Method Article

Wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1

DOI:

10.3791/61805

⸱

October 2nd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, 2Graduate Program in Translational Biology, Medicine and Health, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biomedical Engineering and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Basic Science Education, Virginia Tech Carilion School of Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy bardziej spójną i szybką metodę ilościowego oznaczania przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1 za pomocą Fiji-ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak piersi jest wyniszczającym nowotworem, odpowiadającym za 40 000 zgonów kobiet i 30% nowych diagnoz raka u kobiet w samych Stanach Zjednoczonych w samym tylko 2019 roku. Główną przyczyną zgonów związanych z rakiem piersi jest obciążenie przerzutami. Dlatego modele przedkliniczne raka piersi muszą analizować obciążenie przerzutami, aby były istotne klinicznie. Model raka piersi 4T1 zapewnia spontanicznie przerzutowy, ilościowy mysi model ludzkiego raka piersi w IV stadium. Jednak większość protokołów 4T1 określa ilościowo obciążenie przerzutami poprzez ręczne liczenie barwionych kolonii na płytkach do hodowli tkankowych. Chociaż jest to wystarczające w przypadku tkanek o mniejszym obciążeniu przerzutami, błąd ludzki podczas ręcznego liczenia powoduje niespójne i zmienne wyniki, gdy płytki są zlewające się i trudne do policzenia. Ta metoda oferuje komputerowe rozwiązanie błędu liczenia przez człowieka. W tym przypadku oceniamy protokół za pomocą płuc, tkanki o wysokim stopniu przerzutów w modelu 4T1. Obrazy płytek zabarwionych na niebiesko metylenem są pozyskiwane i przesyłane do analizy w Fiji-ImageJ. Następnie Fiji-ImageJ określa procent wybranego obszaru obrazu, który jest niebieski, reprezentując procent płytki z przerzutami. To podejście komputerowe zapewnia bardziej spójne i szybsze wyniki niż ręczne liczenie lub ocena histopatologiczna w przypadku tkanek o silnych przerzutach. Spójność wyników Fiji-ImageJ zależy od jakości obrazu. Mogą wystąpić niewielkie różnice w wynikach między obrazami, dlatego zaleca się wykonanie wielu zdjęć i uśrednienie wyników. Pomimo minimalnych ograniczeń, metoda ta stanowi ulepszenie w ilościowym określaniu obciążenia przerzutami w płucach, oferując spójne i szybkie wyniki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U jednej na osiem kobiet zostanie zdiagnozowany rak piersi w ciągu swojego życia, a mimo to pomimo wielu opcji leczenia, rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem u amerykańskich kobiet1. Te kobiety nie umierają z powodu pierwotnego guza w piersi. Zamiast tego obciążenie przerzutami jest odpowiedzialne za śmiertelność tej choroby, ponieważ często rozprzestrzenia się na płuca, kości, mózg, wątrobę i węzły chłonne2. Z tego powodu modele raka piersi muszą oceniać przerzuty, aby przyczynić się do ograniczenia śmiertelności z powodu tej choroby. Mysi model raka piersi 4T1 jest doskonałym protokołe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Virginia Tech oraz zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykonanie tego protokołu wymaga zgody odpowiednich instytucji i przestrzegania wszystkich odpowiednich wytycznych.

1. Hodowla komórkowa

  1. Przygotuj kompletne pożywki hodowlane (RPMI + 10% płodowa surowica bydlęca +1% paciorkowiec piórkowy). Ożywić komórki 4T1 zgodnie z protokołem ATCC 10 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w kolbie T-25 aż do konfluen....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda zawiera proste poprawki z protokołu 4T1 Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga3 i może być wizualizowana w Rysunek 1. Kiedy 3 oddzielnych badaczy ręcznie policzyło kolonie przerzutowe dla 12 płytek płucnych (rozcieńczenie 1:10), wyniki były bardzo niespójne między różnymi licznikami (Rysunek 2A). Wszyscy badacze zostali poinstruowani, aby "policzyć kolonie przerzutowe, które pojawiają się jako niebieskie kropki", jednak niespójności pokazują pr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wykazano, ręczne liczenie kolonii przerzutów na każdej płytce płucnej może być niedokładną i nieprecyzyjną metodą ilościowego określania przerzutów do płuc, co wskazuje na potrzebę lepszego sposobu oznaczania ilościowego (ryc. 2). Analiza histopatologiczna różniła się nieznacznie zarówno od ręcznego liczenia, jak i analizy Fidżi-ImageJ (ryc. 2B i 4D), prawdopodobnie dlatego, że szkiełka H&E nie są reprezentatywną próbką całego narządu. Proto.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) oraz National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Komora anestezjologicznaZobacz komentarzeZobacz komentarze Korzystajzatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji Środek
znieczulającyZobaczkomentarze Zobacz komentarzeKorzystaj z zatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji
BALB/c Samice myszyLaboratorium Jacksona000651
nożyczkiRobozRS-6700
KalkulatorDowolnaDowolna
kameraDowolnaMinimum 8 megapikseli
WirówkaDowolna DowolnaMusibyć zdolna do 125 x g i 300 x g
Konfiguracja eutanazji CO2Zobacz komentarzeZobacz komentarze Korzystajzatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji
Chłodnia, lodówka, chłodniaDowolna Dowolna
Komputer z Fiji-ImageJDowolnyMusibyć w stanie uruchomić Fiji-ImageJ
Komora liczącaFisher Scientific02-671-10
Zakrzywione nożyczkiRobozRS-5859
Woda destylowanaDowolnaDowolna
ElastazaMP Biomedicals100617
Waga elektronicznaDowolna Dowolna
Płodowa surowica bydlęca (FBS)R& D SystemsS11150
KleszczeRobozRS-8100
Inkubator lodowyNiedotyczy
Zobacz komentarze Zobaczkomentarze Zobacz komentarzeMusi być zdolny do 5% CO2 oraz 37 ° C
MetanolFisher ScientificA412SK-4
Błękit metylenowySigma-Aldrich03978-250ML
Penicylina StreptomycynaATCC30-2300
Szpilki lub igłyDowolne DowolnyDo przygniażdżania myszy podczas sekcji
Suwmiarki plastikoweVWR25729-670
RMPI-1640 ŚredniATCC30-2001
Rocker lub koło obrotoweDowolne
Ostre nożyczkiRobozRS-6702
Sterylny filtr jednorazowy z membraną PESTermoFisher Scientific568-0010
T-150 KolbyFisher Scientific08-772-48
T-25Kolby Fisher Scientific10-126-10
Kolby T-75Fisher Scientific13-680-65
Trójkątna plastikowa zlewkaFisher Scientific14-955-111FSłuży do ważenia myszy
Błękit trypanowyVWR97063-702
Trypsyna-EDTAATCC30-2101
Kolagenaza typu IVSigma-AldrichC5138
3,5 cm płytki do hodowli tkankowychNunclon153066
strzykawka 1 mlBD309659
1,7 ml probówki do mikrowirówekVWR87003-294
10 cm płytki do hodowli tkankowychFisher Scientific08-772-22
12-dołkowa płytkaCorning3512
15 ml probówka wirówkowaFisher Scientific14-959-70C
1X Sól fizjologiczna buforowana phostfatem Dulbecco (DPBS)Fisher ScientificSH30028FS
1X Hank' s Zrównoważony roztwór soli fizjologicznej (HBSS)Thermo ScientificSH3026802
27 g 1/2 cala igiełFisher Scientific14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&nieśmiały; 2539&handel ;)ATCCCRL-2539
Probówka wirówkowa 50 mlFisher Scientific14-959-49A
6-tioguaninaSigma-AldrichA4882
70 μ Filtr siatkowy MFisher Scientific22-363-548
70% etanolSigma AldrichE7023Rozcieńczyć do 70% wodą DI
z z zwłok

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
  2. Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (201....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung Metastasis Quantification4T1 Breast Cancer ModelComputer based Image AnalysisFiji ImageJ AnalysisMethylene Blue StainingMetastatic Burden MeasurementTissue Culture Plate AnalysisColony Counting AutomationImage Thresholding MethodMetastasis Detection Protocol

Related Articles