Ta technika pozwala na szybkie i proste przygotowanie sekcji żywicy o rozmiarach całych nasion do obserwacji i analizy komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania całego przekroju żywicy wielkości nasion i jej zastosowania
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Morfologia, rozmiar i ilość komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w nasionach decydują o wadze i jakości nasion. Różnią się one znacznie w różnych regionach nasion. Aby wyraźnie zobaczyć morfologię komórek, granulek skrobi i ciał białkowych oraz dokładnie przeanalizować ilościowo ich parametry morfologiczne, potrzebna jest sekcja o wielkości całego ziarna. Chociaż sekcja parafinowa o wielkości całych nasion może badać nagromadzenie materiałów magazynujących w nasionach, bardzo trudno jest ilościowo przeanalizować parametry morfologiczne komórek i materiałów magazynujących ze względu na niską rozdzielczość grubego przekroju. Cienka sekcja żywicy ma wysoką rozdzielczość, ale rutynowa metoda cięcia żywicy nie jest odpowiednia do przygotowania całej sekcji dojrzałych nasion o dużej objętości i wysokiej zawartości skrobi. W niniejszej pracy przedstawiono prostą metodę cięcia na sucho w celu przygotowania przekroju żywicy o wielkości całych nasion. Technika ta pozwala przygotować krzyżowe i podłużne sekcje całych nasion rozwijających się, dojrzałych, kiełkujących i ugotowanych zatopionych w żywicy LR White, nawet w przypadku dużych nasion o wysokiej zawartości skrobi. Cała sekcja nasion może być barwiona fluorescencyjnym rozjaśniaczem 28, jodem i błękitem brylantowym Coomassie R250, aby wyraźnie pokazać morfologię komórek, granulek skrobi i ciał białkowych. Uzyskany obraz może być również analizowany ilościowo w celu pokazania parametrów morfologicznych komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion.
Wprowadzenie
Nasiona roślin zawierają materiały magazynujące, takie jak skrobia i białko, i dostarczają ludziom energii i składników odżywczych. Kształt, rozmiar i ilość komórek i materiałów magazynujących decyduje o wadze i jakości nasion. Komórki i materiały magazynujące w różnych regionach nasion mają znacznie różną morfologię, szczególnie w przypadku niektórych upraw zbóż o wysokiej zawartości amylozy z hamowaniem enzymu rozgałęziającego skrobię IIb1,2,3. Dlatego bardzo ważne jest zbadanie morfologii komórek i materiałów magazynujących w różnych regionach nasion.
Sekcja parafiny jest dobrą metodą do przygotowania całego przekroju nasion i może pokazać strukturę tkankową nasion oraz nagromadzenie materiału magazynującego w różnych regionach nasion4,5,6. Jednak sekcje parafinowe mają zwykle grubość 6-8 μm o niskiej rozdzielczości; W związku z tym bardzo trudno jest wyraźnie zaobserwować i ilościowo przeanalizować morfologię komórek i materiałów magazynujących. Sekcje żywicy mają zwykle grubość 1-2 μm i wysoką rozdzielczość i są bardzo odpowiednie do obserwacji i analizy morfologii komórek i materiałów magazynujących7. Jednak rutynowa metoda cięcia żywicy ma trudności z przygotowaniem całego przekroju nasion, szczególnie w przypadku nasion o dużej objętości i wysokiej zawartości skrobi; W związku z tym nie ma możliwości obserwowania i analizowania morfologii komórek i materiałów magazynujących w różnych regionach nasion. Żywica LR White jest żywicą akrylową i wykazuje niską lepkość i dużą przepuszczalność, co prowadzi do jej dobrych zastosowań w przygotowaniu sekcji żywicznej nasion, szczególnie w przypadku dojrzałych ziaren zbóż o dużej objętości i wysokiej zawartości skrobi. Ponadto próbka zanurzona w żywicy LR White może być łatwo barwiona wieloma barwnikami chemicznymi, aby wyraźnie pokazać morfologię komórek i materiałów magazynujących pod mikroskopem świetlnym lub fluorescencyjnym7. W naszym poprzednim artykule opisaliśmy metodę dzielenia na sucho w celu przygotowania całych sekcji dojrzałych ziaren zbóż zatopionych w żywicy LR White. Metoda ta może również przygotować całą porcję rozwijającego się, kiełkującego i ugotowanego ziarna zboża8. Uzyskany przekrój o wielkości całego ziarna ma wiele zastosowań w obserwacji i analizie mikromorfologicznej, szczególnie do przejrzystego przeglądania i ilościowej analizy różnic morfologicznych komórek i materiałów magazynujących w różnych regionach seed8,9.
Ta technika jest odpowiednia dla badaczy, którzy chcą obserwować mikrostrukturę tkanki oraz kształt i rozmiar komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion za pomocą mikroskopu świetlnego. Obrazy całych odcinków nasion wybarwionych specjalnie do wystawiania komórek, granulek skrobi i ciał białkowych mogą być analizowane za pomocą oprogramowania do analizy morfologicznej w celu ilościowego pomiaru parametrów morfologicznych komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion. W celu wykazania możliwości zastosowania technicznego i zastosowania całych przekrojów nasion, zbadaliśmy dojrzałe nasiona kukurydzy i rzepaku oraz rozwijające się, kiełkujące i gotowane ziarna ryżu w tym badaniu. Protokół zawiera cztery procesy. W tym przypadku używamy dojrzałego ziarna kukurydzy, które jest najtrudniejsze w przygotowaniu całych sekcji nasion ze względu na dużą objętość i wysoką zawartość skrobi, jako próbkę do pokazania procesów krok po kroku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie ziarna zatopionego w żywicy (Rysunek 1)
- Związać sześć dojrzałych ziaren kukurydzy w 10 ml 2,5% buforowanego fosforanem aldehydu glutarowego (0,1 M, pH 7,2) w temperaturze 4 °C przez 48 godzin. Naukowcy mogą wybrać inne mieszaniny utrwalające, stężenia utrwalające i warunki utrwalania zgodnie z celami badawczymi i typami tkanek.
- Wyjmij ziarna i pokrój je wzdłuż lub poprzecznie na grubość 2-3 mm za pomocą ostrego dwustronnego ostrza, a następnie umieść je w 10 ml 2,5% buforowanego fosforanem aldehydu glutarowego (0,1 M, pH 7,2) ponownie przez 48 godzin.
- Przemyć próbki trzykrotnie 10 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,2) przez 30 minut za każdym razem.
- Odwodnić próbki w roztworze wodnym etanolu o rosnących stopniach (10 ml) od 30% do 50%, 70%, 90% raz i 100% trzy razy przez 30 minut za każdym razem.
- Próbki należy infiltrować w 10 ml roztworu żywicy LR White rozcieńczonego etanolem od 25% do 50%, 75% raz i 100% dwukrotnie w temperaturze 4 °C przez 12 godzin za każdym razem.
- Przygotuj cokoły na próbki przed osadzeniem. Dodać 0,25 ml 100% białej żywicy LR do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml i polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.
- Kolejno dodawać czystą żywicę LR White (0,5 ml) i infiltrowaną próbkę do probówki wirówkowej z cokołem. Wyprostować próbki za pomocą anatomicznej igły i polimeryzować je w temperaturze 60 °C w piecu przez 48 godzin.
2. Podział na sucho w celu przygotowania sekcji o wielkości całego ziarna (Rysunek 1)
- Wyjmij osadzone ziarna z probówki wirówkowej i odetnij nadmiar żywicy wokół próbki za pomocą ostrego ostrza.
- Zacisnąć blok żywicy w uchwycie próbki ultramikrotomu (EM UC7) i odciąć zbędną żywicę na powierzchni próbki i wokół próbki za pomocą ostrza.
- Dokładnie wypoleruj powierzchnię próbki szklanym nożem, aż będzie można uformować cały przekrój.
- Przed cięciem umieść mały miedziany haczyk około 2 mm nad krawędzią ostrza i pokrój próbkę na odcinek 2 μm. Rolą haczyka jest uniknięcie zwijania się sekcji do góry.
- Umieść hak pod sekcją, aby ją podeprzeć, gdy sekcja stanie się długa.
- Dodaj 100 μl wody na niepoddane wcześniej obróbce szkiełko i ostrożnie przenieś cały i nieuszkodzony fragment do wody za pomocą pęsety.
- W celu wygładzenia pomarszczonego przekroju podgrzać i wysuszyć próbkę na stole do spłaszczania w temperaturze 50 °C przez noc.
- Jeśli przekrój kruszy się lub rozrywa, należy wydłużyć czas każdej infiltracji próbki żywicą z 12 godzin do 24 godzin lub 48 godzin.
- Jeśli sekcja ma kilka linii równoległych do noża, mocno zacisnąć blok próbki. Jeśli sekcja ma jakieś linie pionowe do noża, użyj nowego noża.
3. Barwienie i obserwacja przekroju
UWAGA: Aby obserwować strukturę tkankową i morfologię komórek, granulek skrobi i ciał białkowych, zabarwić skrawki specyficznymi barwnikami zgodnie z celem badań. Tutaj używamy rozjaśniacza fluorescencyjnego 28, roztworu jodu i błękitu brylantowego Coomassie R250 do barwienia ścian komórkowych, granulek skrobi i ciał białkowych.
- W celu obserwacji morfologii komórek należy zabarwić wycinek 40 ml 0,1% (w/v) roztworu wodnego rozjaśniacza fluorescencyjnego 28 w kompaktowym szklanym słoiku do barwienia o pojemności 70 ml w temperaturze 45 °C przez 10 minut, a następnie płukać go bieżącą wodą przez 5 minut. Obserwuj i fotografuj wycinek pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę CCD.
- W celu obserwacji morfologii granulek skrobi należy zabarwić skrawek 40 μl roztworu jodu (0,07% (m/v) I2 i 0,14% (m/v) KI w 25% (v/v) glicerolu) przez 1 minutę i przykryć próbkę zawierającą roztwór jodu szkiełkiem nakrywkowym. Obejrzyj i sfotografuj próbkę pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę CCD.
- W celu obserwacji morfologii ciał białkowych należy zanurzyć skrawek z 40 ml 10% (v/v) kwasu octowego w kompaktowym szklanym słoiku do barwienia o pojemności 70 ml na 10 minut w temperaturze 45 °C, a następnie zabarwić go w 40 ml 1% (w/v) błękitu brylantowego Coomassie R250 w 25% (v/v) izopropanolu i 10% (v/v) kwasie octowym przez 15 minut w temperaturze 45 °C. Umyć poplamione fragmenty pod bieżącą wodą przez 5 minut i wysuszyć. Obserwuj i fotografuj przekrój pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę CCD.
4. Ilościowa analiza parametrów morfologicznych
- Przetwarzaj i analizuj ilościowo sfotografowane obrazy pod kątem obszaru, długiej/krótkiej osi i okrągłości komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion za pomocą oprogramowania do analizy morfologii (oprogramowanie Image-Pro Plus 6.0) zgodnie z procedurami Zhao et al.9 dokładnie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania przekroju o rozmiarze całego nasiona
Opracowaliśmy prostą metodę cięcia na sucho do przygotowywania przekrojów o rozmiarze całego nasiona zatopionego w żywicy LR-white (Rysunek 1). Metoda ta pozwala na przygotowanie poprzecznych i podłużnych przekrojów o rozmiarze całego nasiona o grubości 2 µm (Rysunki 2-5, Rysunki uzupełniające 1-4). Przykładowo, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasiona są najważniejszym zasobem odnawialnym dla żywności, pasz i surowców przemysłowych oraz są bogate w materiały magazynujące, takie jak skrobia i białko. Morfologia i ilość komórek oraz zawartość i konfiguracja materiałów magazynujących wpływają na masę i jakość nasion 7,12. Chociaż technologia stereologii i analizy obrazu może mierzyć rozmiar i ilość komórek w regionie tkanki, brakuje ich w wielu laboratoriach. Sekcje parafiny i żywicy dają dwuwymiarowy (2D...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie zostało zapewnione przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32071927), Projekt Talentów Uniwersytetu w Yangzhou oraz Priorytetowy Program Rozwoju Akademickiego Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas octowy | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Kompaktowy szklany słoik do barwienia (5 miejsc) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Coomassie brylantowy niebieski R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Szkiełko nakrywkowe | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Dwustronne ostrze | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Absolutny etanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Stół do spłaszczania | Leica | HI1220 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Olympus | BX60 | |
| Rozjaśniacz fluorescencyjny 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Paski szklane | Leica | 840031 | |
| Aldehyd glutarowy 50% roztwór w wodzie | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Mikroskop świetlny | Olympus | BX53 | |
| LR Agar z białej żywicy | Scientific AGR1281A | ||
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co., Ltd. | 9023A | |
| Jodek potasu | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Slide | Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd. | ||
| Pęseta | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Fosforan sodu dwuzasadowy dwunastowodny | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| Ultramikrotom | Leica | EM UC7 |
Bibliografia
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
