Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Summary

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Abstract

Mikroskopia elektronowa jest stosowana w biologii i medycynie do obrazowania szczegółów komórkowych i strukturalnych w rozdzielczości nanometrów. Historycznie rzecz biorąc, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) zapewniała wgląd w ultrastrukturę komórek, ale w ostatniej dekadzie rozwój nowoczesnych skaningowych mikroskopów elektronowych (SEM) zmienił sposób patrzenia do wnętrza komórek. Mimo że rozdzielczość TEM jest lepsza, gdy potrzebne są szczegóły strukturalne na poziomie białka, rozdzielczość SEM jest wystarczająca dla większości pytań związanych z biologią komórki na poziomie organelli. Postęp technologiczny umożliwił automatyczne pozyskiwanie rozwiązań, takich jak obrazowanie szeregowe blokowe (SBF-SEM) i skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM). Niemniej jednak do dziś metody te pozostają nieskuteczne, gdy kluczowa jest identyfikacja i nawigacja do obszarów zainteresowania. Bez środków do precyzyjnej lokalizacji obszarów docelowych przed obrazowaniem, operatorzy muszą pozyskiwać znacznie więcej danych niż potrzebują (w SBF-SEM), lub, co gorsza, przygotowywać wiele siatek i obrazować je wszystkie (w TEM). Proponujemy strategię "bocznego badania przesiewowego" z wykorzystaniem tomografii matrycowej w SEM, która ułatwia lokalizację obszarów zainteresowania, a następnie zautomatyzowane obrazowanie odpowiedniej frakcji całkowitej objętości próbki. Próbki tomografii matrycowej są konserwowane podczas obrazowania i można je układać w biblioteki sekcji gotowe do wielokrotnego obrazowania. Przedstawiono kilka przykładów, w których przesiewanie boczne umożliwia nam analizę szczegółów strukturalnych, do których dostęp jest niezwykle trudny przy użyciu jakiejkolwiek innej metody.

Introduction

Pomimo znaczenia technik związanych z EM, wysiłek wymagany do ich opanowania sprawia, że cała dziedzina jest ograniczona do niewielkiej liczby specjalistów. Jedną z istotnych trudności jest identyfikacja i odnalezienie obszaru zainteresowania (ROI) w próbkach zachowanych dla EM. Wygląd tej samej próbki znacznie się różni, gdy jest analizowany za pomocą mikroskopii optycznej i po przetworzeniu do obserwacji EM. Zmiany dla próbek przygotowanych chemicznie obejmują kurczenie się próbki anizotropowej po etapach odwadniania (~10% w każdym wymiarze) oraz utratę fluorescencji przy użyciu osmu w protokole utrwalania i barwienia (Rysunek 1A). W przypadku ultracienkiego przekroju próbki są zatapiane w żywicach epoksydowych lub akrylowych przy użyciu różnych strategii (Rysunek 1B). Aby uzyskać pomyślne wyniki tego przygotowania, cała próbka musi zostać pofrakcjonowana na kawałki, które nie przekraczają 1 mm x 1 mm. Aby spełnić wymagania standardowych warunków obserwacji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), ta niewielka część próbki jest dalej cięta na warstwy o grubości 50-150 nm. Uzyskane obrazy w skali szarości pokazują organizację tkanek i strukturę organelli niewielkiej części całej próbki z większą szczegółowością niż jakakolwiek inna technika mikroskopowa (Rysunek 1C). Typowy zestaw danych TEM dostarcza informacji 2D, teoretycznie ekstrapolowanych w celu zrozumienia procesów naturalnie zachodzących w przestrzeni 3D w komórkach i tkankach. Rysunek 1D przedstawia wyzwanie związane z pozyskiwaniem objętości ultrastrukturalnych: jeśli sześcian o boku 1000 μm jest podzielony na grubość 50 nm, potrzeba będzie 20 000 sekcji, aby pokryć całą objętość; W przypadku sześcianu bocznego o grubości 500 μm będzie to 10 000 sekcji. Aby pokryć objętość 50 μm x 50 μm x 50 μm, może być konieczne 1000 sekcji "tylko". Ręczne uzyskanie tej objętości jest praktycznie niemożliwe i niezwykle trudne do wykonania za pomocą automatyzacji. Jeżeli, oprócz głębokości próbki, musimy pokryć całą powierzchnię takich hipotetycznych sześcianów, pokrycie powierzchni 1^μm2 w rozsądnej rozdzielczości staje się poważnym problemem logistycznym (Rysunek 1E). Podczas gdy w przypadku nadzwyczajnych projektów na dużą skalę, takich jak podejścia konektomiczne, duża liczba sekcji jest kluczowa, dla większości "przyziemnych" projektów EM generowanie większej liczby sekcji wymaganych do obserwacji stanowi istotną wadę.

Istnieje kilka metod pozyskiwania informacji ultrastrukturalnych 3D: transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), tomografia TEM, tomografia matrycowa (AT), skaningowa mikroskopia elektronowa z blokiem szeregowym (SBF-SEM) oraz skaningowa mikroskopia elektronowa z ogniskowaną wiązką jonów (FIB-SEM). Główne różnice między tymi metodami to strategia podziału na sekcje oraz to, czy akwizycja obrazu jest sprzężona z generowaniem sekcji¹. W przypadku TEM z podziałem szeregowym sekwencyjne sekcje są zbierane na siatkach szczelin, obrazy TEM są generowane z tych sekwencji i aligned^2,3,4,5. W tomografii TEM serie pochyleń od 150-300 nm na siatce, a w połączeniu z sekcjami szeregowymi, zapewniają bardzo wysoką rozdzielczość, choć stosunkowo małe objętości^6,7,8. Podejście AT wykorzystuje fizyczne cięcie z różnymi ręcznymi i półautomatycznymi sposobami zbierania przekrojów na stosunkowo dużym podłożu, takim jak szklane szkiełko nakrywkowe, płytki silikonowe lub specjalna taśma. W przypadku akwizycji obrazu wsparcie jest analizowane w SEM, z dostępnymi różnymi strategiami pozyskiwania obrazów^{9,10,11,12,13,14,15} . W przypadku SBF-SEM fizyczne cięcie odbywa się za pomocą mini-mikrotomu z diamentowym nożem umieszczonym bezpośrednio w komorze SEM, z obrazem SEM generowanym z powierzchni bloku żywicy^16,17,18,19. W przypadku FIB-SEM źródło jonów usuwa cienkie warstwy próbki, a następnie następuje automatyczne obrazowanie odsłoniętej powierzchni za pomocą SEM^20,21. Tomografia TEM i AT generują fizyczne przekroje, które w razie potrzeby można ponownie zobrazować, podczas gdy FSBF-SEM i FIB-SEM eliminują przekrój po obrazowaniu. Niedawna kombinacja fizycznych przekrojów zobrazowanych przez wielowiązkowy SEM zapewnia kombinację metod, która rozwiązuje problem "wąskiego gardła" szybkości akwizycji obrazu²². Każda z tych technik zrewolucjonizowała sposób pozyskiwania i analizowania danych EM, a każde podejście ma swoje praktyczne oddziaływania związane z danym zagadnieniem badawczym.

Biorąc pod uwagę charakter przygotowania i skalę wymiarów ultrastrukturalnych, nie jest łatwo przewidzieć, gdzie w bloku próbki znajduje się konkretna struktura docelowa (Rysunek1D,E). Jednym z rozwiązań dla lokalizacji ROI jest nagrywanie obrazów z całego bloku w żądanej rozdzielczości od samego początku. Interesujące nas struktury mogą znajdować się w pozyskanej objętości danych, gdy znajdują się z dala od mikroskopu. Czas akwizycji i obsługa danych związane z tą strategią są problematyczne. Pożądane jest zmniejszenie ilości rejestrowanych danych, zwłaszcza jeśli ROI są znacznie mniejsze niż blok tkankowy, tj. jeśli obiektami zainteresowania są określone typy komórek (nie całe narządy). Różne techniki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) mogą być skuteczne, gdy fluorescencja jest zachowana i zlokalizowana przed lub po przygotowaniu w tej samej próbce^{23,24,25,26,27,28,29}. Niemniej jednak wiele struktur komórkowych jest rozpoznawalnych nawet bez korelacji fluorescencyjnej, tylko na podstawie znanej ultrastruktury. W takich przypadkach uważamy, że boczna tomografia matrycowa zapewnia równowagę między wysiłkiem włożonym w lokalizację ROI a ultrastrukturalną jakością informacji. Korzystając z tej strategii, podzbiór sekcji na płytce jest badany w regularnych odstępach czasu, które można ustalić na podstawie wielkości i charakteru zwrotu z inwestycji. Po znalezieniu zwrotów z inwestycji akwizycja danych jest konfigurowana w ciągłej serii sekcji, zaczynając przed i kończąc po sekcji zakotwiczenia, zbierając odpowiednie informacje w ukierunkowany sposób.

Prezentujemy protokoły dla AT, które upraszczają i przyspieszają pozyskiwanie interesujących regionów lub wydarzeń w licznych sekcjach i dają lepiej dopasowane objętości obrazów. Boczne przesiewanie i wieloetapowa akwizycja generują dane o bardzo wysokiej rozdzielczości w precyzyjnie docelowych regionach. Opisana przez nas procedura rozwiązuje kilka wyzwań związanych z pozyskiwaniem danych 3D EM, ponieważ zapewnia: kompatybilność z szeroką gamą próbek bez zasadniczej zmiany procesu przygotowywania próbek; ukierunkowana lokalizacja dla sekcji i przejęć SEM; skrócony czas i wysiłek podczas konfiguracji; obrazowanie regionów w wielu sekcjach z lepszym wyrównaniem wynikowych objętości; oraz płynna procedura zszywania i wyrównywania w celu skompilowania różnych obrazów w zszyty obraz mozaiki. Zdecydowaliśmy się zademonstrować siłę naszej metody na kilku próbkach z opublikowanych i trwających projektów. Uważamy, że takie podejście może znacznie ułatwić generowanie i pozyskiwanie ukierunkowanych danych EM, nawet dla badaczy z ograniczonym doświadczeniem w EM.

Protocol

UWAGA: Metody przygotowania próbek są opisane gdzie indziej^14,30,31, i nie są omówione w tej publikacji. Krótko mówiąc, pokazane przykłady zostały chemicznie utrwalone aldehydem glutarowym, utrwalone po utrwaleniu 1% OsO₄, a następnie potraktowane 1% wodnym octanem uranylu przed zatopieniem w żywicy do zatapiania. Alternatywnie próbki można przygotować za pomocą zamrażania pod wysokim ciśnieniem, zamrażania podstawiając 0,1% octanem uranylu w acetonie i zatopić w żywicy akrylowej. Bloki próbki przygotowano przy użyciu metody płaskiego zatapiania, która pozwala na wyraźny widok próbki, ułatwiając jej orientację do przekroju (Rysunek 1B).

1. Procedura generowania tablicy

1. Orientacja i przycinanie osadzonej próbki
   1. Za pomocą lornetki/mikroskopu zidentyfikuj i zaznacz ROI na powierzchni osadzonego bloku, lekko drapiąc powierzchnię bloku żyletką. Pomoże to zorientować próbkę wewnątrz ultramikrotomu i zmniejszy powierzchnię cięcia.
   2. Zacisnąć próbkę na uchwycie ultramikrotomu (Rysunek 2A).
   3. Przytnij żywicę wokół próbki, najpierw żyletką (przycinanie zgrubne), a następnie kontynuuj za pomocą diamentowego narzędzia do przycinania (dokładne przycinanie; Rysunek 2A). Używaj noży o nachyleniu krawędzi 20° lub 90°, aby upewnić się, że górna i dolna powierzchnia bloku są równoległe do krawędzi tnącej noża.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla seryjnego cięcia i pozyskiwania prostych taśm.
   4. Wymieszaj ksylen i klej w proporcji 3:1. Za pomocą rzęsy przymocowanej do wykałaczki nałóż tę mieszankę na górną i dolną krawędź przyciętego bloku. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
2. Przygotuj wspornik montażowy matrycy A (tj. płytki krzemowe).
   1. Wytnij kawałek wafla za pomocą narzędzia do rozłupywania płytek (EMS), dostosowując jego rozmiar do celu projektu. 2 cm x 4 cm jest wygodne zarówno do obserwacji mikroskopią świetlną, jak i elektronową.
   2. Oczyść wafel w wodzie destylowanej, aby pozbyć się zanieczyszczeń.
   3. Wyładowanie jarzeniowe/plazmowe czyści powierzchnię przy użyciu standardowego wyposażenia. Dokładne parametry będą zależeć od używanej maszyny. Zacznij od parametrów rozładowania kratek i empirycznie dostosuj czas. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla dobrego rozłożenia sekcji na podporze podczas wysychania sekcji i nie należy go pomijać.
3. Przygotować wspornik montażowy B tablic (tj. szklane szkiełko nakrywkowe)
   1. Jeśli planujesz eksperymenty z multipleksowym znakowaniem immunologicznym, przenieś próbki na szkiełku nakrywkowym, aby lepiej wykryć sygnał fluorescencyjny. Aby poprawić przyczepność szkiełka nakrywkowego, należy zastosować szczegółową procedurę powlekania żelatyną, która została opisana wcześniej⁹.
   2. Zwiększyć przewodność, pokrywając szkiełka tlenkiem indu i cyny (ITO) lub złotem przez odparowanie. Przygotowane szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w czystym miejscu. Wyładować próbki jarzeniowo, jak opisano w ppkt 1.2.3.

2. Podział próbki na sekcje

1. Przygotowanie noża AT
   UWAGA: Do wygenerowania tablic należy użyć zmodyfikowanego noża (ATS), zaprojektowanego w celu ułatwienia pozyskiwania długich wstęg. Noże Histo-Jumbo lub podobne noże przeznaczone do generowania sekcji na dużych podporach mogą również służyć do cięcia AT.
   1. Przymocuj igłę do dolnej części noża za pomocą piankowej taśmy klejącej i przebij ją (Rysunek 2B). Umieść nóż ATS w uchwycie ultramikrotomu pod kątem 0°. Wyreguluj krawędź noża równolegle do powierzchni bloku, postępując zgodnie ze standardową procedurą.
   2. Przyłóż przycięty blok do krawędzi noża w pozycji gotowej do cięcia.
   3. Umieść wafel/szkiełko nakrywkowe w misce na noże i napełnij ją wodą do tego samego poziomu, co krawędź noża. Pozwól, aby diamentowa krawędź noża odpowiednio nawilżyła i, jeśli to konieczne, pobierz wodę za pomocą dołączonej strzykawki (Rysunek 2C).
2. Dzielenie i przenoszenie macierzy
   1. Ustaw mikrotom na żądane parametry cięcia. W przypadku noża ATS wskazany jest zakres 50-100 nm i prędkość cięcia 0,6-1 mm/s. Rozpocznij sekcję (Rysunek 2Di).
   2. Uzyskaj wstęgę o długości, która zakryje docelowy wolumin z i zatrzyma zbieranie. W zależności od rozmiaru bloku, jednorodności tkanki i rodzaju żywicy, wstęga będzie stosunkowo prosta (Rysunek 2D-ii). Wiele próbek nie da prostych wstążek, pomimo zainwestowanego wysiłku i rodzaju użytego noża.
   3. W zależności od ostatecznego celu wykonaj jedną długą lub kilka krótkich wstążek wyrównanych obok siebie. Wspornik o wymiarach 2 cm x 4 cm może wygodnie pomieścić od 100 do 1 000 sekcji. Ułożenie wstążki na stopniu podparcia to krok, który wymaga zręczności i pewnych rąk. Jednak krzywa uczenia się tej umiejętności jest szybko nabywana.
   4. Odczep wstążkę od krawędzi noża za pomocą czystej, nieklejącej się końcówki rzęsy przyklejonej do wykałaczki (Rysunek 2Diii).
   5. Za pomocą rzęsy delikatnie przesuń wstążkę nad środek podłoża podporowego. W tym momencie użyj chloroformu lub pisaka grzewczego do rozciągania sekcji, jeśli to konieczne. Pamiętaj jednak, że ta manipulacja może wywołać zerwanie i deformację wstążki.
   6. Spuszczanie wody należy rozpocząć od pociągnięcia za strzykawkę. W przypadku delikatniejszych wstążek lub wolniejszego cofania wody, pozwól, aby woda kapała, odłączając strzykawkę od węża. Gdy poziom wody obniża się do poziomu wafla, kontroluj wstążkę i w razie potrzeby zmień jej położenie, delikatnie dociskając wstążkę do środka. Po osadzeniu wstęg na powierzchni wafla kontynuuj opróżnianie, aż pozostała woda zostanie całkowicie wycofana z miski.
      UWAGA: Jeśli nie używasz dolnego noża ATS do cofania wody, ostrożnie zmniejsz ilość wody z boków noża ATS, aby nie wywoływać turbulencji.
   7. Pozostaw sekcje na wsporniku wewnątrz wanny do całkowitego wyschnięcia. W zależności od hydrofobowości podłoża i poziomu wilgotności otoczenia, woda będzie parować w różnym tempie (Rysunek 2Div). Ważne jest, aby pozostawić próbkę do powolnego wyschnięcia, aby zmniejszyć lub całkowicie uniknąć wszelkich fałd na próbce.
   8. Przenieść suchą próbkę do szczelnie zamkniętego pojemnika w celu ochrony przed zanieczyszczeniem brudem i umieścić ją w piecu o temperaturze 60 °C na co najmniej 30 minut. W razie potrzeby przeciwbejcuj sekcje za pomocą metali ciężkich, aby zwiększyć ogólny kontrast.
   9. Po zakończeniu procedury ostrożnie wyczyść nóż zgodnie z instrukcjami producenta
      UWAGA: Przenoszenie wielu lub szeregowych sekcji na płytce (Rysunek 2E) w porównaniu z przenoszeniem na siatkę szczelinową (Rysunek 2F) całkowicie zmienia sposób przygotowania EM. Nieprzerwane cięcie i zbieranie sekcji na pojedynczym podporze zmniejsza liczbę błędów związanych z cięciem i zbieraniem sekcji, które są częste w przypadku cięcia szeregowego. Odpowiednik 100 sekcji o wymiarach 1000 μm x 500 μm zebranych na jednej płytce odpowiada 33 siatkom szczelinowym (Rysunek 2G).

3. Przykładowa obserwacja

UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki przepływu pracy zaimplementowane przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania (zobacz Spis materiałów). Można użyć dowolnego oprogramowania do akwizycji obrazu na dowolnym SEM wyposażonym w odpowiednie detektory, jednak konkretne działania użytkownika będą się różnić i często będą bardziej ręczne.

1. Uzyskaj mapę poglądową obrazów SEM, która ujawnia lokalizacje sekcji na płytce. Wbudowany obraz z kamery optycznej pomaga w definiowaniu mozaiki obrazów SEM, która obejmuje wstęgę sekcji lub wszystkie sekcje. Utwórz mozaikę, klikając i przeciągając myszą w prawo na obrazie z kamery próbki i rozpocznij Automatyczną Akwizycję.
   UWAGA: Wystarczą bardzo zgrubne ustawienia obrazowania, tj. rozmiar piksela 1-2 μm i czas przebywania 1 μs. Proces ten jest zilustrowany w materiałach uzupełniających (strony 2-7).
2. Zlokalizuj sekcje za pomocą funkcji automatycznego wykrywania Section Finder lub zlokalizuj je ręcznie. Pozycje i kontury przekrojów są pobierane automatycznie za pomocą tego oprogramowania na podstawie dopasowania obrazu. Aby zilustrować ten proces, zobacz Materiały dodatkowe (strony 8 - 15).
3. W przypadku, gdy obrazy przeglądowe nie pokazują wyraźnie zwrotu z inwestycji, uzyskaj obrazy sekcji w wyższej rozdzielczości. Użyj funkcji Podgląd sekcji, aby automatycznie tworzyć i pobierać obrazy. Proces ten jest zilustrowany w materiałach uzupełniających, strony 16-18. Ustawienia obrazowania muszą być wybrane zgodnie z charakterem i wielkością zwrotu z inwestycji, którego szuka użytkownik.
   1. Aby znaleźć optymalne ustawienia, aktywuj obrazowanie na żywo w oprogramowaniu sterującym mikroskopem i przejdź do jednego zwrotu z inwestycji. Zmieniaj ustawienia obrazowania, aż obrazy wyraźnie pokażą zwrot z inwestycji, ale akwizycja obrazu nie będzie zbyt długa.
4. Definiowanie regionów obrazowania
   UWAGA: Zaproponowano kilka różnych strategii.
   1. Jeśli konieczne jest zobrazowanie tylko kilku sekcji, użyj obrazów utworzonych do tej pory sekcji, aby przejść do odpowiednich sekcji i użyj przeglądarki Zoomable, która pokazuje wszystkie uzyskane obrazy w ich oryginalnych lokalizacjach względnych, aby spojrzeć na wszystkie sekcje. Po znalezieniu sekcji, która powinna zostać zobrazowana w wysokiej rozdzielczości, utwórz region obrazowania za pomocą kliknięcia i przeciągnięcia. Wybierz ustawienia obrazowania w wysokiej rozdzielczości i zapisz je w szablonie. Użyj tego szablonu ponownie w dalszych sekcjach.
   2. Aby znaleźć szczególnie małe lub trudne do wykrycia rzadkie zdarzenia, należy zastosować metodę badania przesiewowego bocznego. Ręcznie utwórz region obrazowania z ustawieniami obrazowania o wysokiej rozdzielczości na co dziesiątej sekcji lub na jednej sekcji na wstążkę i uzyskaj obrazy. Przejrzyj obrazy i zaznacz sekcje, które zawierają zwrot z inwestycji w oprogramowaniu lub zanotuj.
      1. Zaczynając od sekcji, które zawierają zwrot z inwestycji, poruszaj się do przodu i do tyłu przez zestaw sekcji i twórz regiony obrazowania o wysokiej rozdzielczości w tych samych lokalizacjach względnych tak długo, jak długo struktura jest nadal widoczna w przekroju. Można to zrobić ręcznie lub korzystając z procedury opisanej w kolejnych krokach.
   3. Uzyskuj obrazy w więcej niż dziesięciu kolejnych sekcjach. Kliknij przycisk Rozpocznij zawężanie pozycji po powiększeniu obrazu, aby zwiększyć precyzję rejestrowanych lokalizacji sekcji zgodnie z opisem w instrukcji. Zmniejsza to zmienność położenia serii obrazów. Procedura jest zilustrowana i wyjaśniona w materiałach uzupełniających na stronach 19-21.
   4. Kliknij i przeciągnij dowolną sekcję, aby zdefiniować region obrazowania, przytrzymując Alt, a następnie wybierz opcję Utwórz tablicę zestawów kafelków z menu kontekstowego, które otwiera się po zwolnieniu przycisku myszy. Następnie oprogramowanie tworzy obszary obrazowania w tym samym względnym położeniu we wszystkich sekcjach, które zostały wcześniej znalezione lub oznaczone. Możliwe jest ograniczenie obrazowania do określonego zakresu przekrojów za pomocą suwaka Rozpiętość sekcji.
      UWAGA: Procedurę tę można powtórzyć z dowolną liczbą obszarów obrazowania, dzięki czemu umożliwia rejestrowanie wielu małych obrazów o wysokiej rozdzielczości zamiast rejestrowania pojedynczego większego obrazu na każdej sekcji.
   5. Po utworzeniu skonfiguruj liczbę pikseli, rozmiar pikseli, układ kafelków, czas przebywania pikseli itp. w każdej serii obrazów zgodnie z potrzebami. Po utworzeniu i skonfigurowaniu serii obrazowania wszystkie są wymienione w podpowiedzi zadania.
5. Konfiguracja funkcji automatycznych i rozpoczęcie akwizycji obrazu
   1. Utwórz osobną serię obrazów dla funkcji automatycznych, korzystając z tej samej metody, która została opisana w poprzednim kroku. Przenieś serię obrazów do miejsca w sekcji, która zawiera struktury o wysokim kontraście.
   2. Ustaw serię obrazów na 1024 x 884 pikseli i wybierz rozmiar piksela odpowiadający najwyższej rozdzielczości używanej w serii obrazów skonfigurowanej w poprzednich krokach. Na liście funkcji automatycznych sprawdź Auto Focus i Auto Stigmator.
   3. Wybierz opcję Według sekcji w kontrolkach sekwencji akwizycji i upewnij się, że obraz funkcji automatycznych jest pierwszym elementem na liście. Rozpocznij pobieranie obrazu, klikając przycisk Uruchom obok podpowiedzi zadania. Procedury te są zilustrowane w materiałach uzupełniających, strony 22-23.
      UWAGA: Nie ma potrzeby ręcznego wstępnego ustawiania ostrości na każdej sekcji. Podczas sesji nagrywania, za każdym razem, gdy mikroskop przejdzie do nowej sekcji, funkcje automatyczne zostaną wykonane przed zarejestrowaniem wszystkich innych obrazów w tej sekcji.

4. Wyrównanie i analiza danych

1. Eksport danych
   1. Upewnij się, że dane są zapisane w .tif formacie, więc nie ma potrzeby korzystania z dedykowanej funkcji eksportu. Sortowanie danych w strukturze folderów, która odpowiada bezpośrednio warstwom i elementom w drzewie warstw.
   2. Po zarejestrowaniu mozaiki obrazów użyj funkcji StitchAll, aby automatycznie zszyć wszystkie płytki.
2. Wyrównywanie i kadrowanie stosu w Fidżi
   NUTA. Do pracy z danymi tomografii matrycowej można wykorzystać wiele pakietów oprogramowania (bezpłatnych i komercyjnych). Poniższe kroki są pokazane za pomocą programu typu open source Fiji³², ponieważ jest on powszechnie dostępny i zawiera wszystkie wymagane funkcje.
   1. Zaimportuj stos obrazów (lub zszytych obrazów) na Fidżi jako stos wirtualny.
   2. Jeśli konieczna jest normalizacja kontrastu/jasności, wybierz polecenie Zwiększony kontrast... z menu Proces. Ustaw opcję Nasycone piksele na 0,1 lub mniej, a następnie zaznacz opcję Przetwarzaj wszystkie plasterki.
   3. Z menu Wtyczki wybierz Rejestracja | Liniowe wyrównanie stosu za pomocą SIFT.
   4. Wybierz opcję Sztywny lub Nierafinowany z menu rozwijanego Oczekiwana transformacja. W przeciwnym razie zachowaj ustawienia domyślne. Rozpocznij wyrównywanie, klikając przycisk OK.
      UWAGA: Załadowanie danych jako wirtualnego stosu umożliwia Fidżi obsługę stosów o dowolnym rozmiarze. Dane wyjściowe wyrównania są tworzone w pamięci RAM; Może to jednak ograniczyć maksymalny rozmiar stosów, które mogą być przetwarzane. W takim przypadku należy użyć opcji Register Virtual Stack Slices, która jest implementacją tego samego algorytmu rejestracji typu folder-folder. Po zakończeniu rejestracji załaduj dane wyjściowe jako stos wirtualny.
   5. Przytnij stos obrazów, klikając Przytnij, aby zawierał tylko zwrot z inwestycji.
   6. Zapisz stos jako pojedynczy obraz .tif lub serię .tif obrazów.
      UWAGA: Krytyczne etapy tomografii matrycowej są pokazane w Rysunek 3.

Results

Poniższe przykłady mają na celu pokazanie wszechstronności zalecanych przepływów pracy. Ilustracje case study to projekty, w przypadku których mieliśmy trudności z uzyskaniem satysfakcjonujących efektów przy użyciu jakichkolwiek innych technik. Wybraliśmy dorosłego Drosophila, aby zilustrować typowe wyzwania, jakie można napotkać w przypadku wielu próbek. Ten rurkowaty organ o długości około 6 mm i przekroju 500-1000 μm jest podzielony na różne regiony o unikalnej funkcji i składzie komórkowym (Ryc. 4A) < sup class = "xref">33. W zależności od orientacji przekroju, wymiary profilu jelitowego i jego wygląd na przekroju różnią się. Przekroje zorientowane poprzecznie lub podłużnie są stosunkowo duże i tylko kilka można umieścić na jednej siatce TEM (Rysunek 2F). Tylko niewielka część tkanki może być zobrazowana w FIB, a w przypadku SBF-SEM trudność jest podobna do każdej próbki niejednorodnej. AT zapewnia efektywny kompromis w analizie takich próbek, a płaskie osadzanie ułatwia lokalizację ROI. Staranne przycinanie nadmiaru żywicy wokół wybranego obszaru (Rysunek 4B) jest ważne dla efektywnego zbierania tablic z odpowiedniego obszaru (Rysunek 4C). Setki sekcji można zebrać na jednym płytce sekwencyjnie lub losowo (Rysunek 4D). W zależności od pytania badawczego, selekcja i akwizycja próbek będzie wymagała innej strategii, którą arbitralnie podzieliliśmy na kilka scenariuszy. Aby zilustrować różne przedstawione scenariusze w bardziej ukierunkowany sposób, wybraliśmy kilka studiów przypadków z różnych projektów badawczych.

Analiza licznych losowo rozmieszczonych dużych struktur o zakresie 1-10 μm (Rysunek 4E)
Często dane ultrastrukturalne są wymagane do walidacji hipotezy, która powstała w wyniku kilku podejść eksperymentalnych, porównujących stan standardowy i zmieniony eksperymentalnie. W takich przypadkach kilka sekcji jest zazwyczaj losowo zbieranych na siatkach i sprawdzanych w celu zlokalizowania i zobrazowania obszarów zainteresowania. Taktyka ta jest zwykle mniej systematyczna i ogranicza się do niewielkiej liczby analizowanych odcinków. Sugerujemy nagrywanie przeglądów dziesiątek/setek sekcji o średniej rozdzielczości z danej wstęgi (Rysunek 4D). W przypadku typowych odcinków 70 nm, 200 sekcji będzie obejmowało około 14 μm, które będą zawierały wiele komórek, w całości lub częściowo, ukończonych w ciągu pół godziny. W pierwszym kroku rejestrowany jest przegląd całej wstążki w niskiej rozdzielczości, a przegląd pomaga pominąć sekcje, które pokazują artefakty przygotowania (np. fałdy, zabrudzenia). Następnie akwizycję można przeprowadzić ręcznie lub automatycznie bezpośrednio na wybranych częściach przekroju lub całym przekroju, za pomocą obrazowania pojedynczego lub mozaikowego, a następnie zszywania (Rysunek 4E). Następnie można uzyskać obrazy z wybranego obszaru przy użyciu parametrów o wysokiej rozdzielczości. Na przykład mitochondria, jądra i mikrokosmki mogą skorzystać z takiej statystycznie ulepszonej metody (Rysunek 4Ei-iii).

Analiza wielu małych, słabo rozmieszczonych struktur o zakresie 500-1,000 nm (film uzupełniający 1)
W tym scenariuszu ROI nie można po prostu zidentyfikować na skanie przeglądowym w małym powiększeniu i potrzebne są obrazy o wysokiej rozdzielczości. W konwencjonalnych próbkach TEM konieczne jest żmudne powiększanie i pomniejszanie sekcji, dopóki nie zostanie znaleziona wymagana funkcja. Często obrazowanie kilku niezależnych lokalizacji w wielu próbkach jest statystycznie bardziej istotne niż generowanie pojedynczej dużej objętości. W takich przypadkach złożoność ręcznego pozyskiwania rośnie wykładniczo. Chociaż kilka rozwiązań TEM umożliwia automatyczną akwizycję lub przesiewanie wielu siatek, rozmiar siatki i wyzwania związane z szeregowym cięciem często sprawiają, że podejście to jest niekompatybilne w przypadku wielu próbek. W podobnych przypadkach generujemy kompletną mapę ogólnego zwrotu z inwestycji w średniej rozdzielczości w wielu sekcjach z rozdzielczością wystarczającą do zidentyfikowania interesujących struktur. Podczas tego bocznego etapu przesiewania zaleca się przeskakiwanie kilku sekcji na raz, mając na celu trafienie przynajmniej w część interesującej nas struktury, gdy zbliżysz się do niej losowo. Będzie to w dużej mierze zależało od ogólnych wymiarów konstrukcji: np. jeśli całkowity rozmiar konstrukcji wynosi 500 nm, a sekcje mają grubość 50 nm, co najmniej dziewięć kolejnych sekcji w rzędzie będzie prawdopodobnie zawierać część interesującej nas struktury. W ten sposób pominięcie 6-7 sekcji powinno być skuteczne w znajdowaniu wielu różnych rodzajów struktur w wielu obszarach. Automatyczna akwizycja rozwiązanych map mozaikowych wybranych odcinków umożliwia dokładne przesiewanie tych odcinków po ich pozyskaniu. Po uzyskaniu takiej mapy o wysokiej rozdzielczości można wyciąć kilka obszarów obrazowania lub użyć ich do zdefiniowania dodatkowych lokalnych obszarów obrazowania na obszarach ROI (film uzupełniający 1). Golgi, centriole, połączenia, mikrotubule, różne rodzaje pęcherzyków są dobrymi przykładami struktur, które mogą skorzystać z tego scenariusza (film uzupełniający 1).

Analiza rzadko rozmieszczonych dużych ROI w dużych próbkach (Rysunki 4F-4H)
Ten scenariusz obejmuje rzadkie zdarzenia, które często są opisywane jako "igła w stogu siana", w których problem nie polega na identyfikacji ROI, ale na jego lokalizacji. W przypadku wielu próbek podejście korelacyjne nie jest prawidłową opcją, jednak często zwrot z inwestycji ma ujawniającą ultrastrukturę, a po zlokalizowaniu można go zidentyfikować z wysoką wiarygodnością. W przypadku tych próbek konieczne jest zastosowanie akwizycji wielopoziomowej, zaczynając od wstępnie przesianych próbek z dziesiątkami lub setkami sekcji o średniej rozdzielczości. W zastosowanym tutaj oprogramowaniu istnieją dwie różne strategie uzyskiwania zestawów obrazów z wieloma sekcjami: nagrywanie obrazów podglądu w wyższej rozdzielczości lub uzyskanie zestawu kafelków tablicowych z odpowiednimi ustawieniami (Rysunek 4F). Różne wyspecjalizowane typy komórek w jelicieDrosophila są losowo rozmieszczone (np. komórki macierzyste, enteroendokrynne) i cienkie sekcje w losowej orientacji. Można je jednak wizualnie odróżnić po prześwietleniu obrazów uzyskanych przy użyciu parametrów wysokiej rozdzielczości, zarówno z pojedynczych sekcji, jak i jako zbiór obrazów seryjnych (Rysunek 4G). Po wyrównaniu stosy mogą być renderowane przy użyciu różnych rozwiązań programowych (Rysunek 4H, film uzupełniający 2).

Scenariusz 1: Organoidy jelitowe (Rysunek 5A)
Organoidy szybko stają się jednym z najnowocześniejszych narzędzi współczesnych nauk przyrodniczych. Ten niemal fizjologiczny model narządów 3D pochodzący z komórek macierzystych umożliwia dokładne badanie szeregu procesów biologicznych in vivo, w tym odnowy tkanek, reakcji na leki i medycyny regeneracyjnej. Niedawno wprowadzone rurki mini-guts³⁴ otwierają nową generację technologii organoidów, bardzo zbliżoną do fizjologii tkanek in vivo, składu typu komórki i homeostazy, umożliwiając szerokie perspektywy modelowania chorób, interakcji gospodarz-mikroorganizm i odkrywania leków. Jednakże, gdy wymagana jest charakterystyka ultrastrukturalna, lokalizacja różnych typów komórek w tak dużej tkance przy użyciu losowych próbek może być trudna. Ponadto w zmiennych testach "infekcji" ważne jest, aby upewnić się, że analiza ujawnia różne etapy rozwoju, które wpływają na tkankę. W przypadku takich badań kluczowe znaczenie ma statystycznie istotne pokrycie próby, ale trudno je osiągnąć przy użyciu tradycyjnego podejścia TEM on-grid. Scenariusz AT 1 jest korzystny w takich przypadkach: wiele sekwencyjnych sekcji może zostać wygenerowanych na płytce (Rysunek 5Aii) i przesiewanych przy użyciu parametrów o niskiej rozdzielczości w celu zlokalizowania ogólnych obszarów zainteresowania (Rysunek 5Aiii; strzałki). Obszary te mogą być ukierunkowane na dalszą analizę przy użyciu zaawansowanych parametrów akwizycji (Rysunki 5Aiv i Rysunek 5Av). Po wykryciu odpowiedniej struktury (zwykle klaster 5-10 sekcji raz na 100-300 sekcji), łatwo jest skoncentrować się na każdej z interesujących struktur i ręcznie pozyskiwać pojedyncze obrazy lub korzystać z funkcji automatyzacji w celu uzyskania objętości obrazów w wielu sekcjach.

Scenariusz 2: Poczwarka Drosophila notum (Rysunek 5B)
Badanie podziałów komórkowych i mechanizmów kontrolujących postęp w cyklu komórkowym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zarówno standardowych, jak i zmienionych procesów w organizmach wielokomórkowych. Informacje, które istnieją, często pochodzą z systemów jednokomórkowych; jednak w tym rozwiązaniu brakuje krytycznego kontekstu interakcji 3D między komórkami w tkance. Jednokomórkowa monowarstwa notum, rozwijająca się tylna część larwy Drosophila, jest doskonałym modelem interakcji między komórkami nabłonkowymi w ogóle, a podziałem komórek w szczególności³⁵. Jest to uznany model do badań interakcji molekularnych i komórkowych wykorzystujący połączenie danych dostępnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i manipulacji genetycznych. Odcięcie, ostatni etap podziału komórki, zapewnia ostateczną separację między dwiema dzielącymi się komórkami, a scharakteryzowanie zmian strukturalnych, które zachodzą podczas odcięcia, jest niezbędne do naszego zrozumienia mitozy. Jednak podziały mitotyczne w notum nie są łatwe do zlokalizowania na poziomie ultrastrukturalnym: komórki są stosunkowo duże w porównaniu ze strefą odcięcia (Ryc. 5B). Stosunek całkowitej wielkości strefy odcięcia do powierzchni przekroju do pokrycia jest duży (Rysunek 5Bi). Mimo że możliwe jest zlokalizowanie strefy odcięcia za pomocą metod TEM lub SBF-SEM³⁶, zadanie jest pracochłonne. W tym scenariuszu automatyczne obrazy przeglądowe o średniej rozdzielczości skoków 20-40 sekcji mogą być wykorzystane do lokalizacji dzielących się komórek (Rysunek 5Bii). Po zidentyfikowaniu takich komórek, sekcje służą jako kotwica do bliższego zbadania sekcji w pobliżu, a liczne komórki dzielące mogą zostać znalezione i wybrane do dalszej analizy. W ten sposób strefa odcięcia może być zlokalizowana i zobrazowana w całości (Rysunek 5Biii). W zależności od pytania, można zebrać pojedyncze obrazy o wysokiej rozdzielczości lub 3-7 sekwencji obrazów, aby pokryć głębokość struktury (Rysunek 5Biv).

Scenariusz 3: Mysie neurony tanycytowe (Rysunek 5C)
Mysz stanowi dobrze ugruntowany model rozwoju mózgu i jest dobrze udokumentowany na różnych poziomach, w tym przez EM. Mimo że różne zautomatyzowane metody bloków szeregowych są szeroko stosowane do badania tkanki mózgowej, istnieją przypadki, w których AT jest lepiej przystosowane do zbierania niezbędnych danych. Podwzgórze jest dobrze ugruntowanym modelem neurobiologicznym, częścią mózgu, która zawiera wiele funkcji typu neuronów. Tanycyty podwzgórza reprezentują szczególny podzbiór komórek wyściółki wyściełającej dno trzeciej komory, z niezwykle długimi wyrostkami (do 300 μm) i dużymi stopami końcowymi (~5 μm)³⁷. To sprawia, że są one niewygodne dla analizy zarówno metodami TEM, jak i FIB. Zadanie komplikuje się jeszcze bardziej, gdy trzeba zlokalizować i przeanalizować kilka niezależnych tanycytów. Jednym z podejść ułatwiających to zadanie może być celowanie półkorelacyjne, w którym mapa fluorescencji jest uzyskiwana z próbek znakowanych fluorescencyjnie przed utrwaleniem i zatopieniem dla EM. Cięcie odbywa się na uchwyconym obszarze poprzez połączenie informacji o położeniu z próbki fluorescencyjnej i płaskiej osadzonej plastikowej repliki. Następnie można zastosować scenariusz AT 3: generowane są wysokopoziomowe obrazy mozaiki przeglądowej w celu ujawnienia regionów z klastrami kończyn końcowych tanycytów. Następnie funkcje automatyzacji w oprogramowaniu są wykorzystywane do ustawiania akwizycji sekwencji obrazów z jednego lub kilku obszarów w jednym obrazie lub w trybie kafelkowym. Obrazy te mogą być analizowane oddzielnie, jako wyrównane stosy lub renderowane po tym.

Moc metody AT pozwala na stosunkowo łatwe "uaktualnienie" danych z 2D do 3D: mapy są dostępne z pierwszego akwizycji, a objętości można uzyskać z wybranego obszaru i jego okolic. Wynikowy stos można wyrównać, a następnie wyrenderować. Konieczne jest wcześniejsze określenie, jaka rozdzielczość i jakość obrazu są potrzebne, aby uzyskać zwrot z inwestycji. Obrazowanie powinno umożliwiać rozpoznawanie ROI, ale nie poza tą wartością, ponieważ czas akwizycji skaluje się proporcjonalnie do czasu przebywania piksela i odwrotności kwadratu rozmiaru piksela.

Rysunek 1: Wyzwania związane z przygotowaniem próbki EM i jej akwizycją. (A) Utrata fluorescencji i kurczenie się następuje z powodu wysokiego stężenia metali ciężkich i odwodnienia podczas przygotowywania próbki. (i) Schematyczny rysunek próbki obserwowanej pod LM (ii) tej samej próbki przygotowanej dla EM, która staje się całkowicie nieprzezroczysta i traci około 10% swojej objętości. (B) Osadzanie próbek odbywa się zwykle przy użyciu żywic epoksydowych lub akrylowych. Tradycyjne bloki (i) mogą być z powodzeniem stosowane do próbek jednorodnych, które nie wymagają szczególnej orientacji. Płaskie bloki (ii) są pomocne, gdy konieczne jest celowanie i orientacja pod mikroskopem, precyzyjny obszar przeznaczony do cięcia, np. w próbkach niejednorodnych lub procedurach mikroskopii korelacyjnej. (C) Z całej objętości próbki tylko ograniczony ułamek jest reprezentowany na pojedynczym odcinku 50 nm, zapewniając obraz 2D próbki 3D, często w nieznanej orientacji. (D) Aby zilustrować problem rejestrowania zbyt dużych objętości w porównaniu z precyzyjnym celowaniem, wybraliśmy trzy koncentryczne sześciany o ścianach 1000, 500 i 50 μm, które są zorganizowane tak, aby zawierały hipotetyczną próbkę 1000 x 500 x 500 μm (ciemnobordowy). Jeśli takie hipotetyczne kostki próbki zostaną dokładnie pocięte na kawałki z warstwami 50 nm, aby pokryć całą objętość, będzie to wymagało łącznie 20 000, 10 000 i 1 000 plasterków oraz odpowiednio 800 TB, 100 TB i 100 GB (rozdzielczość obrazowania 5 nm x 5 nm x 50 nm, dane 8-bitowe). Pokazuje to, jak ważne jest planowanie pozyskiwania danych EM tylko w celu uzyskania minimalnej niezbędnej ilości. (E) Pokrycie dużej powierzchni próbki w wysokiej rozdzielczości stanowi problem podobny do problemu związanego z dużą objętością. Umieszczenie kilku obrazów o wysokiej rozdzielczości w jednym jest pomocnym rozwiązaniem takiego problemu. Jednak pokrycie powierzchni o wymiarach 1 mm x 1 mm za pomocą ramy 2024 x 1048 w powiększeniu 10 000x będzie wymagało ogromnej liczby płytek, co może stać się trudne do zszycia. Ponadto, jeśli sekcje są zmiennie ściskane lub zniekształcone podczas cięcia, powstałe stosy danych stają się prawie niemożliwe do wyrównania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przepływ pracy do bezpośredniego generowania tablic przekrojów na dużym podporze. (A) W celu dokładnego przycinania za pomocą narzędzia do przycinania, bloki są zabezpieczone wewnątrz uchwytu mikrotomu. Ten krok pomaga zapewnić równoległe boki bloku, a także zmniejsza pustą żywicę wokół próbki. (B) Zmodyfikowany nóż do nabywania sekcji przeciwpancernych. Duża łódź ułatwia przenoszenie sekcji i manipulowanie nimi podczas cięcia próbki i przenoszenia na podporze. Duża umywalka umożliwia manipulowanie sekcjami; System drenujący ogranicza ruch taśm podczas etapu opróżniania, płaskie dno sprawia, że stopniowe suszenie podpory jest niezawodne. (C) Nóż, gotowy do krojenia, z jarzeniową płytką umieszczoną na dnie miednicy i wodą wyrównaną do krawędzi. Konstrukcja noża utrzymuje igłę osadzoną, nie ingerując w podparcie. (D) Generowanie matrycy, widok z góry na obszar przekroju mikrotomu. (i) Pierwsze odcinki są zwykle łatwe do uzyskania, ponieważ przylegają one do siebie i formują regularną wstęgę. (ii) Gdy do wstęgi dodaje się więcej sekcji i staje się ona dłuższa, wstęga traci stabilność i często ulega zakrzywieniu. Bardzo ważne jest, aby ścieżki sekwencji były uporządkowane w kolejności w ramach przygotowań do etapu pozyskiwania obrazu. (iii) Kiedy wstęga odcinków osiągnie pożądaną długość, jest ona ostrożnie odrywana od krawędzi noża za pomocą rzęsy. (iv) woda jest spuszczana z basenu; Wafel pozostaje w środku, dopóki nie wyschnie całkowicie na powietrzu. Ten krok jest niezbędny, ponieważ pomaga wyprostować sekcje i uniknąć tworzenia się mikrofałd. Wafel umieszcza się w piekarniku w temperaturze 60°C na co najmniej 30 minut, aby przymocować sekcje do wspornika. (E) Przykładowe płytki z przeniesionymi sekcjami. Chociaż wygodnie jest uzyskać proste i dokładne wstążki, rzeczywiste próbki w większości przypadków uniemożliwiają tworzenie się takich idealnych wstążek. Niemniej jednak nawet "niechlujne" wstążki są bardzo pouczające dla ogromnej liczby przypadków, a znaczenie "schludnej" wstążki będzie zależało od strategii badawczej, dla której zbierane są sekcje. Podziałka liniowa 1 cm. (F) Przykładowe siatki szczelinowe z sekcjami szeregowymi. Nawet jeśli na jednej siatce zbiera się wiele sekcji, to i tak jest to niewielki ułamek tego, co można zebrać na jednej płytce. Umiejętności wymagane do opanowania przenoszenia skrawków na siatce (w szczególności siatki szczelinowej) stanowiły istotne wąskie gardło w opanowaniu przygotowywania próbek do mikroskopii elektronowej. Podziałka 500 μm. (G) Bez względu na to, która metoda zbierania sekcji została użyta, mocną stroną podejścia AT jest względna łatwość generowania sekwencyjnych sekcji w porównaniu z kolekcją on-grid. Jeśli weźmie się pod uwagę blok próbki o wymiarach 1000 μm x 500 μm, nie ma problemu z umieszczeniem około 100 sekcji na płytce o wymiarach 2 cm x 4 cm (i). Sekcje o tym samym rozmiarze na siatce szczeliny zmieszczą maksymalnie trzy sekcje/siatkę (ii). Udostępniamy przeskalowany obraz, aby pokazać, ile siatek może być wymaganych do pokrycia tej samej liczby sekcji, nie wspominając o trudnościach w zbieraniu sekcji szeregowych na siatce. Podziałka = 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kluczowe etapy przepływu pracy tomografii matrycowej. Schemat przepływu pracy dla bezobsługowej akwizycji stosów obrazów o wysokiej rozdzielczości. Wszystkie etapy przygotowawcze są zautomatyzowane (zielone symbole kół zębatych) i nie wymagają ręcznego wykonywania żadnych czynności, sekcja po sekcji. Stosy obrazów można wyrównywać w dowolnym oprogramowaniu do analizy obrazu, które umożliwia automatyczne wyrównywanie sztywne lub afiniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Trzy scenariusze przejęcia z dorosłym jelitem Drosophila jako modelem demonstracyjnym. (A) rysunek wypreparowanego jelita środkowego Drosophila, z trzema głównymi obszarami oznaczonymi różnymi kolorami: przednim, środkowym i tylnym. (B) Przycięty płaski blok, w którym jelito jest zorientowane do przekroju poprzecznego. Zwróć uwagę, że pusta ilość żywicy jest starannie zrównoważona wokół tkanki zawierającej obszar zainteresowania (biały prostokąt). (C) Poprzeczne sekcje szeregowe unoszą się na powierzchni wody wewnątrz basenu noża AT. Wszystkie obrazy zostały uzyskane w trybie wtórnego elektronu SEM przy użyciu detektora lustrzanego z odwrotnym kontrastem. (D) Zszyty mozaikowy obraz poprzecznych odcinków szeregowych na opłatku. Podziałka wynosi 1000 μm. (E) Przekrój przez jelito Drosophila. Podziałka 20 μm. Obraz jest zszytą mozaiką obrazów średniej klasy o wymiarach 7 x 7. Wstawki - obrazy o większym powiększeniu i rozdzielczości określonych obszarów zainteresowania: (ii) jądro, (iii) granica szczoteczki i (i) mitochondria. Podziałka 5 μm dla wszystkich. (F) Obraz średniego zasięgu przekroju poprzecznego przez jelito, który jest ukierunkowany na lokalizację rozwijających się komórek (kwadrat). Podziałka liniowa wynosi 20 μm. (G) Docelowa tablica sekcji szeregowych zebranych na podstawie obszaru zlokalizowanego podczas analizy przekroju obecnego w panelu F. Podziałka liniowa wynosi 10 μm. (H) Model 3D jest renderowany na podstawie sekwencji stosu 50 sekcji uzyskanej z docelowej akwizycji szeregowej w panelu G. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Studia przypadków dla scenariuszy zastosowania AT. (A) Lokalizacja różnych struktur komórkowych w organoidzie jelitowym. (i) Wbudowany mikroprocesor krzemowy. Podziałka = 200 μm. (ii) Zszyty obraz mozaiki o 127 przekrojach poprzecznych przez środkową część chipa. Podziałka = 1500 μm (iii) Cztery obrazy o niskiej rozdzielczości przedstawiające pełny przekrój poprzeczny przez część organoidu jelitowego. Strzałki wskazują potencjalne miejsce zainteresowania. Podziałka skali wynosi 20 μm. (iv) Różne ROI, ukierunkowane na mikrofotografie o niskiej rozdzielczości wybrane do dalszej analizy. Podziałka = 10 μm. (v) Obraz o wysokiej rozdzielczości zainfekowanej komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Analiza tego samego regionu w sąsiednich sekcjach może w razie potrzeby dostarczyć ukierunkowanych informacji 3D. Pasek skali = 5 μm. (B) Lokalizacja środkowej części ciała w poczwarce Drosophila melanogaster pupal notum. (i) Schematyczny widok wypreparowanej poczwarki Drosophila. Notum odsłonięte do rozwarstwienia (beżowe) po usunięciu części naskórka ochronnego (brązowe). linia wyznacza kierunek przekroju (ii) Przekrój poprzeczny przez obszar przedstawiony na schemacie. Obraz łączy sekwencyjne obrazy SEM w formacie 3x7 o wysokiej rozdzielczości zszyte w jeden panel mozaiki. prostokąt wyznacza obszar, który zawiera komórkę dzielącą. Podziałka skali wynosi 15 μm. (iii) Powiększony obraz na dzielącej komórce z panelu ii. Przy tym powiększeniu i rozdzielczości widoczna jest środkowa część ciała (białe strzałki). Cała sekcja jest analizowana w celu znalezienia dzielących się komórek. Przeskakiwanie między różnymi wstęgami sekcji w odstępach 20-30 sekcji podczas etapu bocznego przesiewania pozwala na zlokalizowanie wielu dzielących się par komórek. Pasek skali wynosi 5 μm (iv), gdy zlokalizowana jest dzieląca się komórka, sekwencyjne obrazy środkowej części ciała zebrane z czterech sekcji wokół środkowej części ciała ograniczonych żółtym kwadratem na panelu (iii). Pasek skali wynosi 1 μm. (C) Lokalizacja końcówek tanycytów w podwzgórzu myszy. (i) Obraz fluorescencyjny wycinka wibratomu. Tanycyty wyrażają tdBiałko fluorescencyjne pomidora (czerwone). Obszar zainteresowania wyznacza biały prostokąt. Podziałka 500 μm. (ii) Ten sam przekrój wibratomu przygotowany dla EM zostanie starannie przycięty wokół obszaru zainteresowania - w oparciu o pośrednią korelację informacji fluorescencyjnych z panelu (i). Biała linia przerywana reprezentuje obszar ultracienkiego przekroju. Podziałka wynosi 50 μm dla obu paneli. (iii) Przekrój przez wycinek wibratomu w obszarze zainteresowania. Obraz mozaiki SEM składa się z 75 zszytych obrazów. Kilka sekcji jest poddawanych ekranowaniu bocznemu i obrazowanych z podobnymi parametrami. Sekcje są analizowane "offline" w celu znalezienia ROI - końcówek tanycytu. prostokąt reprezentuje obszar, w którym znajdują się końcówki tanycytu. Ta sekcja posłuży jako kotwica do dalszej analizy. Pasek skali wynosi 15 μm. (iv) Obraz o wysokiej rozdzielczości i dużym powiększeniu końcówek kończyn tanycytów otaczających naczynie krwionośne. Po początkowej lokalizacji zwrotu z inwestycji na jednej sekcji, sekwencja z jest zbierana z sąsiednich sekcji przed sekcją kotwiącą (panel iii). Podziałka 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Problemy podczas ultramikrotomii, pobierania i przechowywania wycinków mogą prowadzić do powstania artefaktów. (A) Wycinki próbki mózgu na płytce. Większość pustej żywicy oderwała się od tkanki i pofałdowała na sobie (sepia). Przerywana ramka oznacza obszar, który jest używany do przechowywania całej sekcji. Podziałka 500 μm. (B) Mały, lokalny fałd na powierzchni odcinka danio pręgowanego o grubości 50 nm. Podziałka 1 μm. (C) Ślad noża na powierzchni 70-nanometrowego odcinka mózgu myszy. Podziałka 5 μm. (D) Włosy (gwiazdka) na powierzchni płytki, które częściowo pokrywają część mięśnia danio pręgowanego. W kolorze żółtym tkanka jest przeznaczona do analizy. W kolorze różowym oznacza komórkę, która służyła jako odniesienie do rozmiaru dotkniętego obszaru. Podziałka 50 μm. (E) Struna grzbietowa danio pręgowanego ze zmarszczkami w prawym dolnym rogu (czarne strzałki), gdzie gęsta tkanka nerwowa (zacieniona na niebiesko) graniczy z bardziej miękką tkanką mięśniową i pustą żywicą (czarne strzałki). Podziałka skali 10 μm. (F) Segmentacja objętości stosu 50 obrazów, jak w E, pokazująca, że ten obszar wykazywał zmarszczki w większości sekcji. Wielokąt przerywany wyznacza obszar pokazany na G. Pasek skali 10 μm. (G) Widok XY o tej samej segmentacji objętości co w F, pokazujący zmarszczki jako krótkie czarne pociągnięcia w prawej połowie bloku. Należy pamiętać, że zmarszczki nie mają wpływu na wyrównanie stosu w pozostałych częściach tkanki. Podziałka 5 μm. (H) Rzut XZ tego samego obszaru co w G, pokazujący zmarszczki we wszystkich 50 sekcjach. Podziałka 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Wysokiej rozdzielczości obraz montażowy przekroju poprzecznego przez przednie jelito środkowe Drosophila.Obraz mozaikowy odwróconego obrazu SE-MD SEM. 352 oddzielne kafelki obrazu zostały automatycznie pozyskane w rozdzielczości 5 nm i zszyte tak, aby przedstawić cały przekrój. Możliwe jest powiększenie, aby uzyskać więcej szczegółów i uzyskać wyczerpujące pokrycie danych przy użyciu tego samego obrazu. Ścisłe połączenia, mikrotubule, różne rodzaje pęcherzyków mogą być podczas przybliżania. Skala wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: Renderowanie komórek jelitowych Drosophila. Pięćdziesiąt wyrównanych obrazów mozaikowych odcinków w obszarze dzielących się komórek jelitowych. IMOD renderowanie granic komórek (niebieskich, turkusowych i pomarańczowych) oraz jąder (białych). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Materiały dodatkowe.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Mikroskopia elektronowa daje wgląd w ultrastrukturę komórek i organizmów, dla których często pożądane jest obrazowanie interesujących struktur w ich trójwymiarowym kontekście. Pomimo licznych taktyk EM do analizy ultrastrukturalnej, nadal nie ma rozwiązania "złotego standardu". Głównym powodem jest duża różnorodność próbek, wiele kwestii biologicznych, które często wymagają indywidualnego podejścia. Proponowany przepływ pracy AT został zaprojektowany tak, aby zminimalizować czas niezbędny do przetwarzania, pozyskiwania, oceny i przechowywania próbek. Co więcej, zmodyfikowany nóż stanowi pomocne narzędzie upraszczające akwizycję tablicy. Kompaktowy układ sekcji na płytkach jest wygodny, zarówno do obserwacji, jak i późniejszego przechowywania próbek. Taki układ umożliwia "boczne przesiewanie" próbek poprzez poziome przesuwanie się od taśmy do taśmy i skanowanie tylko jednej sekcji na każdej z nich, co znacznie skraca czas potrzebny na zlokalizowanie zwrotu z inwestycji. Proponowane scenariusze pozyskiwania danych ułatwiają ukierunkowanie na małe i losowo rozmieszczone obszary. Po znalezieniu, AT/SEM ogranicza obrazowanie w wysokiej rozdzielczości precyzyjnie do interesującej go wielkości, niezależnie od tego, czy jest wykonywane ręcznie, czy za pomocą funkcji automatycznej. AT dla ograniczonych objętości można wykonać ręcznie, a operator porusza się po próbce i definiuje obszary obrazowania jeden po drugim. Zautomatyzowany moduł oprogramowania zapewnia elastyczną strategię akwizycji obrazu do obrazowania małych obszarów na dużych odcinkach. Automatyzacja w tym oprogramowaniu pozwala na nagrywanie dużych obrazów o wysokiej rozdzielczości na setkach sekcji, osiągając podobne objętości jak SBFI. Rejestrowanie obrazów przeglądowych wszystkich przekrojów upraszcza lokalizację zwrotu z inwestycji i skraca czas spędzony przy mikroskopie. Ponieważ sekcje nie są uszkadzane podczas nagrywania przeglądów i podglądów o wyższej rozdzielczości, AT/SEM zezwala na ponowne wykorzystanie próbki do zbierania dalszych danych o innych ROI lub w wyższej rozdzielczości.

Czas akwizycji obrazu jest jednym z najważniejszych (i najdroższych) aspektów 3D EM i dlatego powinien być brany pod uwagę w projekcie eksperymentu. Chociaż nie jest zaskakujące, że obrazowanie dużych obszarów trwa dłużej niż obrazowanie małych obszarów, łatwo jest nie docenić wpływu: w zależności od wybranych parametrów obrazowania, czas akwizycji na każdej sekcji może wahać się od sekund do godzin. Krytyczne parametry obrazowania obejmują rozmiar pola widzenia, rozdzielczość i czas przebywania. Zakładając docelową rozdzielczość 10 nm na piksel i czas przebywania 1 μs, obrazowanie pola o wymiarach 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm lub 500 μm x500 μm zajmuje 4 sekundy, 100 sekund lub 2,500 s. Możemy pomnożyć te czasy obrazowania dla każdego odcinka przez liczbę sekcji, aby oszacować czas potrzebny na pełne zadanie obrazowania. Długie czasy obrazowania dla każdej sekcji mogą być akceptowalne, jeśli liczba sekcji jest mała lub jeśli czas pracy mikroskopu nie ma znaczenia.

Jednak w większości przypadków konieczne jest ograniczenie czasu nagrywania do pracy w nocy lub w weekendy. Równie krytycznym aspektem 3D EM, który należy wziąć pod uwagę, jest ilość i struktura wynikowych danych obrazu. Zapis w/w pól obrazowania w 100 sekcjach generuje odpowiednio 400 mb, 10 gb lub 250 gb danych obrazu; Obrazy o wymiarach 500 μm x 500 μm stanowią dodatkowy problem polegający na tym, że każdy z nich jest większy niż 2 GB. Wiele programów używanych do oceny danych nie może otwierać obrazów o takim rozmiarze.

Aby skrócić czas obrazowania, ważne jest, aby wybrać czas przebywania pikseli, aby spełnić wymagania dotyczące stosunku sygnału do szumu dla późniejszej oceny danych (np. rekonstrukcji, śledzenia) i ograniczyć nagrania do zdefiniowanych ROI. Rozszerzenie AT oprogramowania ułatwia akwizycję obrazu w małych obszarach w odcinkach szeregowych. Oprogramowanie obsługuje ręczne i automatyczne przepływy pracy oraz wiele wariantów półautomatycznych: obszary obrazowania mogą być ręcznie pozycjonowane i skupiane na każdej sekcji lub użytkownik może korzystać z funkcji automatycznego wyszukiwania sekcji i wyrównywania pozycji. W zależności od wybranego i wspieranego przez typ próbki poziom automatyzacji lub cele obrazowania, czas potrzebny na skonfigurowanie akwizycji obrazu w setkach sekcji może zająć cały dzień roboczy (wykonywany ręcznie) lub tylko kilka minut. Zasadniczo tomografia matrycowa sprawia, że uzyskanie małych zwrotów z inwestycji jest trudniejsze niż inne metody 3D EM; Nieprecyzyjne rozmieszczenie regionów na kolejnych odcinkach musi być kompensowane poprzez pozyskiwanie większych obszarów. Na przykład, jeśli ROI ma rozmiar 20 μm x 20 μm, a zmienność położenia pól obrazowania między sekcjami wynosi 10 μm, należy uzyskać obrazy 40 μm x 40 μm, aby mieć pewność, że ROI jest w pełni uchwycony na każdym obrazie, na każdym przekroju. Rzeczywista zmienność pozycji obrazu waha się od 100 μm do <10 μm, w zależności od dostępności lub jakości funkcji oprogramowania do wyrównywania pozycji lub cierpliwości użytkownika. Dzięki temu oprogramowaniu można osiągnąć 10 μm bez zbytniej ręcznej interwencji w większości próbek.

Jak każda technika, AT ma kilka słabych punktów, które mogą wpływać na pomyślne pozyskiwanie danych, a wiele z nich jest podobnych do innych metod opartych na sekcjach. Brak jednorodnego rozkładu pustej żywicy w stosunku do tkanki może skutkować zakrzywionymi lub uszkodzonymi układami. W skrajnych przypadkach sekcje mogą odczepić się od podpory (Rysunek 6A). Zmienna kompresja lub rozciąganie podczas procesu cięcia może powodować powstawanie fałd, które mogą zakłócać próbkę w zmiennych obszarach na kolejnych odcinkach (rysunek 6B). Na powierzchni pobranych skrawków mogą pojawić się ślady noża po użyciu uszkodzonego noża (Rysunek 6C). Różnice w warunkach przekroju mogą powodować sporadyczne różnice w ściskaniu i grubości przekroju. Cząsteczki kurzu lub brudu mogą wylądować na sekcji i częściowo zasłaniać obszar zainteresowania (rysunek 6D). Akwizycja obrazu może się nie powieść z powodu niedoskonałych funkcji automatycznego kontrastu, automatycznego ustawiania ostrości i autostygmatora. Położenie automatycznie utworzonych obszarów obrazowania może być zmienne i może nie uchwycić zwrotu z inwestycji we wszystkich sekcjach.

Na etapie szycia i wyrównywania może pojawić się kilka problemów. Automatyczne zszywanie płytek mozaikowych może się nie powieść, na przykład z powodu dużej pustej przestrzeni wewnątrz próbki. Ze względu na drastyczną zmianę kształtu w 3D rejestrowanie stosów obrazów może być trudne. Specjalnie opracowane programy (np. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB lub MAPS-AT) mogą ułatwić półautomatyczne wyrównywanie 32,38,39,40. Trudniejsze sekcje można ręcznie wyrównać za pomocą oprogramowania do edycji zdjęć. Niestety, niektóre zestawy danych mogą być niemożliwe do prawidłowego wyrównania.

Duże próbki stanowią wyzwanie dla sekcji szeregowych TEM pasujących do siatek; z drugiej strony, wiele projektów nie uzasadnia długiego automatycznego pozyskiwania za pomocą FIB/SEM lub SBF-SEM. AT jest prostą alternatywą dla żmudnego TEM sekcji szeregowej, w którym zbieranie i manipulowanie sekcjami szeregowymi na płytce jest prostsze niż w przypadku siatek szczelinowych. Opracowano kilka strategii, aby ułatwić zbieranie tablic, a my udostępniamy naszą metodę rozszerzania istniejącego zestawu narzędzi. W przypadkach, w których identyfikacja zwrotu z inwestycji jest trudna, AT-SEM zapewnia fundamentalną przewagę, dzięki skutecznemu badaniu przesiewowemu próbek, w których wymagana jest rozdzielczość w skali organelli w 50 do 500 sekcjach. W przypadku większych ilości strategie automatycznego odbioru AT mogą być efektywnie zbierane, jeśli wymagane jest więcej sekcji. Próbki AT mogą być wielokrotnie obrazowane, co ułatwia celowe obrazowanie obszarów o wysokiej rozdzielczości na podstawie wcześniej uzyskanych obrazów przeglądowych. Uważamy, że proponowana tutaj ukierunkowana analiza i zmniejszone nadpróbkowanie przez AT/SEM zmniejsza wymagania dotyczące pracy i przechowywania danych. Ostatecznie biblioteki sekcji mogą być gromadzone i utrzymywane w celu późniejszego ponownego wykorzystania i konsultacji. W przypadku pozyskiwania objętości podejścia FIB lub SBF-SEM stanowią doskonałe rozwiązanie, gdy zwrot z inwestycji jest łatwy do zidentyfikowania na powierzchni bloku lub gdy do analizy potrzebne są duże objętości 3D. Jednak FIB/SBF-SEM są mniej wydajne, gdy obraz stosu o wysokiej rozdzielczości musi być zbierany ze zdefiniowanego zwrotu z inwestycji w ukierunkowany sposób. Podsumowując, zaproponowane metody badań przesiewowych próbek AT oraz wykorzystanie obrazów przeglądowych o średniej rozdzielczości pozwalają na ograniczenie akwizycji obrazu do odpowiednich części matrycy sekcji. Precyzyjne celowanie w obszary obrazowania skraca czas uzyskiwania danych i upraszcza ich analizę.

Podsumowując, chociaż koncepcja AT/SEM nie jest nowa, jej zastosowanie nadal nie jest tak powszechne, jak sugerowałyby jej zalety. Ogólnie rzecz biorąc, stanowi ona procedurę uzupełniającą w stosunku do innych istniejących metod EM. AT/SEM jest kompatybilny z najszerszym zakresem protokołów przygotowania próbek i procesów obrazowania i może być wykonywany na dowolnym mikroskopie FIB/SEM lub SBF-SEM jako technika towarzysząca. W tym artykule skoncentrowaliśmy się na AT do rejestrowania danych ultrastrukturalnych z próbek, które mają mniejsze szanse na pomyślne rozwiązanie za pomocą innych metod. Mamy nadzieję, że opisana procedura wygodnego zbierania sekcji i znacznie zautomatyzowanych strategii pozyskiwania pomoże w pierwszych próbach tym, którzy nigdy nie zetknęli się z tą metodą i pomoże ją udoskonalić tym, którzy mają już pewne doświadczenie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting
AT nóż do cięcia	Diatome	DUATS3530	Diatome Nóż Jumbo
Diamentowy nóż do przycinania 90°	Diatome	DTB90	Przycinanie diatomu 20° Nóż do szkła
Klej kontaktowy Pattex	Pattex	PCL3C
Wafel silikonowy	Ted Pella	16015	Rezystancja: 1-30 Ohm Typ P: (bor) (1 pierwotny płaski) Chropowatość: 2 nm Brak powłoki wierzchniej SiO2 TTV: = < 20 &mikro; m Wafel jest jednostronnie polerowany
Ultramikrotom	Leica UC6	Alternatywa: Leica UC7
Zestaw do cięcia płytek półprzewodnikowych	EMS	7642	- EMF - Tasak do małych próbek, nr kat. 7652
Akwizycja obrazu
FESEM	Thermo Fischer Helios	1072419	Alternatywy: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Mapy 3 dla SEM z korelacyjnym przepływem pracy & Tomografia macierzowa	Thermo Fisher Scientific	1135932	Maps zapewnia automatyzację procesów obrazowania SEM i umożliwia importowanie danych innych firm dla CLEM i nawigacji.
Image analysis
Amira x.y	Thermo Fisher Scientific	1131599	Amira to oprogramowanie do wizualizacji i analizy danych 3D z kilkoma praktycznymi funkcjami do rekonstrukcji danych tomografii matrycowej.
Przetwarzanie obrazu	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)	IMOD, MIB (Zobacz tekst, aby uzyskać referencje)