Wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1

Summary

Opisujemy bardziej spójną i szybką metodę ilościowego oznaczania przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1 za pomocą Fiji-ImageJ.

Abstract

Rak piersi jest wyniszczającym nowotworem, odpowiadającym za 40 000 zgonów kobiet i 30% nowych diagnoz raka u kobiet w samych Stanach Zjednoczonych w samym tylko 2019 roku. Główną przyczyną zgonów związanych z rakiem piersi jest obciążenie przerzutami. Dlatego modele przedkliniczne raka piersi muszą analizować obciążenie przerzutami, aby były istotne klinicznie. Model raka piersi 4T1 zapewnia spontanicznie przerzutowy, ilościowy mysi model ludzkiego raka piersi w IV stadium. Jednak większość protokołów 4T1 określa ilościowo obciążenie przerzutami poprzez ręczne liczenie barwionych kolonii na płytkach do hodowli tkankowych. Chociaż jest to wystarczające w przypadku tkanek o mniejszym obciążeniu przerzutami, błąd ludzki podczas ręcznego liczenia powoduje niespójne i zmienne wyniki, gdy płytki są zlewające się i trudne do policzenia. Ta metoda oferuje komputerowe rozwiązanie błędu liczenia przez człowieka. W tym przypadku oceniamy protokół za pomocą płuc, tkanki o wysokim stopniu przerzutów w modelu 4T1. Obrazy płytek zabarwionych na niebiesko metylenem są pozyskiwane i przesyłane do analizy w Fiji-ImageJ. Następnie Fiji-ImageJ określa procent wybranego obszaru obrazu, który jest niebieski, reprezentując procent płytki z przerzutami. To podejście komputerowe zapewnia bardziej spójne i szybsze wyniki niż ręczne liczenie lub ocena histopatologiczna w przypadku tkanek o silnych przerzutach. Spójność wyników Fiji-ImageJ zależy od jakości obrazu. Mogą wystąpić niewielkie różnice w wynikach między obrazami, dlatego zaleca się wykonanie wielu zdjęć i uśrednienie wyników. Pomimo minimalnych ograniczeń, metoda ta stanowi ulepszenie w ilościowym określaniu obciążenia przerzutami w płucach, oferując spójne i szybkie wyniki.

Introduction

U jednej na osiem kobiet zostanie zdiagnozowany rak piersi w ciągu swojego życia, a mimo to pomimo wielu opcji leczenia, rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem u amerykańskich kobiet¹. Te kobiety nie umierają z powodu pierwotnego guza w piersi. Zamiast tego obciążenie przerzutami jest odpowiedzialne za śmiertelność tej choroby, ponieważ często rozprzestrzenia się na płuca, kości, mózg, wątrobę i węzły chłonne². Z tego powodu modele raka piersi muszą oceniać przerzuty, aby przyczynić się do ograniczenia śmiertelności z powodu tej choroby. Mysi model raka piersi 4T1 jest doskonałym protokołem, aby to osiągnąć. Opisana tutaj metoda oferuje ulepszenie modelu 4T1 dzięki wykorzystaniu Fiji-ImageJ do ilościowego określenia przerzutów do płuc, dając spójne i szybkie wyniki.

Model 4T1 jest dobrze ugruntowany, a większość laboratoriów korzysta z protokołów takich jak te opisane przez Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga w 2001 roku³. Linia komórkowa 4T1 jest oporna na 6-tioguaninę (6TG) i reprezentuje stadium IV, potrójnie ujemnego raka piersi^3,4,5. Jest to klinicznie istotne, ponieważ jest to model ortotopowy i spontanicznie daje przerzuty do tych samych narządów, co w ludzkim raku piersi^3,4. Komórki 4T1 spontanicznie dają przerzuty w przewidywalnym tempie na podstawie ilości wstrzykniętych komórek^3,4. Co ważne, różnice genetyczne między wykorzystanymi tutaj myszami spowodowały oczekiwaną zmienność międzyosobniczą obciążenia przerzutowego. Aby ocenić przerzuty, pobiera się tkanki w celu zebrania i ilościowego określenia komórek rakowych w odległych miejscach przy użyciu selekcji 6TG i barwienia błękitem metylenowym. Rezultatem jest zbiór płytek do hodowli tkankowych z niebieskimi kropkami reprezentującymi kolonie przerzutowe. Jednak protokół Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga określa ilościowo kolonie przerzutów poprzez ich ręczne liczenie, a zatem jest to standardowy sposób oceny przerzutów w tym modelu. Chociaż jest to łatwe w przypadku tkanek o niskim obciążeniu przerzutami, tkanki takie jak płuca są często obciążone przerzutami. Ponieważ płytki płucne mogą być silnie zlewne, dokładne i precyzyjne określanie ilościowe kolonii przerzutów za pomocą ręcznego liczenia jest trudne i podatne na błędy ludzkie. Aby lepiej określić ilościowo obciążenie przerzutami, opisujemy użycie Fiji-ImageJ do komputerowego rozwiązania błędu liczenia przez człowieka. Analiza histopatologiczna z barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) jest kolejnym sposobem ilościowego oznaczania przerzutów do płuc i, co ciekawe, została również ulepszona dzięki oprogramowaniu Fiji-ImageJ^6,7. Ponieważ jednak analiza histopatologiczna obserwuje pojedynczy wycinek płuca, może być niedokładna i niereprezentatywna. Dzieje się tak, ponieważ model 4T1 powoduje kilka zmian przerzutowych w całym narządzie, które nie są równomiernie rozłożone. Chociaż ogólne trendy między analizą histopatologiczną a ręcznym liczeniem mogą być podobne⁸, poszczególne wartości mogą się różnić, dlatego analiza histopatologiczna nie powinna być stosowana jako jedyny sposób oceny ilościowej. Wykazujemy korzyści w porównaniu z analizą histopatologiczną i niespójności w ręcznym liczeniu między różnymi licznikami, jednocześnie wykazując spójność stosowania Fiji-ImageJ. Dodatkowo pokazujemy, że ta metoda może skrócić czas inkubacji z 10-14 dni do 5 dni, co oznacza, że badacze mogą analizować dane ze swojego badania znacznie szybciej niż w przypadku polegania na ręcznym liczeniu.

Ta metoda jest zbiorem prostych poprawek do protokołu Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga³. Ponieważ model 4T1 jest szeroko stosowany, a przerzuty do płuc są krytycznym parametrem do pomiaru w modelach przedklinicznych, uważamy, że metoda ta może być szeroko stosowana i jest bardzo cenna dla badaczy raka piersi. Jedyne dodatkowe materiały potrzebne to kamera i dostęp do komputera z Fiji-ImageJ, darmowym oprogramowaniem często używanym do analizy obrazu⁹. Metoda ta koncentruje się w szczególności na przerzutach do płuc, ale może być stosowana w przypadku innych tkanek o znacznym obciążeniu przerzutami.

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Virginia Tech oraz zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykonanie tego protokołu wymaga zgody odpowiednich instytucji i przestrzegania wszystkich odpowiednich wytycznych.

1. Hodowla komórkowa

1. Przygotuj kompletne pożywki hodowlane (RPMI + 10% płodowa surowica bydlęca +1% paciorkowiec piórkowy). Ożywić komórki 4T1 zgodnie z protokołem ATCC ¹⁰ i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w kolbie T-25 aż do konfluencji. Zmień pożywkę następnego dnia po ożywieniu, aby usunąć martwe komórki, i ponownie, jeśli pożywka zostanie zużyta, zanim komórki zlewają się wystarczająco do przejścia.
2. Gdy kolba T-25 zlewa się, przełóż komórki do kolby T-75, odrzucając pożywkę, przemywając kolbę 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) i dodając 500 μl trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą.
   1. Po odłączeniu dodaj do komórek 5 ml podgrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej. Odessać i przenieść 5 ml do kolby T-75 zawierającej 15 ml ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej.
3. Komórki pasażowe w kolbach T-75 co najmniej cztery razy. Zrób to, gdy kolba zlewa się, przemywając 8 ml 1x DPBS, dodając 1 ml trypsyny-EDTA w celu odłączenia komórek, dodając 10 ml podgrzanej pożywki do komórek i rozcieńczając 1:6-1:8 w nowej kolbie T-75 zawierającej 20 ml podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej.
4. Komórki pasażowe do odpowiedniej liczby kolb T-150 zawierających 40 ml ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej dla liczby myszy, które mają być wstrzyknięte. Większość badań będzie wymagała wielu kolb T-150, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek do wstrzyknięcia.
5. Kiedy myszy są gotowe do wstrzyknięcia (8 tygodni lub ważące ponad 20 g, w zależności od IACUC lub protokołów instytucjonalnych), zbieraj komórki, odrzucając pożywkę, myjąc każdą kolbę 10 ml 1x DPBS i dodając 2 ml trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą.
6. Przemyć kolbę 10 ml kompletnej pożywki i przenieść całą zawartość (10 ml pożywki + 2 ml mieszaniny trypsyny i komórek EDTA) do następnej kolby. Kontynuuj mycie i zbieranie komórek z każdej kolby przy użyciu tych samych 10 ml pożywki, aby uniknąć użycia nadmiernej ilości pożywki.
   1. Po zebraniu wszystkich kolb przenieść ich zawartość do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Pobrać próbkę o objętości 10 μl do policzenia w probówce do mikrowirówki i odwirować probówkę stożkową o pojemności 50 ml przy 125 x g przez 5 minut.
7. Podczas wirowania komórek dodaj 10 μl błękitu trypanowego do 10 μl próbki komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Po określeniu całkowitej liczby komórek oblicz stężenie komórek potrzebnych do wstrzyknięcia myszy dla 1,2 x 10⁶ komórek na mysz (na 100 μl).
8. Po odwirowaniu zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości sterylnego 1x DPBS na 1,2 x 10⁶ komórek na 100 μL. Podziel mieszaninę komórek/DPBS na probówki mikrowirówkowe, aby uzyskać łatwy dostęp za pomocą strzykawki podczas zasysania komórek do wstrzykiwań. Utrzymuj komórki na lodzie i wstrzyknij wkrótce potem, ponieważ komórki zaczną obumierać po dłuższym przebywaniu na lodzie.

2. Zastrzyki

1. Przygotować komórki do wstrzyknięcia, stukając lub delikatnie mieszając probówkę mikrowirówki w celu ponownego zawieszenia komórek, a następnie odessać 600 μl do strzykawki o pojemności 1 ml. Obrócić strzykawkę do góry i pociągnąć tłok w dół, aby usunąć komórki z otworu strzykawki. Postukać w strzykawkę, aby usunąć z niej pęcherzyki powietrza.
2. Przymocuj igłę skośnie do góry i dozuj komórki z powrotem do probówki mikrowirówkowej, aż w strzykawce pozostanie tylko 500 μl. Umieścić strzykawkę płasko na lodzie.
   UWAGA: Ogniwa 4T1 szybko wypadają z zawieszenia. Dlatego ważne jest, aby wymieszać komórki z powrotem w zawiesinę poprzez częste stukanie.
3. Znieczulij 8-tygodniową/>20 g samicę myszy BALB/c za pomocą izofluranu lub innego zatwierdzonego środka znieczulającego. Monitoruj oddech myszy, aby ocenić głębokość znieczulenia.
4. Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, na co wskazuje brak odruchu rogówkowego, połóż mysz na jej grzbiecie. Używając kciuka, wskaźnika i środkowego palca, delikatnie przytrzymaj mysz. Użyj palca wskazującego i środkowego, aby przytrzymać górną część ciała myszy i kciuk tylnej lewej nogi. Bądź delikatny, ale stanowczy.
5. Skosem igły do góry wstrzyknąć 100 μl komórek podskórnie w lewą poduszeczkę tłuszczową sutka myszy. Monitoruj dobre pęcherzyki i wszelkie wycieki oraz upewnij się, że mysz budzi się i łatwo porusza po wstrzyknięciu.
   1. Zmieniaj igły między każdą myszką.
      UWAGA: Nie dopuścić do przedostania się igły do jamy otrzewnej. Spowodowałoby to, że rak szybko się rozprzestrzeniałby i nie byłby reprezentatywny dla modelu. Aby zapewnić wstrzyknięcie podskórne, należy delikatnie pociągnąć igłę do góry po wprowadzeniu do lewej poduszeczki tłuszczowej w jamie brzusznej. Jeśli igłę można łatwo podnieść do góry, jest ona prawidłowo umieszczona podskórnie.

3. Monitorowanie

1. Monitoruj myszy co najmniej 3 razy w tygodniu pod kątem wagi, oceny kondycji ciała, wielkości guza, stanu guza, oddychania, poziomu aktywności, wyglądu i ruchu. Gdy guz osiągnie średnicę 0,7-0,8 cm, zacznij codziennie monitorować.
   1. Rozważ eutanazję, gdy rozmiar guza osiąga 1,5 cm lub utrata masy ciała osiąga 20%, lub gdy obserwuje się poważne kliniczne pogorszenie oceny kondycji ciała, stanu guza, oddychania, poziomu aktywności, wyglądu lub ruchu w oparciu o wytyczne instytucjonalne.
      UWAGA: Ocena kondycji ciała ma kluczowe znaczenie do monitorowania, ponieważ masa ciała może rosnąć wraz ze wzrostem guza, negując utratę kondycji ciała z powodu obciążenia chorobą. Dokładne protokoły monitorowania będą zależeć od zatwierdzonych protokołów IACUC lub protokołów instytucjonalnych.

4. Sekcja

zwłok

1. Eutanazja myszy za pomocą CO₂ zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Spryskaj mysz 70% etanolem w celu dezynfekcji. Wykonaj nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej myszy, aby odsłonić jamę ciała.
3. Usuń nerkę. Kontynuuj cięcie linii środkowej, aż przepona będzie widoczna. Użyj nożyczek, aby przebić przeponę, aby opróżnić płuca. Przytnij membranę, aby uzyskać lepszy dostęp do wnęki.
4. Użyj nożyczek, aby przeciąć środek klatki piersiowej. Przypnij klatkę piersiową z powrotem, aby odsłonić płuca i serce.
5. Przeprowadź fuzję serca za pomocą 2 ml niesterylnego 1x DPBS, wprowadzając igłę do wierzchołka serca, aż zgromadzi się w jamie brzusznej, z której usunięto nerkę.
6. Aby usunąć serce i płuca, użyj nożyczek, aby przeciąć przełyk i tchawicę bezpośrednio nad sercem. Za pomocą kleszczy zacznij odciągać serce od ciała i odetnij tkankę łączną, która utrzymuje je w przyczepieniu. Płuca wyjdą z sercem.
7. Zidentyfikuj płuca wielopłatkowe (po prawej) i jednopłatkowe (po lewej). Trzymaj serce przywiązane jako odniesienie, ale po zidentyfikowaniu płuc odetnij serce.
8. Oznacz 12-dołkową płytkę zawierającą 1x zrównoważony roztwór soli fizjologicznej Hanka (HBSS) w każdym dołku. Każda mysz potrzebuje 2 dołków. Umieścić płuco wielopłatkowe (prawe) w płytce 12-dołkowej w celu oceny przerzutów i trzymać na lodzie. Na razie utrzymuj sąsiednią studnię pustą.
   UWAGA: Ważne jest, aby używać tego samego płuca (wielopłatkowego) każdej myszy, aby upewnić się, że każda próbka jest zbliżona pod względem wielkości. Płuco jednopłatkowe może być następnie wykorzystane do innych analiz, takich jak histopatologia.
   UWAGA: Próbki są stabilne na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.

5. Przetwarzanie tkanek

UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji powinny być wykonane przy użyciu sterylnej techniki.

1. Oznaczyć 1 stożkową probówkę o pojemności 15 ml na mysz i dodać 2,5 ml mieszaniny kolagenazy typu IV i 30 jednostek elastazy do każdej probówki. Aby przygotować mieszaninę kolagenazy typu IV, rozpuść 2 mg kolagenazy typu IV na ml 1x HBSS i sterylny filtr. Można go przechowywać do 12 miesięcy w temperaturze -20 °C i w razie potrzeby rozmrozić.
2. Przenieś płuco do drugiego, oczyść 1x studzienkę HBSS dla tej próbki. Zawiruj za pomocą kleszczy, aby usunąć pozostałą krew. Przenieść czyste płuco na pustą płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 3,5 cm. Zmiel płuco nożyczkami. Przepłucz płytkę 2,5 ml 1x HBSS, przenieś 1x HBSS i kawałki płuc do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej już koktajl kolagenazy/elastazy (łącznie 5 ml).
3. Inkubować przez 75 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie kontynuować mieszanie próbek, a więc umieścić probówki na wahaczu lub obracającym się kole. Podczas tego etapu inkubacji oznacz 50 ml probówek wirówkowych i 10 cm płytek do hodowli tkankowych dla każdej myszy. Jeśli wykonujesz rozcieńczenie, oznacz wystarczającą ilość 10 cm płytek do hodowli tkankowych na rozcieńczenia.
   UWAGA: Oznacz pokrywę płytek do hodowli tkankowych. W przypadku etykietowania samej tabliczki napis będzie zakłócał analizę Fiji-ImageJ.
4. Doprowadzić objętość każdej probówki do 10 ml za pomocą 1x HBSS. Wlać zawartość przez sitko o wielkości 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dla każdej próbki. Użyj tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, aby delikatnie zmielić próbkę przez sitko, aby umożliwić przefiltrowanie większej liczby komórek.
5. Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej (RT). Wyrzucić supernatant i przepłukać osad 10 ml 1x HBSS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
6. Zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej 60 μM 6TG, RPMI lub IMDM. Próbki należy rozmieścić na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych, w razie potrzeby stosując schemat rozcieńczania. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5 dni.
   UWAGA: 1:2, 1:10 i 1:100 to typowe rozcieńczenia, które będą musiały zostać empirycznie określone na podstawie parametrów badania.
   UWAGA: 6TG jest toksyczny. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się i postępuj zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa dotyczącymi utylizacji.

6. Płytki do barwienia

1. Wlać pożywkę hodowlaną z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady. Utrwalić komórki, dodając 5 ml nierozcieńczonego metanolu na płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że metanol wiruje tak, aby pokrył całą płytkę.
   UWAGA: Metanol jest niebezpieczny w przypadku spożycia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Do tego kroku użyj dygestorium.
2. Wlej metanol z talerzy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Opłucz płytki 5 ml wody destylowanej na płytkę i wlej wodę do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodać 5 ml 0,03% błękitu metylenowego na płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwór błękitu metylenowego jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę.
3. Wlej błękit metylenowy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Ponownie opłucz płytki 5 ml wody destylowanej na płytkę. Odwróć talerze do góry nogami i ocieraj się o ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść talerz na pokrywie i pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze RT.
   UWAGA: Kolonie z przerzutami będą niebieskie. Po wysuszeniu płytki można je przechowywać w RT przez czas nieokreślony.

7. Analiza obrazu

1. Usuń oznaczone wieczka z płytek, zwracając uwagę na wyraźną identyfikację próbek. Ułóż wszystkie poplamione płytki płuc na czystej, jasnej powierzchni, aby zrobić zdjęcie wszystkich płytek na jednym obrazie.
2. Zrób zdjęcie kolekcji talerzy w dobrze oświetlonym miejscu, upewniając się, że minimalizujesz odbicia, ponieważ talerze są bardzo odblaskowe. Odbicia w płytkach będą miały wpływ na analizę obrazu i dlatego należy ich unikać.
   UWAGA: Fiji-ImageJ ma górny limit 2 gigapikseli. Większość nowoczesnych smartfonów będzie miała wystarczającą liczbę aparatów. Nie używaj aparatu o rozdzielczości mniejszej niż 8 megapikseli. Aparat użyty w tym eksperymencie miał 12,2 megapiksela w Google Pixel 2.
3. Przytnij obraz, aby uwzględnić płyty, ale wyklucz pokrywy lub inne elementy tła obrazu. Prześlij przycięty obraz do Fiji-ImageJ.
4. Zmień obraz na czarno-biały za pomocą następujących poleceń: Obraz, Dostosuj, Próg koloru, Metoda progowania: Domyślna, Kolor progu: czarno-biały, Przestrzeń progowa: Lab. Usuń zaznaczenie pola Ciemne tło. Obraz powinien być teraz czarno-biały. reprezentuje jasne tło, a biały reprezentuje niebieskie kolonie przerzutów.
5. Za pomocą narzędzia Okrąg na pasku narzędzi Fiji-ImageJ wybierz obszar, który ma zostać przeanalizowany. Narysuj jeden okrąg, który będzie używany dla wszystkich płyt, aby upewnić się, że każda płyta jest analizowana dla obszaru o tym samym rozmiarze. Wybierz rozmiar, który maksymalizuje analizowany obszar na płytach, jednocześnie minimalizując szum tła, który pojawia się na krawędziach płyt. Rozmiar pojawia się na pasku narzędzi w takiej postaci, w jakiej jest rysowany, więc możliwe jest utworzenie idealnego okręgu, monitorując wysokość i szerokość podczas rysowania okręgu.
6. Przeanalizuj wybrany okrąg, aby określić, jaki procent obszaru jest biały, co reprezentuje obszar płytki, który ma niebieskie kolonie przerzutowe. Użyj następujących poleceń:
   Analizuj, Analizuj cząstki, Rozmiar (pixel²): 0-nieskończoność, Okrągłość: 0,00-1,00, Pokaż: Nic i zaznacz pole Podsumowanie. Uderz OK.
7. Zapisz wynik % powierzchni. Jest to procent wybranego obszaru, który jest biały, a zatem reprezentuje obciążenie przerzutami.
   UWAGA: Zaleca się zapisanie wyników w Fiji-ImageJ lub skopiowanie/wklejenie całej strony wyników do osobnego dokumentu. Jeśli wyniki % obszaru są nieoczekiwane lub podejrzane, można sprawdzić, czy którykolwiek z pozostałych pomiarów był również podejrzany lub czy % obszaru został zarejestrowany nieprawidłowo.
8. Przesuń okrąg, nie zmieniając jego rozmiaru, chwytając go w środku, do następnej płytki na obrazku. Powtórz kroki 7.6 i 7.7 dla wszystkich płyt na rysunku.
9. Powtórz kroki 7.1 – 7.8 na co najmniej dwóch kolejnych obrazach. Po przeanalizowaniu wszystkich płyt i obrazów należy uśrednić wyniki procentowej powierzchni między różnymi obrazami dla każdej płyty, aby złagodzić wszelkie niespójności między obrazami.

Results

Ta metoda zawiera proste poprawki z protokołu 4T1 Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga³ i może być wizualizowana w Rysunek 1. Kiedy 3 oddzielnych badaczy ręcznie policzyło kolonie przerzutowe dla 12 płytek płucnych (rozcieńczenie 1:10), wyniki były bardzo niespójne między różnymi licznikami (Rysunek 2A). Wszyscy badacze zostali poinstruowani, aby "policzyć kolonie przerzutowe, które pojawiają się jako niebieskie kropki", jednak niespójności pokazują pr...

Discussion

Jak wykazano, ręczne liczenie kolonii przerzutów na każdej płytce płucnej może być niedokładną i nieprecyzyjną metodą ilościowego określania przerzutów do płuc, co wskazuje na potrzebę lepszego sposobu oznaczania ilościowego (ryc. 2). Analiza histopatologiczna różniła się nieznacznie zarówno od ręcznego liczenia, jak i analizy Fidżi-ImageJ (ryc. 2B i 4D), prawdopodobnie dlatego, że szkiełka H&E nie są reprezentatywną próbką całego narządu. Proto...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komora anestezjologiczna	Zobacz komentarze	Zobacz komentarze Korzystaj	zatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji Środek
znieczulający	Zobacz	komentarze Zobacz komentarze	Korzystaj z zatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji
BALB/c Samice myszy	Laboratorium Jacksona	000651
nożyczki	Roboz	RS-6700
Kalkulator	Dowolna	Dowolna
kamera		Dowolna	Minimum 8 megapikseli
Wirówka	Dowolna Dowolna	Musi	być zdolna do 125 x g i 300 x g
Konfiguracja eutanazji CO2	Zobacz komentarze	Zobacz komentarze Korzystaj	zatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji
Chłodnia, lodówka, chłodnia	Dowolna Dowolna
Komputer z Fiji-ImageJ	Dowolny	Musi	być w stanie uruchomić Fiji-ImageJ
Komora licząca	Fisher Scientific	02-671-10
Zakrzywione nożyczki	Roboz	RS-5859
Woda destylowana	Dowolna	Dowolna
Elastaza	MP Biomedicals	100617
Waga elektroniczna	Dowolna Dowolna
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	R& D Systems	S11150
Kleszcze	Roboz	RS-8100
Inkubator lodowy	Nie	dotyczy
	Zobacz komentarze Zobacz	komentarze Zobacz komentarze	Musi być zdolny do 5% CO2 oraz 37 ° C
Metanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Błękit metylenowy	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicylina Streptomycyna	ATCC	30-2300
Szpilki lub igły		Dowolne Dowolny	Do przygniażdżania myszy podczas sekcji
Suwmiarki plastikowe	VWR	25729-670
RMPI-1640 Średni	ATCC	30-2001
Rocker lub koło obrotowe	Dowolne
Ostre nożyczki	Roboz	RS-6702
Sterylny filtr jednorazowy z membraną PES	TermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Kolby	Fisher Scientific	08-772-48
T-25	Kolby Fisher Scientific	10-126-10
Kolby T-75	Fisher Scientific	13-680-65
Trójkątna plastikowa zlewka	Fisher Scientific	14-955-111F	Służy do ważenia myszy
Błękit trypanowy	VWR	97063-702
Trypsyna-EDTA	ATCC	30-2101
Kolagenaza typu IV	Sigma-Aldrich	C5138
3,5 cm płytki do hodowli tkankowych	Nunclon	153066
strzykawka 1 ml	BD	309659
1,7 ml probówki do mikrowirówek	VWR	87003-294
10 cm płytki do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	08-772-22
12-dołkowa płytka	Corning	3512
15 ml probówka wirówkowa	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Sól fizjologiczna buforowana phostfatem Dulbecco (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank' s Zrównoważony roztwór soli fizjologicznej (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 cala igieł	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&nieśmiały; 2539&handel ;)	ATCC	CRL-2539
Probówka wirówkowa 50 ml	Fisher Scientific	14-959-49A
6-tioguanina	Sigma-Aldrich	A4882
70 μ Filtr siatkowy M	Fisher Scientific	22-363-548
70% etanol	Sigma Aldrich	E7023	Rozcieńczyć do 70% wodą DI