Hodowla 3D organoidów z nabłonka kosmków jelitowych poddawanego dedyferencjacji

Podsumowanie

Procedura opisuje izolację kosmków od nabłonka jelitowego myszy poddawanego dedyferencjacji w celu określenia ich potencjału do tworzenia organoidów.

Streszczenie

Klonogenność organoidów z nabłonka jelitowego przypisuje się obecności w nim komórek macierzystych. Nabłonek jelita cienkiego myszy jest podzielony na krypty i kosmki: komórki macierzyste i proliferujące są ograniczone do krypt, podczas gdy nabłonek kosmków zawiera tylko zróżnicowane komórki. W związku z tym normalne krypty jelitowe, ale nie kosmki, mogą powodować powstawanie organoidów w kulturach 3D. Opisana tutaj procedura ma zastosowanie tylko do nabłonka kosmków ulegającego odróżnicowaniu prowadzącemu do macierzystości. Opisana metoda wykorzystuje warunkową zmutowaną mysz Smad4-loss-of-function:β-katenina (Smad4^KO:β-katenina^GOF). Mutacja powoduje odróżnicowanie kosmków jelitowych i wytwarzanie komórek macierzystych w kosmkach. Kosmki jelitowe ulegające odróżnicowaniu są zeskrobywane z jelita za pomocą szkiełek podstawowych, umieszczane w sitku o wielkości 70 μm i kilkakrotnie przemywane w celu odfiltrowania wszelkich luźnych komórek lub krypt przed posiewem w matrycy BME-R1 w celu określenia ich potencjału tworzenia organoidów. Zastosowano dwa główne kryteria, aby upewnić się, że powstałe organoidy zostały opracowane z przedziału kosmków deróżnicujących, a nie z krypt: 1) mikroskopowa ocena izolowanych kosmków w celu zapewnienia braku jakichkolwiek krypt na uwięzi, zarówno przed, jak i po posianiu w matrycy 3D, oraz 2) monitorowanie przebiegu w czasie rozwoju organoidów z kosmków. Inicjacja organoidów z kosmków następuje dopiero dwa do pięciu dni po posiewie i wydaje się mieć nieregularny kształt, podczas gdy organoidy pochodzące z krypty z tego samego nabłonka jelitowego są widoczne w ciągu szesnastu godzin od posiewu i wydają się kuliste. Ograniczeniem metody jest jednak to, że liczba utworzonych organoidów i czas potrzebny do inicjacji organoidów z kosmków różnią się w zależności od stopnia odróżnicowania. W związku z tym, w zależności od specyfiki mutacji lub zniewagi powodującej odróżnicowanie, optymalny etap, na którym można zebrać kosmki, aby ocenić ich potencjał tworzenia organoidów, musi zostać określony empirycznie.

Wprowadzenie

Krypty jelitowe, ale nie kosmki, tworzą organoidy, gdy są hodowane w matrycy Matrigel lub BME-R1. Te organoidy są samoorganizującymi się strukturami, często określanymi jako "mini-jelita" ze względu na obecność różnych zróżnicowanych linii, komórek progenitorowych i macierzystych obecnych w nabłonku jelitowym in vivo. Potencjał do tworzenia organoidów z krypt przypisuje się obecności komórek macierzystych¹. Z drugiej strony kosmki jelitowe składają się tylko ze zróżnicowanych komórek, a zatem nie mogą tworzyć organoidów. Jednak mutacje² lub warunki, które pozwalają na dedyferencjację nabłonka kosmków, mogą prowadzić do powstania komórek macierzystych w kosmkach ^2,3. Ta zmiana losu skutkująca powstaniem łodygi w nabłonku kosmków może być potwierdzona przez posiew nabłonka nabłonka deróżnicującego kosmki w matrycy 3D w celu określenia ich potencjału tworzenia organoidów jako wskaźnika macierzystej łodygi de novo w nabłonku kosmków. Dlatego krytycznym aspektem tej procedury jest zapewnienie braku zanieczyszczenia kryptą.

Warunkowa mutacja Smad4^KO:β-kateniny^GOF powoduje dedyferencjację w nabłonku jelitowym zaznaczoną ekspresją proliferacji i markerów komórek macierzystych w kosmkach, a ostatecznie tworzenie struktur przypominających krypty w kosmkach określanych jako krypty ektopowe. Obecność komórek macierzystych tych zderóżnicowanych kosmków została określona przez ekspresję markerów komórek macierzystych w kryptach ektopowych (in vivo) oraz zdolność zmutowanych kosmków do tworzenia organoidów po posianiu Matrigel³. Poniższa procedura rozwija metodologię zastosowaną do potwierdzenia macierzystej nabłonka jelitowego odróżnicowującego się u myszy z mutacją Smad4^KO β-kateniny^GOF. Kluczową cechą tej metodologii izolacji kosmków było zastosowanie skrobania światła jelita, w przeciwieństwie do metody chelatacji EDTA⁴. W przeciwieństwie do metody chelatacji EDTA, izolacja kosmków przez skrobanie zachowuje większość leżącej pod spodem mezenchymy i pozwala dostosować ciśnienie skrobania w celu uzyskania kosmków bez uwięzionych krypt. Nacisk skrobania jest subiektywny dla operatora, stąd optymalne ciśnienie do uzyskania kosmków bez uwięzionych krypt musi być określone empirycznie przez operatora. Krytycznym aspektem tej procedury jest zapewnienie braku zanieczyszczenia kryptą poprzez badanie mikroskopowe kosmków zarówno przed, jak i po posiewie w matrycy BME-R1.

Kosmki jelitowe są zeskrobywane ze światła jelita za pomocą szkiełek i umieszczane w filtrze 70 μm i przemywane PBS, aby pozbyć się luźnych komórek lub krypt, jeśli takie istnieją, przed posiewem w matrycy BME-R1. Metoda kładzie nacisk na następujące kryteria mające na celu uniknięcie zanieczyszczenia kryptami: a) ograniczenie kosmków do bliższej połowy dwunastnicy, gdzie kosmki są najdłuższe, b) zminimalizowanie liczby zadrapań dających kosmki, c) przemycie filtra zawierającego kosmki przez serię PBS w sześciodołkowym naczyniu oraz d) potwierdzenie braku zanieczyszczenia krypty za pomocą badania mikroskopowego przed i po posiewie w matrycy BME-R1. Izolacja kosmków przez skrobanie, a nie przez chelatację EDTA, zapobiega całkowitej utracie leżącej pod spodem mezenchymy, która może dostarczać sygnały niszowe^{5, 6, 7, 8}, jeśli jest to wymagane, do inicjacji organoidu z nabłonka kosmków.

Protokół

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na myszach, w tym stosowanie tamoksyfenu i eutanazja przez zwichnięcie szyjki macicy, uzyskały aprobatę Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Stevensa w dziedzinie ekhnologii.

1. Myszy

UWAGA: Generacja Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Myszy Villin-Cre^ERT2 zostały wcześniej opisane ³. Wykorzystano dorosłe samice myszy w wieku od ośmiu do dwunastu tygodni.

1. Indukować mutację Smad4^KO:β-katenina^GOF w Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 z dootrzewnowym wstrzyknięciem tamoksyfenu w oleju kukurydzianym przez cztery kolejne dni.
2. Poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy dziesięć dni po pierwszym wstrzyknięciu tamoksyfenu.
3. Spryskaj brzuch 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się sierści myszy do jamy otrzewnej.
4. Otwórz jamę brzuszną nożyczkami preparacyjnymi, aby odsłonić jelito. Odizoluj jelito za pomocą nożyczek i kleszczy.
   UWAGA: Jednoczesna utrata Smad4 wraz z mutacją przyrostu funkcji β-kateniny (Smad4^KO; β-katenina^GOF) w nabłonku jelitowym uzyskano przez wstrzyknięcie^Smad4f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Myszy Villin-Cre^ERT2 codziennie przez cztery kolejne dni z 0,05 g tamoksyfenu/kg masy ciała w oleju kukurydzianym. Myszy te są zbierane dziesięć dni po pierwszym wstrzyknięciu tamoksyfenu, aby zapewnić obecność komórek wyrażających markery związane z komórkami macierzystymi w odróżnicowujących się kosmkach.

2. Izolacja i przygotowanie dwunastnicy

1. Wypreparuj bliższą połowę dwunastnicy.
2. Przepłukać dwunastnicę 5 ml lodowatego PBS w strzykawce o pojemności 10 ml, aby usunąć zawartość światła.
3. Otworzyć dwunastnicę wzdłużnie nożyczkami kątowymi i położyć dwunastnicę płasko na 15 cm płytce Petriego na lodzie ze światłem dwunastnicy skierowanym w stronę operatora.

3. Izolacja kosmków przez skrobanie

1. Przed rozpoczęciem skrobania należy umieścić sitko o oczkach 70 μm w jednym z dołków 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Napełnij wszystkie studzienki 4 ml 1x PBS i umieść 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej na lodzie (Rysunek 1).
2. Zeskrob kosmki w następujący sposób, używając dwóch mikroskopijnych szkiełek podstawowych: jednego do przytrzymania dwunastnicy, a drugiego do zeskrobywania (Rysunek 1B1).
   1. Dwukrotnie zeskrob świetlistą stronę dwunastnicy powierzchownie w tę iz powrotem, aby usunąć śluz. Zastosuj nacisk tak, aby ten krok usunął warstwę śluzu, ale nie kosmki.
   2. Ponownie zeskrobać dwunastnicę, dwa razy w tę i z powrotem, wywierając taki sam nacisk jak w 3..1, podczas którego można zobaczyć kosmki zbierające się na szkiełkach (Ryc. 1B2). Jest to optymalne ciśnienie (które musi być określone empirycznie przez operatora), aby uzyskać kosmki bez uwięzi krypt.
3. Użyć pipety transferowej o pojemności 1 ml zawierającej PBS w celu przeniesienia kosmków (zebranych na szkiełku z kroku 3.2.2) do sitka o oczkach 70 μm umieszczonego w naczyniu 6-dołkowym. Kosmki są zbierane w ten sposób, po każdym zadrapaniu (Rysunek 1B2).
4. Umyć kosmki zebrane w sitku o wielkości 70 μm (od kroku 3.3), przenosząc sitko (wraz z kosmkami) przez szereg dołków w 6-dołkowym naczyniu zawierającym zimny PBS (~ 4 ml/studzienkę). Ma to na celu usunięcie luźnych krypt, jeśli takie istnieją.
5. Za pomocą pipety p1000 przenieść zawiesinę kosmków w PBS (~ 3 ml) z sitka o średnicy 70 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
6. Za pomocą 0,1% końcówki pipety p200 z powłoką BSA, na końcu, zassać 50 μl objętości zawiesiny kosmków na szkiełku podstawowym. Policz liczbę kosmków w kropli o objętości 50 μl pod 4-krotnym powiększeniem, aby określić stężenie kosmków w zawiesinie PBS. Na przykład, jeśli w badanej zawiesinie 50 μl znajduje się 10 kosmków, wówczas stężenie kosmków wynosi 0,2 kosmka/μl. Jest to również czas, aby potwierdzić brak krypt na uwięzi.
7. Obliczyć objętość zawiesiny kosmków wymaganą do płytki w stężeniu 0,5 kosmka/μl matrycy BME-R1. Dodać dodatkowe 100 μl, aby uwzględnić błąd pipetowania i objętość wymaganą do badania mikroskopowego wymaganego do zapewnienia czystości kosmków.
   UWAGA: Ciśnienie użyte w pierwszych dwóch zadrapaniach, które usuwa śluz, ale nie kosmki, powinno być stosowane w kolejnych zadrapaniach, podczas których kosmki zostaną uwolnione. Ogranicz liczbę zeskrobywania tam i z powrotem do dwóch po pierwszym zaobserwowaniu uwolnienia kosmków. Środek ten pozwala uniknąć uwolnienia kosmków z uwięzionymi kryptami. Niezbędna jest mikroskopowa ocena kosmków, aby upewnić się, że nie ma krypt na uwięzi.

4. Poszycie kosmków na matrycy BME-R1

1. Używając końcówki pipety p200 pokrytej 0,1% BSA, przenieść do probówki mikrowirówkowej objętość kosmków (z kroku 3.6) wymaganą do płytki o gęstości ~ 6 kosmków na studzienkę w 12,5 μl matrycy BME-R1. Zastosowanie w tym momencie końcówki pokrytej powłoką BSA zapewnia, że kosmki, które są zbyt duże dla spiczastej końcówki, są zasysane bez blokowania lub utraty w wyniku przyklejenia się do boków końcówki.
2. Wirować kosmki przez 2 minuty przy 200 x g w wirówce z chłodzeniem (4 °C) i usunąć supernatant.
3. Powtórzyć krok 4.2, aby usunąć wszelkie pozostałości PBS i przejść do następnego kroku pod okapem z przepływem laminarnym.
4. Delikatnie zawiesić granulki kosmków w wymaganej ilości zimnego BME-R1 rozmrożonego na lodzie.
5. Za pomocą pipety p20 umieść 12,5 μl / studzienkę kosmków w matrycy BME-R1 w 3D na wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U.
6. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić zestalenie matrycy BME-R1.
7. Dodaj 125 μl / studzienkę wstępnie podgrzanego podłoża ENR (naskórkowy czynnik wzrostu / Noggin / R-spondyna1): zaawansowane podłoże DMEM F-12, uzupełnione 1x Penicylina: Streptomycyna, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng / ml EGF, 100 ng / ml Noggin, 5% kondycjonowane podłoże z komórek HEK293-T eksprymujących R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylocysteiny i 0,05 mg / ml Primocin.
8. Inkubować posiane kosmki w inkubatorze do hodowli tkankowych utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i zmieniać pożywkę co drugi dzień.
9. Wyrzucić wszystkie studzienki, w których pojawiają się organoidy przed dwoma dniami posiewu, ponieważ najwcześniejszy punkt, w którym spodziewane są organoidy pochodzące z kosmków, to po dwóch dniach.
   UWAGA: Wszystkie kosmki, które mają połowę lub więcej niż połowę długości kosmków, są liczone jako jeden kosmek. W przeciwieństwie do organoidów pochodzących z krypty, organoidy pochodzące z kosmków nie są oczekiwane w ciągu 24 godzin po posiewie. Wydaje się, że kosmki inicjujące organoidy ciemnieją i kurczą się przed utworzeniem organoidów. W związku z tym wszelkie studnie z organoidami rozwijającymi się w ciągu jednego dnia od posiewu należy wyrzucić, aby uniknąć prawdopodobieństwa, że pochodzą one z prawdopodobnego zanieczyszczenia krypty. Metodologia zastosowana do produkcji kondycjonowanych pożywek jest dostępna na życzenie.

Wyniki

Kluczowym czynnikiem warunkującym sukces procedury jest zapobieganie kontaminacji kryptami. Rozwój organoidów z kosmków (a nie z jakichkolwiek zanieczyszczających krypt) zapewnia potwierdzenie czterech głównych kryteriów: 1) zapewnienie czystości pobranych kosmków poprzez badanie mikroskopowe przed i po wysianiu kosmków w BME-R1, 2) wysianie ograniczonej liczby kosmków na dołek, aby umożliwić indywidualną wizualizację wszystkich wysianych kosmków, 3) codzienne monitorowanie rozwoju organoidów; obrazy z przebiegu czasoweg...

Dyskusja

Metoda ta może potwierdzić zdolność do samoodnawiania się nabłonka kosmków odróżnicowujących, które pozyskują markery komórek macierzystych in vivo. Prawidłowy nabłonek jelitowy może powodować powstawanie organoidów z krypty, ale nie z przedziału kosmków, gdy jest hodowany w 3D ze względu na obecność komórek macierzystych w kryptach¹. Tak więc tworzenie organoidów z odróżnicowanego nabłonka kosmków hodowanego w hodowlach 3D potwierdza powstawanie komórek macierzystych w wyniku odwrócenia ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zaawansowane media DMEM F-12	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzydyna	Vector Labs	SK-4105
96-dołkowa płyta denna U-bottom	Fisher Scientific	FB012932
zestaw ABC	Vector Labs	PK4001
Nożyczki kątowe	Fisher Scientific	11-999
Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Suplement (50X), bez witaminy A	Gibco	12587010
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek bez proteaz	Fisher Scientific	BP9703100
Przeciwciało CD44	BioLegend
Przeciwciało Cdx2	Sygnalizacja komórkowa	12306
Olej kukurydziany	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-mikronowy sitko komórkowe	Nauki biologiczne	431751
Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex o zredukowanym czynniku wzrostu, typ R1	R& D	3433-005-R1
Nożyczki preparacyjne	Fisher Scientific	22-079-747
Kleszcze	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
Komórki HEK 293-T eksprymujące RSPO-1	Prezent od dr Michaela Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Filtr siatkowy	Fisher Scientific	07-201-431
Szkiełko do miroskopu	VWR	89218-844
Suplement N-2 (100X)	Gibco	17502048
N-acetylocysteina	Sigma-Aldrich	A9165
p200 końcówki	VWR	46620-642
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)	Gibco	15140-122
Primocin (50 mg / ml)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Rekombinowany mysi Noggin	Peprotech	250-38
Rozcieńczalnik sygnałowy	Sygnalizacja komórkowa	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	50-146-770

1030001