Artykuł metodologiczny

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61847

⸱

15 lipca 2021

 , 
1Thermo Fisher, 2Universite de Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Streszczenie

Mikroskopia elektronowa jest stosowana w biologii i medycynie do obrazowania szczegółów komórkowych i strukturalnych w rozdzielczości nanometrów. Historycznie rzecz biorąc, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) zapewniała wgląd w ultrastrukturę komórek, ale w ostatniej dekadzie rozwój nowoczesnych skaningowych mikroskopów elektronowych (SEM) zmienił sposób patrzenia do wnętrza komórek. Mimo że rozdzielczość TEM jest lepsza, gdy potrzebne są szczegóły strukturalne na poziomie białka, rozdzielczość SEM jest wystarczająca dla większości pytań związanych z biologią komórki na poziomie organelli. Postęp technologiczny umożliwił automatyczne pozyskiwanie rozwiązań, takich jak obrazowanie szeregowe blokowe (SBF-SEM) i skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM). Niemniej jednak do dziś metody te pozostają nieskuteczne, gdy kluczowa jest identyfikacja i nawigacja do obszarów zainteresowania. Bez środków do precyzyjnej lokalizacji obszarów docelowych przed obrazowaniem, operatorzy muszą pozyskiwać znacznie więcej danych niż potrzebują (w SBF-SEM), lub, co gorsza, przygotowywać wiele siatek i obrazować je wszystkie (w TEM). Proponujemy strategię "bocznego badania przesiewowego" z wykorzystaniem tomografii matrycowej w SEM, która ułatwia lokalizację obszarów zainteresowania, a następnie zautomatyzowane obrazowanie odpowiedniej frakcji całkowitej objętości próbki. Próbki tomografii matrycowej są konserwowane podczas obrazowania i można je układać w biblioteki sekcji gotowe do wielokrotnego obrazowania. Przedstawiono kilka przykładów, w których przesiewanie boczne umożliwia nam analizę szczegółów strukturalnych, do których dostęp jest niezwykle trudny przy użyciu jakiejkolwiek innej metody.

Wprowadzenie

Pomimo znaczenia technik związanych z EM, wysiłek wymagany do ich opanowania sprawia, że cała dziedzina jest ograniczona do niewielkiej liczby specjalistów. Jedną z istotnych trudności jest identyfikacja i odnalezienie obszaru zainteresowania (ROI) w próbkach zachowanych dla EM. Wygląd tej samej próbki znacznie się różni, gdy jest analizowany za pomocą mikroskopii optycznej i po przetworzeniu do obserwacji EM. Zmiany dla próbek przygotowanych chemicznie obejmują kurczenie się próbki anizotropowej po etapach odwadniania (~10% w każdym wymiarze) oraz utratę fluorescencji przy użyciu osmu w protokole utrwalania i barwienia (Rysunek 1A). W przypadku ultracienkiego przekroju próbki są zatapiane w żywicach epoksydowych lub akrylowych przy użyciu różnych strategii (Rysunek 1B). Aby uzyskać pomyślne wyniki tego przygotowania, cała próbka musi zostać pofrakcjonowana na kawałki, które nie przekraczają 1 mm x 1 mm. Aby spełnić wymagania standardowych warunków obserwacji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), ta niewielka część próbki jest dalej cięta na warstwy o grubości 50-150 nm. Uzyskane obrazy w skali szarości pokazują organizację tkanek i strukturę organelli niewielkiej części całej próbki z większą szczegółowością niż jakakolwiek inna technika mikroskopowa (Rysunek 1C). Typowy zestaw danych TEM dostarcza informacji 2D, teoretycznie ekstrapolowanych w celu zrozumienia procesów naturalnie zachodzących w przestrzeni 3D w komórkach i tkankach. Rysunek 1D przedstawia wyzwanie związane z pozyskiwaniem objętości ultrastrukturalnych: jeśli sześcian o boku 1000 μm jest podzielony na grubość 50 nm, potrzeba będzie 20 000 sekcji, aby pokryć całą objętość; W przypadku sześcianu bocznego o grubości 500 μm będzie to 10 000 sekcji. Aby pokryć objętość 50 μm x 50 μm x 50 μm, może być konieczne 1000 sekcji "tylko". Ręczne uzyskanie tej objętości jest praktycznie niemożliwe i niezwykle trudne do wykonania za pomocą automatyzacji. Jeżeli, oprócz głębokości próbki, musimy pokryć całą powierzchnię takich hipotetycznych sześcianów, pokrycie powierzchni 1μm2 w rozsądnej rozdzielczości staje się poważnym problemem logistycznym (Rysunek 1E). Podczas gdy w przypadku nadzwyczajnych projektów na dużą skalę, takich jak podejścia konektomiczne, duża liczba sekcji jest kluczowa, dla większości "przyziemnych" projektów EM generowanie większej liczby sekcji wymaganych do obserwacji stanowi istotną wadę.

Istnieje kilka metod pozyskiwania informacji ultrastrukturalnych 3D: transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), tomografia TEM, tomografia matrycowa (AT), skaningowa mikroskopia elektronowa z blokiem szeregowym (SBF-SEM) oraz skaningowa mikroskopia elektronowa z ogniskowaną wiązką jonów (FIB-SEM). Główne różnice między tymi metodami to strategia podziału na sekcje oraz to, czy akwizycja obrazu jest sprzężona z generowaniem sekcji1. W przypadku TEM z podziałem szeregowym sekwencyjne sekcje są zbierane na siatkach szczelin, obrazy TEM są generowane z tych sekwencji i aligned2,3,4,5. W tomografii TEM serie pochyleń od 150-300 nm na siatce, a w połączeniu z sekcjami szeregowymi, zapewniają bardzo wysoką rozdzielczość, choć stosunkowo małe objętości6,7,8. Podejście AT wykorzystuje fizyczne cięcie z różnymi ręcznymi i półautomatycznymi sposobami zbierania przekrojów na stosunkowo dużym podłożu, takim jak szklane szkiełko nakrywkowe, płytki silikonowe lub specjalna taśma. W przypadku akwizycji obrazu wsparcie jest analizowane w SEM, z dostępnymi różnymi strategiami pozyskiwania obrazów9,10,11,12,13,14,15 . W przypadku SBF-SEM fizyczne cięcie odbywa się za pomocą mini-mikrotomu z diamentowym nożem umieszczonym bezpośrednio w komorze SEM, z obrazem SEM generowanym z powierzchni bloku żywicy16,17,18,19. W przypadku FIB-SEM źródło jonów usuwa cienkie warstwy próbki, a następnie następuje automatyczne obrazowanie odsłoniętej powierzchni za pomocą SEM20,21. Tomografia TEM i AT generują fizyczne przekroje, które w razie potrzeby można ponownie zobrazować, podczas gdy FSBF-SEM i FIB-SEM eliminują przekrój po obrazowaniu. Niedawna kombinacja fizycznych przekrojów zobrazowanych przez wielowiązkowy SEM zapewnia kombinację metod, która rozwiązuje problem "wąskiego gardła" szybkości akwizycji obrazu22. Każda z tych technik zrewolucjonizowała sposób pozyskiwania i analizowania danych EM, a każde podejście ma swoje praktyczne oddziaływania związane z danym zagadnieniem badawczym.

Biorąc pod uwagę charakter przygotowania i skalę wymiarów ultrastrukturalnych, nie jest łatwo przewidzieć, gdzie w bloku próbki znajduje się konkretna struktura docelowa (Rysunek1D,E). Jednym z rozwiązań dla lokalizacji ROI jest nagrywanie obrazów z całego bloku w żądanej rozdzielczości od samego początku. Interesujące nas struktury mogą znajdować się w pozyskanej objętości danych, gdy znajdują się z dala od mikroskopu. Czas akwizycji i obsługa danych związane z tą strategią są problematyczne. Pożądane jest zmniejszenie ilości rejestrowanych danych, zwłaszcza jeśli ROI są znacznie mniejsze niż blok tkankowy, tj. jeśli obiektami zainteresowania są określone typy komórek (nie całe narządy). Różne techniki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) mogą być skuteczne, gdy fluorescencja jest zachowana i zlokalizowana przed lub po przygotowaniu w tej samej próbce23,24,25,26,27,28,29. Niemniej jednak wiele struktur komórkowych jest rozpoznawalnych nawet bez korelacji fluorescencyjnej, tylko na podstawie znanej ultrastruktury. W takich przypadkach uważamy, że boczna tomografia matrycowa zapewnia równowagę między wysiłkiem włożonym w lokalizację ROI a ultrastrukturalną jakością informacji. Korzystając z tej strategii, podzbiór sekcji na płytce jest badany w regularnych odstępach czasu, które można ustalić na podstawie wielkości i charakteru zwrotu z inwestycji. Po znalezieniu zwrotów z inwestycji akwizycja danych jest konfigurowana w ciągłej serii sekcji, zaczynając przed i kończąc po sekcji zakotwiczenia, zbierając odpowiednie informacje w ukierunkowany sposób.

Prezentujemy protokoły dla AT, które upraszczają i przyspieszają pozyskiwanie interesujących regionów lub wydarzeń w licznych sekcjach i dają lepiej dopasowane objętości obrazów. Boczne przesiewanie i wieloetapowa akwizycja generują dane o bardzo wysokiej rozdzielczości w precyzyjnie docelowych regionach. Opisana przez nas procedura rozwiązuje kilka wyzwań związanych z pozyskiwaniem danych 3D EM, ponieważ zapewnia: kompatybilność z szeroką gamą próbek bez zasadniczej zmiany procesu przygotowywania próbek; ukierunkowana lokalizacja dla sekcji i przejęć SEM; skrócony czas i wysiłek podczas konfiguracji; obrazowanie regionów w wielu sekcjach z lepszym wyrównaniem wynikowych objętości; oraz płynna procedura zszywania i wyrównywania w celu skompilowania różnych obrazów w zszyty obraz mozaiki. Zdecydowaliśmy się zademonstrować siłę naszej metody na kilku próbkach z opublikowanych i trwających projektów. Uważamy, że takie podejście może znacznie ułatwić generowanie i pozyskiwanie ukierunkowanych danych EM, nawet dla badaczy z ograniczonym doświadczeniem w EM.

Protokół

UWAGA: Metody przygotowania próbek są opisane gdzie indziej14,30,31, i nie są omówione w tej publikacji. Krótko mówiąc, pokazane przykłady zostały chemicznie utrwalone aldehydem glutarowym, utrwalone po utrwaleniu 1% OsO4, a następnie potraktowane 1% wodnym octanem uranylu przed zatopieniem w żywicy do zatapiania. Alternatywnie próbki można przygotować za pomocą zamrażania pod wysokim ciśnieniem, zamrażania podstawiając 0,1% octanem uranylu w acetonie i zatopić w żywicy akrylowej. Bloki próbki przygotowano przy użyciu metody płaskiego zatapiania, która pozwala na wyraźny widok próbki, ułatwiając jej orientację do przekroju (Rysunek 1B).

1. Procedura generowania tablicy

  1. Orientacja i przycinanie osadzonej próbki
    1. Za pomocą lornetki/mikroskopu zidentyfikuj i zaznacz ROI na powierzchni osadzonego bloku, lekko drapiąc powierzchnię bloku żyletką. Pomoże to zorientować próbkę wewnątrz ultramikrotomu i zmniejszy powierzchnię cięcia.
    2. Zacisnąć próbkę na uchwycie ultramikrotomu (Rysunek 2A).
    3. Przytnij żywicę wokół próbki, najpierw żyletką (przycinanie zgrubne), a następnie kontynuuj za pomocą diamentowego narzędzia do przycinania (dokładne przycinanie; Rysunek 2A). Używaj noży o nachyleniu krawędzi 20° lub 90°, aby upewnić się, że górna i dolna powierzchnia bloku są równoległe do krawędzi tnącej noża.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla seryjnego cięcia i pozyskiwania prostych taśm.
    4. Wymieszaj ksylen i klej w proporcji 3:1. Za pomocą rzęsy przymocowanej do wykałaczki nałóż tę mieszankę na górną i dolną krawędź przyciętego bloku. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
  2. Przygotuj wspornik montażowy matrycy A (tj. płytki krzemowe).
    1. Wytnij kawałek wafla za pomocą narzędzia do rozłupywania płytek (EMS), dostosowując jego rozmiar do celu projektu. 2 cm x 4 cm jest wygodne zarówno do obserwacji mikroskopią świetlną, jak i elektronową.
    2. Oczyść wafel w wodzie destylowanej, aby pozbyć się zanieczyszczeń.
    3. Wyładowanie jarzeniowe/plazmowe czyści powierzchnię przy użyciu standardowego wyposażenia. Dokładne parametry będą zależeć od używanej maszyny. Zacznij od parametrów rozładowania kratek i empirycznie dostosuj czas. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla dobrego rozłożenia sekcji na podporze podczas wysychania sekcji i nie należy go pomijać.
  3. Przygotować wspornik montażowy B tablic (tj. szklane szkiełko nakrywkowe)
    1. Jeśli planujesz eksperymenty z multipleksowym znakowaniem immunologicznym, przenieś próbki na szkiełku nakrywkowym, aby lepiej wykryć sygnał fluorescencyjny. Aby poprawić przyczepność szkiełka nakrywkowego, należy zastosować szczegółową procedurę powlekania żelatyną, która została opisana wcześniej9.
    2. Zwiększyć przewodność, pokrywając szkiełka tlenkiem indu i cyny (ITO) lub złotem przez odparowanie. Przygotowane szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w czystym miejscu. Wyładować próbki jarzeniowo, jak opisano w ppkt 1.2.3.

2. Podział próbki na sekcje

  1. Przygotowanie noża AT
    UWAGA: Do wygenerowania tablic należy użyć zmodyfikowanego noża (ATS), zaprojektowanego w celu ułatwienia pozyskiwania długich wstęg. Noże Histo-Jumbo lub podobne noże przeznaczone do generowania sekcji na dużych podporach mogą również służyć do cięcia AT.
    1. Przymocuj igłę do dolnej części noża za pomocą piankowej taśmy klejącej i przebij ją (Rysunek 2B). Umieść nóż ATS w uchwycie ultramikrotomu pod kątem 0°. Wyreguluj krawędź noża równolegle do powierzchni bloku, postępując zgodnie ze standardową procedurą.
    2. Przyłóż przycięty blok do krawędzi noża w pozycji gotowej do cięcia.
    3. Umieść wafel/szkiełko nakrywkowe w misce na noże i napełnij ją wodą do tego samego poziomu, co krawędź noża. Pozwól, aby diamentowa krawędź noża odpowiednio nawilżyła i, jeśli to konieczne, pobierz wodę za pomocą dołączonej strzykawki (Rysunek 2C).
  2. Dzielenie i przenoszenie macierzy
    1. Ustaw mikrotom na żądane parametry cięcia. W przypadku noża ATS wskazany jest zakres 50-100 nm i prędkość cięcia 0,6-1 mm/s. Rozpocznij sekcję (Rysunek 2Di).
    2. Uzyskaj wstęgę o długości, która zakryje docelowy wolumin z i zatrzyma zbieranie. W zależności od rozmiaru bloku, jednorodności tkanki i rodzaju żywicy, wstęga będzie stosunkowo prosta (Rysunek 2D-ii). Wiele próbek nie da prostych wstążek, pomimo zainwestowanego wysiłku i rodzaju użytego noża.
    3. W zależności od ostatecznego celu wykonaj jedną długą lub kilka krótkich wstążek wyrównanych obok siebie. Wspornik o wymiarach 2 cm x 4 cm może wygodnie pomieścić od 100 do 1 000 sekcji. Ułożenie wstążki na stopniu podparcia to krok, który wymaga zręczności i pewnych rąk. Jednak krzywa uczenia się tej umiejętności jest szybko nabywana.
    4. Odczep wstążkę od krawędzi noża za pomocą czystej, nieklejącej się końcówki rzęsy przyklejonej do wykałaczki (Rysunek 2Diii).
    5. Za pomocą rzęsy delikatnie przesuń wstążkę nad środek podłoża podporowego. W tym momencie użyj chloroformu lub pisaka grzewczego do rozciągania sekcji, jeśli to konieczne. Pamiętaj jednak, że ta manipulacja może wywołać zerwanie i deformację wstążki.
    6. Spuszczanie wody należy rozpocząć od pociągnięcia za strzykawkę. W przypadku delikatniejszych wstążek lub wolniejszego cofania wody, pozwól, aby woda kapała, odłączając strzykawkę od węża. Gdy poziom wody obniża się do poziomu wafla, kontroluj wstążkę i w razie potrzeby zmień jej położenie, delikatnie dociskając wstążkę do środka. Po osadzeniu wstęg na powierzchni wafla kontynuuj opróżnianie, aż pozostała woda zostanie całkowicie wycofana z miski.
      UWAGA: Jeśli nie używasz dolnego noża ATS do cofania wody, ostrożnie zmniejsz ilość wody z boków noża ATS, aby nie wywoływać turbulencji.
    7. Pozostaw sekcje na wsporniku wewnątrz wanny do całkowitego wyschnięcia. W zależności od hydrofobowości podłoża i poziomu wilgotności otoczenia, woda będzie parować w różnym tempie (Rysunek 2Div). Ważne jest, aby pozostawić próbkę do powolnego wyschnięcia, aby zmniejszyć lub całkowicie uniknąć wszelkich fałd na próbce.
    8. Przenieść suchą próbkę do szczelnie zamkniętego pojemnika w celu ochrony przed zanieczyszczeniem brudem i umieścić ją w piecu o temperaturze 60 °C na co najmniej 30 minut. W razie potrzeby przeciwbejcuj sekcje za pomocą metali ciężkich, aby zwiększyć ogólny kontrast.
    9. Po zakończeniu procedury ostrożnie wyczyść nóż zgodnie z instrukcjami producenta
      UWAGA: Przenoszenie wielu lub szeregowych sekcji na płytce (Rysunek 2E) w porównaniu z przenoszeniem na siatkę szczelinową (Rysunek 2F) całkowicie zmienia sposób przygotowania EM. Nieprzerwane cięcie i zbieranie sekcji na pojedynczym podporze zmniejsza liczbę błędów związanych z cięciem i zbieraniem sekcji, które są częste w przypadku cięcia szeregowego. Odpowiednik 100 sekcji o wymiarach 1000 μm x 500 μm zebranych na jednej płytce odpowiada 33 siatkom szczelinowym (Rysunek 2G).

3. Przykładowa obserwacja

UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki przepływu pracy zaimplementowane przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania (zobacz Spis materiałów). Można użyć dowolnego oprogramowania do akwizycji obrazu na dowolnym SEM wyposażonym w odpowiednie detektory, jednak konkretne działania użytkownika będą się różnić i często będą bardziej ręczne.

  1. Uzyskaj mapę poglądową obrazów SEM, która ujawnia lokalizacje sekcji na płytce. Wbudowany obraz z kamery optycznej pomaga w definiowaniu mozaiki obrazów SEM, która obejmuje wstęgę sekcji lub wszystkie sekcje. Utwórz mozaikę, klikając i przeciągając myszą w prawo na obrazie z kamery próbki i rozpocznij Automatyczną Akwizycję.
    UWAGA: Wystarczą bardzo zgrubne ustawienia obrazowania, tj. rozmiar piksela 1-2 μm i czas przebywania 1 μs. Proces ten jest zilustrowany w materiałach uzupełniających (strony 2-7).
  2. Zlokalizuj sekcje za pomocą funkcji automatycznego wykrywania Section Finder lub zlokalizuj je ręcznie. Pozycje i kontury przekrojów są pobierane automatycznie za pomocą tego oprogramowania na podstawie dopasowania obrazu. Aby zilustrować ten proces, zobacz Materiały dodatkowe (strony 8 - 15).
  3. W przypadku, gdy obrazy przeglądowe nie pokazują wyraźnie zwrotu z inwestycji, uzyskaj obrazy sekcji w wyższej rozdzielczości. Użyj funkcji Podgląd sekcji, aby automatycznie tworzyć i pobierać obrazy. Proces ten jest zilustrowany w materiałach uzupełniających, strony 16-18. Ustawienia obrazowania muszą być wybrane zgodnie z charakterem i wielkością zwrotu z inwestycji, którego szuka użytkownik.
    1. Aby znaleźć optymalne ustawienia, aktywuj obrazowanie na żywo w oprogramowaniu sterującym mikroskopem i przejdź do jednego zwrotu z inwestycji. Zmieniaj ustawienia obrazowania, aż obrazy wyraźnie pokażą zwrot z inwestycji, ale akwizycja obrazu nie będzie zbyt długa.
  4. Definiowanie regionów obrazowania
    UWAGA: Zaproponowano kilka różnych strategii.
    1. Jeśli konieczne jest zobrazowanie tylko kilku sekcji, użyj obrazów utworzonych do tej pory sekcji, aby przejść do odpowiednich sekcji i użyj przeglądarki Zoomable, która pokazuje wszystkie uzyskane obrazy w ich oryginalnych lokalizacjach względnych, aby spojrzeć na wszystkie sekcje. Po znalezieniu sekcji, która powinna zostać zobrazowana w wysokiej rozdzielczości, utwórz region obrazowania za pomocą kliknięcia i przeciągnięcia. Wybierz ustawienia obrazowania w wysokiej rozdzielczości i zapisz je w szablonie. Użyj tego szablonu ponownie w dalszych sekcjach.
    2. Aby znaleźć szczególnie małe lub trudne do wykrycia rzadkie zdarzenia, należy zastosować metodę badania przesiewowego bocznego. Ręcznie utwórz region obrazowania z ustawieniami obrazowania o wysokiej rozdzielczości na co dziesiątej sekcji lub na jednej sekcji na wstążkę i uzyskaj obrazy. Przejrzyj obrazy i zaznacz sekcje, które zawierają zwrot z inwestycji w oprogramowaniu lub zanotuj.
      1. Zaczynając od sekcji, które zawierają zwrot z inwestycji, poruszaj się do przodu i do tyłu przez zestaw sekcji i twórz regiony obrazowania o wysokiej rozdzielczości w tych samych lokalizacjach względnych tak długo, jak długo struktura jest nadal widoczna w przekroju. Można to zrobić ręcznie lub korzystając z procedury opisanej w kolejnych krokach.
    3. Uzyskuj obrazy w więcej niż dziesięciu kolejnych sekcjach. Kliknij przycisk Rozpocznij zawężanie pozycji po powiększeniu obrazu, aby zwiększyć precyzję rejestrowanych lokalizacji sekcji zgodnie z opisem w instrukcji. Zmniejsza to zmienność położenia serii obrazów. Procedura jest zilustrowana i wyjaśniona w materiałach uzupełniających na stronach 19-21.
    4. Kliknij i przeciągnij dowolną sekcję, aby zdefiniować region obrazowania, przytrzymując Alt, a następnie wybierz opcję Utwórz tablicę zestawów kafelków z menu kontekstowego, które otwiera się po zwolnieniu przycisku myszy. Następnie oprogramowanie tworzy obszary obrazowania w tym samym względnym położeniu we wszystkich sekcjach, które zostały wcześniej znalezione lub oznaczone. Możliwe jest ograniczenie obrazowania do określonego zakresu przekrojów za pomocą suwaka Rozpiętość sekcji.
      UWAGA: Procedurę tę można powtórzyć z dowolną liczbą obszarów obrazowania, dzięki czemu umożliwia rejestrowanie wielu małych obrazów o wysokiej rozdzielczości zamiast rejestrowania pojedynczego większego obrazu na każdej sekcji.
    5. Po utworzeniu skonfiguruj liczbę pikseli, rozmiar pikseli, układ kafelków, czas przebywania pikseli itp. w każdej serii obrazów zgodnie z potrzebami. Po utworzeniu i skonfigurowaniu serii obrazowania wszystkie są wymienione w podpowiedzi zadania.
  5. Konfiguracja funkcji automatycznych i rozpoczęcie akwizycji obrazu
    1. Utwórz osobną serię obrazów dla funkcji automatycznych, korzystając z tej samej metody, która została opisana w poprzednim kroku. Przenieś serię obrazów do miejsca w sekcji, która zawiera struktury o wysokim kontraście.
    2. Ustaw serię obrazów na 1024 x 884 pikseli i wybierz rozmiar piksela odpowiadający najwyższej rozdzielczości używanej w serii obrazów skonfigurowanej w poprzednich krokach. Na liście funkcji automatycznych sprawdź Auto Focus i Auto Stigmator.
    3. Wybierz opcję Według sekcji w kontrolkach sekwencji akwizycji i upewnij się, że obraz funkcji automatycznych jest pierwszym elementem na liście. Rozpocznij pobieranie obrazu, klikając przycisk Uruchom obok podpowiedzi zadania. Procedury te są zilustrowane w materiałach uzupełniających, strony 22-23.
      UWAGA: Nie ma potrzeby ręcznego wstępnego ustawiania ostrości na każdej sekcji. Podczas sesji nagrywania, za każdym razem, gdy mikroskop przejdzie do nowej sekcji, funkcje automatyczne zostaną wykonane przed zarejestrowaniem wszystkich innych obrazów w tej sekcji.

4. Wyrównanie i analiza danych

  1. Eksport danych
    1. Upewnij się, że dane są zapisane w .tif formacie, więc nie ma potrzeby korzystania z dedykowanej funkcji eksportu. Sortowanie danych w strukturze folderów, która odpowiada bezpośrednio warstwom i elementom w drzewie warstw.
    2. Po zarejestrowaniu mozaiki obrazów użyj funkcji StitchAll, aby automatycznie zszyć wszystkie płytki.
  2. Wyrównywanie i kadrowanie stosu w Fidżi
    NUTA. Do pracy z danymi tomografii matrycowej można wykorzystać wiele pakietów oprogramowania (bezpłatnych i komercyjnych). Poniższe kroki są pokazane za pomocą programu typu open source Fiji32, ponieważ jest on powszechnie dostępny i zawiera wszystkie wymagane funkcje.
    1. Zaimportuj stos obrazów (lub zszytych obrazów) na Fidżi jako stos wirtualny.
    2. Jeśli konieczna jest normalizacja kontrastu/jasności, wybierz polecenie Zwiększony kontrast... z menu Proces. Ustaw opcję Nasycone piksele na 0,1 lub mniej, a następnie zaznacz opcję Przetwarzaj wszystkie plasterki.
    3. Z menu Wtyczki wybierz Rejestracja | Liniowe wyrównanie stosu za pomocą SIFT.
    4. Wybierz opcję Sztywny lub Nierafinowany z menu rozwijanego Oczekiwana transformacja. W przeciwnym razie zachowaj ustawienia domyślne. Rozpocznij wyrównywanie, klikając przycisk OK.
      UWAGA: Załadowanie danych jako wirtualnego stosu umożliwia Fidżi obsługę stosów o dowolnym rozmiarze. Dane wyjściowe wyrównania są tworzone w pamięci RAM; Może to jednak ograniczyć maksymalny rozmiar stosów, które mogą być przetwarzane. W takim przypadku należy użyć opcji Register Virtual Stack Slices, która jest implementacją tego samego algorytmu rejestracji typu folder-folder. Po zakończeniu rejestracji załaduj dane wyjściowe jako stos wirtualny.
    5. Przytnij stos obrazów, klikając Przytnij, aby zawierał tylko zwrot z inwestycji.
    6. Zapisz stos jako pojedynczy obraz .tif lub serię .tif obrazów.
      UWAGA: Krytyczne etapy tomografii matrycowej są pokazane w Rysunek 3.

Wyniki

Poniższe przykłady mają na celu zademonstrowanie wszechstronności zalecanych schematów postępowania. Ilustracje studiów przypadku przedstawiają projekty, w których mieliśmy trudności z uzyskaniem satysfakcjonujących wyników przy użyciu innych technik. Do zilustrowania typowych wyzwań, z jakimi można się spotkać przy licznych typach próbek, wybraliśmy dorosłe osobniki Drosophila. Ten narząd rurkowaty o długości około 6 mm i przekroju 500-1000 µm jest podzielony na różne regiony o unikalnej funkcji i składzie komórkowym (Rycina 4A)33. W zależności od orientacji cięcia, wymiary profilu jelita oraz jego wygląd na przekroju ulegają zmianie. Przekroje orientowane poprzecznie lub wzdłużnie są stosunkowo duże i tylko kilka z nich można umieścić na jednej siatce TEM (Rycina 2F). W FIB można obrazować jedynie niewielką część tkanki, a w przypadku SBF-SEM trudności są podobne jak przy wszelkich próbkach niejednorodnych. AT zapewnia efektywny kompromis w analizie takich próbek, a płaskie zatapianie ułatwia lokalizację ROI. Staranne przycięcie nadmiaru żywicy wokół wybranego obszaru (Rycina 4B) jest istotne dla efektywnego pobierania serii z odpowiedniego obszaru (Rycina 4C). Setki przekrojów można zebrać na pojedynczym waflu sekwencyjnie lub losowo (Rycina 4D). W zależności od pytania badawczego, przesiewanie próbek i ich akwizycja będą wymagać różnej strategii, którą umownie podzieliliśmy na kilka scenariuszy. Aby w bardziej ukierunkowany sposób zilustrować przedstawione scenariusze, wybraliśmy kilka studiów przypadku z różnych projektów badawczych.

Analiza licznych, losowo rozmieszczonych dużych struktur w zakresie 1-10 µm (Rycina 4E)
Często dane ultrastrukturalne są wymagane do zweryfikowania hipotezy wynikającej z kilku podejść eksperymentalnych, porównujących warunki standardowe i zmienione eksperymentalnie. W takich przypadkach zazwyczaj losowo pobiera się kilka przekrojów na siatki i poddaje je przesiewowej analizie w celu zlokalizowania i obrazowania obszarów zainteresowania. Taktyka ta jest zazwyczaj mniej systematyczna i ograniczona do niewielkiej liczby analizowanych przekrojów. Sugerujemy rejestrację obrazów ogólnych dziesiątek lub setek przekrojów o średniej rozdzielczości z danej serii (Rycina 4D). W przypadku typowych przekrojów o grubości 70 nm, 200 przekrojów obejmie około 14 µm, co pozwoli na uchwycenie licznych komórek, w całości lub częściowo, w czasie pół godziny. W pierwszym kroku rejestruje się obraz ogólny całej serii w niskiej rozdzielczości, co pomaga pominąć przekroje wykazujące artefakty preparatyki (np. fałdy, zanieczyszczenia). Następnie akwizycję można przeprowadzić ręcznie lub automatycznie bezpośrednio na wybranych fragmentach przekroju lub na całym przekroju, stosując obrazowanie pojedyncze lub mozaikowe, a następnie sklejanie obrazów (Rycina 4E). W dalszej kolejności można pozyskać obrazy z wybranego obszaru przy użyciu parametrów wysokiej rozdzielczości. Przykładowo, taka statystycznie ulepszona metoda może być przydatna w analizie mitochondriów, jąder komórkowych i mikrokosmków (Rycina 4Ei-iii).

Analiza wielu małych, rzadko rozmieszczonych struktur w zakresie 500-1 000 nm (Film uzupełniający 1)
W tym scenariuszu obszar ROI nie może zostać łatwo zidentyfikowany podczas skanowania przeglądowego przy niskim powiększeniu, dlatego wymagane są obrazy o wysokiej rozdzielczości. W przypadku konwencjonalnych próbek TEM konieczne jest żmudne przybliżanie i oddalanie obrazu przekroju, aż do momentu znalezienia wymaganej cechy. Często obrazowanie kilku niezależnych lokalizacji w wielu próbkach jest bardziej istotne statystycznie niż generowanie pojedynczej, dużej objętości. W takich przypadkach złożoność ręcznej akwizycji rośnie wykładniczo. Choć kilka rozwiązań TEM umożliwia automatyczną akwizycję lub przesiewanie wielu siatek, rozmiar siatki i wyzwania związane z seryjnym cięciem często sprawiają, że podejście to jest niekompatybilne z wieloma próbkami. W podobnych przypadkach generujemy kompletną mapę o średniej rozdzielczości całego ROI w wielu przekrojach, przy rozdzielczości wystarczającej do zidentyfikowania struktur, które nas interesują. Podczas tego etapu przesiewania bocznego zaleca się pomijanie kilku przekrojów naraz, dążąc do trafienia w przynajmniej część interesującej nas struktury przy losowym podejściu. Będzie to w dużej mierze zależało od ogólnych wymiarów struktury: np. jeśli całkowity rozmiar struktury wynosi 500 nm, a przekroje mają grubość 50 nm, to co najmniej dziewięć kolejnych przekrojów w rzędzie prawdopodobnie będzie zawierać fragment interesującej nas struktury. W ten sposób pomijanie 6-7 przekrojów powinno być efektywne w wyszukiwaniu wielu różnych rodzajów struktur w wielu obszarach. Automatyczna akwizycja rozdzielczych map mozaikowych wybranych przekrojów umożliwia dokładne przesiewanie tych przekrojów po ich pozyskaniu. Po uzyskaniu takiej mapy o wysokiej rozdzielczości można wyciąć kilka ROI lub wykorzystać je do zdefiniowania dodatkowych lokalnych obszarów obrazowania w ramach ROI (Film uzupełniający 1). Aparat Golgiego, centriola, złącza, mikrotubule oraz różne rodzaje pęcherzyków są dobrymi przykładami struktur, w przypadku których ten scenariusz może być korzystny (Film uzupełniający 1).

Analiza rzadko rozproszonych dużych ROI w dużych próbkach (ryc. 4F-4H)
Scenariusz ten dotyczy rzadkich zdarzeń, często opisywanych jako „igła w stogu siana”, w których problemem nie jest identyfikacja ROI, lecz jego lokalizacja. W przypadku wielu próbek podejście korelacyjne nie jest właściwą opcją, mimo że ROI często posiada charakterystyczną ultrastrukturę i po zlokalizowaniu może zostać zidentyfikowane z wysoką niezawodnością. Dla takich próbek niezbędne jest zastosowanie akwizycji wielopoziomowej, rozpoczynając od wstępnego przesiewu próbek obejmującego od kilkudziesięciu do kilkuset przekrojów w średniej rozdzielczości. W użytkowanym tutaj oprogramowaniu istnieją dwie różne strategie uzyskiwania zestawów obrazów z wielu przekrojów: rejestrowanie obrazów podglądu (Preview) w wyższej rozdzielczości lub akwizycja zestawu kafli (Array Tile Set) z odpowiednimi ustawieniami (ryc. 4F). Różne wyspecjalizowane typy komórek w jelicie Drosophila są rozmieszczone losowo (np. komórki macierzyste, enteroendokrynne) i cięte w cienkich przekrojach o losowej orientacji. Można je jednak odróżnić wizualnie po analizie obrazów uzyskanych przy użyciu parametrów wysokiej rozdzielczości, pochodzących albo z pojedynczych przekrojów, albo z kolekcji obrazów seryjnych (ryc. 4G). Po wyrównaniu stosy obrazów mogą zostać przetworzone przy użyciu różnych rozwiązań programowych (ryc. 4H, Supplementary Movie 2).

Scenariusz 1: Organoidy jelitowe (Rysunek 5A)
Organoidy szybko stają się jednym z najnowocześniejszych narzędzi w dzisiejszych naukach o życiu. Ten niemal fizjologiczny 3D model organu pochodzący z komórek macierzystych umożliwia dokładne badanie szeregu procesów biologicznych in vivo, w tym odnowy tkanek, odpowiedzi na leki oraz medycyny regeneracyjnej. Niedawno wprowadzone mini-rurki jelitowe34 otwierają nową generację technologii organoidów, ściśle przypominającą fizjologię tkanki in vivo, skład typów komórek i homeostazę, co daje szerokie perspektywy w modelowaniu chorób, badaniu interakcji gospodarz-mikrob oraz odkrywaniu leków. Jednak w przypadku konieczności charakterystyki ultrastrukturalnej, lokalizacja różnych typów komórek w tak dużych tkankach przy użyciu próbek losowych może być trudna. Ponadto w zmiennych testach „zakażenia” kluczowe jest zapewnienie, aby analiza ujawniła różne stadia rozwojowe wpływające na tkankę. W takich badaniach centralne znaczenie ma statystycznie istotne pokrycie próbki, co jest jednak trudne do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnego podejścia TEM na siatce. Scenariusz AT 1 jest korzystny w takich przypadkach: na waflu można wygenerować wiele sekcji następujących po sobie (Rysunek 5Aii) i przeskanować je przy użyciu parametrów niskiej rozdzielczości w celu zlokalizowania ogólnych obszarów zainteresowania (Rysunek 5Aiii; strzałki). Obszary te mogą zostać wybrane do dalszej analizy przy użyciu zaawansowanych parametrów akwizycji (Rysunki 5Aiv i Rysunek 5Av). Po wykryciu odpowiedniej struktury (zazwyczaj grupy 5-10 sekcji raz na każde 100-300 sekcji) można łatwo skupić się na każdej z interesujących struktur i pozyskać pojedyncze obrazy ręcznie lub wykorzystać funkcje automatyzacji do pozyskiwania wolumenów obrazów z wielu sekcji.

Scenariusz 2: Drosophila notum poczwarki (Rysunek 5B)
Badanie podziałów komórkowych oraz mechanizmów kontrolujących progresję cyklu komórkowego jest kluczowe dla zrozumienia procesów standardowych i zaburzonych w organizmach wielokomórkowych. Istniejące informacje są często pochodne z systemów jednokomórkowych; jednak rozwiązaniu temu brakuje krytycznego kontekstu oddziaływań 3D między komórkami w tkance. Monowarstwa komórek notum, rozwijającego się grzbietu larwy Drosophila, stanowi idealny model oddziaływań między komórkami nabłonkowymi w ogóle, a w szczególności procesu podziału komórkowego35. Jest to uznany model do badań nad oddziaływaniami molekularnymi i komórkowymi, wykorzystujący kombinację danych z mikroskopii fluorescencyjnej i manipulacji genetycznych. Abscysja, ostatni etap podziału komórki, zapewnia ostateczne rozdzielenie dwóch dzielących się komórek, a charakterystyka zmian strukturalnych zachodzących podczas abscysji jest niezbędna dla naszego zrozumienia mitozy. Jednak podziały mitotyczne w notum nie są łatwe do zlokalizowania na poziomie ultrastrukturalnym: komórki są stosunkowo duże w porównaniu do strefy abscysji (Rysunek 5B). Stosunek ogólnej wielkości strefy abscysji do powierzchni przekroju do objęcia jest duży (Rysunek 5Bi). Chociaż lokalizacja strefy abscysji jest możliwa przy użyciu metod TEM lub SBF-SEM36, zadanie to jest pracochłonne. W tym scenariuszu automatyczne obrazy przeglądowe o średniej rozdzielczości, wykonywane co 20-40 przekrojów, mogą służyć do lokalizacji dzielących się komórek (Rysunek 5Bii). Po zidentyfikowaniu takich komórek, przekroje te służą jako punkt odniesienia do dokładniejszej analizy sekcji w sąsiedztwie, co pozwala na znalezienie i wybranie licznych dzielących się komórek do dalszych badań. W ten sposób strefa abscysji może zostać zlokalizowana i zobrazowana w całości (Rysunek 5Biii). W zależności od stawianego pytania badawczego, można zebrać pojedyncze obrazy o wysokiej rozdzielczości lub sekwencje od 3 do 7 obrazów, aby objąć głębokość struktury (Rysunek 5Biv).

Scenariusz 3: Neurony tanycytowe myszy (Rysunek 5C)
Mysz stanowi dobrze ugruntowany model rozwoju mózgu, który jest szczegółowo udokumentowany na różnych poziomach, w tym za pomocą EM. Mimo że różne zautomatyzowane metody seryjnego obrazowania powierzchni bloków (serial-block-face) są szeroko stosowane do badania tkanki mózgowej, istnieją przypadki, w których AT jest lepiej dostosowane do gromadzenia niezbędnych danych. Podwzgórze jest uznanym modelem neurobiologicznym, częścią mózgu zawierającą wiele typów neuronów i funkcji. Tanycyty podwzgórza stanowią szczególną podgrupę komórek ependymoglialnych wyścielających dno trzeciej komory, charakteryzujących się wyjątkowo długimi wypustkami (do 300 µm) i dużymi stopkami końcowymi (~5 µm)37. Czyni to je nieodpowiednimi do analizy za pomocą metod TEM lub FIB. Zadanie to jest dodatkowo utrudnione, gdy konieczna jest lokalizacja i analiza kilku niezależnych tanycytów. Jednym z podejść ułatwiających to zadanie może być celowanie półkorelatywne, w którym mapa fluorescencyjna jest uzyskiwana z próbek znakowanych fluorescencyjnie przed utrwaleniem i zatopieniem do EM. Sekcjonowanie jest wykonywane w obszarze wyznaczonym poprzez połączenie informacji pozycyjnych z próbki fluorescencyjnej i płaskiej repliki zatopionej w plastiku. Następnie można zastosować scenariusz 3 AT: generowane są mozaikowe obrazy o wysokim stopniu ogólności, aby ujawnić regiony z skupiskami stopek końcowych tanycytów. Następnie funkcje automatyzacji w oprogramowaniu są wykorzystywane do ustawienia akwizycji sekwencji obrazów z jednego lub kilku obszarów w trybie pojedynczego obrazu lub kafelkowania. Obrazy te mogą być analizowane oddzielnie, jako wyrównane stosy lub po ich renderowaniu.

Potencjał metody AT pozwala na stosunkowo łatwą „aktualizację” danych z 2D na 3D: mapy są dostępne już po wstępnej akwizycji, a wolumetry można uzyskać z wybranego obszaru oraz jego bezpośredniego sąsiedztwa. Powstały stos obrazów można wyrównać, a następnie poddać renderowaniu. Niezbędne jest wcześniejsze określenie, jaka rozdzielczość i jakość obrazu są wymagane do znalezienia ROI. Obrazowanie powinno umożliwiać rozpoznanie ROI, jednak nie powinno wykraczać poza tę wartość, ponieważ czas akwizycji skaluje się proporcjonalnie do czasu przebywania wiązki na pikselu oraz odwrotności kwadratu rozmiaru piksela.

Schemat segmentacji komórek 3D przedstawiający analizę danych wolumetrycznych przy różnych rozdzielczościach i objętościach.
Rysunek 1: Wyzwania związane z przygotowaniem próbek do EM i akwizycją wolumetryczną. (A) Utrata fluorescencji i kurczenie się następują wskutek wysokiego stężenia metali ciężkich oraz dehydratacji podczas przygotowania próbki. (i) Schematyczny rysunek preparatu obserwowanego pod LM (ii) ten sam preparat przygotowany do EM, który staje się całkowicie nieprzezroczysty i traci około 10% swojej objętości. (B) Osadzanie próbek w medium wykonuje się zazwyczaj przy użyciu żywic epoksydowych lub akrylowych. Tradycyjne bloczki (i) mogą być z powodzeniem stosowane dla próbek homogennych, które nie wymagają określonej orientacji. Bloczki płaskie (ii) są pomocne, gdy niezbędne jest precyzyjne namierzenie i zorientowanie pod mikroskopem konkretnego obszaru przeznaczonego do sekcjonowania, np. w próbkach niehomogennych lub w procedurach mikroskopii korelacyjnej. (C) Z całej objętości próbki tylko ograniczona część jest reprezentowana na pojedynczym przekroju o grubości 50 nm, co dostarcza obrazu 2D próbki 3D, często w nieznanej orientacji. (D) Aby zilustrować problem rejestrowania zbyt dużych objętości w przeciwieństwie do precyzyjnego namierzania, wybrano trzy koncentryczne sześciany o krawędziach 1000, 500 i 50 µm, tak aby objęły one hipotetyczną próbkę o wymiarach 1000 x 500 x 500 µm (ciemny bordowy). Jeśli takie hipotetyczne sześciany próbek zostaną dokładnie pocięte na plastry o grubości 50 nm, aby pokryć całą objętość, będzie to wymagało łącznie 20 000, 10 000 i 1 000 plastrów oraz odpowiednio 800 tb, 100 tb i 100 gb danych (rozdzielczość obrazowania 5 nm x 5 nm x 50 nm, dane 8-bitowe). Pokazuje to znaczenie planowania akwizycji danych EM w celu pozyskania jedynie minimalnej niezbędnej objętości. (E) Pokrycie dużej powierzchni próbki w wysokiej rozdzielczości stanowi problem podobny do problemu dużej objętości. Pomocnym rozwiązaniem w takim przypadku jest łączenie (tiling) kilku obrazów o wysokiej rozdzielczości w jeden. Jednakże pokrycie powierzchni 1 mm x 1 mm przy użyciu klatki 2024 x 1048 w powiększeniu 10 000x będzie wymagało ogromnej liczby kafelków, co może utrudnić ich późniejszą kompozycję (stitching). Ponadto, jeśli przekroje zostaną w różny sposób ściśnięte lub zniekształcone podczas cięcia, powstałe stosy danych stają się niemal niemożliwe do wyrównania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Proces chromatografii cienkowarstwowej; schemat; zestaw obejmuje komorę rozwijającą, płytkę z próbką i rozpuszczalnik.
Rycina 2: Schemat bezpośredniego generowania macierzy przekrojów na dużym podłożu. (A) W celu precyzyjnego przycinania za pomocą narzędzia do przycinania, bloczki są mocowane w uchwycie mikrotomu. Ten krok pomaga zapewnić równoległość boków bloczka i zmniejsza ilość wolnej żywicy wokół próbki. (B) Zmodyfikowany nóż do pozyskiwania przekrojów AT. Duża łódka ułatwia przenoszenie przekrojów i ich manipulację podczas krojenia próbki i przenoszenia na podłoże. Duża wanna umożliwia manipulację przekrojami; system odpływowy ogranicza ruchy wstążek podczas etapu osuszania, a płaskie dno zapewnia niezawodne, stopniowe schnięcie podłoża. (C) Nóż przygotowany do krojenia z waflem poddanym wyładowaniu Glow Discharge umieszczonym na dnie wanny i wodą wypoziomowaną do krawędzi. Konstrukcja noża sprawia, że igła pozostaje zatopiona, nie kolidując z podłożem. (D) Generowanie macierzy, widok z góry na obszar krojenia mikrotomu. (i) Pierwsze przekroje są zazwyczaj łatwe do uzyskania, ponieważ przylegają do siebie i tworzą regularną wstążkę. (ii) Gdy do wstążki dodawanych jest więcej przekrojów i staje się ona dłuższa, traci ona stabilność i często się wygina. Kluczowe jest utrzymanie zorganizowanej sekwencji ścieżek w przygotowaniu do etapu akwizycji obrazów. (iii) Gdy wstążka przekrojów osiągnie pożądaną długość, jest ona ostrożnie oddzielana od krawędzi noża za pomocą pęsety do rzęs. (iv) Woda jest odprowadzana z wanny; wafelek pozostaje wewnątrz, dopóki całkowicie nie wyschnie na powietrzu. Ten krok jest niezbędny, ponieważ pomaga wyprostować przekroje i zapobiega powstawaniu mikroskładek. Wafelek jest umieszczany w piecu w temperaturze 60°C przez co najmniej 30 min, aby przytwierdzić przekroje do podłoża. (E) Przykładowe wafle z przeniesionymi przekrojami. Chociaż wygodnie jest uzyskać proste i dokładne wstążki, rzeczywiste próbki w większości przypadków uniemożliwiają utworzenie tak idealnych wstążek. Niemniej jednak, nawet „niestarannie” ułożone wstążki są bardzo informacyjne w ogromnej liczbie przypadków, a znaczenie „estetycznej” wstążki zależy od strategii badawczej, dla której zbierane są przekroje. Pasek skali 1 cm. (F) Przykładowe siatki z otworami (slot grids) z przekrojami seryjnymi. Nawet gdy na jednej siatce zbieranych jest wiele przekrojów, jest to wciąż niewielka część tego, co można zmieścić na pojedynczym waflu. Umiejętność opanowania przenoszenia przekrojów na siatkę (w szczególności na slot grid) stanowiła znaczną przeszkodę w opanowaniu przygotowania próbek do mikroskopii elektronowej. Pasek skali 500 µm. (G) Niezależnie od zastosowanej metody zbierania przekrojów, zaletą podejścia AT jest względna łatwość generowania przekrojów sekwencyjnych w porównaniu do zbierania ich bezpośrednio na siatce. Przyjmując bloczek próbki o wymiarach 1000 µm x 500 µm, nie ma problemu z rozmieszczeniem około 100 przekrojów na waflu 2 cm x 4 cm (i). Przekroje tej samej wielkości na slot grid zmieszczą maksymalnie tylko trzy przekroje/siatka (ii). Przedstawiamy obraz w skali, aby pokazać, ile siatek mogłoby być wymaganych do pokrycia tej samej liczby przekrojów, nie wspominając o trudności zbierania przekrojów seryjnych na siatce. Pasek skali = 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu obrazowania mikroskopowego z etapami: wyszukiwanie przekroju, podgląd, doprecyzowanie, wyrównanie, renderowanie.
Rycina 3: Kluczowe etapy procedury tomografii tablicowej (Array Tomography). Schemat procedury bezobsługowego pozyskiwania stosów obrazów o wysokiej rozdzielczości. Wszystkie etapy przygotowawcze są zautomatyzowane (zielone symbole kół zębatych) i nie wymagają żadnych działań wykonywanych ręcznie dla każdego przekroju z osobna. Stosy obrazów można wyrównać w dowolnym oprogramowaniu do analizy obrazu umożliwiającym automatyczne wyrównanie sztywne (rigid) lub afiniczne (affine). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie mikroskopowe neuroanatomii; przekrój poprzeczny TEM i schemat trójwymiarowej rekonstrukcji wolumetrycznej.
Rycina 4: Trzy scenariusze akwizycji z Muszka owocówka jelito dorosłego osobnika jako model demonstracyjny. (A) rysunek preparatu po sekcji Muszka owocówka jelito środkowe z trzema głównymi regionami oznaczonymi różnymi kolorami: przednim, środkowym i tylnym. (BPrzycięty płaski blok, w którym jelito jest zorientowane do przekrojów poprzecznych. Należy zwrócić uwagę, że ilość wolnej żywicy jest starannie zrównoważona wokół tkanki zawierającej obszar zainteresowania (biały prostokąt).CPoprzeczne przekroje seryjne unoszą się na powierzchni wody w zbiorniku noża AT. Wszystkie obrazy zostały pozyskane w trybie SEM z detekcją elektronów wtórnych przy użyciu detektora lustrzanego z odwróconym kontrastem.DZłożony obraz mozaikowy seryjnych przekrojów poprzecznych na płytce. Pasek skali wynosi 1000 µm. (E) Przekrój poprzeczny przez Muszka owocówka jelito. Pasek skali 20 µmObraz stanowi mozaikę złożoną z 7 x 7 obrazów o średnim powiększeniu. Wstawki – obrazy konkretnych obszarów zainteresowania o większym powiększeniu i rozdzielczości: (ii) jądro komórkowe, (iii) rąbek szczoteczkowy oraz (i) mitochondria. Pasek skali 5 µm dla wszystkich. (F) Zdjęcie w średnim powiększeniu przekroju poprzecznego jelita, wskazujące lokalizację rozwijających się komórek (kwadrat). Pasek skali wynosi 20 µm. (G) Ukierunkowany zestaw seryjnych przekrojów pobranych na podstawie obszaru zlokalizowanego podczas analizy przekroju przedstawionego na panelu F. Pasek skali wynosi 10 µm. (HModel 3D został wyrenderowany na podstawie stosu 50 sekcji uzyskanych w drodze ukierunkowanej akwizycji seryjnej przedstawionej w panelu G. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schematy organoidów jelitowych i notum Drosophila; mikroskopowa analiza struktury komórkowej.
Rysunek 5: Studia przypadków dla scenariuszy zastosowania AT. (A) Lokalizacja różnych struktur komórkowych w organoidzie jelitowym. (i) Osadzony krzemowy mikrochip. Pasek skali = 200 µm. (ii) Mozaikowy obraz złożony z 127 przekrojów poprzecznych przez centralną część chipa. Pasek skali = 1500 µm (iii) Cztery obrazy o niskiej rozdzielczości kompletnego przekroju poprzecznego przez fragment organoidu jelitowego. Strzałki wskazują potencjalne miejsce zainteresowania. Pasek skali wynosi 20 µm. (iv) Różne ROI, ukierunkowane na mikrofotografie o niskiej rozdzielczości wybrane do dalszej analizy. Pasek skali = 10 µm. (v) Obraz o wysokiej rozdzielczości zainfekowanej komórki zainteresowania. Analiza tego samego obszaru w sąsiednich przekrojach może dostarczyć ukierunkowanych informacji 3D, jeśli jest to wymagane. Pasek skali = 5 µm. (B) Lokalizacja midbody w notum poczwarki Drosophila melanogaster. (i) Schematyczny widok rozsectowanej poczwarki Drosophila. Notum odsłonięte do sekcji (beżowy) po usunięciu części ochronnej kutykuli (brązowa). Czarna linia wyznacza kierunek cięcia (ii) Przekrój poprzeczny przez obszar przedstawiony na schemacie. Obraz łączy 3x7 sekwencyjnie wykonanych obrazów SEM o wysokiej rozdzielczości, złożonych w jeden panel mozaikowy. Czarny prostokąt wyznacza obszar zawierający dzielącą się komórkę. Pasek skali wynosi 15 µm. (iii) Powiększony obraz dzielącej się komórki z panelu ii. Przy tym powiększeniu i rozdzielczości widoczne jest midbody (białe strzałki). Cały przekrój jest analizowany w celu znalezienia dzielących się komórek. Przeskakiwanie między różnymi pasmami przekrojów w odstępach 20-30 przekrojów podczas etapu przesiewania bocznego pozwala zlokalizować liczne pary dzielących się komórek. Pasek skali wynosi 5 µm (iv) po zlokalizowaniu dzielącej się komórki, sekwencyjne obrazy midbody zebrane z czterech przekrojów wokół midbody wyznaczonego żółtym kwadratem w panelu (iii). Pasek skali wynosi 1 µm. (C) Lokalizacja stopek tanycytów w podwzgórzu myszy. (i) Obraz fluorescencyjny skrawka z wibrotomu. Tanycyty wykazują ekspresję białka fluorescencyjnego tdTomato (czerwony). Biały prostokąt wyznacza obszar zainteresowania. Pasek skali 500 µm. (ii) Ten sam przekrój z wibrotomu przygotowany do EM zostanie starannie przycięty wokół obszaru zainteresowania w oparciu o pośrednią korelację informacji fluorescencyjnych z panelu (i). Biała przerywana linia reprezentuje obszar cięcia ultracienkiego. Pasek skali wynosi 50 µm dla obu paneli. (iii) Przekrój poprzeczny przez skrawek z wibrotomu w obszarze zainteresowania. Mozaikowy obraz SEM składa się z 75 złożonych obrazów. Kilka przekrojów jest celowanych poprzez przesiewanie boczne i obrazowanych z podobnymi parametrami. Przekroje są analizowane „offline” w celu znalezienia ROI – stopek tanycytów. Czarny prostokąt reprezentuje obszar zawierający stopki tanycytów. Ten przekrój będzie służył jako punkt zakotwiczenia dla dalszej analizy. Pasek skali wynosi 15 µm. (iv) Obraz o wysokiej rozdzielczości i dużym powiększeniu stopek tanycytów otaczających naczynie krwionośne. Po wstępnej lokalizacji ROI na jednym przekroju, sekwencja z jest zbierana z sąsiednich przekrojów powyżej przekroju zakotwiczającego (panel iii). Pasek skali 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia elektronowa przekrojów biologicznych; odrywanie żywicy, ultrastruktura, szczegóły komórkowe, powiększenia.
Rycina 6: Problemy podczas ultramikrotomii, zbierania i przechowywania przekrojów mogą prowadzić do powstania artefaktów. (A) Przekroje próbki mózgu na szkiełku. Większość pustej żywicy oddzieliła się od tkanki i złożyła (sepia). Czarna przerywana ramka wyznacza obszar służący do objęcia całego przekroju. Pasek skali 500 µm. (B) A małe, lokalne zagięcie na powierzchni przekroju ryby zebrafish o grubości 50 nm. Pasek skali 1 µm. (C) Ślad noża na powierzchni przekroju mózgu myszy o grubości 70 nm. Pasek skali 5 µm. (D) Włos (gwiazdka) na powierzchni szkiełka, który częściowo zakrywa przekrój mięśnia zebrafish. Na żółto zaznaczono tkankę przeznaczoną do analizy. Na różowo komórkę służącą jako odniesienie dla wielkości dotkniętego obszaru. Pasek skali 50 µm. (E) Cioteczka ryby zebrafish z pomarszczeniami w dolnym prawym rogu (czarne strzałki), gdzie gęsta tkanka nerwowa (zacieniona na niebiesko) graniczy z miększą tkanką mięśniową i pustą żywicą (czarne strzałki). Pasek skali 10 µm. (F) Segmentacja wolumetryczna stosu 50 obrazów, analogicznie jak w E, wykazująca, że w większości przekrojów w tym regionie wystąpiły pomarszczenia. Przerywany wielokąt obrysowuje obszar pokazany na G. Pasek skali 10 µm. (G) Widok XY tej samej segmentacji wolumetrycznej co w F, pokazujący pomarszczenia jako krótkie czarne kreski w prawej połowie bloku. Należy zauważyć, że wyrównanie stosu w pozostałych częściach tkanki nie jest zaburzone przez pomarszczenia. Pasek skali 5 µm. (H) Projekcja XZ tego samego obszaru co w G, pokazująca pomarszczenia we wszystkich 50 przekrojach. Pasek skali 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Film uzupełniający 1: Wysokorozdzielczy montaż obrazu przekroju przez Drosophila przedni odcinek jelita środkowego. Obraz mozaikowy odwróconego zdjęcia SEM SE-MD. 352 oddzielne kafelki obrazu zostały automatycznie pozyskane w rozdzielczości 5 nm i zszyte, aby przedstawić cały przekrój. Korzystając z tego samego obrazu, można przybliżyć widok, aby dostrzec więcej szczegółów i uzyskać wyczerpujący zakres danych. Po przybliżeniu widoczne są połączenia ścisłe, mikrotubule oraz różne rodzaje pęcherzyków. Pasek skali wynosi 10 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: Muszka owocówka wizualizacja komórek jelitowych Pięćdziesiąt wyrównanych obrazów mozaikowych przekrojów w obszarze dzielących się komórek jelitowych. Rendering IMOD granic komórek (niebieski, turkusowy i pomarańczowy) oraz jąder komórkowych (biały). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Materiały uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Mikroskopia elektronowa daje wgląd w ultrastrukturę komórek i organizmów, dla których często pożądane jest obrazowanie interesujących struktur w ich trójwymiarowym kontekście. Pomimo licznych taktyk EM do analizy ultrastrukturalnej, nadal nie ma rozwiązania "złotego standardu". Głównym powodem jest duża różnorodność próbek, wiele kwestii biologicznych, które często wymagają indywidualnego podejścia. Proponowany przepływ pracy AT został zaprojektowany tak, aby zminimalizować czas niezbędny do przetwarzania, pozyskiwania, oceny i przechowywania próbek. Co więcej, zmodyfikowany nóż stanowi pomocne narzędzie upraszczające akwizycję tablicy. Kompaktowy układ sekcji na płytkach jest wygodny, zarówno do obserwacji, jak i późniejszego przechowywania próbek. Taki układ umożliwia "boczne przesiewanie" próbek poprzez poziome przesuwanie się od taśmy do taśmy i skanowanie tylko jednej sekcji na każdej z nich, co znacznie skraca czas potrzebny na zlokalizowanie zwrotu z inwestycji. Proponowane scenariusze pozyskiwania danych ułatwiają ukierunkowanie na małe i losowo rozmieszczone obszary. Po znalezieniu, AT/SEM ogranicza obrazowanie w wysokiej rozdzielczości precyzyjnie do interesującej go wielkości, niezależnie od tego, czy jest wykonywane ręcznie, czy za pomocą funkcji automatycznej. AT dla ograniczonych objętości można wykonać ręcznie, a operator porusza się po próbce i definiuje obszary obrazowania jeden po drugim. Zautomatyzowany moduł oprogramowania zapewnia elastyczną strategię akwizycji obrazu do obrazowania małych obszarów na dużych odcinkach. Automatyzacja w tym oprogramowaniu pozwala na nagrywanie dużych obrazów o wysokiej rozdzielczości na setkach sekcji, osiągając podobne objętości jak SBFI. Rejestrowanie obrazów przeglądowych wszystkich przekrojów upraszcza lokalizację zwrotu z inwestycji i skraca czas spędzony przy mikroskopie. Ponieważ sekcje nie są uszkadzane podczas nagrywania przeglądów i podglądów o wyższej rozdzielczości, AT/SEM zezwala na ponowne wykorzystanie próbki do zbierania dalszych danych o innych ROI lub w wyższej rozdzielczości.

Czas akwizycji obrazu jest jednym z najważniejszych (i najdroższych) aspektów 3D EM i dlatego powinien być brany pod uwagę w projekcie eksperymentu. Chociaż nie jest zaskakujące, że obrazowanie dużych obszarów trwa dłużej niż obrazowanie małych obszarów, łatwo jest nie docenić wpływu: w zależności od wybranych parametrów obrazowania, czas akwizycji na każdej sekcji może wahać się od sekund do godzin. Krytyczne parametry obrazowania obejmują rozmiar pola widzenia, rozdzielczość i czas przebywania. Zakładając docelową rozdzielczość 10 nm na piksel i czas przebywania 1 μs, obrazowanie pola o wymiarach 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm lub 500 μm x500 μm zajmuje 4 sekundy, 100 sekund lub 2,500 s. Możemy pomnożyć te czasy obrazowania dla każdego odcinka przez liczbę sekcji, aby oszacować czas potrzebny na pełne zadanie obrazowania. Długie czasy obrazowania dla każdej sekcji mogą być akceptowalne, jeśli liczba sekcji jest mała lub jeśli czas pracy mikroskopu nie ma znaczenia.

Jednak w większości przypadków konieczne jest ograniczenie czasu nagrywania do pracy w nocy lub w weekendy. Równie krytycznym aspektem 3D EM, który należy wziąć pod uwagę, jest ilość i struktura wynikowych danych obrazu. Zapis w/w pól obrazowania w 100 sekcjach generuje odpowiednio 400 mb, 10 gb lub 250 gb danych obrazu; Obrazy o wymiarach 500 μm x 500 μm stanowią dodatkowy problem polegający na tym, że każdy z nich jest większy niż 2 GB. Wiele programów używanych do oceny danych nie może otwierać obrazów o takim rozmiarze.

Aby skrócić czas obrazowania, ważne jest, aby wybrać czas przebywania pikseli, aby spełnić wymagania dotyczące stosunku sygnału do szumu dla późniejszej oceny danych (np. rekonstrukcji, śledzenia) i ograniczyć nagrania do zdefiniowanych ROI. Rozszerzenie AT oprogramowania ułatwia akwizycję obrazu w małych obszarach w odcinkach szeregowych. Oprogramowanie obsługuje ręczne i automatyczne przepływy pracy oraz wiele wariantów półautomatycznych: obszary obrazowania mogą być ręcznie pozycjonowane i skupiane na każdej sekcji lub użytkownik może korzystać z funkcji automatycznego wyszukiwania sekcji i wyrównywania pozycji. W zależności od wybranego i wspieranego przez typ próbki poziom automatyzacji lub cele obrazowania, czas potrzebny na skonfigurowanie akwizycji obrazu w setkach sekcji może zająć cały dzień roboczy (wykonywany ręcznie) lub tylko kilka minut. Zasadniczo tomografia matrycowa sprawia, że uzyskanie małych zwrotów z inwestycji jest trudniejsze niż inne metody 3D EM; Nieprecyzyjne rozmieszczenie regionów na kolejnych odcinkach musi być kompensowane poprzez pozyskiwanie większych obszarów. Na przykład, jeśli ROI ma rozmiar 20 μm x 20 μm, a zmienność położenia pól obrazowania między sekcjami wynosi 10 μm, należy uzyskać obrazy 40 μm x 40 μm, aby mieć pewność, że ROI jest w pełni uchwycony na każdym obrazie, na każdym przekroju. Rzeczywista zmienność pozycji obrazu waha się od 100 μm do <10 μm, w zależności od dostępności lub jakości funkcji oprogramowania do wyrównywania pozycji lub cierpliwości użytkownika. Dzięki temu oprogramowaniu można osiągnąć 10 μm bez zbytniej ręcznej interwencji w większości próbek.

Jak każda technika, AT ma kilka słabych punktów, które mogą wpływać na pomyślne pozyskiwanie danych, a wiele z nich jest podobnych do innych metod opartych na sekcjach. Brak jednorodnego rozkładu pustej żywicy w stosunku do tkanki może skutkować zakrzywionymi lub uszkodzonymi układami. W skrajnych przypadkach sekcje mogą odczepić się od podpory (Rysunek 6A). Zmienna kompresja lub rozciąganie podczas procesu cięcia może powodować powstawanie fałd, które mogą zakłócać próbkę w zmiennych obszarach na kolejnych odcinkach (rysunek 6B). Na powierzchni pobranych skrawków mogą pojawić się ślady noża po użyciu uszkodzonego noża (Rysunek 6C). Różnice w warunkach przekroju mogą powodować sporadyczne różnice w ściskaniu i grubości przekroju. Cząsteczki kurzu lub brudu mogą wylądować na sekcji i częściowo zasłaniać obszar zainteresowania (rysunek 6D). Akwizycja obrazu może się nie powieść z powodu niedoskonałych funkcji automatycznego kontrastu, automatycznego ustawiania ostrości i autostygmatora. Położenie automatycznie utworzonych obszarów obrazowania może być zmienne i może nie uchwycić zwrotu z inwestycji we wszystkich sekcjach.

Na etapie szycia i wyrównywania może pojawić się kilka problemów. Automatyczne zszywanie płytek mozaikowych może się nie powieść, na przykład z powodu dużej pustej przestrzeni wewnątrz próbki. Ze względu na drastyczną zmianę kształtu w 3D rejestrowanie stosów obrazów może być trudne. Specjalnie opracowane programy (np. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB lub MAPS-AT) mogą ułatwić półautomatyczne wyrównywanie 32,38,39,40. Trudniejsze sekcje można ręcznie wyrównać za pomocą oprogramowania do edycji zdjęć. Niestety, niektóre zestawy danych mogą być niemożliwe do prawidłowego wyrównania.

Duże próbki stanowią wyzwanie dla sekcji szeregowych TEM pasujących do siatek; z drugiej strony, wiele projektów nie uzasadnia długiego automatycznego pozyskiwania za pomocą FIB/SEM lub SBF-SEM. AT jest prostą alternatywą dla żmudnego TEM sekcji szeregowej, w którym zbieranie i manipulowanie sekcjami szeregowymi na płytce jest prostsze niż w przypadku siatek szczelinowych. Opracowano kilka strategii, aby ułatwić zbieranie tablic, a my udostępniamy naszą metodę rozszerzania istniejącego zestawu narzędzi. W przypadkach, w których identyfikacja zwrotu z inwestycji jest trudna, AT-SEM zapewnia fundamentalną przewagę, dzięki skutecznemu badaniu przesiewowemu próbek, w których wymagana jest rozdzielczość w skali organelli w 50 do 500 sekcjach. W przypadku większych ilości strategie automatycznego odbioru AT mogą być efektywnie zbierane, jeśli wymagane jest więcej sekcji. Próbki AT mogą być wielokrotnie obrazowane, co ułatwia celowe obrazowanie obszarów o wysokiej rozdzielczości na podstawie wcześniej uzyskanych obrazów przeglądowych. Uważamy, że proponowana tutaj ukierunkowana analiza i zmniejszone nadpróbkowanie przez AT/SEM zmniejsza wymagania dotyczące pracy i przechowywania danych. Ostatecznie biblioteki sekcji mogą być gromadzone i utrzymywane w celu późniejszego ponownego wykorzystania i konsultacji. W przypadku pozyskiwania objętości podejścia FIB lub SBF-SEM stanowią doskonałe rozwiązanie, gdy zwrot z inwestycji jest łatwy do zidentyfikowania na powierzchni bloku lub gdy do analizy potrzebne są duże objętości 3D. Jednak FIB/SBF-SEM są mniej wydajne, gdy obraz stosu o wysokiej rozdzielczości musi być zbierany ze zdefiniowanego zwrotu z inwestycji w ukierunkowany sposób. Podsumowując, zaproponowane metody badań przesiewowych próbek AT oraz wykorzystanie obrazów przeglądowych o średniej rozdzielczości pozwalają na ograniczenie akwizycji obrazu do odpowiednich części matrycy sekcji. Precyzyjne celowanie w obszary obrazowania skraca czas uzyskiwania danych i upraszcza ich analizę.

Podsumowując, chociaż koncepcja AT/SEM nie jest nowa, jej zastosowanie nadal nie jest tak powszechne, jak sugerowałyby jej zalety. Ogólnie rzecz biorąc, stanowi ona procedurę uzupełniającą w stosunku do innych istniejących metod EM. AT/SEM jest kompatybilny z najszerszym zakresem protokołów przygotowania próbek i procesów obrazowania i może być wykonywany na dowolnym mikroskopie FIB/SEM lub SBF-SEM jako technika towarzysząca. W tym artykule skoncentrowaliśmy się na AT do rejestrowania danych ultrastrukturalnych z próbek, które mają mniejsze szanse na pomyślne rozwiązanie za pomocą innych metod. Mamy nadzieję, że opisana procedura wygodnego zbierania sekcji i znacznie zautomatyzowanych strategii pozyskiwania pomoże w pierwszych próbach tym, którzy nigdy nie zetknęli się z tą metodą i pomoże ją udoskonalić tym, którzy mają już pewne doświadczenie.

Oświadczenia

Autor, Tilman Franke, jest pracownikiem firmy Thermo Fisher, która produkuje mikroskopy elektronowe i programy pilotażowe, które są wykorzystywane w artykule.

Podziękowania

Chcemy podziękować członkom placówki EM Uniwersytetu w Lozannie za ich wsparcie podczas opracowywania różnych etapów procedury AT. Serdecznie dziękujemy Garethowi Griffithsowi, Marcie Rodrigues, Ursce Repnik, Christel Genoud, Helmutowi Gnaegi, Einat Zelinger, Paoli Moreno-Roman, Lucy O'Brien i Lindsay Lewellyn za dyskusje podczas przygotowywania rękopisu i krytyczną lekturę. Chcemy podziękować grupom, które dostarczyły próbki użyte do zademonstrowania różnych scenariuszy: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat i Fanny Langlet.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cutting
AT nóż do cięciaDiatomeDUATS3530Diatome Nóż Jumbo
Diamentowy nóż do przycinania 90°DiatomeDTB90Przycinanie diatomu 20°
Nóż do szkła
Klej kontaktowy PattexPattexPCL3C
Wafel silikonowyTed Pella16015Rezystancja: 1-30 Ohm
Typ P: (bor) (1 pierwotny płaski)
Chropowatość: 2 nm
Brak powłoki wierzchniej SiO2
TTV: = < 20 &mikro; m
Wafel jest jednostronnie polerowany
UltramikrotomLeica UC6Alternatywa: Leica UC7
Zestaw do cięcia płytek półprzewodnikowychEMS7642- EMF - Tasak do małych próbek, nr kat. 7652
Akwizycja obrazu
FESEMThermo Fischer Helios1072419Alternatywy: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Mapy 3 dla SEM z korelacyjnym przepływem pracy & Tomografia macierzowaThermo Fisher Scientific1135932Maps zapewnia automatyzację procesów obrazowania SEM i umożliwia importowanie danych innych firm dla CLEM i nawigacji.
Image analysis
Amira x.yThermo Fisher Scientific1131599Amira to oprogramowanie do wizualizacji i analizy danych 3D z kilkoma praktycznymi funkcjami do rekonstrukcji danych tomografii matrycowej.
Przetwarzanie obrazuOpen sourceFiji (http://fiji.sc/#download)IMOD, MIB (Zobacz tekst, aby uzyskać referencje)
-

Bibliografia

  1. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  3. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  4. Mulcahy, B., et al. A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system. Frontiers in Neural Circuits. 12, 94(2018).
  5. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  6. Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. Electron tomography of molecules and cells. Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).
  7. Hoog, J. L., et al. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  8. Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography. Cells. 8 (1), 57(2019).
  9. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  10. Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), 35172(2012).
  11. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 8, 68(2014).
  12. Kubota, Y., et al. A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Nature Communication. 9 (1), 437(2018).
  13. Wacker, I. U., et al. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Journal of Visualized Experiments. (133), e57059(2018).
  14. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  15. Templier, T. MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. Elife. 8, 45696(2019).
  16. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  17. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  18. Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).
  19. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  20. Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. FIB-SEM tomography in biology. Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).
  21. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 25916(2017).
  22. Hayworth, K. J., et al. Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution. Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).
  23. Maco, B., et al. Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons. PLoS One. 8 (2), 57405(2013).
  24. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  25. Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  26. Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).
  27. Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
  28. Markert, S. M., et al. 3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species. Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).
  29. Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms. Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).
  30. Kolotuev, I. Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production. Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).
  31. Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118(2021).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
  34. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  35. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  36. Daniel, E., et al. Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues. Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).
  37. Pasquettaz, R., et al. Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma. Journal of Comparative Neurology. , (2020).
  38. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  39. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011(2012).
  40. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Seryjne ci cieakwizycja obj to ciowaobrazowanie celowaneprzygotowanie waflawst ga skrawk wobrazowanie o wysokiej rozdzielczo cilokalizator skrawk wakwizycja mozaikowa
Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.