Artykuł metodologiczny

Tetrameryczne matryce antygenów fluorescencyjnych do jednoetapowej identyfikacji limfocytów B specyficznych dla antygenu

DOI:

10.3791/61827

⸱

20 października 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Kansas, 2Bioengineering Graduate Program, University of Kansas, 3Department of Chemical and Petroleum Engineering, University of Kansas

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną produkcję i użycie sond fluorescencyjnych do znakowania komórek B specyficznych dla antygenu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja antygenu fluorescencyjnego jest kluczowym krokiem w identyfikacji komórek B specyficznych dla antygenu. Tutaj szczegółowo opisaliśmy przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie czteroramiennych, fluorescencyjnych koniugatów PEG-antygen do selektywnej identyfikacji komórek B specyficznych dla antygenu poprzez intensywne zaangażowanie w pokrewne receptory komórek B. Korzystając z modułowej chemii kliknięć i dostępnych na rynku zestawów chemicznych do fluoroforów, wykazaliśmy wszechstronność przygotowania niestandardowych fluorescencyjnych koniugatów PEG, tworząc odrębne macierze dla białka proteolipidowego (PLP139-151) i insuliny, które są ważnymi autoantygenami w mysich modelach stwardnienia rozsianego i cukrzycy typu 1. Testy opracowano dla każdego koniugatu fluorescencyjnego w odpowiednim modelu choroby przy użyciu cytometrii przepływowej. Macierze antygenowe porównano z monowalentnym autoantygenem w celu ilościowego określenia korzyści płynących z multimeryzacji na szkieletach PEG. Na koniec zilustrowaliśmy użyteczność tej platformy, izolując i oceniając odpowiedzi komórek B antyinsuliny po stymulacji antygenowej ex vivo. Znakowanie limfocytów B specyficznych dla insuliny umożliwiło wzmocnione wykrywanie zmian w kostymulacji (CD86), które w przeciwnym razie zostałyby stłumione w analizie zagregowanych limfocytów B. Podsumowując, raport ten umożliwia produkcję i wykorzystanie fluorescencyjnych matryc antygenowych jako solidnego narzędzia do badania populacji komórek B.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptacyjny układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w postępie lub regresji wielu stanów chorobowych, w tym autoimmunizacji, raka i chorób zakaźnych1. W przypadku szerokich zastosowań, takich jak badanie immunopatologii lub opracowywanie nowych precyzyjnych metod leczenia, często krytyczna jest ocena odpowiedzi limfocytów B i T specyficznych dla antygenu leżących u podstaw progresji choroby2,3,4. Główne tetramery kompleksu zgodności tkankowej (MHC) są szeroko i komercyjnie dostępne do identyfikacji klonów limfocytów T specyficznych dla antygenu5. Te znakowane fluoroforem konstrukty prezentują czterowalentne kompleksy peptyd-MHC, które zachłannie angażują się w pokrewne receptory limfocytów T do zastosowań znakowania, takich jak mikroskopia i cytometria przepływowa.

Antygeny do badania limfocytów B mogą charakteryzować się bardzo zróżnicowanymi masami cząsteczkowymi, ładunkami i rozpuszczalnościami6,7. W przypadku stosowania antygenu monomerycznego jako rozpuszczalnych sond limfocytów B, właściwości fizykochemicznego antygenu mogą nie zostać ustabilizowane poprzez kompleksowanie ze znacznie większą, rozpuszczalną w wodzie cząsteczką streptawidyny lub mogą powodować problemy z rozpuszczalnością jako odczynniki monomeryczne przed koniugacją. Tak więc niektóre białka mają trudności z biokoniugacją i nieoczekiwane wyniki w praktyce7,8. Bezpośrednia koniugacja barwnika fluorescencyjnego może czasami sprawić, że konstrukty staną się nierozpuszczalne w wodzie i lipofilowe. Te bezpośrednie związki antygenu barwnika są podatne na niespecyficzne osadzanie w błonach komórkowych, co zakłóca analizy specyficzne dla antygenu7,8,9. Niektóre strategie przezwyciężyły wyzwania związane z rozpuszczalnością poprzez sprzężenie antygenu i fluoroforów z innymi grupami funkcyjnymi. Na przykład Cambier i wsp. zastosowali biotynylowaną insulinę w jej natywnej postaci, aby zaangażować się w receptory komórek B specyficznych dla insuliny (BCR) przed dodaniem streptawidyny znakowanej fluoroforem w sposób stopniowy10. Chociaż podejście to umożliwiło ocenę limfocytów B, które wiążą się z insuliną monomeryczną z wysoką rozdzielczością, wymagane były dwa etapy znakowania. Uogólniony protokół przygotowania gotowych do użycia sond limfocytów B na bazie polimerów, który można łatwo zintegrować z powszechnymi procedurami znakowania przeciwciał fluorescencyjnych, byłby korzystny dla dalszego rozwoju badań nad komórkami B w chorobie.

W tym protokole szczegółowo opisujemy produkcję i wykorzystanie fluorescencyjnych matryc antygenowych (FAA) do uogólnionego i jednoetapowego znakowania komórek B specyficznych dla antygenu do eksperymentów mikroskopowych i cytometrii przepływowej (Rysunek 1). Rozpuszczalne macierze antygenowe (SAgAs) zostały wykorzystane w ciągu ostatniej dekady jako immunoterapie specyficzne dla antygenu ukierunkowanego na limfocyty B przeciwko chorobom autoimmunologicznym11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. SAgA wykorzystują wyświetlanie antygenu wielowartościowego na elastycznych, polimerowych szkieletach, aby zachłannie angażować receptory komórek B i wywoływać efekty immunomodulacyjne, chociaż ich specyficzność antygenowa zapewnia kolejną okazję do sondowania interesujących komórek B po sprzężeniu z klasą fluoroforową23. Polimerowe szkielety tworzące SAgAs nadają rozpuszczalność w wodzie całej biomakrocząsteczce i mogą tłumić czasami ekstremalne cechy antygenu, które zakłócają generowanie sondy i specyficzność barwienia6,24. Na platformę SAgA przeszczepiliśmy liczne antygeny o różnej wielkości i złożoności za pomocą modułowej chemii kliknięć, co sprzyja stosowaniu małych epitopów peptydowych i pełnych białek14,18. W tym miejscu pokazujemy FAA jako solidne narzędzia do znakowania limfocytów B specyficznych dla antygenu, które mogą być stosowane równolegle z typowym znakowaniem przeciwciał fluorescencyjnych. Przygotowaliśmy i oceniliśmy FAA składające się z ludzkiej insuliny do znakowania komórek B w transgenicznym mysim modelu cukrzycy typu 1 (VH125), a także FAA, które zawierały białko proteolipidowe 139-151 (PLP), epitop peptydowy dla eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), mysiego modelu stwardnienia rozsianego. Naszym zamiarem przy stosowaniu tych modeli chorób było zademonstrowanie wszechstronności tej platformy, zarówno w zakresie modułowej substytucji stosowanych antygenów, jak i wykonalności stosowania zarówno z epitopami peptydowymi (PLP), jak i pełnymi białkami (insulina). Protokół ten został przedstawiony z myślą o dostępności, bez konieczności posiadania rozległej wiedzy specjalistycznej w zakresie biokoniugacji. Odczynniki, a także metody syntezy i oczyszczania, są zaprojektowane tak, aby były wszechstronne i łatwe do wdrożenia w większości laboratoriów badawczych zajmujących się chemią, biologią molekularną lub immunologią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach przedstawione w tej pracy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kansas.

1. Synteza macierzy antygenowej (4–6 dni)

  1. Funkcjonalizować niezmodyfikowany antygen za pomocą uchwytu alkinowego (1 h). Dodać 1 równoważnik insuliny (100 mg, 17,4 μmol) do szklanej fiolki o pojemności 20 ml z mieszadłem i rozpuścić w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) (2 ml) delikatnie podgrzewając do temperatury 40–50 °C za pomocą opalarki lub łaźni wodnej.
    1. Dodać 1,1,3,3-tetrametyloguanidynę (40,2 mg, 348,8 μmol) i 1,35 równoważnika świeżo przygotowanego roztworu podstawowego 78,5 mM estru N-hydroksysukcynimidu propargylu (ester NHS) w bezwodnym DMSO (0,3 ml, 5,3 mg, 23,6 μmol).
    2. Mieszać przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wygasić reakcję 0,05% HCl (12 ml).
  2. Oczyścić pojedynczo modyfikowaną insulinoalkinę za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (4 h). Użyć preparatywnej kolumny C18 (19 mm x 250 mm, wielkość porów 300 A, wielkość cząstek 5 μm) o 10-minutowym gradiencie 30–40% B (A, woda z 0,05% kwasem trifluorooctowym (TFA); B, acetonitryl z 0,05% TFA) i natężenie przepływu 14 ml/min. Pożądany produkt wymywa się natychmiast po niezmodyfikowanej insulinie.
    1. Odparować acetonitryl i TFA za pomocą strumienia azotu lub parowania rotacyjnego pod zmniejszonym ciśnieniem (650 paskalów) i obracającego się z prędkością 150 obr./min. Zamrozić roztwór wodny i liofilizować do sucha. Funkcjonalizowaną insulinę należy przechowywać w temperaturze -20 °C w suchej atmosferze.
      UWAGA: W tych warunkach przechowywania funkcjonalizowana insulina jest stabilna przez okres do roku.
  3. Zsyntetyzuj macierz antygenową przez katalizowaną miedzią, cykloaddycję azydkowo-alkinową (CuAAC) (2,5 h)22. Dodać 6 odpowiedników insulinoalkinu (38 mg, 6,3 μmol) do szklanej fiolki o pojemności 10 ml z mieszadłem i rozpuścić w DMSO (1,2 ml) delikatnie podgrzewając.
    1. Dodać 50 mM buforu fosforanu sodu (1,8 ml) o pH 7,4, 1 odpowiednik 20 kDa 4-ramienny azydek PEG (21 mg, 1,05 μmol), pięciowodny siarczan miedzi (II) (3,15 mg, 12,6 μmol), tris(3-hydroksypropylotriazolylometylometylo)aminę (27,37 mg, 63 μmol) i askorbinian sodu (50,34 mg, 254 μmol).
    2. Mieszaj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj DMSO (3 ml), aby rozpuścić wszelkie osady i zakwasz roztwór 0,05% HCl (4 ml).
  4. Oczyścić matrycę antygenową metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (3 h). Użyj kolumny preparatywnej C18 (19 mm x 250 mm, wielkość porów 300 A, wielkość cząstek 5 μm) z 10-minutowym gradientem 20–60% B (A, woda o 0,05% TFA; B, acetonitryl o zawartości TFA 0,05%) i natężeniu przepływu 14 ml/min. Pożądany produkt wymywa się natychmiast po insulinoalkinie.
    1. Odparować acetonitryl za pomocą strumienia azotu lub parowania obrotowego pod zmniejszonym ciśnieniem. Zamrozić roztwór wodny i liofilizować do sucha. Przechowywać w temperaturze -20 °C w suchej atmosferze.
      UWAGA: Matryca antygenu insuliny jest wysoce higroskopijna. Liofilizowane włókna mogą łączyć się w gęste granulki po wielokrotnym wystawieniu na działanie atmosfery. Właściwości FAA mogą się różnić w zależności od użytego antygenu specyficznego dla aplikacji. W tych warunkach przechowywania zestaw antygenu insuliny jest stabilny przez kilka miesięcy.

2. Koniugacja fluoroforu (1-2 dni)

  1. Sprzęgnij fluorofor z matrycą antygenową (2,5 h). Dodać 1 równoważną insulinę czterowartościową (21,7 mg, 0,5 μmol) do szklanej fiolki o pojemności 20 ml z mieszadłem i rozpuścić w DMSO (1,75 ml) delikatnie ogrzewając. Dodać świeżo przygotowany 100 mM bufor węglanowy (8 ml) o pH 9,0 i 5 równoważników izotiocyjanianu fluoresceiny do świeżo przygotowanego 10 mM roztworu podstawowego w DMSO (0,25 ml, 0,97 mg, 2,5 μmol). Mieszaj przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
  2. Oczyść produkt przez dializę (24 godziny). Używać rurki dializacyjnej o masie cząsteczkowej 3,5 kDa w mieszanym wiadrze o pojemności 5 l z wodą destylowaną w ciemności w temperaturze pokojowej. Dializuj przez 24 godziny i zmieniaj roztwór dializacyjny co 6–12 godzin.
  3. Zamrozić dializowany roztwór i liofilizować do sucha, aby uzyskać FAA. Przechowywać w ciemności, w suchej atmosferze, w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: FAA jest stabilny przez kilka miesięcy w tych warunkach przechowywania.

3. Charakterystyka FAA (2–4 godziny)

  1. Przeanalizować produkty z etapów 1 i 2 za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu zgodnie z Laemmli25 (2 h). Przygotować próbki zawierające 5 μg oczyszczonego antygenu monowartościowego, 4-ramienny azydek PEG o masie 20 kDa, układ antygenów i FAA.
    1. Wizualizacja znakowania fluoroforem w próbkach FAA za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w żelowym imagerze.
    2. Wykonaj barwienie na niebiesko Coomassie 26, aby zobrazować antygen.
    3. Wykonaj barwienie jodem27, aby zobrazować szkielet PEG. Wypłukać żel w wodzie destylowanej (3 x 2 min), inkubować w 5% roztworze chlorku baru (20 ml) przez 10 min, płukać w wodzie destylowanej (3 x 2 min), inkubować w 0,1 N roztworze jodu (20 ml) przez 1 min, następnie płukać w wodzie destylowanej (3 x 2 min) w celu usunięcia zabarwienia tła przed wizualizacją.
      UWAGA: Aby przygotować roztwór jodu 0,1 N, dodaj jodek potasu (2,0 g, 12 mmol) i jod (1,27 g, 5 mmol) do 100 ml wody destylowanej.
  2. Obliczyć stopień znakowania barwnikiem za pomocą spektroskopii UV-Vis (1 h). Rozpuścić niewielką ilość FAA w stężeniu 0,1 mg/ml i zapisać absorbancję przy 280 nm oraz szczytową długość fali absorpcji barwnika. Uzyskać współczynniki ekstynkcji molowej dla antygenu i barwnika.
    UWAGA: Niektóre barwniki są wrażliwe na pH. Upewnij się, że używasz odpowiednio buforowanego roztworu, takiego jak bufor węglanowy 100 mM o pH 8,3 podczas pomiaru absorbancji FAA, aby upewnić się, że podany współczynnik ekstynkcji barwnika jest dokładny.
    1. Wykonaj następujące obliczenia28 gdzie ADye, maxλ to absorbancja FAA przy szczytowej długości fali absorpcji barwnika, EDye, maxλ jest molowym współczynnikiem ekstynkcji przy szczytowej długości fali absorpcji barwnika, aantygen E, 280 nm to molowy współczynnik ekstynkcji dla monowalentnego antygenu przy 280 nm.:
      Współczynnik korekcyjny (CF) =Barwnik A, 280 nm /Barwnik A, maxλ 0,25 * (Barwnik A, maxλ / Barwnik E, maxλ) * (Antygen E, 280 nm / (A280 nm – (Barwnik A, maxλ * CF))) = barwnik/FAA
  3. Przeanalizować FAA pod kątem wolnego barwnika lub potencjalnych produktów degradacji za pomocą RP-HPLC (1 h).
    1. Rozpuścić niewielką ilość FAA w stężeniu 1,0 mg/ml i przeanalizować za pomocą analitycznej kolumny C18 (4,6 mm x 150 mm, wielkość porów 300 A, wielkość cząstek 2,5 μm) przy użyciu 10-minutowego gradientu 5–95% B (A, woda z 0,05% kwasem trifluorooctowym: B, acetonitryl z 0,05% kwasem trifluorooctowym) o natężeniu przepływu 1 ml/min. Ustawić detektor UV-Vis tak, aby monitorował szczytową długość fali absorbancji barwnika (437 nm dla FITC).
      UWAGA: W przypadku barwników wrażliwych na pH analiza HPLC w zakwaszonych rozpuszczalnikach może wymagać przesunięcia monitorowanej długości fali od szczytowej długości fali absorpcji barwnika w neutralnych, wodnych warunkach. W 0,05% TFA pH wynosi około 3, a maksymalna absorpcja FITC uległa zmianie.

4. Opracowanie testu za pomocą miareczkowania FAA (3–5 h)

UWAGA: Przedstawiono zastosowanie FAA do cytometrii przepływowej, ale te same kroki mogą być zmodyfikowane do użycia w innych formatach, takich jak immunohistochemia czy mikroskopia fluorescencyjna. W przypadku stosowania FAA dla nowego formatu należy wykonać nowy test optymalizacyjny. Mieszane lub izolowane populacje komórek można uzyskać za pomocą metod przetwarzania krwi lub narządów limfatycznych23,29. Nie zaleca się zbierania poprzez trawienie enzymatyczne tkanek, ponieważ markery powierzchniowe komórek mogą zostać zrzucone.

  1. Zawiesić zapasy FAA do 1 mg/ml w buforze FACS (1x PBS + 5% płodowej surowicy bydlęcej i 0,1% azydku sodu). Można włączyć do 10% DMSO w celu przyspieszenia rozpuszczania.
  2. Uzyskać komórki dodatnie dla interesujących nas limfocytów B specyficznych dla antygenu i dozować do probówek do mikrowirówek. Wymaganebędzie około 1 x 10 7 komórek.
    UWAGA: Splenocyty zostały zebrane od myszy VH125 i EAE zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC protokołami na Uniwersytecie Kansas w celu przeprowadzenia niniejszej demonstracji. Badacze mogą stosować metody opisane w niniejszym dokumencie w odniesieniu do próbek komórek specyficznych dla ich własnego zastosowania i przygotowania FAA.
    1. Dozować 5 x 105 komórek do oznaczania powtórzeń do miareczkowania (co najmniej 3 kontrpróby na miareczkowanie).
    2. Dozować 1 x 105 komórek do kontroli pojedynczej plamy, a także kontroli niebarwionej.
      UWAGA: Izotypy przeciwciał i fluorescencja minus jedna kontrola mogą być również wykorzystane do pełnej walidacji testu.
  3. Umyj komórki, dodając 1 ml buforu FACS do każdej probówki. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w 50 μl buforu FACS.
  5. Dodać przeciwciała fluorescencyjne CD3 i CD19 do każdej próbki w stężeniach zalecanych przez producenta, a także w dawkach miareczkowanych FAA.
    UWAGA: Stężenia robocze przeciwciał fluorescencyjnych mogą być miareczkowane niezależnie w celu potwierdzenia integralności partii. Odpowiednie zakresy dawek FAA będą się różnić w zależności od zastosowania, ale dobrym punktem wyjścia jest 50, 25, 10, 5 i 1 μg na próbkę. 1 μl podstawowego roztworu FAA to 1 μg dawki.
  6. Dobrze wymieszać każdą próbkę i inkubować pod przykryciem od światła, na lodzie przez 30 minut.
  7. Po inkubacji umyć komórki, dodając 1 ml buforu FACS do każdej probówki. Odwirować próbki o masie 200 x g przez 5 minut.
  8. Odessać supernatant i powtórzyć płukanie, dodając 1 ml buforu FACS do każdej probówki. Odwirować próbki o masie 200 x g przez 5 minut.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić próbki w 200 μl świeżego buforu FACS. Umieść próbki na lodzie i udaj się do cytometru.
  10. Uruchom próbki na cytometrze i zbierz co najmniej 50 000 zdarzeń.

5. Analiza miareczkowania FAA i optymalizacja dawki etykietowania (1–2 h)

  1. Korzystanie z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, bramka dla pojedynczych komórek.
  2. Na pojedynczych komórkach umieść bramki dla CD19 + (komórki B) i CD3 + (limfocyty T).
  3. W populacjach rodzicielskich CD19 + i CD3 + bramka dla zdarzeń FAA+ w odpowiednim kanale fluorochromowym.
  4. Zapisz procent zdarzeń FAA+ w populacjach rodzicielskich CD19+ i CD3+.
  5. Oblicz współczynnik swoistości, dzieląc odsetek zdarzeń FAA+ w populacji CD19+ (swoistej) przez proporcję zdarzeń FAA+ w populacji CD3+ (niespecyficznych). Współczynnik swoistości powinien być zmaksymalizowany, aby zapewnić skuteczne stosowanie FAA.
  6. Zastosować dawkę znakującą odpowiadającą najwyższemu współczynnikowi swoistości dla przyszłych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczona wydajność insulinoalkinu (Rysunek 2, górny panel), określona na podstawie masy, zazwyczaj wahała się od 50 do 65%. Plony mniejsze niż 40% były prawdopodobnie spowodowane zanieczyszczeniem wody w bezwodnym DMSO i/lub hydrolizą propargilowego estru NHS. W przypadku multimeryzacji antygenu (Rysunek 1B), oczyszczona wydajność tablicy antygenów insulinowych (Rysunek 2, środkowy panel) wahała się od 60 do 75%, a analiza SDS-PAGE potwierdziła, że głównym pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy protokół (rysunek 1) w celu skonstruowania niestandardowych FAA do identyfikacji limfocytów B specyficznych dla antygenu, upraszczając generowanie sond limfocytów B dla trudnych celów antygenowych. Wybraliśmy 4-ramienne polimery PEG z końcowymi grupami azydkowymi jako łatwy substrat do budowy FAA, ponieważ PEG nadaje rozpuszczalność w wodzie, podczas gdy funkcjonalne uchwyty azydkowe umożliwiają proste reakcje koniugacji na klik33. Zdefiniowana liczba fu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CJB jest współzałożycielem Orion Bioscience, Inc., firmy udzielającej licencji na technologię SAgA w celu badania jej zastosowań terapeutycznych. Niniejszy raport opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Program w ramach grantu nr 1946099. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Colette Worcester za pomoc w zbieraniu danych. Praca ta była wspierana przez Fundację PhRMA (JDG), Program Stypendialny dla Absolwentów Narodowej Fundacji Nauki (KDA) oraz przez granty NIH R21AI143407, R21AI144408 i DP5OD023118.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M kwas solnyFisher ChemicalA508-4
12% Prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-ramienny azyd PEGJenkem USAA7185-1
3,5 kDa MWCO rurki do dializy (regenerowana celuloza)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitryl, klasa HPLCFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 przeciwciało anty-mysie CD19BioLegend115522
bezwodny dimetylosulfotlenekACROS OrganicsAC610420010
chlorek baruACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioOdczynnikiBP100-50
Cell Prime r-insulinaEMD Millipore4512-01Rekombinowana insulina ludzka do syntezy insuliny FAA
Siarczan miedzi (II) pentahydratACROS OrganicsAC197722500
dimetylosulfotlenekFisher ChemicalS67496
izomer izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) 1Sigma-AldrichF7250-1G
Lodowaty kwas octowyFisher ChemicalA38-212
GlicerolACROS Organics15892-0010
GlicynaFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNAem>Niestandardowa synteza (sekwencja: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; czystość: 97,29%)
jodSigma-Aldrich207772-100G
Metanol, klasa HPLCFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (ester sukcymidylowy 5/6-karboksy-tetrametylo-rodaminy), mieszany izomerThermo Scientific46406Dostępny na rynku analog estru NHS Rhodamine-B stosowanego w bibułce
PE/Cyjanine7 przeciwciało anty-mysie CD3BioLegend100220
jodek potasuSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroksysukcynimidester Sigma-Aldrich764221
askorbinian soduSigma-AldrichA7631
biowęglan soduSigma-AldrichS5761-1KG
dodecylosiarczan soduFisher BioReagentsBP166-100
Sód fosforan monobasic monohydratFisher ChemicalS468-500
kwas trifluorooctowySigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroksypropylotriazolylo)aminaClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3,5 um, kolumna 4,6 x 150 mm186003034Wody
xBridge BEH C18 5um Kolumna przygotowawcza OBD, 19 x 250 mmWoda186004021
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology. , Garland Science. (2016).
  2. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Seminars in Neurology, Thieme Medical Publishers. , 115-127 (2016).
  3. Knutson, K. L., Disis, M. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 54 (8), 721-728 (2005).
  4. Rivino, L., et al. Hepatitis B virus-specific T cells associate with viral control upon nucleos (t) ide-analogue therapy discontinuation. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 668-681 (2018).
  5. Constantin, C. M., Bonney, E. E., Altman, J. D., Strickland, O. L. Major histocompatibility complex (MHC) tetramer technology: an evaluation. Biological Research For Nursing. 4 (2), 115-127 (2002).
  6. Griffin, J. D., Song, J. Y., Sestak, J. O., DeKosky, B. J., Berkland, C. J. Linking autoantigen properties to mechanisms of immunity. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2020).
  7. Moody, M. A., Haynes, B. F. Antigen-specific B cell detection reagents: use and quality control. Cytometry A. 73 (11), 1086-1092 (2008).
  8. Boonyaratanakornkit, J., Taylor, J. J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Frontiers in Immunology. 10 (1694), (2019).
  9. Newman, J., Rice, J. S., Wang, C., Harris, S. L., Diamond, B. Identification of an antigen-specific B cell population. Journal of Immunological Methods. 272 (1), 177-187 (2003).
  10. Smith, M. J., et al. Silencing of high-affinity insulin-reactive B lymphocytes by anergy and impact of the NOD genetic background in mice. Diabetologia. 61 (12), 2621-2632 (2018).
  11. Griffin, J. D., et al. Acute B-cell inhibition by soluble antigen arrays is valency-dependent and predicts immunomodulation in splenocytes. Biomacromolecules. 20 (5), 2115-2122 (2019).
  12. Hartwell, B. L., et al. Antigen-specific binding of multivalent soluble antigen arrays induces receptor clustering and impedes B cell receptor mediated signaling. Biomacromolecules. 17 (3), 710-722 (2016).
  13. Hartwell, B. L., Pickens, C. J., Leon, M., Berkland, C. Multivalent soluble antigen arrays exhibit high avidity binding and modulation of B cell receptor-mediated signaling to drive efficacy against experimental autoimmune encephalomyelitis. Biomacromolecules. 18 (6), 1893-1907 (2017).
  14. Hartwell, B. L., et al. Soluble antigen arrays disarm antigen-specific B cells to promote lasting immune tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Autoimmunity. 93, 76-88 (2018).
  15. Hartwell, B. L., et al. Molecular dynamics of multivalent soluble antigen arrays support a two-signal co-delivery mechanism in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 13 (2), 330-343 (2016).
  16. Kuehl, C., et al. Pulmonary administration of soluble antigen arrays is superior to antigen in treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (11), 3293-3302 (2017).
  17. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays displaying mimotopes direct the response of diabetogenic T Cells. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1436-1448 (2019).
  18. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays for selective desensitization of Insulin-Reactive B cells. Molecular Pharmaceutics. 16 (4), 1563-1572 (2019).
  19. Sestak, J. O., Fakhari, A., Badawi, A. H., Siahaan, T. J., Berkland, C. Structure, size, and solubility of antigen arrays determines efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. The AAPS Journal. 16 (6), 1185-1193 (2014).
  20. Sestak, J. O., et al. Codelivery of antigen and an immune cell adhesion inhibitor is necessary for efficacy of soluble antigen arrays in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 1, 14008(2014).
  21. Thati, S., et al. Routes of administration and dose optimization of soluble antigen arrays in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 714-721 (2015).
  22. Johnson, S. N., et al. Multimeric insulin desensitizes insulin-specific B cells. ACS Applied Bio Materials. , (2020).
  23. Griffin, J. D., et al. Antigen-specific immune decoys intercept and exhaust autoimmunity to prevent disease. Biomaterials. 222, 119440(2019).
  24. Hartwell, B. L., et al. Multivalent nanomaterials: learning from vaccines and progressing to antigen-specific immunotherapies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 346-361 (2015).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with coomassie blue. CSH Protocols. 2007, 4719(2007).
  27. Moosmann, A., Müller, E., Böttinger, H. Purification of PEGylated proteins, with the example of PEGylated lysozyme and PEGylated scFv. Methods Molecular Biology. 1129, 527-538 (2014).
  28. Haugland, R. P. Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Monoclonal Antibody Protocols. Davis, W. C. , Humana Press. Totowa, NJ. 205-221 (1995).
  29. Martin, T. J., Whalen, M. M. Exposures to the environmental toxicants pentachlorophenol (PCP) and dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) modify secretion of interleukin 1-beta (IL-1β) from human immune cells. Archives of Toxicology. 91 (4), 1795-1808 (2017).
  30. Felton, J. L., Maseda, D., Bonami, R. H., Hulbert, C., Thomas, J. W. Anti-insulin B cells are poised for antigen presentation in type 1 diabetes. The Journal of Immunology. 201 (3), 861-873 (2018).
  31. Griffin, J. D., et al. Tocopherol emulsions as functional autoantigen delivery vehicles evoke therapeutic efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 607-617 (2019).
  32. Yarkoni, Y., Getahun, A., Cambier, J. C. Molecular underpinning of B-cell anergy. Immunology Reviews. 237 (1), 249-263 (2010).
  33. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2017).
  34. Song, J. Y., et al. Glatiramer acetate persists at the injection site and draining lymph nodes via electrostatically-induced aggregation. Journal of Controlled Release. 293, 36-47 (2019).
  35. van Dongen, M. A., et al. Avidity mechanism of dendrimer-folic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 11 (5), 1696-1706 (2014).
  36. Hudson, P. J., Kortt, A. A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of Immunological Methods. 231 (1), 177-189 (1999).
  37. Baker, J. C., et al. Selective acylation of epsilon-amino groups. Google Patents. , (2003).
  38. Grimsley, G. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. A summary of the measured pK values of the ionizable groups in folded proteins. Protein Science. 18 (1), 247-251 (2009).
  39. Fesel, C., Coutinho, A. Serum IgM repertoire reactions to MBP/CFA immunization reflect the individual status of EAE susceptibility. Journal of Autoimmunity. 14 (4), 319-324 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Koniugaty PEG antygenchemia klikcytometria przep ywowadetekcja autoantygen wanga owanie receptor w kom rek Bplatforma multimeryzacjianaliza ex vivoocena kostymulacji
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły