Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Summary

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Abstract

Dynamiczne procesy biologiczne w żywych komórkach, w tym te związane z organizacją błony plazmatycznej, zachodzą na różnych skalach przestrzennych i czasowych, odpowiednio od nanometrów do mikrometrów i od mikrosekund do minut. Tak szeroki zakres procesów biologicznych stanowi wyzwanie dla konwencjonalnych podejść mikroskopowych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę wykonywania pomiarów spektroskopii korelacji fluorescencji ze zmiennością plamki (svFCS) przy użyciu klasycznego mikroskopu fluorescencyjnego, który został dostosowany. Protokół zawiera szczegółową kontrolę wydajności konfiguracji svFCS oraz wytyczne dotyczące pomiarów dyfuzji molekularnej za pomocą svFCS na błonie plazmatycznej żywych komórek w warunkach fizjologicznych. Dodatkowo przedstawiamy procedurę przerywania nanodomen błony plazmatycznej przez leczenie oksydazą cholesterolową i pokazujemy, w jaki sposób te zmiany w bocznej organizacji błony plazmatycznej mogą zostać ujawnione przez analizę svFCS. Podsumowując, ta metoda oparta na fluorescencji może dostarczyć bezprecedensowych szczegółów na temat bocznej organizacji błony plazmatycznej z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Introduction

Złożoność organizacji błony plazmatycznej
Obecne rozumienie organizacji błon komórkowych musi uwzględniać kilka aspektów¹. Po pierwsze, złożony skład lipidowy różni się nie tylko w zależności od typu komórki, ale także w obrębie pojedynczej komórki (organelle błonowe/błona plazmatyczna). Poza tym związane lub wewnętrzne białka błonowe są w większości zorganizowane w dynamiczne kompleksy multimeryczne, z dużymi domenami rozciągającymi się na zewnątrz błony, co stanowi znacznie większy obszar niż w przypadku samych domen transbłonowych. Co więcej, białka związane z błoną wykazują specyficzne zdolności wiązania lipidów lub interakcji z lipidami, które odgrywają rolę w regulacji funkcji białek. Zależą one bezpośrednio od lokalnego składu i dostępności lipidów².

Na koniec, obserwuje się znaczny poziom asymetrii między dwoma listkami błonowymi ze względu na wewnętrzną asymetryczną strukturę białek błonowych i rozmieszczenie lipidów. Rzeczywiście, równowaga metaboliczna lipidów między syntezą a hydrolizą, w połączeniu z przerzutkiem lipidów między listkami, generuje taką asymetryczną dystrybucję. Ponieważ każdy transport przez dwuwarstwę jest ograniczony przez darmową energię wymaganą do przemieszczania polarnej grupy głowy przez hydrofobowe wnętrze membran, jest on zwykle wspomagany przez selektywne transportery. Dla każdego typu komórki asymetria ma tendencję do stałego utrzymywania się. Łącznie czynniki te przyczyniają się do bocznej niejednorodności lub podziału błony plazmatycznej^3,4.

Wzbogacamy tę reprezentację błony plazmatycznej, biorąc pod uwagę wewnętrzną dyfuzję molekularną wewnątrz i w poprzek dwuwarstwy, co przyczynia się do dynamicznej niejednorodności bocznej w skali od dziesiętnych do setek nanometrów i od mikrosekund do sekund. Na przykład zależne od lipidów nanodomeny błonowe - tak zwane tratwy lipidowe, zdefiniowane jako cholesterol i platformy sygnalizacyjne bogate w sfingolipidy - przyczyniają się do podziału błony plazmatycznej^5,6. Jednak obecny pogląd na organizację błon nie ogranicza się tylko do tratw lipidowych. Nanodomeny błonowe są bardziej złożone i niejednorodne pod względem składu, pochodzenia i funkcji. Mimo to ich obecność w błonie plazmatycznej musi być ściśle skoordynowana, a dynamiczne interakcje między białkami i lipidami wydają się być ważne w dystrybucji przestrzennej i modyfikacji chemicznej nanodomen błonowych^1,3,7,8.

Zasada svFCS i jej zastosowanie do badania organizacji błony plazmatycznej
Chociaż poczyniono znaczne postępy w analizie domen błonowych, głównie za pomocą technik biofizycznych, determinanty, które dyktują lokalną organizację błony plazmatycznej, muszą zostać dopracowane z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną i czasową. Wyznaczniki oparte na śledzeniu pojedynczych molekuł zapewniają doskonałą precyzję przestrzenną i pozwalają na charakteryzację różnych trybów ruchu^9,10,11,12, ale mają ograniczoną rozdzielczość czasową przy klasycznej niskiej liczbie klatek na sekundę kamery i wymagają więcej wysiłku eksperymentalnego, aby zarejestrować znaczną liczbę trajektorii. Alternatywnie, współczynnik dyfuzji składników membrany można ocenić za pomocą odzysku fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)¹³ lub spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS)¹⁴. Ten ostatni zyskał więcej uwagi, głównie ze względu na jego wysoką czułość i selektywność, mikroskopijną objętość detekcji, niską inwazyjność i szeroki zakres dynamiki¹⁵.

Koncepcyjne podstawy FCS zostały wprowadzone przez Magde i współpracowników około 50 lat temu^16,17. Opiera się na rejestrowaniu fluktuacji emisji fluorescencji z wysoką rozdzielczością czasową (od μs do s)¹⁸. W swojej nowoczesnej wersji pomiary w żywych komórkach są wykonywane przez małą objętość wzbudzenia konfokalnego (~0,3 femtolitra) umieszczoną w obszarze zainteresowania (np. na błonie komórkowej); Sygnał fluorescencyjny generowany przez dyfundujące cząsteczki fluorescencyjne wchodzące i wychodzące z objętości obserwacyjnej jest zbierany z bardzo wysoką rozdzielczością czasową (tj. czas nadejścia każdego fotonu do detektora). Następnie sygnał jest obliczany w celu wygenerowania funkcji autokorelacji (ACF), z której ekstrahuje się średni czas t_d (czas dyfuzji), przez który cząsteczka pozostaje w objętości ogniskowej, wraz ze średnią liczbą cząstek (N) obecnych w objętości obserwacyjnej, która jest odwrotnie proporcjonalna do amplitudy ACF. Ten ostatni parametr może być przydatną informacją na temat stężenia cząsteczek w objętości obserwacyjnej.

Od tego czasu, dzięki szybko rozwijającemu się instrumentarium w biofotonice, zaimplementowano coraz większą liczbę modalności FCS, co pozwala na opis dynamicznych zjawisk zachodzących w żywych systemach. Mimo to, gatunek molekularny doświadczyłby bardziej nakładającego się rozkładu wartości współczynnika dyfuzji, co zwykle znajduje odzwierciedlenie w anomalnej charakterystyce dyfuzji, w której cząsteczki dyfundują z nieliniową relacją w czasie¹⁹, oraz trudności w zidentyfikowaniu biologicznego znaczenia tej anomalnej subdyfuzji. W przeszłości trudność ta została w pewnym stopniu przezwyciężona poprzez rejestrowanie dyfuzji molekularnej za pomocą FRAP z obszarów o różnych rozmiarach, a nie tylko z jednego obszaru, dostarczając w ten sposób dodatkowych informacji przestrzennych. Umożliwiło to na przykład konceptualizację mikrodomen membranowych^20,21,22.

Przełożenie tej strategii na pomiary FCS (tj. tzw. spektroskopię korelacji fluorescencji (svFCS)) zostało ustalone poprzez zmianę wielkości ogniskowej obserwacji, co pozwoliło na rejestrację fluktuacji fluorescencji w różnych skalach przestrzennych²³. W ten sposób podejście svFCS dostarcza pośrednich informacji przestrzennych pozwalających na identyfikację i określenie trybów dyfuzji molekularnej oraz rodzaju podziału błony (domeny izolowane kontra domeny ciągłe²⁴) badanych cząsteczek. Wykreślając czas dyfuzji t_d jako funkcję różnych skal przestrzennych zdefiniowanych przez wartość talii (ω), która odpowiada wielkości promienia wiązki detekcyjnej w tym przypadku^23,25, można scharakteryzować prawo dyfuzji danej cząsteczki w danym stanie fizjologicznym. svFCS jest zatem doskonałym odpowiednikiem śledzenia pojedynczych cząstek w dziedzinie czasu²⁶. Zgodnie z ograniczeniem dyfuzji Browna należy spodziewać się ściśle liniowej zależności między czasem dyfuzji t_d a talią ω (Rysunek 1)^23,25. Pochodzenie odchylenia prawa dyfuzji od tego schematu można przypisać niewyłącznym przyczynom, takim jak siatka cytoszkieletu, stłoczenie molekularne, dynamiczne partycjonowanie w nanodomenach lub dowolna kombinacja tych i innych efektów (Rysunek 1) i musi być przetestowana eksperymentalnie²⁵.

Tutaj zapewniamy wszystkie niezbędne punkty kontrolne do codziennego użytku systemu optycznego svFCS zbudowanego od podstaw, który uzupełnia nasze poprzednie recenzje protokołów^27,28 na temat tego eksperymentalnego podejścia. Ponadto, jako dowód słuszności koncepcji, podajemy wytyczne dotyczące kalibracji konfiguracji, przygotowania komórek, pozyskiwania danych i analizy w celu ustalenia prawa dyfuzji svFCS (DL) dla Thy1-GFP, białka zakotwiczonego w błonie komórkowej glikozylofosfatydyloinozytolu, o którym wiadomo, że jest zlokalizowane w nanodomenach tratwy lipidowej²⁹. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób częściowa destabilizacja nanodomen lipidowo-tratwy przez leczenie oksydazą cholesterolową wpływa na właściwości dyfuzyjne Thy1-GFP. Dodatkowo, szczegółowy opis budowania konfiguracji svFCS od podstaw znajduje się w materiałach uzupełniających.

Protocol

1. Specyfikacja ustawień do montażu konfiguracji svFCS na zamówienie

UWAGA: Prostota proponowanej konfiguracji svFCS pozwala na łatwą instalację, obsługę i konserwację przy niskich kosztach, zapewniając jednocześnie efektywność odzyskiwania fotonów. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Materiały uzupełniające.

1. Pomieszczenie eksperymentalne i bezpieczeństwo
   1. System należy zainstalować w pomieszczeniu o ustabilizowanej temperaturze około 21 °C.
   2. Unikaj bezpośredniego przepływu powietrza na pasywnym (lub aktywnym) stole optycznym i postępuj zgodnie z zasadami bezpieczeństwa lasera dotyczącymi ustawiania optycznego.
2. Sprzęt i oprogramowanie
   UWAGA: Materiały uzupełniające szczegółowo opisują kroki instalacji przedstawione w Rysunek 2.
   1. Napisz główne oprogramowanie do akwizycji i kontroli w LabVIEW przy użyciu architektury maszyny stanów i struktury zdarzeń, w której wielofunkcyjna płytka akwizycyjna steruje większością sterowników.
      UWAGA: Korelator, laser i miernik mocy są sterowane lub monitorowane przez ich własne oprogramowanie.
   2. Dostosuj procedury instalacji sprzętu i oprogramowania do używanego sprzętu.
3. Konfiguracja optyczna
   UWAGA: Rysunek 3 ilustruje moduły optyczne używane w poniższych sekcjach do kontroli jakości wyrównania optycznego. Wszystkie specyfikacje elementów optycznych są wymienione w tabeli materiałów. Procedura tworzenia konfiguracji jest szczegółowo opisana w materiałach uzupełniających. System ten składa się z lasera o fali ciągłej, zmotoryzowanego mikroskopu odwróconego wyposażonego w zanurzeniowy obiektyw wodny, detektora fotodiody lawinowej sprzężonego z pojedynczym modułem zliczającym fotony oraz korelatora sprzętowego. Mikroskopowa komora inkubacyjna z grzałkami bez wibracji została specjalnie zaprojektowana do kontrolowania temperatury w eksperymentach na żywych komórkach. Zgodnie z konwencją oś XY odpowiada prostopadłej płaszczyźnie ścieżki optycznej, a oś Z odpowiada ścieżce optycznej.

2. Codzienny punkt kontrolny przed rozpoczęciem eksperymentu

1. Kontroluj ścieżkę wzbudzenia (Rysunek 3, & ).
   1. Otwórz wszystkie przysłony przysłony.
   2. Zmierz moc lasera za pomocą miernika mocy, utrzymując pierwszą przysłonę całkowicie otwartą.
   3. Obróć płytkę półfalową (HWP), aby znaleźć maksymalną moc.
   4. Sprawdź wyrównanie za pomocą przysłony, jeśli moc lasera jest niższa niż zwykle, i w razie potrzeby przesuwaj naprzemiennie L1 i M1.
   5. Zanotuj wartość mocy w notatniku laboratorium doświadczalnego.
2. Kontroluj ścieżkę detekcji (Rysunek 3, & ).
   1. Umieść na obiektywie wodę, szkiełko nakrywkowe i kroplę roztworu rodaminy 6G (Rh6G) o stężeniu 2 nM.
   2. Jeśli sygnał fluorescencji (liczba zliczeń na APD, zarejestrowana za pomocą oprogramowania LabVIEW) jest niższy niż zwykle, przerób roztwór Rh6G, sprawdź położenie i liczbę szkiełka nakrywkowego na soczewce obiektywu lub wyeliminuj pęcherzyki, jeśli występują.
      1. Jeśli sygnał fluorescencji jest nadal niższy niż zwykle, umieść miernik mocy wewnątrz ścieżki optycznej, aby zablokować wiązkę.
      2. Wyłącz APD (dalej APD odnosi się do APD i modułu zliczania pojedynczych fotonów).
      3. Usunąć próbkę.
      4. Wyczyść i wymień soczewkę obiektywu na tarczę odblaskową.
      5. Sprawdź wiązkę laserową na odblaskowym celu, wyjmując miernik mocy ze ścieżki światła. Upewnij się, że wiązka celu jest wyśrodkowana, a odbicie wsteczne dociera do pierwszej tęczówki na linii (Rysunek 3).
      6. Jeśli nie, dostosuj środkowe położenie za pomocą M2 lub tylne odbicie za pomocą lustra dichroicznego.
      7. Jeśli sprzężenie mikroskopu jest prawidłowe, odepchnij soczewkę obiektywu, dodaj kroplę wody, szkiełko nakrywkowe i kroplę bardziej stężonego roztworu Rh6G (tj. 200 nM) i ustaw niższą moc lasera niż dla klasycznych pomiarów (kilka μW).
      8. Włącz APD i zoptymalizuj APD i wyrównanie otworków, naprzemiennie, za pomocą odpowiednich regulacyjnych XYZ, jednocześnie monitorując sygnał intensywności (oprogramowanie LabVIEW).
      9. Zmienić szkiełko nakrywkowe i dodać niższe stężenie Rh6G (2 nM). Przesuń otwór wzdłuż osi Z, aby znaleźć pozycję, w której współczynnik jasności molekularnej wzrasta, a talia jest minimalna.
      10. Zamknij przysłonę, aż sygnał spadnie: rozmiar wiązki laserowej osiąga rozmiar tylnej apertury obiektywu (tj. minimalny rozmiar talii, patrz Materiał uzupełniający).
      11. Uruchomić oprogramowanie korelatora i zapisać dane (patrz rozdział 7 dotyczący rejestracji danych).
      12. Sprawdź ACF, który powinien wykazywać niski poziom hałasu, dawać mały obwód talii i wysoką szybkość zliczania na cząsteczkę na sekundę (patrz sekcja 7 w celu analizy danych i oceny rozmiaru talii).

3. Ogólne uwagi dotyczące rejestracji i analizy danych svFCS

1. Zapisz i przeanalizuj dane fluorescencji zgodnie z tym ogólnym schematem (patrz sekcje 7, 8 i 9): (1) zapis fluorescencji i generowanie ACF (oprogramowanie korelatora), (2) nieoczekiwane odrzucenie danych, średnia z zatrzymanych danych, dopasowanie do odpowiedniego modelu (z domowym oprogramowaniem Igor Pro), (3) wykres prawa dyfuzji (domowe oprogramowanie MATLAB 1) i (4) opcjonalne porównanie prawa dyfuzji (domowe oprogramowanie MATLAB 2). Różne programy są dostępne na życzenie.
   UWAGA: Korelator sprzętowy ma minimalny czas próbkowania 12,5 ns (tj. częstotliwość próbkowania 80 MHz). Zapewnia rozdzielczość czasową, która jest co najmniej o 1,000 krótsza niż typowy czas przebywania swobodnie dyfuzującej małej cząsteczki w roztworze i o 10⁶ krótsza niż czas dyfuzji białek błonowych w objętości obserwacji konfokalnej.

4. Hodowla komórkowa i transfekcja

1. Wysiewaj komórki Cos7 w 8-dołkowym szkle nakrywkowym z dnem ze szkła borokrzemianowego #1,0 o gęstości 10 000 komórek / studzienkę przy użyciu kompletnego zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 5% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 U / ml), streptomycyną (100 U / ml) i L-glutaminą (1 mM).
2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO_{2 przez} 24 godziny.
3. Usunąć pożywkę, dodać 300 μl świeżej, kompletnej pożywki do basenu i wstępnie inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
4. Rozcieńczyć 0,5 μg plazmidowego DNA kodującego białko Thy-1 połączone z eGFP²⁵ w 50 μl DMEM bez surowicy. Krótko zmieszaj, aby wymieszać.
5. Rozcieńczyć 1,5 μl odczynnika do transfekcji DNA w 50 μl DMEM bez surowicy i dobrze wymieszać roztwór.
6. Dodać rozcieńczony odczynnik do transfekcji bezpośrednio do przygotowanego roztworu DNA i natychmiast wymieszać związki.
7. Przygotowaną mieszaninę inkubować przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej.
8. Dodać kroplami 10 μl połączonych kompleksów DNA/odczynników do transfekcji na pożywkę w każdym dołku i homogenizować, delikatnie obracając płytkę.
9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 3 godziny.
10. Po inkubacji zastąpić pożywkę zawierającą kompleksy DNA/odczynników do transfekcji 400 μl świeżego kompletnego DMEM i hodować komórki przez 16 godzin przed eksperymentem svFCS.

5. Przygotowanie komórek do pomiarów svFCS

1. Usuń pożywkę hodowlaną.
2. Delikatnie umyj komórki dwa do trzech razy buforem zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) bez surowicy zawierającym Ca²⁺ i Mg²⁺ uzupełnionym 10 mM (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym) kwasem (HEPES), pH 7,4 (HBSS / HEPES).
3. Utrzymuj komórki w buforze HBSS/HEPES podczas wszystkich akwizycji svFCS.

6. Leczenie farmakologiczne

1. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć komórki dwa do trzech razy bezsurowicowym HBSS uzupełnionym 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES).
2. Inkubować komórki z 1 j./ml roztworu oksydazy cholesterolowej (COazy) w buforze HBSS/HEPES przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
3. Usunąć roztwór i utrzymywać komórki w obecności 0,1 U/ml COazy w buforze HBSS/HEPES podczas wykonywania pomiarów svFCS.

7. Kalibracja rozmiaru plamki

1. Rozgrzać komorę mikroskopu do temperatury 37 °C.
2. Przygotować wzorcowy roztwór Rh6G o stężeniu 2 nM przez szeregowe rozcieńczanie.
3. Upuść 200 μl roztworu Rh6G o stężeniu 2 nM na szklane szkiełko nakrywkowe umieszczone na obiektywie zanurzonym w wodzie.
4. Uruchom cały sprzęt i oprogramowanie.
5. Zmierz i dostosuj moc wiązki laserowej 488 nm do 300 μW. W zależności od jasności i fotostabilności zastosowanej sondy fluorescencyjnej, dostosuj tę moc zgodnie z (1) intensywnością fluorescencji (w oprogramowaniu LabVIEW), która powinna być stabilna, (2) kształtem ACF (w oprogramowaniu korelatora), który powinien mieć stały kształt w czasie, oraz (3) parametry dopasowania dające mały rozmiar talii i wysoki wskaźnik zliczania na cząsteczkę (fotony na cząsteczkę na sekundę, zwykle od kilkudziesięciu do setek fotonów na cząsteczkę na sekundę).
   UWAGA: Amplituda ACF (zwana G(0)) jest odwrotnie proporcjonalna do liczby cząsteczki (tj. stężenia sondy fluorescencyjnej). W przypadku kalibracji rozmiaru talii jest to dobry parametr kandydata do kontroli jakości. Dlatego G(0) powinno być podobne dla tego samego stężenia z dnia na dzień, ponieważ łączy obwód talii i stężenie. W przypadku pomiarów celi, ponieważ FCS jest dokładniejszy dla niskiego stężenia, G(0) powinno być wysokie, aby uzyskać prawidłowe dopasowanie do ekstrakcji.
6. Ustaw port mikroskopu oświetlenia/detekcji svFCS za pomocą oprogramowania LabVIEW.
7. Włącz APD.
8. Zamknij tęczówkę, aż sygnał spadnie, aby uzyskać minimalny rozmiar talii, lub zamknij ją, aby uzyskać większy rozmiar talii.
9. Zarejestruj kilka ACF o wybranym czasie trwania (a mianowicie przebieg), aby poprawić odtwarzalność statystyczną, zazwyczaj 10 serii trwających 20 s każdy za pomocą oprogramowania korelatora.
10. Wyłącz APD.
11. Użyj oprogramowania Igor Pro, aby sprawdzić i odrzucić przebiegi z silnymi wahaniami spowodowanymi agregatami molekularnymi. Wykonaj ten krok ręcznie — powinien być niezależny od użytkownika po przeszkoleniu użytkowników.
12. Dopasuj średnią zachowanych ACF do modelu dyfuzji 3D.
13. Wyodrębnij z parametrów dopasowania średni czas dyfuzji i zapisz go do pliku ".txt" (format pliku jest dyktowany przez oprogramowanie Igor Pro).
14. Sprawdź szybkość zliczania na cząsteczkę na sekundę (dobry wskaźnik wydajności), dzieląc średnią intensywność (wyekstrahowaną ze śladu fluorescencji) przez liczbę cząsteczek (wyekstrahowanych z ACF).
    UWAGA: Upewnij się, że ta wartość jest wysoka i stabilna z dnia na dzień dla tych samych parametrów akwizycji.
15. Znając współczynnik dyfuzji Rh6G w roztworze wodnym w temperaturze 37 °C (D) i (patrz 7.13), obliczyć eksperymentalny obwód obwodu talii ω według: .
16. Zastosuj procedurę dla każdej modyfikacji obwodu talii wymaganej do wykreślenia prawa dyfuzji FCS i przed każdą nową serią eksperymentalną akwizycji danych svFCS.

8. Akwizycja danych svFCS na komórkach

1. Zmierz i dostosuj moc wiązki 488 nm w zakresie od 2 do 4 μW. W zależności od jasności i fotostabilności użytej sondy fluorescencyjnej, dostosuj tę moc, aby umożliwić wysoką szybkość zliczania na cząsteczkę (zwykle kilka tysięcy fotonów na cząsteczkę na sekundę), przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego poziomu fotowybielania (tj. stabilnego śladu intensywności w oprogramowaniu LabVIEW).
2. Przed rozpoczęciem pomiarów należy równoważyć próbki przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
3. Ustaw mikroskop oświetlenia epi-fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania LabVIEW.
4. Wybierz komórkę z odpowiednią lokalizacją sondy fluorescencyjnej i (niską) intensywnością sygnału fluorescencji.
   UWAGA: Im niższa fluorescencja, tym lepsze są pomiary FCS (patrz krok 8.1).
5. Ustaw port mikroskopu oświetlenia/detekcji svFCS za pomocą oprogramowania LabVIEW.
6. Włącz APD.
7. Wykonaj skanowanie xy wybranej komórki za pomocą oprogramowania LabVIEW.
8. Wykonaj skan z i zlokalizuj plamkę konfokalną o maksymalnej intensywności fluorescencji, wybierając błonę plazmatyczną u góry i rozpocznij akwizycję danych. Aby zmaksymalizować separację między dwiema błonami, najlepiej wykonać skan w obszarze jądrowym komórki.
9. Nagraj jedną serię 20 przebiegów trwających 5 sekund, każdy za pomocą oprogramowania korelatora.
   UWAGA: Upewnij się, że czas trwania każdego biegu jest wystarczająco długi, aby uzyskać ACF o zmniejszonym hałasie. Długie akwizycje są podatne na fotobielenie lub nieoczekiwane znaczne zmiany (np. agregaty). Dostosuj liczbę serii, czas ich trwania i liczbę serii do próbek, ale upewnij się, że pozostają one stałe w tej samej liczbie eksperymentów, aby zapewnić odtwarzalność.
10. Wyłącz APD.
11. Odrzuć nieoczekiwane przebiegi za pomocą oprogramowania Igor Pro.
12. Dopasuj przeciętny ACF do 2-gatunkowego modelu dyfuzji 2D. Dostosuj ten model do rodzaju zachowania dyfuzyjnego cząsteczki docelowej.
13. Zapisz parametry dopasowania w poprzednim pliku (patrz krok 7.13).
14. Wykonaj od 10 do 15 serii nagrań na co najmniej 10 różnych komórkach i odtwórz kroki od 8.3 do 8.13. Sprawdź, czy uzyskany pojedynczy plik zawiera informacje o rozmiarze talii i parametrach dopasowania 10–15 nagrań.
15. Aby ustalić pojedyncze prawo dyfuzji, przeanalizuj co najmniej cztery rozmiary talii wahające się od 200 do 400 nm. Zakres ten jest zdefiniowany przez granicę optyczną dyfrakcji, ale jest zależny od obiektywu (apertura numeryczna) i lasera (długość fali).
    UWAGA: Ponieważ kalibracja obwodu talii nie jest bezwzględna i ma pewien stopień niepewności, dedykowane oprogramowanie MATLAB²⁸ uwzględniające błąd x i y (czyli ω² i t_d) zostało zbudowane tak, aby pasowało do prawa dyfuzji.
16. Uruchom oprogramowanie MATLAB 1 i wybierz folder zawierający wszystkie pliki ".txt" odpowiadające co najmniej czterem eksperymentom z obwodem talii.
17. Wykres <t_d> a <ω²>, czyli prawo dyfuzji. Można wyodrębnić dwa główne parametry: punkt przecięcia osi y (t₀) i efektywny współczynnik dyfuzji (D_eff, odwrotnie proporcjonalny do nachylenia).

9. Porównanie praw dyfuzji różnych warunków eksperymentalnych

UWAGA: Jeśli to konieczne, odtwórz sekcje 7 i 8 dla różnych warunków eksperymentalnych. Opracowano dedykowane oprogramowanie (MATLAB software 2) w celu określenia, czy te prawa dyfuzji są podobne, czy nie, zgodnie z wartościami t₀ i D_eff²⁸. Testuje dwie hipotezy: dwie wartości są różne lub dwie wartości nie różnią się przy progu ustawionym powyżej prawdopodobieństwa fałszywego alarmu (PFA). Dowolna wartość PFA wynosząca 5% (T = 3,8) jest uważana za górną granicę istotności między dwoma parametrami (t₀ lub D_eff), co wskazuje, że istnieje tylko 5% szansy, że te dwie wartości są identyczne.

1. Utwórz plik ".xls" zawierający charakterystyczne wartości prawa dyfuzji dla każdego warunku do porównania (tj. plik zawierający błąd t₀, t₀, błąd D_eff i błąd D_eff dla warunków nietraktowanych (NT) i traktowanych (COase) w formie tabeli).
   1. Uruchom oprogramowanie MATLAB 2.
   2. Wybierz plik ".xls".
   3. Przeanalizuj wygenerowany wykres 2D oznaczony kolorami, na którym testy statystyczne t₀ i D_eff mają być wykreślone odpowiednio na osiach x i y (Rysunek 4). Im wyższe jest T, tym większa jest różnica między porównywanymi wartościami.

10. Pomiary stężenia cholesterolu

1. Leczenie i liza komórek
   1. Wysiewać komórki Cos7 trzykrotnie na płytkach 6-dołkowych w 4 × 10⁵ komórek/basenik i inkubować w 2 ml kompletnego DMEM w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez noc, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do płytki.
   2. Usunąć pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   3. Dodać 1 ml buforu HBSS/HEPES zawierającego (lub nie, w przypadku kontroli) 1 U/ml Coase i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   4. Zastąp pożywkę 1 ml HBSS/HEPES zawierającym 0,1 U/ml Coase i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   5. Usuń roztwór i zbierz komórki.
   6. Przemyć komórki trzykrotnie PBS i odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Lizować komórki za pomocą buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl₂, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy, 2% glicerol, koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy) przez 30 minut na lodzie.
   8. Odwirować lizaty w temperaturze 10000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.
2. Określić ilościowo całkowite stężenie białka dla każdej próbki za pomocą zmodyfikowanego testu białkowego Bradforda, używając roztworu roboczego zgodnie z zaleceniami producenta.
3. Pomiar stężenia cholesterolu
   1. Aby enzymatycznie określić całkowity poziom cholesterolu komórkowego, należy użyć odpowiedniego zestawu (np. Amplex Red Cholesterol Assay Kit) zgodnie z zaleceniami producenta.
   2. Dla każdej reakcji wymieszać próbkę zawierającą 5 μg białka z odczynnikiem Amplex Red/roztworem roboczym peroksydazy chrzanowej/oksydazy cholesterolowej/esterazy cholesterolu i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
   3. Zmierz fluorescencję za pomocą wzbudzenia 520 nm i wykryj emisję przy 560–590 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
   4. Odejmij tło od wartości końcowej i określ stężenie cholesterolu za pomocą krzywej standardowej.
   5. Obliczyć końcową zawartość cholesterolu w ng cholesterolu na μg białka.

Results

Wygenerowano DL dla Thy1-GFP wyrażonego w komórkach Cos-7 (Rysunek 4, czarne kwadraty). Prawo dyfuzji ma dodatnią wartość t₀ (19,47 ms ± 2 ms), co wskazuje, że Thy1-GFP jest zamknięty w strukturach nanodomenowych błony komórkowej. Leczenie oksydazą cholesterolową komórek wykazujących ekspresję Thy1-GFP spowodowało przesunięcie wartości DL _{t 0} do 7,36 ± 1,34 ms (Rysunek 4, szare kwadraty). Obserwacja ta potwierdza, że charakter uwięzienia Thy1-GFP zależy od zawartości cholesterolu i jest związany z nanodomenami tratw lipidowych. Wykazano, że te dwa prawa dyfuzji różnią się od siebie zgodnie z testem statystycznym opisanym powyżej (patrz krok 9.1.3) pod względem wartości t₀ i D_eff. Ponadto oceniliśmy stężenie całkowitego cholesterolu komórkowego w nieleczonych komórkach Cos-7 w porównaniu z komórkami leczonymi COazą. Niewielki, ale znaczący spadek całkowitej zawartości cholesterolu obserwuje się po leczeniu COazy (Ryc. 5). Ponieważ enzym ten działa tylko na pulę cholesterolu dostępną na zewnętrznej płatku błony komórkowej, zakładamy, że obserwowany spadek cholesterolu jest związany tylko z błoną plazmatyczną i powoduje destabilizację nanodomen tratwy lipidowej.

Rysunek 1: Symulowane prawa dyfuzji spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) ustalone przez FCS o zmienności punktowej dla różnych form organizacji błony. (Górne panele) Schematyczne przedstawienie organizacji membrany - (A) swobodna dyfuzja, (B) bariery siatkowe i (C) uwięzienia pułapki/domeny — z trajektorią narysowaną dla pojedynczej cząsteczki (kolor czerwony). Niebieskie kółka oznaczają przecięcie membrany i wiązki laserowej talii ω. (Dolne panele) Prawa dyfuzji FCS reprezentowane przez wykreślenie czasu dyfuzji t_d w funkcji kwadratu promienia ω². Rzut prawa dyfuzji (zielona linia przerywana) przecina oś czasu w punkcie (A) początku układu współrzędnych (t₀ = 0) w przypadku dyfuzji swobodnej; (B) w osi ujemnej (t₀ < 0), gdy istnieją bariery siatkowe, lub (C) w osi dodatniej (t₀ > 0), gdy istnieją pułapki i domeny (tratwy lipidowe). D jest współczynnikiem dyfuzji bocznej dla ruchów Browna; D_eff, efektywny współczynnik dyfuzji; D_mikro, mikroskopijny współczynnik dyfuzji wewnątrz pułapek siatkowych; D_in, współczynnik dyfuzji wewnątrz domen; D_out, współczynnik dyfuzji poza domenami; L, rozmiar boku domeny kwadratowej; i r_D, promień domeny kołowej. Ten rysunek został zmodyfikowany z He and Marguet⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat sterowania sprzętowego svFCS. Komputer steruje wszystkimi urządzeniami za pomocą różnych protokołów komunikacyjnych: szeregowego (mikroskop, zewnętrzna migawka), USB (stolik piezoelektryczny XYZ, korelator) i PCI (płytka akwizycyjna). DAQ: płytka akwizycji danych, APD: fotodioda lawinowa, SPCM: moduł zliczający pojedyncze fotony, DO: wyjście cyfrowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematyczny widok ścieżek optycznych wzbudzenia i emisji układu svFCS. Konfiguracja svFCS składa się z czterech modułów: (1) wyjście światłowodowego lasera 488 nm jest kolimowane, (2) połączenie płytki półfalowej i polaryzacyjnego rozdzielacza wiązki ustawia moc optyczną, (3) wiązka laserowa skupiona na próbce po przejściu przez mikroskop z silnikiem bez soczewki rurki oraz (4) fluorescencja jest wykrywana przez konfokalną ścieżkę detekcji na fotodiodę lawinową sprzężoną z pojedynczym modułem zliczającym fotony, który dostarcza sygnał do korelatora sprzętowego. Prostota nadaje systemowi czułość, solidność i łatwość obsługi (szeroko komentowane w materiałach dodatkowych). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Prawa dyfuzji svFCS wygenerowane na podstawie analizy dyfuzji Thy1-GFP wyrażonego w Cos-7. Prawa dyfuzji svFCS komórek Cos-7 bez leczenia (NT, czarne kwadraty) i po leczeniu oksydazą cholesterolową (COase, szare kółka). Wstawka na wykresie przedstawia statystyczne testowanie istotnej różnicy między dwoma przedstawionymi prawami dyfuzji svFCS (według Mailfert et al.²⁸). Wartość badania (T) powinna być wyższa od progu ustalonego na poziomie 3,8, gdy oba prawa dyfuzji są różne. Im jest wyższy, tym większa jest różnica między prawami dyfuzji. Wartość T jest oznaczona kolorem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Porównanie zawartości cholesterolu całkowitego w komórkach Cos-7. Komórki Cos-7 nie były leczone (NT) lub traktowane 1 U/ml oksydazy cholesterolowej (COazy) przez 1 godzinę. Dane reprezentują przykład jednego eksperymentu w trzech egzemplarzach. Do oceny różnicy statystycznej zastosowano dwustronny, niesparowany test t (α=0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela materiałów: Lista elementów optycznych wymaganych do konfiguracji svFCS.

Materiał uzupełniający: Ten dokument opisuje budowę konfiguracji svFCS od podstaw. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

W tym miejscu opisaliśmy implementację modułu svFCS na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym, potężne eksperymentalne podejście do rozszyfrowania dynamiki organizacji błony plazmatycznej w żywych komórkach dzięki analizie prawa dyfuzji FCS. Koncepcyjnie svFCS opiera się na prostej zasadzie: pomiarach korelacji fluorescencji w dziedzinie czasu przy jednoczesnej zmianie wielkości obszaru oświetlenia²³. Strategia ta odegrała zasadniczą rolę w dedukowaniu informacji nanoskopowych z pomiarów mikroskopowych, co pomaga rozszyfrować główne elementy fizykochemiczne przyczyniające się do organizacji błony plazmatycznej w stanie ustalonym²⁵ i procesach fizjologicznych 30,31,32,33^. Podsumowując, te analizy svFCS jednoznacznie wskazują na istnienie zależnych od lipidów nanodomen w różnych typach komórek i ich bezpośredni wpływ na dostrajanie różnych zdarzeń sygnalizacyjnych.

W tym kontekście istnieją pewne aspekty optyczne, które należy wziąć pod uwagę podczas budowania konfiguracji svFCS, aby zoptymalizować budżet fotonów i zminimalizować aberracje optyczne. Dlatego zalecamy użycie mikroskopu, z którego można wyjąć soczewkę tubusu podczas wykonywania pomiaru svFCS. Co więcej, pojedyncza przysłona odgrywa kluczową rolę w konfiguracji svFCS: zmienia rozmiar wiązki na tylnym otworze obiektywu, bezpośrednio zmieniając w ten sposób efektywny rozmiar talii (tj. efektywną objętość wzbudzenia). Średnica wiązki powinna pasować do tylnej źrenicy obiektywu, aby uzyskać najmniejszy rozmiar w pasie³⁴. Ta opcja, która pomaga dostosować obwód talii, zapewnia optymalizację budżetu fotonowego i jest łatwa do wdrożenia. Wreszcie, wzdłuż ścieżki światła stosuje się minimalną liczbę części optycznych; Im mniej złożony system, tym mniej utraconych fotonów. Wszystkie te opcje znacznie zwiększają niezawodność eksperymentów svFCS.

Jeśli chodzi o sam protokół, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Najważniejsze jest odpowiednie ustawienie ścieżek optycznych, które ma kluczowe znaczenie dla udanych pomiarów svFCS (protokół, sekcja 2). Można to łatwo sprawdzić, analizując sygnał fluorescencyjny z roztworu Rh6G 2 nM, który powinien wynosić ~200 kHz przy oświetleniu laserowym 300 μW. Wszystkie tęczówki powinny być otwarte, a ACF powinny mieć ważną amplitudę (zwykle G0 ~ 1,5–2,0). Kolejny krytyczny punkt dotyczy komórek i ich przygotowania do analizy svFCS (protokół, sekcje 4-8). Ich gęstość musi być dostosowana tak, aby izolowane komórki, które mają być obserwowane, były dostępne do analizy. Nieprzylegające komórki muszą zostać unieruchomione na komorze nakrywkowej za pomocą roztworu poli-L-lizyny. Sygnał fluorescencyjny z znakowania komórek nie powinien być zbyt silny, w przeciwnym razie będzie to skutkowało bardzo płaskimi ACF-ami, które są trudne do dopasowania, a parametry dopasowania obarczone są istotnym błędem. Dodatkowo, niejednorodne znakowanie i agregaty fluorescencyjne w komórkach sprawiają, że pomiary svFCS są niezwykle trudne do interpretacji. Wreszcie, leczenie oksydazą cholesterolową wpływa na żywotność komórek, a analiza svFCS nie powinna przekraczać jednej godziny po zabiegu. Lepiej jest również rejestrować fluktuacje fluorescencji z górnej błony plazmatycznej, ponieważ nie jest ona przymocowana do podpory i nie ma ryzyka utrudnionej dyfuzji cząsteczek z powodu fizycznych interakcji z podporą.

Technika svFCS poczyniła wystarczające postępy, aby można ją było stosować w różnych podejściach, ze względu na różnorodność modalności regulacji objętości detekcji, co umożliwia badanie różnych procesów biologicznych w żywych komórkach. Alternatywą dla regulacji wielkości objętości wzbudzenia jest zastosowanie zmiennego ekspandera wiązki³⁵. Możliwe jest również proste modulowanie wielkości obszaru oświetlenia poprzez rejestrację sygnału fluorescencyjnego z punktu przecięcia błony plazmatycznej wzdłuż kierunku z³⁶. Można to zrobić na standardowym mikroskopie konfokalnym, dla którego opracowano ramy teoretyczne w celu wyprowadzenia prawa dyfuzji^37,38.

Chociaż metoda svFCS oferuje rozdzielczość czasoprzestrzenną, która jest niezbędna do scharakteryzowania niejednorodnej organizacji bocznej błony plazmatycznej, geometryczne tryby uwięzienia nie wykluczają się wzajemnie. Odchylenie t₀ w jednym lub drugim kierunku ujawnia wyłącznie dominujący sposób uwięzienia²⁵. Co więcej, kolejnym istotnym ograniczeniem obecnej metody svFCS jest klasyczna granica dyfrakcji optycznej (~200 nm). Jest to bezsprzecznie większe niż domeny ograniczające cząsteczki w błonie komórkowej plazmatycznej. W związku z tym analizę uwięzienia wyprowadza się z wartości t₀ , ekstrapolowanej z prawa dyfuzji.

Ta wada została przezwyciężona poprzez wdrożenie alternatywnych metod. Początkowo stosowanie folii metalicznych wierconych za pomocą nanoapertur dawało możliwość oświetlenia bardzo małego obszaru membrany (tj. poniżej granicy dyfrakcji optycznej pojedynczych apertur nanometrycznych o promieniach wahających się od 75 do 250 nm)³⁹. W ten sposób przedstawiono reżim przejściowy przewidziany na podstawie teoretycznego prawa dyfuzji dla organizacji izolowanej domeny, który pozwolił na udoskonalenie charakterystycznego rozmiaru nanometrycznych niejednorodności błon i ilościowe oszacowanie powierzchni zajmowanej przez nanodomeny zależne od lipidów³⁹. Alternatywnie, oświetlenie nanometryczne zostało również opracowane przy użyciu skaningowej mikroskopii optycznej^{bliskiego pola 40} lub planarnych nanoanten optycznych⁴¹. Niedawno, połączenie wymuszonego zubożenia emisji (STED) i FCS dostarczyło potężnego i czułego narzędzia do dokumentowania prawa dyfuzji z bardzo wysoką rozdzielczością przestrzenną. Ten STED-FCS daje dostęp do charakterystyki dyfuzji molekularnej w nanoskali zachodzącej w krótkim czasie, umożliwiając badanie dynamicznej organizacji sond lipidowych w błonie plazmatycznej ^42,43. Jednak niepełne tłumienie fluorescencji w procesie STED stanowi wyzwanie dla analizy krzywych autokorelacji w FCS.

Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowano nowy model dopasowania, poprawiając dokładność pomiarów czasów dyfuzji i średniej liczby cząsteczek⁴⁴. Wreszcie, w celu powolnej dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej, zasadę svFCS można zastosować do danych zarejestrowanych za pomocą spektroskopii korelacji obrazu⁴⁵. Ostatnio wykazano, że połączenie mikroskopii sił atomowych (AFM) z obrazowaniem całkowitego wewnętrznego odbicia-FCS (ITIR-FCS) przyczynia się do udoskonalenia natury mechanizmu utrudniającego dyfuzję molekularną w błonie plazmatycznej, zwłaszcza w pobliżu konfiguracji membrany progowej perkolacji ze względu na dużą gęstość nanodomen⁴⁶.

Podsumowując, ustalenie prawa dyfuzji przez svFCS dostarczyło dowodów eksperymentalnych pozwalających wywnioskować lokalną heterogeniczność utworzoną przez dynamiczne zbiorowe asocjacje lipidów i białek błonowych. Jak stwierdzili Wohland i^{współpracownicy46}, "analiza prawa dyfuzji FCS pozostaje cennym narzędziem do wnioskowania o cechach strukturalnych i organizacyjnych poniżej limitu rozdzielczości na podstawie informacji dynamicznych". Mimo to musimy opracować nowe modele, aby doprecyzować interpretację prawa dyfuzji, co powinno pozwolić na lepsze zrozumienie dynamiki zdarzeń molekularnych zachodzących w błonie plazmatycznej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Narzędzie do zliczania	Klucz płaski do pierścieni ustalających z gwintem SM1	Thorlabs	SPW602
Fotodioda lawinowa i moduł zliczający pojedyncze fotony (SPCM)	Moduł zliczający pojedyncze fotony, fotodioda lawinowa	Excelitas	SPCM-AQRH-15
	BNC 50 & Omega; wtyczka do 50 & Omega; przewód wtykowy 2 m	RS Components	742-4315
	koncentryczny 415 Złącza cinch, RG-316, 50 i Omega; Ze złączem, 1,22 m, RoHS2	RS Components	885-8172
	Tee 50Ω Adapter RF Wtyk BNC do gniazda BNC 0 i rzadko; 1GHz	RS Components	546-4948
	Brennenstuhl 2.5 m, 8 Gniazdo Typ E – Francuski przedłużacz, 230 V	RS Components	768-5500
	Mascot, zasilacz wtykowy 6 W 5 V DC, 1,2 A, 1 wyjście Zasilacz impulsowy, typ C	RS Components	452-8394
	Crystek CCSMACL-MC-24 Oscylator referencyjny zasilający Adapter RF	RS Components	792-4079
Filtrowanie fluorescencyjne	535/70 ET Pasmo przepustowe, AOI 0° Średnica chrominancji 25 mm	Filtr AHF	F47-539
	Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Filtr AHF Chroma 25,5 x 36 x 1 mm		F43-088
	496/LP BrightLine HC Filtr długoprzepustowy, AOI 0° Filtr AHF o średnicy chrominancji 25		F37-496
Korelator sprzętowy	80 MHz Korelator cyfrowy	Correlator.com	Flex02-12D
Laser	LASER LASOS LDM-XT sprzężony światłowód, 488 nm, 65 mW	Lasos	BLD-XT 488100
Bezpieczeństwo laserowe	Wysokowydajna taśma maskująca, 1" x 180' (25 mm x 55 m) rolka	Thorlabs	T743-2.0
	Chusteczki do soczewek, 25 arkuszy w broszurze, 5 broszur	okulary ochronne Thorlabs	MC-5
	, jasnopomarańczowe soczewki, 48% przepuszczalności światła widzialnego	Mikroskop Thorlabs	LG3B
	Zmotoryzowany mikroskop odwróconej fluorescencji Zeiss Axiovert 200M Precyzyjne i zgrubne ustawianie ostrości, obrót wieżyczki reflektora, obrót głowicy obiektywu, przełączanie portów kamery i wewnętrznych przesłon świetlnych	Carl Zeiss
	C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.wybrane dla FCS (D=0,14-0,19 mm) (WD=0,28 mm przy D=0,17 mm), UV-VIS-IR	Carl Zeiss	421767-9971-711
	Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-345
	Pierścień środkowy W0.8 - W0.8 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-347
Ścieżka optyczna	D25.4mm Lustro, chronione srebrne	tholabs	PF10-03-P01
	D25.4mm, F=60.0.mm, Widoczne	achromatyczne Horlabs	AC254-060-A
	D25.4mm, F=35.0.mm, Widoczne	achromatyczne	AC254-035-A
	25 µ m Otwór otworkowy	Thorlabs	P25S I
	25,4 mm Zamontowany zero, zamówienie 1/2 Waveplate 488 nm	Thorlabs	WPH10M-488 (HWP)
	20mm Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki Cube 420-680 nm	Thorlabs	PBS201
	Stopień obrotu 56 mm x 26 mm Gwintowany identyfikator	Thorlabs	RSP1/M
	52 mm x 52 mm Kinematyczny uchwyt platformowy	Thorlabs	KM100B/M
	Regulowany zacisk pryzmatyczny	Thorlabs	PM3/M
	Blok belki - obszar aktywny 19 mm x 38 mm	Thorlabs	LB1/M Przysłona
	irysowa 1 mm do 25 mm Przysłona	Thorlabs	ID25/M
	Leworęczny kinematyczny cylindryczny uchwyt	obiektywu Thorlabs	KM100CL
	" Uchwyt optyczny, kran M4	Thorlabs	MFF101/M
	1" Stackable Lens Tube	Thorlabs	SM1L03
	Stackable Lens Mount do 1" optycznej głębokości użytkowej i frac12;	Thorlabs	SM1L05
	Uchwyt do układania w stos do 1 "Optyczna głębokość użytkowa 2"	Thorlabs	SM1L20
	Małe szyny optyczne 600 mm, metryczne	Thorlabs	RLA600 / M
	Małe szyny optyczne 75 mm, metryczne	Thorlabs	RLA075 / M
	Małe szyny optyczne 150 mm, metryczne	Thorlabs	RLA150 / M
	Rail Carrier, Otwór z pogłębieniem 1 "x 1"	Thorlabs	RC1
	Nośnik szynowy, prostopadły jaskółczy ogon	Thorlabs	RC3
	Precyzyjne mocowanie soczewki translacyjnej do 1-calowych	Thorlabs	LM1XY/M
	½ " (12mm) Stopień translacji jaskółczego ogona	Thorlabs	DT12/M
	Zaciski szynowe	Thorlabs	CL6
	Metryczny stolik translacyjny XYZ (zawiera PT102)	Thorlabs	PT3/M
	gumowana tkanina Zestaw	Thorlabs	BK5
	/ 6 narzędzi	Adapter Thorlabs	BD-KIT/M
	z zewnętrznymi gwintami M6 x 1,0 i zewnętrznymi gwintami M4 x 0,7	Podstawa montażowa Thorlabs	AP6M4M
	, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 sztuk	Thorlabs	BA1S/M-P5
	Mocowanie obiektywu do adaptera optycznego 25,4 mm	Thorlabs	LMR1/M
	SM1 FC/APC	Thorlabs	SM1FCA
	Kinematyczne mocowanie lustra do optyki 1 cal Silikonowa głowica zasilająca	Thorlabs	KM100
	, 400-1100nm, 50mW	Thorlabs	S120C
	12,7 mm, śruba skrzydełkowa z blokadą sześciokątną, L=50 mm, 5 sztuk		PH50/M-P5
	Uchwyt słupka ze sprężynową śrubą skrzydełkową z blokadą sześciokątną, L=20 mm	Thorlabs	PH20/M
	12,7 mm x 50 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, otwór gwintowany M6, 5 sztuk	Thorlabs	TR50/M-P5
	12,7 mm x 75 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, Otwór gwintowany M6, 5 sztuk	Thorlabs	TR75/M-P5
	Interfejs USB Power and Energy Meter	Thorlabs	PM100USB
	12,7 mm x 30 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, Otwór gwintowany M6 Rurki		TR30/M
	12,7 mm x 20 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4, Otwór gwintowany M6	Thorlabs	TR20/M
	Szyna konstrukcyjna o długości 750 mm (skrzynka detekcyjna)	Thorlabs	XE25L750/M
	Szyna konstrukcyjna o długości 350 mm (skrzynka detekcyjna)	Thorlabs	XE25L350/M
	Quick Corner Cube do szyn 25 mm	Thorlabs	XE25W3
	do szyn 25 mm	Thorlabs	XE25A90
	tablica plakatowa 20" x 30" (508 mm x 762 mm), grubość 1/16" (1,6 mm), 5 arkuszy	Zawias Thorlabs	TB5
	do obudów	szynowych 25 mmOgranicznik pokrywy Thorlabs	XE25H
	do obudów szynowych 25 mm	Thorlabs	XE25LS
	M4 Zestaw z walcowym	Thorlabs	HW-KIT1/M
	M6 i zestaw osprzętu	Thorlabs	HW-KIT2/M
	Zacisk stołowy, kształt litery L, 5 sztuk	Thorlabs	CL5-P5
	Membrana przysłony irysowej uruchamiana pierścieniowo (Ø 0,8 - &Ø 12 mm)	Thorlabs	SM1D12D
	Ø 1" Tarcza wyrównująca z matowego szkła SM1 z ukoszkiem; Otwór 1 mm		DG10-1500-H1-MD
	Blat optyczny o strukturze plastra miodu, Standa	Standa	1HB10-15-12
	Wspornik stołu optycznego, Standa	Standa	1TS05-12-06-AR
Próbka nanopozycjonowania	Precyzja XYZ Nanopozycjonowanie	Physik Instrumente	PI P527-3.CD
	Cyfrowy wielokanałowy Piezo Co, 3 kanały, -30 do 130 V Złącze Sub-D, Czujniki pojemnościowe,Physik	Instrumente	PI E727-3.CD
komora temperaturowa	System inkubatora mikroskopu odwróconego Zeiss 200M MATT BLK	Digital Pixel
	Dwukanałowy mikroprocesorowy regulator temperatury	Cyfrowy piksel	DP_MTC_2000_DUO
	Dwa moduły	grzewcze bez wibracjiCyfrowy	czujnik temperatury Pixel DP_150_VF
	PT100 Piksel	cyfrowy	DP_P100_TS
odczynniki i materiały biologiczne
Hodowla i transfekcja	komórkowa Komórki Cos7	ATCC®	CRL-1651 i handel;
	8-dołkowe komory Lab-Tek	Thermo Fisher Scientific	155411PK
	Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
	Surowica bydlęca	płodu Thermo Fisher Scientific	16000044
	L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081
	Bufor PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
	PenStrep	Thermo Fisher Scientific	15140122
	Odczynnik do transfekcji PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Pomiar zawartości cholesterolu	Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex	Thermo Fisher Scientific	A12216
	Inhibitor proteazy	Thermo Fisher Scientific	87786
	Inhibitor fosfatazy Koktajl	Thermo Fisher Scientific	78420
	ROTI Nanoquant Roztwór roboczy	Roth	K880
	GloMax Discover Czytnik mikropłytek	Pomiary svFCS Promega	GM3000
	Bufor HBSS	Thermo Fisher Scientific	14025092
	Hepes Bufor	Thermo Fisher Scientific	15630080
	Cholesterol oksydaza	Sigma-Aldrich	C8868
	Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	83697-1G