Artykuł metodologiczny

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61823

⸱

12 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, Inserm, Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Univ, 2Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 3Faculty of Biological Sciences, University of Wroclaw, 4CNRS, Centrale Marseille, Institut Fresnel, Aix Marseille Univ

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Streszczenie

Dynamiczne procesy biologiczne w żywych komórkach, w tym te związane z organizacją błony plazmatycznej, zachodzą na różnych skalach przestrzennych i czasowych, odpowiednio od nanometrów do mikrometrów i od mikrosekund do minut. Tak szeroki zakres procesów biologicznych stanowi wyzwanie dla konwencjonalnych podejść mikroskopowych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę wykonywania pomiarów spektroskopii korelacji fluorescencji ze zmiennością plamki (svFCS) przy użyciu klasycznego mikroskopu fluorescencyjnego, który został dostosowany. Protokół zawiera szczegółową kontrolę wydajności konfiguracji svFCS oraz wytyczne dotyczące pomiarów dyfuzji molekularnej za pomocą svFCS na błonie plazmatycznej żywych komórek w warunkach fizjologicznych. Dodatkowo przedstawiamy procedurę przerywania nanodomen błony plazmatycznej przez leczenie oksydazą cholesterolową i pokazujemy, w jaki sposób te zmiany w bocznej organizacji błony plazmatycznej mogą zostać ujawnione przez analizę svFCS. Podsumowując, ta metoda oparta na fluorescencji może dostarczyć bezprecedensowych szczegółów na temat bocznej organizacji błony plazmatycznej z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Wprowadzenie

Złożoność organizacji błony plazmatycznej
Obecne rozumienie organizacji błon komórkowych musi uwzględniać kilka aspektów1. Po pierwsze, złożony skład lipidowy różni się nie tylko w zależności od typu komórki, ale także w obrębie pojedynczej komórki (organelle błonowe/błona plazmatyczna). Poza tym związane lub wewnętrzne białka błonowe są w większości zorganizowane w dynamiczne kompleksy multimeryczne, z dużymi domenami rozciągającymi się na zewnątrz błony, co stanowi znacznie większy obszar niż w przypadku samych domen transbłonowych. Co więcej, białka związane z błoną wykazują specyficzne zdolności wiązania lipidów lub interakcji z lipidami, które odgrywają rolę w regulacji funkcji białek. Zależą one bezpośrednio od lokalnego składu i dostępności lipidów2.

Na koniec, obserwuje się znaczny poziom asymetrii między dwoma listkami błonowymi ze względu na wewnętrzną asymetryczną strukturę białek błonowych i rozmieszczenie lipidów. Rzeczywiście, równowaga metaboliczna lipidów między syntezą a hydrolizą, w połączeniu z przerzutkiem lipidów między listkami, generuje taką asymetryczną dystrybucję. Ponieważ każdy transport przez dwuwarstwę jest ograniczony przez darmową energię wymaganą do przemieszczania polarnej grupy głowy przez hydrofobowe wnętrze membran, jest on zwykle wspomagany przez selektywne transportery. Dla każdego typu komórki asymetria ma tendencję do stałego utrzymywania się. Łącznie czynniki te przyczyniają się do bocznej niejednorodności lub podziału błony plazmatycznej3,4.

Wzbogacamy tę reprezentację błony plazmatycznej, biorąc pod uwagę wewnętrzną dyfuzję molekularną wewnątrz i w poprzek dwuwarstwy, co przyczynia się do dynamicznej niejednorodności bocznej w skali od dziesiętnych do setek nanometrów i od mikrosekund do sekund. Na przykład zależne od lipidów nanodomeny błonowe - tak zwane tratwy lipidowe, zdefiniowane jako cholesterol i platformy sygnalizacyjne bogate w sfingolipidy - przyczyniają się do podziału błony plazmatycznej5,6. Jednak obecny pogląd na organizację błon nie ogranicza się tylko do tratw lipidowych. Nanodomeny błonowe są bardziej złożone i niejednorodne pod względem składu, pochodzenia i funkcji. Mimo to ich obecność w błonie plazmatycznej musi być ściśle skoordynowana, a dynamiczne interakcje między białkami i lipidami wydają się być ważne w dystrybucji przestrzennej i modyfikacji chemicznej nanodomen błonowych1,3,7,8.

Zasada svFCS i jej zastosowanie do badania organizacji błony plazmatycznej
Chociaż poczyniono znaczne postępy w analizie domen błonowych, głównie za pomocą technik biofizycznych, determinanty, które dyktują lokalną organizację błony plazmatycznej, muszą zostać dopracowane z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną i czasową. Wyznaczniki oparte na śledzeniu pojedynczych molekuł zapewniają doskonałą precyzję przestrzenną i pozwalają na charakteryzację różnych trybów ruchu9,10,11,12, ale mają ograniczoną rozdzielczość czasową przy klasycznej niskiej liczbie klatek na sekundę kamery i wymagają więcej wysiłku eksperymentalnego, aby zarejestrować znaczną liczbę trajektorii. Alternatywnie, współczynnik dyfuzji składników membrany można ocenić za pomocą odzysku fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)13 lub spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS)14. Ten ostatni zyskał więcej uwagi, głównie ze względu na jego wysoką czułość i selektywność, mikroskopijną objętość detekcji, niską inwazyjność i szeroki zakres dynamiki15.

Koncepcyjne podstawy FCS zostały wprowadzone przez Magde i współpracowników około 50 lat temu16,17. Opiera się na rejestrowaniu fluktuacji emisji fluorescencji z wysoką rozdzielczością czasową (od μs do s)18. W swojej nowoczesnej wersji pomiary w żywych komórkach są wykonywane przez małą objętość wzbudzenia konfokalnego (~0,3 femtolitra) umieszczoną w obszarze zainteresowania (np. na błonie komórkowej); Sygnał fluorescencyjny generowany przez dyfundujące cząsteczki fluorescencyjne wchodzące i wychodzące z objętości obserwacyjnej jest zbierany z bardzo wysoką rozdzielczością czasową (tj. czas nadejścia każdego fotonu do detektora). Następnie sygnał jest obliczany w celu wygenerowania funkcji autokorelacji (ACF), z której ekstrahuje się średni czas td (czas dyfuzji), przez który cząsteczka pozostaje w objętości ogniskowej, wraz ze średnią liczbą cząstek (N) obecnych w objętości obserwacyjnej, która jest odwrotnie proporcjonalna do amplitudy ACF. Ten ostatni parametr może być przydatną informacją na temat stężenia cząsteczek w objętości obserwacyjnej.

Od tego czasu, dzięki szybko rozwijającemu się instrumentarium w biofotonice, zaimplementowano coraz większą liczbę modalności FCS, co pozwala na opis dynamicznych zjawisk zachodzących w żywych systemach. Mimo to, gatunek molekularny doświadczyłby bardziej nakładającego się rozkładu wartości współczynnika dyfuzji, co zwykle znajduje odzwierciedlenie w anomalnej charakterystyce dyfuzji, w której cząsteczki dyfundują z nieliniową relacją w czasie19, oraz trudności w zidentyfikowaniu biologicznego znaczenia tej anomalnej subdyfuzji. W przeszłości trudność ta została w pewnym stopniu przezwyciężona poprzez rejestrowanie dyfuzji molekularnej za pomocą FRAP z obszarów o różnych rozmiarach, a nie tylko z jednego obszaru, dostarczając w ten sposób dodatkowych informacji przestrzennych. Umożliwiło to na przykład konceptualizację mikrodomen membranowych20,21,22.

Przełożenie tej strategii na pomiary FCS (tj. tzw. spektroskopię korelacji fluorescencji (svFCS)) zostało ustalone poprzez zmianę wielkości ogniskowej obserwacji, co pozwoliło na rejestrację fluktuacji fluorescencji w różnych skalach przestrzennych23. W ten sposób podejście svFCS dostarcza pośrednich informacji przestrzennych pozwalających na identyfikację i określenie trybów dyfuzji molekularnej oraz rodzaju podziału błony (domeny izolowane kontra domeny ciągłe24) badanych cząsteczek. Wykreślając czas dyfuzji td jako funkcję różnych skal przestrzennych zdefiniowanych przez wartość talii (ω), która odpowiada wielkości promienia wiązki detekcyjnej w tym przypadku23,25, można scharakteryzować prawo dyfuzji danej cząsteczki w danym stanie fizjologicznym. svFCS jest zatem doskonałym odpowiednikiem śledzenia pojedynczych cząstek w dziedzinie czasu26. Zgodnie z ograniczeniem dyfuzji Browna należy spodziewać się ściśle liniowej zależności między czasem dyfuzji td a talią ω (Rysunek 1)23,25. Pochodzenie odchylenia prawa dyfuzji od tego schematu można przypisać niewyłącznym przyczynom, takim jak siatka cytoszkieletu, stłoczenie molekularne, dynamiczne partycjonowanie w nanodomenach lub dowolna kombinacja tych i innych efektów (Rysunek 1) i musi być przetestowana eksperymentalnie25.

Tutaj zapewniamy wszystkie niezbędne punkty kontrolne do codziennego użytku systemu optycznego svFCS zbudowanego od podstaw, który uzupełnia nasze poprzednie recenzje protokołów27,28 na temat tego eksperymentalnego podejścia. Ponadto, jako dowód słuszności koncepcji, podajemy wytyczne dotyczące kalibracji konfiguracji, przygotowania komórek, pozyskiwania danych i analizy w celu ustalenia prawa dyfuzji svFCS (DL) dla Thy1-GFP, białka zakotwiczonego w błonie komórkowej glikozylofosfatydyloinozytolu, o którym wiadomo, że jest zlokalizowane w nanodomenach tratwy lipidowej29. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób częściowa destabilizacja nanodomen lipidowo-tratwy przez leczenie oksydazą cholesterolową wpływa na właściwości dyfuzyjne Thy1-GFP. Dodatkowo, szczegółowy opis budowania konfiguracji svFCS od podstaw znajduje się w materiałach uzupełniających.

Protokół

1. Określenie specyfikacji dla montażu niestandardowego układu svFCS

UWAGA: Prostota proponowanej konfiguracji svFCS umożliwia łatwą instalację, obsługę i konserwację przy niskich kosztach, zapewniając jednocześnie wysoką wydajność odzyskiwania fotonów. Więcej szczegółów znajduje się w Materiałach uzupełniających.

  1. Pomieszczenie eksperymentalne i bezpieczeństwo
    1. Zainstaluj system w pomieszczeniu o stabilnej temperaturze około 21 °C.
    2. Unikaj bezpośredniego przepływu powietrza na pasywny (lub aktywny) stół optyczny i przestrzegaj zasad bezpieczeństwa laserowego podczas ustawiania optyki.
  2. Sprzęt i oprogramowanie
    UWAGA: Materiały uzupełniające szczegółowo opisują etapy instalacji przedstawione na Rysunku 2.
    1. Napisz główne oprogramowanie do akwizycji i sterowania w LabVIEW, wykorzystując architekturę maszyny stanów i strukturę zdarzeń, w której wielofunkcyjna karta akwizycji steruje większością kontrolerów.
      UWAGA: Korelator, laser i miernik mocy są sterowane lub monitorowane za pomocą ich własnego oprogramowania.
    2. Dostosuj procedury instalacji sprzętu i oprogramowania do wykorzystanego sprzętu.
  3. Układ optyczny
    UWAGA: Rysunek 3 ilustruje moduły ławy optycznej użyte w następnych sekcjach w celu kontroli jakości ustawień optycznych. Wszystkie specyfikacje elementów optycznych wymieniono w Tabeli materiałów. Procedura budowy układu jest szczegółowo opisana w Materiałach uzupełniających. System ten składa się z lasera fali ciągłej, zmotoryzowanego mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw imersyjny wodny, detektora z fotodiody lawinowej sprzężonego z modułem zliczania pojedynczych fotonów oraz korelatora sprzętowego. Specjalnie zaprojektowano komorę inkubacyjną mikroskopu z grzałkami bezwibracyjnymi, aby kontrolować temperaturę podczas eksperymentów na żywych komórkach. Zgodnie z konwencją oś XY odpowiada płaszczyźnie prostopadłej do drogi optycznej, a oś Z odpowiada drodze optycznej.

2. Codzienna kontrola przed rozpoczęciem eksperymentu

  1. Skontroluj tor wzbudzenia (Rysunek 3, Równowaga statyczna; schemat ΣFx=0; analiza sił; edukacyjny koncept fizyczny. oraz Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, bilans sprzętu, edukacyjne słowa kluczowe z fizyki.).
    1. Otwórz wszystkie przysłony irysowe.
    2. Zmierz moc lasera miernikiem mocy, pozostawiając pierwszą przysłonę całkowicie otwartą.
    3. Obracaj płytką półfalową (HWP), aby znaleźć maksymalną moc.
    4. Jeśli moc lasera jest niższa niż zazwyczaj, sprawdź wyrównanie za pomocą przysłon i w razie potrzeby przesuwaj naprzemiennie L1 i M1.
    5. Zapisz wartość mocy w laboratoryjnym dzienniku doświadczeń.
  2. Skontroluj tor detekcji (Rysunek 3, Równowaga statyczna; schemat ΣFx=0; bilans wiązki; wektory sił; analiza strukturalna. oraz Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; rozkład wektorowy; ilustracja bilansu sił.).
    1. Umieść wodę, szkiełko nakrywkowe i kroplę 2 nM roztworu rhodaminy 6G (Rh6G) na obiektywie.
    2. Jeśli sygnał fluorescencji (liczba zliczeń na APD, rejestrowana oprogramowaniem LabVIEW) jest niższy niż zazwyczaj, przygotuj ponownie roztwór Rh6G, sprawdź pozycjonowanie i numer szkiełka nakrywkowego na soczewce obiektywu lub usuń ewentualne pęcherzyki powietrza.
      1. Jeśli sygnał fluorescencji nadal jest niższy niż zazwyczaj, umieść miernik mocy w torze optycznym, aby zablokować wiązkę.
      2. Wyłącz APD (dalej APD odnosi się do detektora APD oraz modułu zliczania pojedynczych fotonów).
      3. Usuń próbkę.
      4. Wyczyść soczewkę obiektywu i zastąp ją celem refleksyjnym.
      5. Sprawdź wiązkę lasera na celu refleksyjnym, usuwając miernik mocy z toru świetlnego. Upewnij się, że wiązka na celu jest wycentrowana, a odbicie wsteczne dociera do pierwszej przysłony na linii Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, bilans sprzętu, edukacyjne słowa kluczowe z fizyki. (Rysunek 3).
      6. Jeśli tak nie jest, wyreguluj pozycjonowanie centrum za pomocą M2 lub odbicie wsteczne za pomocą lustra dichroicznego.
      7. Jeśli sprzężenie mikroskopu jest prawidłowe, przesuń soczewkę obiektywu z powrotem, dodaj kroplę wody, szkiełko nakrywkowe oraz kroplę bardziej stężonego roztworu Rh6G (tj. 200 nM) i ustaw niższą moc lasera niż w pomiarach klasycznych (kilka µW).
      8. Włącz APD i optymalizuj naprzemiennie wyrównanie APD oraz otworka (pinhole) za pomocą odpowiednich śrub regulacyjnych XYZ, monitorując sygnał intensywności (oprogramowanie LabVIEW).
      9. Wymień szkiełko nakrywkowe i dodaj Rh6G o niższym stężeniu (2 nM). Przesuwaj otworek wzdłuż osi Z, aby znaleźć pozycję, w której stosunek jasności molekularnej wzrasta, a Talia (waist) jest minimalna.
      10. Zamykaj przysłonę, aż sygnał spadnie: rozmiar wiązki lasera osiąga rozmiar tylnej apertury obiektywu (tj. minimalny rozmiar talii, patrz Supplementary material).
      11. Uruchom oprogramowanie korelatora i zarejestruj dane (patrz sekcja 7 w celu rejestracji danych).
      12. Sprawdź ACF, która powinna wykazywać niski poziom szumów, wskazywać mały rozmiar talii i wysoką liczbę zliczeń na cząsteczkę na sekundę (patrz sekcja 7 w celu analizy danych i oceny rozmiaru talii).

3. Ogólne uwagi dotyczące rejestracji i analizy danych svFCS

  1. Rejestrację i analizę danych fluorescencji należy przeprowadzić według następującego ogólnego schematu (patrz sekcje 7, 8 i 9): (1) rejestracja fluorescencji i generowanie ACF (oprogramowanie korelatora), (2) odrzucenie nieoczekiwanych danych, obliczenie średniej z zachowanych danych, dopasowanie do odpowiedniego modelu (przy użyciu autorskiego oprogramowania Igor Pro), (3) wykres prawa dyfuzji (autorskie oprogramowanie MATLAB 1) oraz (4) opcjonalne porównanie praw dyfuzji (autorskie oprogramowanie MATLAB 2). Różne programy komputerowe są dostępne na żądanie.
    UWAGA: Korelator sprzętowy posiada minimalny czas próbkowania wynoszący 12.5 ns (tj. częstotliwość próbkowania 80 MHz). Zapewnia on rozdzielczość czasową, która jest co najmniej 1 000 razy niższa niż typowy czas przebywania swobodnie dyfundującej małej cząsteczki w roztworze i 106 razy mniejsza niż czas dyfuzji białek błonowych w objętości obserwacji konfokalnej.

4. Hodowla komórek i transfekcja

  1. Wysiać komórki Cos7 w 8-dołkowych komorach z pokrywek szklanych z dnem z borokrzemianu o grubości #1.0 z gęstością 10 000 komórek/dołek, używając pełnej pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę (100 U/mL), streptomycynę (100 U/mL) oraz L-glutaminę (1 mM).
  2. Kulturować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 przez 24 h.
  3. Usunąć pożywkę, dodać 300 µL świeżej pełnej pożywki hodowlanej do każdego dołka i preinkubować komórki przez 30 min w temperaturze 37 °C.
  4. Rozpuścić 0,5 µg plazmidowego DNA kodującego białko Thy-1 połączone z eGFP25 w 50 µL DMEM bez surowicy. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex.
  5. Rozcieńczyć 1,5 µL odczynnika do transfekcji DNA w 50 µL DMEM bez surowicy i dokładnie wymieszać roztwór.
  6. Dodać rozcieńczony odczynnik do transfekcji bezpośrednio do przygotowanego roztworu DNA i natychmiast wymieszać składniki.
  7. Inkubować przygotowaną mieszaninę przez 10 do 15 min w temperaturze pokojowej.
  8. Dodać po kropli 10 µL kompleksów DNA/odczynnika do transfekcji do pożywki w każdym dołku, a następnie ujednolicić, delikatnie kołysząc płytką.
  9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 h.
  10. Po inkubacji zastąpić pożywkę zawierającą kompleksy DNA/odczynnika do transfekcji 400 µL świeżej pełnej pożywki DMEM i kulturować komórki przez 16 h przed eksperymentem svFCS.

5. Przygotowanie komórek do pomiarów svFCS

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną.
  2. Delikatnie przemyć komórki dwa do trzech razy bezserowym buforem soli zrównoważonego roztworu Hanksa (HBSS) zawierającym Ca2+ i Mg2+, uzupełnionym o 10 mM (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES).
  3. Przez cały czas trwania pomiarów svFCS utrzymywać komórki w buforze HBSS/HEPES.

6. Leczenie farmakologiczne

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć komórki dwa do trzech razy bezserowym HBSS uzupełnionym o 10 mM HEPES, pH 7.4 (HBSS/HEPES).
  2. Inkubować komórki z roztworem cholesterol oksydazy (COase) o stężeniu 1 U/mL w buforze HBSS/HEPES przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  3. Usunąć roztwór i utrzymywać komórki w obecności 0.1 U/mL COase w buforze HBSS/HEPES podczas wykonywania pomiarów svFCS.

7. Kalibracja rozmiaru plamki

  1. Podgrzej komorę mikroskopową do 37 °C.
  2. Przygotuj standardowy roztwór Rh6G o stężeniu 2 nM poprzez rozcieńczanie szeregowe.
  3. Nanieś 200 µL roztworu Rh6G 2 nM na szkiełko nakrywkowe umieszczone na obiektywie imersyjnym.
  4. Uruchom cały sprzęt oraz oprogramowanie.
  5. Zmierz i dostosuj moc wiązki lasera 488 nm do 300 µW. W zależności od jasności i fotostabilności zastosowanej sondy fluorescencyjnej, dostosuj tę moc zgodnie z: (1) intensywnością fluorescencji (w oprogramowaniu LabVIEW), która powinna być stabilna, (2) kształtem ACF (w oprogramowaniu korelatora), który powinien być stały w czasie, oraz (3) parametrami dopasowania dającymi niewielki rozmiar pasma (waist size) i wysoką szybkość zliczeń na cząsteczkę (fotony na cząsteczkę na sekundę, zazwyczaj od kilkudziesięciu do kilkuset fotonów na cząsteczkę na sekundę).
    UWAGA: Amplituda ACF (oznaczana jako G(0)) jest odwrotnie proporcjonalna do liczby cząsteczek (tj. stężenia sondy fluorescencyjnej). W przypadku kalibracji rozmiaru pasma jest to odpowiedni parametr do kontroli jakości. Zatem G(0) powinno być zbliżone dla tego samego stężenia z dnia na dzień, ponieważ wiąże ono rozmiar pasma ze stężeniem. W pomiarach komórkowych, ponieważ FCS jest dokładniejszy przy niskich stężeniach, G(0) powinno być wysokie, aby umożliwić prawidłowe wyznaczenie parametrów dopasowania.
  6. Ustaw port mikroskopu do oświetlenia/detekcji svFCS za pomocą oprogramowania LabVIEW.
  7. Włącz detektor APD.
  8. Przymknij przysłonę, aż sygnał spadnie, aby uzyskać minimalny rozmiar pasma, lub zamknij ją bardziej dla większego rozmiaru pasma.
  9. Zarejestruj kilka funkcji ACF o wybranym czasie trwania (tj. jeden przebieg), aby poprawić powtarzalność statystyczną, zazwyczaj 10 przebiegów trwających po 20 s każdy, korzystając z oprogramowania korelatora.
  10. Wyłącz detektor APD.
  11. Użyj oprogramowania Igor Pro, aby sprawdzić i odrzucić przebiegi z silnymi fluktuacjami spowodowanymi agregatami molekularnymi. Wykonaj ten krok ręcznie — po przeszkoleniu użytkowników proces ten powinien być niezależny od osoby wykonującej.
  12. Dopasuj średnią z zachowanych funkcji ACF do modelu dyfuzji 3D.
  13. Wyznacz z parametrów dopasowania średni czas dyfuzji schemat spektroskopii korelacyjnej fluorescencji, pomiar τ_D do analizy dyfuzji i zapisz go w pliku „.txt” (format pliku jest narzucony przez oprogramowanie Igor Pro).
  14. Sprawdź szybkość zliczeń na cząsteczkę na sekundę (dobry wskaźnik wydajności), dzieląc średnią intensywność (wyznaczoną z przebiegu fluorescencji) przez liczbę cząsteczek (wyznaczoną z ACF).
    UWAGA: Upewnij się, że wartość ta jest wysoka i stabilna z dnia na dzień dla tych samych parametrów akwizycji.
  15. Znając współczynnik dyfuzji Rh6G w roztworze wodnym w 37 °C (D) oraz schemat spektroskopii korelacyjnej fluorescencji, pomiar τ_D do analizy dyfuzji (patrz 7.13), oblicz eksperymentalny rozmiar pasma ω zgodnie z: Równowaga statyczna, równanie ω=√(4×τD×D), wzór do analizy naukowej..
  16. Stosuj tę procedurę przy każdej modyfikacji rozmiaru pasma wymaganej do wykreślenia prawa dyfuzji FCS oraz przed każdą nową serią akwizycji danych svFCS.

8. Akwizycja danych svFCS na komórkach

  1. Zmierz i dostosuj moc wiązki 488 nm do zakresu od 2 do 4 µW. W zależności od jasności i fotostabilności zastosowanej sondy fluorescencyjnej, dostosuj tę moc tak, aby uzyskać wysoką liczbę zliczeń na cząsteczkę (zazwyczaj kilka tysięcy fotonów na cząsteczkę na sekundę), utrzymując jednocześnie niski poziom fotobleachingu (tzn. stabilny ślad intensywności w oprogramowaniu LabVIEW).
  2. Równoważ próbki przez 10 min w temperaturze 37 °C przed rozpoczęciem pomiarów.
  3. Ustaw mikroskop z oświetleniem epi-fluorescencyjnym za pomocą oprogramowania LabVIEW.
  4. Wybierz komórkę z odpowiednią lokalizacją sondy fluorescencyjnej i (niską) intensywnością sygnału fluorescencji.
    UWAGA: Im niższa fluorescencja, tym lepsze pomiary FCS (patrz krok 8.1).
  5. Ustaw port mikroskopu do oświetlenia/detekcji svFCS za pomocą oprogramowania LabVIEW.
  6. Włącz detektor APD.
  7. Wykonaj skan xy wybranej komórki za pomocą oprogramowania LabVIEW.
  8. Wykonaj skan z i zlokalizuj punkt konfokalny przy maksymalnej intensywności fluorescencji, wybierając błonę plazmatyczną u góry, a następnie rozpocznij akwizycję danych. Aby zmaksymalizować separację między dwiema błonami, skan należy najlepiej przeprowadzić w obszarze jądra komórkowego.
  9. Zarejestruj jedną serię 20 pomiarów trwających 5 s każdy, korzystając z oprogramowania korelatora.
    UWAGA: Upewnij się, że czas trwania każdego pomiaru jest wystarczająco długi, aby uzyskać ACF z zredukowanym szumem. Długie akwizycje są podatne na fotobleaching lub nieoczekiwane znaczne wahania (np. agregaty). Dostosuj liczbę pomiarów, ich czas trwania oraz liczbę serii do próbek, ale upewnij się, że pozostają one stałe w obrębie tej samej serii eksperymentów w celu zapewnienia powtarzalności.
  10. Wyłącz detektor APD.
  11. Odrzuć nieoczekiwane pomiary za pomocą oprogramowania Igor Pro.
  12. Dopasuj średnią ACF do modelu dyfuzji 2D dla dwóch gatunków cząsteczek. Dostosuj ten model do typu zachowania dyfuzyjnego cząsteczki docelowej.
  13. Zapisz parametry dopasowania w poprzednim pliku (patrz krok 7.13).
  14. Wykonaj od 10 do 15 serii pomiarów na co najmniej 10 różnych komórkach i powtórz kroki od 8.3 do 8.13. Sprawdź, czy uzyskany pojedynczy plik zawiera informacje o rozmiarze waist oraz parametry dopasowania dla 10–15 pomiarów.
  15. Aby ustanowić pojedyncze prawo dyfuzji, przeanalizuj co najmniej cztery rozmiary waist w zakresie od 200 do 400 nm. Zakres ten jest określony przez dyfrakcyjny limit optyczny, ale zależy od obiektywu (apertura numeryczna) i lasera (długość fali).
    UWAGA: Ponieważ kalibracja rozmiaru waist nie jest absolutna i obarczona jest pewnym stopniem niepewności, stworzono dedykowane oprogramowanie MATLAB28 uwzględniające błąd x i y (a mianowicie ω2 i td) w celu dopasowania prawa dyfuzji.
  16. Uruchom oprogramowanie MATLAB 1 i wybierz folder zawierający wszystkie pliki „.txt” odpowiadające co najmniej czterem eksperymentom z różnymi rozmiarami waist.
  17. Wykreśl <td> w funkcji <ω2>, czyli prawo dyfuzji. Można wyodrębnić dwa główne parametry: punkt przecięcia z osią y (t0) oraz efektywny współczynnik dyfuzji (Deff, odwrotnie proporcjonalny do nachylenia).

9. Porównanie praw dyfuzji w różnych warunkach doświadczalnych

UWAGA: W razie potrzeby należy powtórzyć sekcje 7 i 8 dla różnych warunków doświadczalnych. Opracowano specjalistyczne oprogramowanie (oprogramowanie MATLAB 2) w celu ustalenia, czy prawa dyfuzji są podobne, czy nie, na podstawie wartości t0 oraz Deff28. Program testuje dwie hipotezy: że dwie wartości są różne lub że dwie wartości nie są różne, przy progu ustalonym powyżej prawdopodobieństwa fałszywego alarmu (PFA). Przyjęto, że dowolna wartość PFA wynosząca 5% (T = 3.8) stanowi górną granicę istotności między dwoma parametrami (t0 lub Deff), co wskazuje, że istnieje tylko 5% szansy, iż dwie wartości są identyczne.

  1. Utwórz plik „.xls” zawierający charakterystyczne wartości prawa dyfuzji dla każdego porównywanego stanu (tzn. plik zawierający wartości t0, błąd t0, Deff oraz błąd Deff dla grup niepoddanych działaniu czynnika (NT) i poddanych działaniu czynnika (COase) w formie tabeli).
    1. Uruchom oprogramowanie MATLAB 2.
    2. Wybierz plik „.xls”.
    3. Przeanalizuj wygenerowany kolorowy wykres 2D, w którym testy statystyczne t0 i Deff są naniesione odpowiednio na osie x i y (Rysunek 4). Im wyższa wartość T, tym większa jest różnica między porównywanymi wartościami.

10. Pomiary stężenia cholesterolu

  1. Obróbka i lizą komórek
    1. Wysiać komórki Cos7 w trzech powtórzeniach w płytkach 6-dołkowych w zagęszczeniu 4 × 105 komórek/dołek i inkubować w 2 mL kompletnej pożywki DMEM w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez noc, aby umożliwić przyleganie komórek do płytki.
    2. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć komórki trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    3. Dodać 1 mL buforu HBSS/HEPES zawierającego (lub nie, w przypadku kontroli) 1 U/mL Coase i inkubować przez 1 h w 37 °C przy 5% CO2.
    4. Wymienić pożywkę na 1 mL HBSS/HEPES zawierającego 0,1 U/mL Coase i inkubować przez 1 h w 37 °C przy 5% CO2.
    5. Usunąć roztwór i zebrać komórki.
    6. Przemyć komórki trzykrotnie PBS i odwirować przy 400 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    7. Zlizować komórki w buforze do radioimmunoprecypitacji (25 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM MgCl2, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, 2% glicerolu, koktajl inhibitorów proteaz i fosfataz) przez 30 min na lodzie.
    8. Odwirować lizaty przy 10000 × g przez 10 min w 4 °C i zebrać nadsącz.
  2. Oznaczyć całkowite stężenie białka w każdej próbce za pomocą zmodyfikowanej metody Bradforda, stosując roztwór roboczy zgodnie z zaleceniami producenta.
  3. Pomiar stężenia cholesterolu
    1. W celu enzymatycznego oznaczenia całkowitego poziomu cholesterolu w komórkach należy użyć odpowiedniego zestawu (np. Amplex Red Cholesterol Assay Kit) zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. W każdej reakcji zmieszać próbkę zawierającą 5 µg białka z roztworem roboczym odczynnika Amplex Red/peroksydazy chrzanowej/oksydazy cholesterolu/esterazy cholesterolu i inkubować przez 30 min w 37 °C w ciemności.
    3. Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu 520 nm i detekcji emisji w zakresie 560–590 nm przy użyciu czytnika mikropłytek.
    4. Odjąć wartość tła od wyniku końcowego i wyznaczyć stężenie cholesterolu za pomocą krzywej wzorcowej.
    5. Obliczyć końcową zawartość cholesterolu w ng cholesterolu na µg białka.

Wyniki

Wyznaczono prawo dyfuzji (DL) dla Thy1-GFP wyrażanego w komórkach Cos-7 (Rysunek 4, czarne kwadraty). Prawo dyfuzji wykazuje dodatnią wartość t0 (19,47 ms ± 2 ms), co wskazuje, że Thy1-GFP jest ograniczony w strukturach nanodomen błony plazmatycznej. Potraktowanie komórek wyrażających Thy1-GFP oksydazą cholesterolu spowodowało przesunięcie wartości t0 dla DL do 7,36 ± 1,34 ms (Rysunek 4, szare kwadraty). Obserwacja ta potwierdza, że charakter ograniczenia Thy1-GFP zależy od zawartości cholesterolu i jest związany z nanodomenami tratw lipidowych. Zgodnie z opisanym powyżej testem statystycznym (patrz krok 9.1.3), oba prawa dyfuzji różnią się pod względem wartości t0 i Deff. Dodatkowo oceniono stężenie całkowitego cholesterolu komórkowego w niepotraktowanych komórkach Cos-7 w porównaniu z komórkami traktowanymi COase. Po zastosowaniu COase zaobserwowano niewielki, lecz istotny spadek całkowitej zawartości cholesterolu (Rysunek 5). Ponieważ enzym ten działa wyłącznie na pulę cholesterolu dostępną w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, przyjmujemy, że obserwowany spadek poziomu cholesterolu dotyczy tylko błony plazmatycznej i prowadzi do destabilizacji nanodomen tratw lipidowych.

Schematy analizy dyfuzji; równania z wykresami pokazujące czas przejścia w funkcji powierzchni plamki; metoda mikroskopowa.
Rycina 1: Symulowane prawa dyfuzji w spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) ustalone za pomocą FCS z wariacją wielkości plamki dla różnych form organizacji błony.(Panele górne) Schematyczne przedstawienie organizacji błony — (A) dyfuzja swobodna, (B) bariery sieciowe i (C) uwięzienia w pułapkach/domenach — z narysowaną trajektorią dla pojedynczej cząsteczki (czerwona). Niebieskie okręgi oznaczają przecięcie błony z wiązką lasera o promieniu w talii ω. (Panele dolne) Prawa dyfuzji FCS przedstawione poprzez wykreślenie czasu dyfuzji td jako funkcji kwadratu promienia ω2. Projekcja prawa dyfuzji (zielona przerywana linia) przecina oś czasu w (A) punkcie początkowym (t0 = 0) w przypadku dyfuzji swobodnej; (B) na osi ujemnej (t0 < 0) w obecności barier sieciowych lub (C) na osi dodatniej (t0 > 0) w przypadku występowania pułapek i domen (tratw lipidowych). D to lateralny współczynnik dyfuzji dla ruchu Browna; Deff to efektywny współczynnik dyfuzji; Dmicro to mikroskopowy współczynnik dyfuzji wewnątrz pułapek sieciowych; Din to współczynnik dyfuzji wewnątrz domen; Dout to współczynnik dyfuzji na zewnątrz domen; L to długość boku kwadratowej domeny; a rD to promień domeny kolistej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy He i Marguet6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat układu mikroskopowego z komputerem, systemem DAQ, APD/SPCM, korelatorami; analiza fluorescencji.
Rysunek 2: Schematyczna budowa sterowania sprzętowego svFCS. Komputer steruje wszystkimi urządzeniami za pomocą różnych protokołów komunikacyjnych: szeregowego (mikroskop, zewnętrzna migawka), USB (piezoelektryczny stolik XYZ, korelator) oraz PCI (płyta akwizycyjna). DAQ: płyta akwizycji danych, APD: fotodioda lawinowa, SPCM: moduł zliczania pojedynczych fotonów, DO: wyjście cyfrowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat układu optycznego z laserem 488nm, drogą wiązki, korelatorami, detektorem APD i systemem obrazowania.
Rycina 3: Schematyczne przedstawienie optycznych ścieżek wzbudzenia i emisji w układzie svFCS. Układ svFCS składa się z czterech modułów: (1) kolimacja wyjścia światłowodowego lasera 488 nm, (2) kombinacja płytki półfalowej i polaryzacyjnego dzielnika wiązki służąca do regulacji mocy optycznej, (3) ogniszkowanie wiązki lasera na próbce po przejściu przez zmotoryzowany mikroskop bez soczewki tubusowej oraz (4) detekcja fluorescencji za pomocą ścieżki detekcyjnej typu konfokalnego na fotodiodę lawinową sprzężoną z modułem zliczania pojedynczych fotonów, który przekazuje sygnał do sprzętowego korelatora. Prostota konstrukcji zapewnia systemowi czułość, stabilność i łatwość obsługi (szeroko omówione w Materiałach uzupełniających). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres procesu dyfuzji, równanie: T w zależności od D_eff, schemat porównujący czasy dyfuzji NT i COase.
Rycina 4: Prawa dyfuzji svFCS wygenerowane z analizy dyfuzji Thy1-GFP eksprymowanego w komórkach Cos-7. Prawa dyfuzji svFCS dla komórek Cos-7 niepoddanych działaniu czynnika (NT, czarne kwadraty) oraz po traktowaniu oksydazą cholesterolu (COase, szare koła). Wstawka na wykresie przedstawia test statystyczny istotności różnicy między dwoma zaprezentowanymi prawami dyfuzji svFCS (zgodnie z Mailfert et al.28). Wartość testowa (T) powinna być powyżej progu ustalonego na 3,8, gdy oba prawa dyfuzji są różne. Im jest ona wyższa, tym większa jest różnica między prawami dyfuzji. Wartość T jest oznaczona kolorystycznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy redukcji cholesterolu; NT vs traktowanie COase; istotność statystyczna; analiza biochemiczna.
Rysunek 5: Porównanie całkowitej zawartości cholesterolu w komórkach Cos-7. Komórki Cos-7 nie były traktowane (NT) lub zostały poddane działaniu 1 U/mL oksydazy cholesterolu (COase) przez 1 h. Dane przedstawiają przykład jednego eksperymentu wykonanego w trzech powtórzeniach. Do oceny różnic statystycznych wykorzystano obustronny, niezależny test t (α=0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela materiałów: Lista elementów optycznych wymaganych do konfiguracji svFCS.

Materiały uzupełniające: Niniejszy dokument opisuje budowę układu svFCS od podstaw. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy implementację modułu svFCS na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym, potężne eksperymentalne podejście do rozszyfrowania dynamiki organizacji błony plazmatycznej w żywych komórkach dzięki analizie prawa dyfuzji FCS. Koncepcyjnie svFCS opiera się na prostej zasadzie: pomiarach korelacji fluorescencji w dziedzinie czasu przy jednoczesnej zmianie wielkości obszaru oświetlenia23. Strategia ta odegrała zasadniczą rolę w dedukowaniu informacji nanoskopowych z pomiarów mikroskopowych, co pomaga rozszyfrować główne elementy fizykochemiczne przyczyniające się do organizacji błony plazmatycznej w stanie ustalonym25 i procesach fizjologicznych 30,31,32,33. Podsumowując, te analizy svFCS jednoznacznie wskazują na istnienie zależnych od lipidów nanodomen w różnych typach komórek i ich bezpośredni wpływ na dostrajanie różnych zdarzeń sygnalizacyjnych.

W tym kontekście istnieją pewne aspekty optyczne, które należy wziąć pod uwagę podczas budowania konfiguracji svFCS, aby zoptymalizować budżet fotonów i zminimalizować aberracje optyczne. Dlatego zalecamy użycie mikroskopu, z którego można wyjąć soczewkę tubusu podczas wykonywania pomiaru svFCS. Co więcej, pojedyncza przysłona odgrywa kluczową rolę w konfiguracji svFCS: zmienia rozmiar wiązki na tylnym otworze obiektywu, bezpośrednio zmieniając w ten sposób efektywny rozmiar talii (tj. efektywną objętość wzbudzenia). Średnica wiązki powinna pasować do tylnej źrenicy obiektywu, aby uzyskać najmniejszy rozmiar w pasie34. Ta opcja, która pomaga dostosować obwód talii, zapewnia optymalizację budżetu fotonowego i jest łatwa do wdrożenia. Wreszcie, wzdłuż ścieżki światła stosuje się minimalną liczbę części optycznych; Im mniej złożony system, tym mniej utraconych fotonów. Wszystkie te opcje znacznie zwiększają niezawodność eksperymentów svFCS.

Jeśli chodzi o sam protokół, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Najważniejsze jest odpowiednie ustawienie ścieżek optycznych, które ma kluczowe znaczenie dla udanych pomiarów svFCS (protokół, sekcja 2). Można to łatwo sprawdzić, analizując sygnał fluorescencyjny z roztworu Rh6G 2 nM, który powinien wynosić ~200 kHz przy oświetleniu laserowym 300 μW. Wszystkie tęczówki powinny być otwarte, a ACF powinny mieć ważną amplitudę (zwykle G0 ~ 1,5–2,0). Kolejny krytyczny punkt dotyczy komórek i ich przygotowania do analizy svFCS (protokół, sekcje 4-8). Ich gęstość musi być dostosowana tak, aby izolowane komórki, które mają być obserwowane, były dostępne do analizy. Nieprzylegające komórki muszą zostać unieruchomione na komorze nakrywkowej za pomocą roztworu poli-L-lizyny. Sygnał fluorescencyjny z znakowania komórek nie powinien być zbyt silny, w przeciwnym razie będzie to skutkowało bardzo płaskimi ACF-ami, które są trudne do dopasowania, a parametry dopasowania obarczone są istotnym błędem. Dodatkowo, niejednorodne znakowanie i agregaty fluorescencyjne w komórkach sprawiają, że pomiary svFCS są niezwykle trudne do interpretacji. Wreszcie, leczenie oksydazą cholesterolową wpływa na żywotność komórek, a analiza svFCS nie powinna przekraczać jednej godziny po zabiegu. Lepiej jest również rejestrować fluktuacje fluorescencji z górnej błony plazmatycznej, ponieważ nie jest ona przymocowana do podpory i nie ma ryzyka utrudnionej dyfuzji cząsteczek z powodu fizycznych interakcji z podporą.

Technika svFCS poczyniła wystarczające postępy, aby można ją było stosować w różnych podejściach, ze względu na różnorodność modalności regulacji objętości detekcji, co umożliwia badanie różnych procesów biologicznych w żywych komórkach. Alternatywą dla regulacji wielkości objętości wzbudzenia jest zastosowanie zmiennego ekspandera wiązki35. Możliwe jest również proste modulowanie wielkości obszaru oświetlenia poprzez rejestrację sygnału fluorescencyjnego z punktu przecięcia błony plazmatycznej wzdłuż kierunku z36. Można to zrobić na standardowym mikroskopie konfokalnym, dla którego opracowano ramy teoretyczne w celu wyprowadzenia prawa dyfuzji37,38.

Chociaż metoda svFCS oferuje rozdzielczość czasoprzestrzenną, która jest niezbędna do scharakteryzowania niejednorodnej organizacji bocznej błony plazmatycznej, geometryczne tryby uwięzienia nie wykluczają się wzajemnie. Odchylenie t0 w jednym lub drugim kierunku ujawnia wyłącznie dominujący sposób uwięzienia25. Co więcej, kolejnym istotnym ograniczeniem obecnej metody svFCS jest klasyczna granica dyfrakcji optycznej (~200 nm). Jest to bezsprzecznie większe niż domeny ograniczające cząsteczki w błonie komórkowej plazmatycznej. W związku z tym analizę uwięzienia wyprowadza się z wartości t0 , ekstrapolowanej z prawa dyfuzji.

Ta wada została przezwyciężona poprzez wdrożenie alternatywnych metod. Początkowo stosowanie folii metalicznych wierconych za pomocą nanoapertur dawało możliwość oświetlenia bardzo małego obszaru membrany (tj. poniżej granicy dyfrakcji optycznej pojedynczych apertur nanometrycznych o promieniach wahających się od 75 do 250 nm)39. W ten sposób przedstawiono reżim przejściowy przewidziany na podstawie teoretycznego prawa dyfuzji dla organizacji izolowanej domeny, który pozwolił na udoskonalenie charakterystycznego rozmiaru nanometrycznych niejednorodności błon i ilościowe oszacowanie powierzchni zajmowanej przez nanodomeny zależne od lipidów39. Alternatywnie, oświetlenie nanometryczne zostało również opracowane przy użyciu skaningowej mikroskopii optycznejbliskiego pola 40 lub planarnych nanoanten optycznych41. Niedawno, połączenie wymuszonego zubożenia emisji (STED) i FCS dostarczyło potężnego i czułego narzędzia do dokumentowania prawa dyfuzji z bardzo wysoką rozdzielczością przestrzenną. Ten STED-FCS daje dostęp do charakterystyki dyfuzji molekularnej w nanoskali zachodzącej w krótkim czasie, umożliwiając badanie dynamicznej organizacji sond lipidowych w błonie plazmatycznej 42,43. Jednak niepełne tłumienie fluorescencji w procesie STED stanowi wyzwanie dla analizy krzywych autokorelacji w FCS.

Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowano nowy model dopasowania, poprawiając dokładność pomiarów czasów dyfuzji i średniej liczby cząsteczek44. Wreszcie, w celu powolnej dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej, zasadę svFCS można zastosować do danych zarejestrowanych za pomocą spektroskopii korelacji obrazu45. Ostatnio wykazano, że połączenie mikroskopii sił atomowych (AFM) z obrazowaniem całkowitego wewnętrznego odbicia-FCS (ITIR-FCS) przyczynia się do udoskonalenia natury mechanizmu utrudniającego dyfuzję molekularną w błonie plazmatycznej, zwłaszcza w pobliżu konfiguracji membrany progowej perkolacji ze względu na dużą gęstość nanodomen46.

Podsumowując, ustalenie prawa dyfuzji przez svFCS dostarczyło dowodów eksperymentalnych pozwalających wywnioskować lokalną heterogeniczność utworzoną przez dynamiczne zbiorowe asocjacje lipidów i białek błonowych. Jak stwierdzili Wohland iwspółpracownicy46, "analiza prawa dyfuzji FCS pozostaje cennym narzędziem do wnioskowania o cechach strukturalnych i organizacyjnych poniżej limitu rozdzielczości na podstawie informacji dynamicznych". Mimo to musimy opracować nowe modele, aby doprecyzować interpretację prawa dyfuzji, co powinno pozwolić na lepsze zrozumienie dynamiki zdarzeń molekularnych zachodzących w błonie plazmatycznej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

SB, SM i DM były wspierane przez fundusze instytucjonalne z CNRS, Inserm i Uniwersytetu Aix-Marseille oraz granty programowe z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR-17-CE15-0032-01 i ANR-18-CE15-0021-02) oraz francuskiego "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW uznaje "BioTechNan", program interdyscyplinarnych środowiskowych studiów doktoranckich KNOW w dziedzinie biotechnologii i nanotechnologii. EB dziękuje za wsparcie finansowe Narodowego Centrum Nauki (NCN) w ramach projektu nr 2016/21/D/NZ1/00285, a także Rządu Francji i Ambasady Francji w Polsce. MŁ dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Ministerstwa Rozwoju (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) oraz Narodowego Centrum Badań i Rozwoju (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT porozumiało się ze wsparciem finansowym Narodowego Centrum Nauki (NCN) w ramach projektu nr 2016/21/B/NZ3/00343 oraz Wrocławskiego Centrum Biotechnologii (KNOW).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzie do zliczaniaKlucz płaski do pierścieni ustalających z gwintem SM1ThorlabsSPW602
Fotodioda lawinowa i moduł zliczający pojedyncze fotony (SPCM)Moduł zliczający pojedyncze fotony, fotodioda lawinowaExcelitasSPCM-AQRH-15
BNC 50 & Omega; wtyczka do 50 & Omega; przewód wtykowy 2 mRS Components742-4315
koncentryczny 415 Złącza cinch, RG-316, 50 i Omega; Ze złączem, 1,22 m, RoHS2RS Components885-8172
Tee 50Ω Adapter RF Wtyk BNC do gniazda BNC 0 i rzadko; 1GHzRS Components546-4948
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Gniazdo Typ E – Francuski przedłużacz, 230 VRS Components768-5500
Mascot, zasilacz wtykowy 6 W 5 V DC, 1,2 A, 1 wyjście Zasilacz impulsowy, typ CRS Components452-8394
Crystek CCSMACL-MC-24 Oscylator referencyjny zasilający Adapter RFRS Components792-4079
Filtrowanie fluorescencyjne535/70 ET Pasmo przepustowe, AOI 0° Średnica chrominancji 25 mmFiltr AHFF47-539
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Filtr AHF Chroma 25,5 x 36 x 1 mmF43-088
496/LP BrightLine HC Filtr długoprzepustowy, AOI 0° Filtr AHF o średnicy chrominancji 25F37-496
Korelator sprzętowy80 MHz Korelator cyfrowyCorrelator.comFlex02-12D
LaserLASER LASOS LDM-XT sprzężony światłowód, 488 nm, 65 mWLasosBLD-XT 488100
Bezpieczeństwo laseroweWysokowydajna taśma maskująca, 1" x 180' (25 mm x 55 m) rolkaThorlabsT743-2.0
Chusteczki do soczewek, 25 arkuszy w broszurze, 5 broszurokulary ochronne ThorlabsMC-5
, jasnopomarańczowe soczewki, 48% przepuszczalności światła widzialnegoMikroskop ThorlabsLG3B
Zmotoryzowany mikroskop odwróconej fluorescencji Zeiss Axiovert 200M
Precyzyjne i zgrubne ustawianie ostrości, obrót wieżyczki reflektora, obrót głowicy obiektywu, przełączanie portów kamery i wewnętrznych przesłon świetlnych		Carl Zeiss
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.wybrane dla FCS
(D=0,14-0,19 mm) (WD=0,28 mm przy D=0,17 mm), UV-VIS-IR		Carl Zeiss421767-9971-711
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5"Carl Zeiss000000-1698-345
Pierścień środkowy W0.8 - W0.8 H "5"Carl Zeiss000000-1698-347
Ścieżka optycznaD25.4mm Lustro, chronione srebrnetholabsPF10-03-P01
D25.4mm, F=60.0.mm, Widoczneachromatyczne HorlabsAC254-060-A
D25.4mm, F=35.0.mm, WidoczneachromatyczneAC254-035-A
25 µ m Otwór otworkowyThorlabsP25S I
25,4 mm Zamontowany zero, zamówienie 1/2 Waveplate 488 nmThorlabsWPH10M-488 (HWP)
20mm Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki Cube 420-680 nmThorlabsPBS201
Stopień obrotu 56 mm x 26 mm Gwintowany identyfikatorThorlabsRSP1/M
52 mm x 52 mm Kinematyczny uchwyt platformowyThorlabsKM100B/M
Regulowany zacisk pryzmatycznyThorlabsPM3/M
Blok belki - obszar aktywny 19 mm x 38 mmThorlabsLB1/M Przysłona
irysowa 1 mm do 25 mm PrzysłonaThorlabsID25/M
Leworęczny kinematyczny cylindryczny uchwytobiektywu ThorlabsKM100CL
" Uchwyt optyczny, kran M4ThorlabsMFF101/M
1" Stackable Lens TubeThorlabsSM1L03
Stackable Lens Mount do 1" optycznej głębokości użytkowej i frac12;ThorlabsSM1L05
Uchwyt do układania w stos do 1 "Optyczna głębokość użytkowa 2"ThorlabsSM1L20
Małe szyny optyczne 600 mm, metryczneThorlabsRLA600 / M
Małe szyny optyczne 75 mm, metryczneThorlabsRLA075 / M
Małe szyny optyczne 150 mm, metryczneThorlabsRLA150 / M
Rail Carrier, Otwór z pogłębieniem 1 "x 1"ThorlabsRC1
Nośnik szynowy, prostopadły jaskółczy ogonThorlabsRC3
Precyzyjne mocowanie soczewki translacyjnej do 1-calowychThorlabsLM1XY/M
½ " (12mm) Stopień translacji jaskółczego ogonaThorlabsDT12/M
Zaciski szynoweThorlabsCL6
Metryczny stolik translacyjny XYZ (zawiera PT102)ThorlabsPT3/M
gumowana tkanina ZestawThorlabsBK5
/ 6 narzędziAdapter ThorlabsBD-KIT/M
z zewnętrznymi gwintami M6 x 1,0 i zewnętrznymi gwintami M4 x 0,7Podstawa montażowa ThorlabsAP6M4M
, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 sztukThorlabsBA1S/M-P5
Mocowanie obiektywu do adaptera optycznego 25,4 mmThorlabsLMR1/M
SM1 FC/APCThorlabsSM1FCA
Kinematyczne mocowanie lustra do optyki 1 cal Silikonowa głowica zasilającaThorlabsKM100
, 400-1100nm, 50mWThorlabsS120C
12,7 mm, śruba skrzydełkowa z blokadą sześciokątną,
L=50 mm, 5 sztuk		PH50/M-P5
Uchwyt słupka ze sprężynową śrubą skrzydełkową z blokadą sześciokątną, L=20 mmThorlabsPH20/M
12,7 mm x 50 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4,
otwór gwintowany M6, 5 sztuk		ThorlabsTR50/M-P5
12,7 mm x 75 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4,
Otwór gwintowany M6, 5 sztuk		ThorlabsTR75/M-P5
Interfejs USB Power and Energy MeterThorlabsPM100USB
12,7 mm x 30 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4,
Otwór gwintowany M6 Rurki		TR30/M
12,7 mm x 20 mm Słupek optyczny ze stali nierdzewnej, kołek M4,
Otwór gwintowany M6		ThorlabsTR20/M
Szyna konstrukcyjna o długości 750 mm (skrzynka detekcyjna)ThorlabsXE25L750/M
Szyna konstrukcyjna o długości 350 mm (skrzynka detekcyjna)ThorlabsXE25L350/M
Quick Corner Cube do szyn 25 mmThorlabsXE25W3
do szyn 25 mmThorlabsXE25A90
tablica plakatowa 20" x 30" (508 mm x 762 mm), grubość 1/16" (1,6 mm), 5 arkuszyZawias ThorlabsTB5
do obudówszynowych 25 mmOgranicznik pokrywy ThorlabsXE25H
do obudów szynowych 25 mmThorlabsXE25LS
M4 Zestaw z walcowymThorlabsHW-KIT1/M
M6 i zestaw osprzętuThorlabsHW-KIT2/M
Zacisk stołowy, kształt litery L, 5 sztukThorlabsCL5-P5
Membrana przysłony irysowej uruchamiana pierścieniowo (Ø 0,8 - &Ø 12 mm)ThorlabsSM1D12D
Ø 1" Tarcza wyrównująca z matowego szkła SM1 z ukoszkiem; Otwór 1 mmDG10-1500-H1-MD
Blat optyczny o strukturze plastra miodu, StandaStanda1HB10-15-12
Wspornik stołu optycznego, StandaStanda1TS05-12-06-AR
Próbka nanopozycjonowaniaPrecyzja XYZ NanopozycjonowaniePhysik InstrumentePI P527-3.CD
Cyfrowy wielokanałowy Piezo Co, 3 kanały, -30 do 130 V
Złącze Sub-D, Czujniki pojemnościowe,Physik		InstrumentePI E727-3.CD
komora temperaturowaSystem inkubatora mikroskopu odwróconego Zeiss 200M MATT BLKDigital Pixel
Dwukanałowy mikroprocesorowy regulator temperaturyCyfrowy pikselDP_MTC_2000_DUO
Dwa modułygrzewcze bez wibracjiCyfrowyczujnik temperatury Pixel DP_150_VF
PT100 PikselcyfrowyDP_P100_TS
odczynniki i materiały biologiczne
Hodowla i transfekcjakomórkowa Komórki Cos7ATCC®CRL-1651 i handel;
8-dołkowe komory Lab-TekThermo Fisher Scientific155411PK
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher Scientific16000044
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030081
Bufor PBSThermo Fisher Scientific14190144
PenStrepThermo Fisher Scientific15140122
Odczynnik do transfekcji PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688
Pomiar zawartości cholesteroluZestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu AmplexThermo Fisher ScientificA12216
Inhibitor proteazyThermo Fisher Scientific87786
Inhibitor fosfatazy KoktajlThermo Fisher Scientific78420
ROTI Nanoquant Roztwór roboczyRothK880
GloMax Discover Czytnik mikropłytekPomiary svFCS PromegaGM3000
Bufor HBSSThermo Fisher Scientific14025092
Hepes BuforThermo Fisher Scientific15630080
Cholesterol oksydazaSigma-AldrichC8868
Rodamina 6GSigma-Aldrich83697-1G
Laserowe 1 sterowników kulkowych Uchwyty do słupków Wspornik kątowy SM1

Bibliografia

  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Newton, A. C. Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm. The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).
  3. Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).
  4. Edidin, M. The state of lipid rafts: From model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. , (2010).
  6. He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).
  7. Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids. Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).
  8. Nicolson, G. L. The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).
  9. Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).
  10. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).
  11. Destainville, N., Salomé, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).
  12. Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).
  13. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. , (1976).
  14. Petrášek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2008).
  15. Elson, E. L. 40 Years of FCS: How it all began. Methods in Enzymology. , (2013).
  16. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. , (1974).
  17. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. , (1974).
  18. Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical Journal. , (1999).
  19. Bouchaud, J. P., Georges, A. Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications. Physics Reports. , (1990).
  20. Yechiel, E., Edidin, M. Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes. Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).
  21. Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas. European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).
  22. Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells. The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).
  23. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  24. Saxton, M. J. Fluorescence corralation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2005).
  25. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  26. Ruprecht, V., et al. Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility. Cell. , (2015).
  27. Billaudeau, C., et al. Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).
  28. Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).
  29. Rege, T. A., Hagood, J. S. Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).
  30. Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. Blood. , (2006).
  31. Guia, S., et al. Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance. Science Signaling. 4 (167), 21(2011).
  32. Blouin, C. M., et al. Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation. Cell. 166 (4), 920-934 (2016).
  33. Chouaki-Benmansour, N., et al. Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation. Scientific Reports. , (2018).
  34. Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes. Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).
  35. Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices. Biophysical Journal. , (2005).
  36. Humpolíčková, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2006).
  37. Benda, A., et al. How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy. Langmuir. , (2003).
  38. Ganguly, S., Chattopadhyay, A. Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study. Biophysical Journal. , (2010).
  39. Wenger, J., et al. Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization. Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).
  40. Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes. Biophysical Journal. , (2011).
  41. Regmi, R., et al. Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells. Nano Letters. , (2017).
  42. Mueller, V., et al. FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics. Methods in Enzymology. , (2013).
  43. Sezgin, E., et al. Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS. Nature Protocols. , (2019).
  44. Wang, R., et al. A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses. Methods. , (2018).
  45. Veerapathiran, S., Wohland, T. The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes. Methods. , (2018).
  46. Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law. Biophysical Journal. , (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

FCS z wariacj plamkidyfuzja w b onie plazmatycznejanaliza dyfuzji molekularnejtraktowanie oksydaz cholesterolunanodomeny tratw lipidowychekspresja Thy1 GFPkom rki Cos7kalibracja mocy laserafunkcja autokorelacji
Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.