program i po otrzymaniu instrukcji rozpocznij nowy projekt.
   2. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi importowania i analizowania danych. Podczas importowania danych prześlij wyodrębnione pliki (sekcja 3.1). Podczas analizy danych wybierz istotność i zmianę krotności dla analizy różnicowej i wybierz linię bazową danych do mediany intensywności we wszystkich plikach danych. Nie ustawiaj żadnych filtrów danych (jeśli zostało to zrobione w poprzednim kroku przetwarzania widm (sekcja 3.1)), ponieważ ponowne zastosowanie filtrów zanegowałoby solidną ekstrakcję cech rekurencyjnych. Jednak, podobnie jak w przypadku ekstrakcji cech, analiza różnicowa musi być dostosowana w oparciu o masę (m/z) i czas retencji z powodu dryfu w zbiorze danych LC-MS. Użyć parametrów określonych podczas wyodrębniania cech (sekcja 3.1).
      UWAGA: Normalizować między plikami danych za pomocą oceny ilościowej muropeptydu (sekcja 1.3), aby upewnić się, że różnice wynikają z parametrów eksperymentalnych, a nie z różnic w oczyszczaniu kości krzyżowej (sekcja 1.2). Użyj opcji skalera zewnętrznego, aby dostosować każdy plik danych pod kątem różnic w stężeniu MurNAc w próbce.
   3. Po zakończeniu analizy należy zapoznać się z wynikającymi analizami graficznymi i statystycznymi w celu zidentyfikowania muropeptydów, które wykazują znaczącą zmianę liczebności między badanymi warunkami eksperymentalnymi.
   4. W nawigatorze projektu kliknij prawym przyciskiem myszy różne analizy i wybierz opcję eksportu, aby zapisać szczegóły elementu jako plik danych rozdzielonych kolumnami (.csv), który zawiera m/z, czas przechowywania, surowe i znormalizowane wartości intensywności, wartość p, FDR i zmiany zagięcia dla każdej cechy. Aby uzyskać wszystkie istotne dane, należy zapisać wiele analiz.
   5. Eksportuj drugi plik .csv zawierający tylko te muropeptydy, które przekroczyły analizy statystyczne, w tym wartość p <0,05 i zmianę krotności >2.
3. Adnotacja tożsamości muropeptydu do cech spektralnych
   UWAGA: Każda zidentyfikowana cecha musi mieć przypisaną przewidywaną strukturę muropeptydową na podstawie m/z, a adnotacja ta musi zostać potwierdzona przez badanie fragmentacji MS/MS. Po potwierdzeniu adnotacji może być konieczne przeprowadzenie i doprecyzowanie analizy różnicowej (sekcja 3.2).
   1. W oprogramowaniu do analizy różnicowej, w obszarze Interpretacja wyników, wybierz opcję Przeglądarka identyfikatorów. Dodaj bibliotekę oczekiwanych struktur muropeptydowych i wybierz parametry podobne do używanych wcześniej (sekcja 3.1.3). W ten sposób zostanie wygenerowana przewidywana adnotacja muropeptydu dla każdej zidentyfikowanej cechy. Biblioteka struktur muropeptydowych może być tworzona przy użyciu m/z dla przewidywanych struktur muropeptydowych i oprogramowania bazodanowego MS (patrz tabela materiałów). Jednak bibliotekę m/z zawierającą >6 000 możliwych muropeptydów można znaleźć w Reference¹².
   2. Wybierz przewidywaną adnotację muropeptydu na podstawie pasującego wyniku i biologicznego znaczenia przewidywanego muropeptydu, tj. wybierz najbardziej prawdopodobny muropeptyd obecny w próbce biologicznej.
   3. Ręcznie potwierdź przewidywaną adnotację muropeptydu, porównując piki m/z chromatogramu MS/MS z przewidywanymi m/z wszystkich możliwych fragmentacji znanej struktury muropeptydowej (np. Rysunek 4).
      1. Przeglądaj dane MS i MS/MS za pomocą programu do przeglądania chromatogramów (patrz Tabela materiałów, Rysunek 4).
      2. Narysuj przewidywaną strukturę muropeptydu za pomocą edytora molekularnego (program do rysowania struktury chemicznej) (patrz Tabela materiałów, Rysunek 4, szara wstawka). Użyj narzędzia do fragmentacji masowej, aby pokazać m/z fragmentów MS, gdy każde wiązanie jest zrywane pojedynczo lub w połączeniu.
         UWAGA: W zależności od energii fragmentacji użytej do MS/MS, fragmentacja może wystąpić przy dowolnym wiązaniu w strukturze muropeptydu. Jednak niektóre wiązania są łatwiej / częściej fragmentowane na niższych poziomach energii. Na przykład fragmentacja w łańcuchu bocznym peptydu zachodzi najczęściej na wiązaniu amidowym między aminokwasami. Oceniając fragmentację, należy zauważyć, że reszty GlcNAc są bardzo łatwo fragmentowane od muropeptydu. W związku z tym fragmentację znanej struktury muropeptydu należy oceniać z GlcNAc i bez niego. Ze względu na fragmentację GlcNAc w źródle, kilka cech wyodrębnionych w przetwarzaniu spektralnym (sekcja 3.1) może reprezentować pojedynczą strukturę muropeptydu. W przypadku znalezienia tych cech należy je połączyć, a analiza różnicowa ponownie ocenić.
      3. Porównać wszystkie możliwe fragmentacje struktury muropeptydu, które zostały określone (sekcja 3.3.3.2) z chromatogramem MS/MS (sekcja 3.3.3.1). Aby potwierdzić adnotację muropeptydu, piki m/z wielu fragmentów powinny być znalezione na chromatogramie MS/MS z bardzo minimalnym oknem wyrównania m/z (Rysunek 4).
      4. W celu wyjaśnienia tożsamości muropeptydu w przypadku niejednoznacznej fragmentacji MS/MS, należy powtórzyć sekcje od 2.2.2 do 2.2.3 z próbkami (sekcja 2.1.9) w celu dodatkowego pozyskania danych MS/MS zawierających preferowaną listę prekursorów m/z i czas retencji z dodatkowymi energiami zderzenia fragmentacji MS/MS.
   4. W przypadku jednostek współeluujących, które zostały oznaczone jako ten sam muropeptyd, ponownie uruchom analizę różnicową (sekcja 3.2.2) i połącz wyodrębnione cechy.
4. Ocena globalnych zmian w modyfikacjach muropeptydów
   1. Edytuj plik .csv (sekcja 3.2.4) statystycznie istotnych muropeptydów o dużej krotności, aby uwzględnić pojedynczą kolumnę dla każdej modyfikacji muropeptydu. Wypełnić tę kolumnę oznaczeniem dla każdego muropeptydu z adnotacją (sekcja 3.3) (np. acetylowany kontra de-N-acetylowany GlcNAc lub MurNAc).
   2. Prześlij zmodyfikowany plik .csv do Perseus^22,23. Zaimportuj znormalizowane wartości intensywności do pola Import główny i zaimportuj oznaczenie modyfikacji do pola Import kategorii.
   3. W obszarze Dodawanie adnotacji do wierszy kliknij pozycję Kategorycznie adnotuj wiersze i dodaj pliki danych do każdego parametru eksperymentalnego.
   4. W obszarze test kliknij dwa przykładowe testy, aby wykonać test t studenta (wartość p < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
   5. Kliknij na 1D, aby wykonać adnotację 1D^22,23. Adnotacja 1D FDR < 0,05 wskazuje na istotną zmianę liczebności modyfikacji muropeptydu między badanymi parametrami eksperymentalnymi. Ustawienie wartości progowej (s0) = 1 spowoduje wyświetlenie wyników FDR adnotacji 1D dla wszystkich muropeptydów.
   6. W oprogramowaniu do tworzenia wykresów (patrz Tabela materiałów) utwórz mapę cieplną zmiany krotności obfitości dla każdej modyfikacji muropeptydu i pokaż wynik adnotacji 1D, aby zademonstrować istotność (Rysunek 5B). Zmianę krotności każdej modyfikacji muropeptydu można uzyskać w programie Microsoft Excel przy użyciu surowych intensywności wszystkich pojedynczych muropeptydów, które zawierają modyfikację.

Zwiększona czułość wykrywania maszyn MS w połączeniu z oprogramowaniem do rozpoznawania pików o dużej mocy poprawiła możliwość izolowania, monitorowania i analizowania składu substancji złożonych próbek w najdrobniejszych szczegółach. Korzystając z tych osiągnięć technologicznych, ostatnie badania nad składem peptydoglikanu zaczęły wykorzystywać techniki automatycznej ekstrakcji cech LC-MS12,13,14,24 w porównaniu ze starszą metodologią opartą na HPLC11,25,26,27, 28,29,30,31. Chociaż dostępnych jest wiele ogólnych pakietów oprogramowania do ekstrakcji cech, komercyjne oprogramowanie wykorzystujące rekurencyjną ekstrakcję cech jest szybkie i bardzo niezawodne, automatycznie identyfikując i łącząc wszystkie ładunki, izotopy i wersje adduktów każdego muropeptydu znalezionego w zestawie danych LC-MS (Rysunek 3). Ponadto początkowe czasy przechowywania, m/z i wzorce izotopowe wyodrębnionych cech są wykorzystywane do ponownej oceny (rekurencyjnej) zbioru danych w celu zapewnienia dokładnej identyfikacji każdej cechy we wszystkich plikach danych. W związku z tym algorytm rekurencyjny pomaga w walidacji i zwiększaniu pewności identyfikacji pików. Większość ogólnych programów do ekstrakcji cech nie grupuje ładunków/izotopów itp. i będzie wymagać tego jako dodatkowego kroku ręcznego. Ponadto programy ogólne będą mniej niezawodne, ponieważ funkcje są wyodrębniane oddzielnie w każdym pliku danych, a nie jako cały zestaw danych, który jest częścią algorytmu rekurencyjnego.

Przedstawiony tutaj protokół peptydoglikomiczny został ostatnio wykorzystany do zbadania zmian składu PG pomiędzy dwoma fizjologicznymi warunkami wzrostu, a mianowicie swobodnie pływającym planktonem i stacjonarnym wspólnym biofilmem12. Korzystając z bardzo czułego QTOF MS w połączeniu z rekurencyjną ekstrakcją cech, rozpoznano i śledzono 160 różnych muropeptydów. Stanowiło to ośmiokrotność liczby muropeptydów zidentyfikowanych w tym organizmie wcześniej29,32 i ponad dwukrotnie więcej niż muropeptydy zidentyfikowane przy użyciu innych metodologii w innych organizmach10,14,24.

Powiązanie każdego piku m/z wyodrębnionego z danych MS z konkretnym muropeptydem jest ułatwione przez odniesienie do bazy danych znanych i przewidywanych struktur muropeptydowych. Chromatogram fragmentacji MS/MS (Rysunek 4) dla każdej wyodrębnionej cechy jest porównywany z profilem fragmentacji (Rysunek 4, szara wstawka) muropeptydu proponowanego przy użyciu bazy danych.

Dane peptidoglycomic mogą być przeglądane na wiele różnych sposobów, w zależności od konfiguracji eksperymentu i zadawanych pytań. Taka analiza graficzna może obejmować analizę głównych składowych (PCA), wykresy rozrzutu, wykresy wulkanów, mapy cieplne i hierarchiczną analizę klastrów. Na przykład wykresy wulkanów podkreślają muropeptydy, które wykazują statystycznie istotną dużą zmianę liczebności między badanymi warunkami (Rysunek 5A). Te wybrane muropeptydy, które reprezentują znaczące zmiany liczebności między badanymi warunkami, mogą być dalej badane pod kątem modyfikacji muropeptydów. Modyfikacje te mogą obejmować obecność podstawień aminokwasów, zmiany acetylacji lub obecność aktywności amidazy. Badane razem, wiele muropeptydów posiadających tę samą modyfikację może być badanych pod kątem tendencji do jednego warunku eksperymentalnego (Rysunek 5A - zaznaczone punkty na zielono) i całej grupy ocenianej pod kątem istotności ( Figura 5B). Śledzenie modyfikacji muropeptydu w ten sposób może wskazać na określoną aktywność enzymatyczną, na którą wpływa parametr eksperymentalny. Ponadto wartości odstające od tego trendu mogą wskazywać na aktywność enzymatyczną o określonej specyficzności lub funkcji biologicznej (Rysunek 5A — punkty podświetlone na pomarańczowo).

Rycina 1: Przykład typowej struktury peptydoglikanu Gram-ujemnego. (A) U bakterii Gram-ujemnych peptydoglikan znajduje się w peryplazmie między błoną wewnętrzną i zewnętrzną. (B) Pojedynczy muropeptyd składa się z N-acetyloglukozaminy połączonej β-1,4 (GlcNAc) (niebieski) i kwasu N-acetylo-muraminowego (MurNAc) (fioletowy) z dołączonym łańcuchem bocznym peptydu (pomarańczowy). Łańcuch boczny peptydu może być usieciowany z łańcuchem bocznym sąsiedniego muropeptydu, wytwarzając dojrzały peptydoglikan podobny do siatki (A). Oczyszczanie polega na odizolowaniu peptydoglikanu z całej komórki jako woreczka, z którego usunięto cały pozostały materiał komórkowy. (C) Mikrografia elektronów transmisyjnych worka peptydoglikanu. Dla porównania, Gram-dodatni PG może składać się z większej liczby wariantów struktury i jest częścią Gram-dodatniej klasyfikacji taksonomicznej33. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przepływ pracy Peptidoglycomics. Przygotowanie próbki. Krok 1, hoduj i osadzaj komórki bakteryjne (sekcja 1.1). Krok 2, oczyść woreczki peptydoglikanu przez 4% wrzód SDS (sekcja 1.2). Akwizycja danych. Krok 3, trawienie enzymatyczne kości krzyżowych w celu wytworzenia muropeptydów poprzez zerwanie wiązania β-1,4 między N-acetyloglukozaminą (GlcNAc) a kwasem N-acetylomuraminowym (MurNAc) szkieletu peptydoglikanu (sekcja 2.1). Krok 4, analiza intensywności muropeptydu za pomocą LC-MS/MS (sekcja 2.2). Analiza danych. Krok 5, rekurencyjna ekstrakcja cech identyfikuje i zbiera wszystkie ładunki, addukty i izotopy związane z pojedynczym muropeptydem (sekcja 3.1). Etap 6: identyfikacja muropeptydów poprzez porównanie przewidywanej fragmentacji z chromatogramami MS/MS (sekcja 3.3). Etap 7, bioinformatyczna analiza różnicowa (sekcja 3.2) porównująca zmiany składu peptydoglikanu między różnymi parametrami doświadczalnymi. Krok 8, zbadaj globalną zmianę modyfikacji muropeptydów w ramach różnych parametrów eksperymentalnych za pomocą adnotacji 1D (sekcja 3.4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykład wyodrębniania cech rekurencyjnych. Dla muropeptydu reprezentującego peptydowy łańcuch boczny alaniny (A), izo-ᴅ-glutaminianu (E), kwasu mezo-diaminopimelicznego (m), alaniny (A) usieciowanej z AEmA sąsiedniego łańcucha bocznego muropeptydu (1864,8 m/z). Wyodrębniona cecha dla 1864,8 m/z obejmuje ładunki (+1, +2 i +3), addukty (np. sód i potas), ubytek GlcNAc (1 lub 2 GlcNAc) oraz wiele pików izotopowych dla każdej odmiany (np. powiększona wstawka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Fragmentacja i identyfikacja muropeptydów. Do adnotacji, każdemu pikowi (cechi) m/z wyekstrahowanemu z chromatogramu MS podaje się proponowaną strukturę muropeptydu opartą na podobieństwie do biblioteki muropeptydów. Aby potwierdzić tę proponowaną strukturę, przewidywane fragmenty MS/MS są generowane za pomocą programu do rysowania chemicznego (szara wstawka). Tę przewidywaną fragmentację porównuje się z chromatogramem MS/MS. Gdy przewidywane fragmenty (szara wstawka) pasują do chromatogramu MS/MS, proponowana struktura muropeptydu zostaje potwierdzona. Rysunek został zmodyfikowany z Reference12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Analiza różnicowa składu peptydoglikanu. (A) Wykres wulkaniczny zmiany fałdu i istotność statystyczna zmian intensywności muropeptydu między peptydoglikanem oczyszczonym z P. aeruginosa uprawianym jako swobodnie pływająca hodowla planktonu lub stacjonarna hodowla biofilmu. Wszystkie muropeptydy, które mają modyfikację, która reprezentowała zmianę w typowym układzie aminokwasów w łańcuchu bocznym peptydu, są wyróżnione. Muropeptydy podstawione aminokwasami, które wykazywały tendencję do zmniejszania obfitości peptydoglikanu pochodzącego z biofilmu, są zaznaczone na zielono. Muropeptydy podstawione aminokwasami, które odstawały od tego trendu i wykazywały zwiększoną obfitość peptydoglikanu pochodzącego z biofilmu, są zaznaczone na pomarańczowo. (B) Mapa cieplna globalnej zmiany fałdowania obfitości wszystkich podstawionych aminokwasów muropeptydów o zwiększonej obfitości (pomarańczowy) i zmniejszonej obfitości (zielony) w biofilmach. Te muropeptydy przegrupowano i oceniono, czy substytucja aminokwasów nastąpiła na monomerach, usieciowanych dimerach, czy też podstawiono czwarty (AEm +), piąty (AEmA +) lub oba aminokwasy (AEm ++). Istotność każdej grupy muropeptydów oceniono za pomocą adnotacji 1D z FDR < 0,05 dla istotności i wyświetlany jest powiązany wynik 1D. Adnotację 1D można przeprowadzić tylko na więcej niż 2 muropeptydach (np. substytucję AEm++ stwierdzono tylko na dwóch muropeptydach). Dlatego w tym przypadku należy zbadać znaczenie dla poszczególnych muropeptydów, a nie dla grupy. Rysunek został zmodyfikowany z Reference12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.