Artykuł metodologiczny

Model obrzęku limfatycznego mysiego ogona

DOI:

10.3791/61848

⸱

10 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Indiana Center for Regenerative Medicine and Engineering, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrzęk limfatyczny to obrzęk kończyn spowodowany dysfunkcją układu limfatycznego. Opisujemy przewlekły model obrzęku limfatycznego mysiego ogona i nowatorskie zastosowanie technologii nanotransfekcji tkanek (TNT) do dostarczania ładunku genetycznego do ogona.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrzęk limfatyczny to obrzęk kończyn spowodowany dysfunkcją układu limfatycznego. Dotknięta chorobą kończyna powiększa się z powodu nagromadzenia płynu, tkanki tłuszczowej i zwłóknienia. Nie ma lekarstwa na tę chorobę. Do badania obrzęku limfatycznego wykorzystano model ogona myszy wykorzystujący ogniskowe wycięcie skóry na pełnej grubości w pobliżu podstawy ogona, powodujący obrzęk ogona. Jednak model ten może powodować budowę naczyń krwionośnych i w konsekwencji martwicę ogona oraz wczesne ustąpienie obrzęku ogona, co ogranicza jego kliniczną translatowalność. Model przewlekłego obrzęku limfatycznego mysiego ogona wywołuje utrzymujący się obrzęk limfatyczny przez 15 tygodni i niezawodną perfuzję do ogona. Ulepszenia tradycyjnego modelu obrzęku limfatycznego mysiego ogona obejmują 1) precyzyjne wycięcie pełnej grubości i wycięcie limfy za pomocą mikroskopu chirurgicznego, 2) potwierdzenie pooperacyjnej perfuzji tętniczej i żylnej za pomocą plamki laserowej o wysokiej rozdzielczości oraz 3) ocenę funkcjonalną za pomocą limfangiografii laserowej w bliskiej podczerwieni w zieleni indocyjaninowej. Wykorzystujemy również technologię nanotransfekcji tkanek (TNT) do nowatorskiego, niewirusowego, przezskórnego, ogniskowego dostarczania ładunku genetycznego do układu naczyniowego ogona myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrzęk limfatyczny to obrzęk kończyn spowodowany dysfunkcją układu limfatycznego. Kończyna dotknięta chorobą powiększa się z powodu nagromadzenia płynu, tkanki tłuszczowej i zwłóknienia1. Obrzęk limfatyczny dotyka 250 milionów ludzi na całym świecie2,3,4. Szacuje się, że u 20-40% pacjentów leczonych z powodu nowotworów złośliwych, takich jak rak piersi, czerniak, nowotwory ginekologiczne/urologiczne lub mięsaki, rozwija się obrzęk limfatyczny2,4,5. Zachorowalność na obrzęk limfatyczny obejmuje nawracające infekcje, ból i deformację6. Nie ma lekarstwa na tę postępującą, trwającą całe życie chorobę. Obecne terapie są różnie skuteczne7 i obejmują kompresję, pełną terapię obkurczającą przekrwienie przez fizjoterapeutów, zabiegi wycinające i operacje mikrochirurgiczne, w tym transfer unaczynionych węzłów chłonnych i obejście limfatyczne żylne7,8,9,10,11,12,13,14. Idealne leczenie obrzęku limfatycznego nie zostało jeszcze odkryte.

Badanie mechanizmu i terapii obrzęku limfatycznego zostało ograniczone. Średni okres opóźnienia w wystąpieniu urazu limfatycznego wynosi jeden rok po urazie limfatycznym15,16 i większość osób, które doświadczają jatrogennego urazu podczas promieniowania i operacji, nie rozwija obrzęku limfatycznego4,6,17. Chociaż opisano duże modele zwierząt, w tym psów, owiec i świń18,19,20, model ogona myszy jest najczęściej stosowany ze względu na łatwość, koszt i powtarzalność. Modele mysie do badania obrzęku limfatycznego obejmują model ogona, ablację limfatyczną za pośrednictwem toksyny błonicy oraz rozwarstwienie węzłów chłonnych pachowych lub podkolanowych21,22,23,24,25,26. Większość modeli ogonów wykorzystuje ogniskowe, pełnej grubości wycięcie skóry z przecięciem kanału limfatycznego, które jest wykonywane w pobliżu podstawy ogona22, co skutkuje obrzękiem ogona i cechami histologicznymi podobnymi do ludzkiego obrzęku limfatycznego24,27,28,29. Jednak standardowy model mysiego ogona zazwyczaj ustępuje spontanicznie w ciągu zaledwie 20 dni i towarzyszy mu okresowa martwica ogona30. Model ogona myszy z obrzękiem limfatycznym przedłuża utrzymujący się obrzęk limfatyczny poza 15 tygodni, wykazuje potwierdzoną drożność tętnic i żył oraz umożliwia ocenę funkcjonalnej dysfunkcji układu limfatycznego.

Model obrzęku limfatycznego z mysim ogonem pozwala na ocenę nowych metod leczenia obrzęku limfatycznego. Strategie oparte na genach zostały wykorzystane w modelu mysim, w którym pośredniczą wektory wirusowe31,32. Wykorzystujemy również nowatorską technologię nanotransfekcji tkanek (TNT) do dostarczania ładunku genetycznego do ogona myszy z obrzękiem limfatycznym. TNT ułatwia bezpośrednie, przezskórne dostarczanie genów za pomocą chipa z nanokanałami w szybko skoncentrowanym polu elektrycznym33,34,35,36. Model obejmuje użycie TNT2.0, aby umożliwić ogniskowe dostarczanie genów potencjalnych terapii opartych na genach do miejsca uszkodzenia układu limfatycznego ogona myszy35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na zwierzętach. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee. Zwierzęta trzymano w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność z jedzeniem i wodą ad libitum.

1. Chirurgiczne uszkodzenie układu limfatycznego mysiego ogona

  1. Użyj ośmiu tygodniowych myszy C57BL/6 o równym rozkładzie płci.
  2. Umieść mysz w znieczuleniu ogólnym w komorze indukcyjnej z 3-4% izofluranem w 100% tlenie, a następnie sedacją podtrzymującą w 1-3% podczas zabiegu.
  3. Podawać podskórnie 0,5 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (SR) w celu kontroli bólu.
    UWAGA: Dodatkowe leki przeciwbólowe podawane po operacji: karprofen raz na 24 h przez co najmniej 48 h i bupiwakaina raz po wykonaniu nacięcia lub przed zamknięciem nacięcia, aplikowane przez kapanie na brzegi skóry (utrzymuje się do 4 – 6 h).
  4. Ustaw mysz grzbietowo i przygotuj ogon 70% alkoholem izopropylowym.
  5. Przed zabiegiem zmierzyć średnicę ogona w odstępach co 5 mm, zaczynając 20 mm od podstawy ogona za pomocą suwmiarki. Pomiary te zostaną użyte do obliczenia objętości przy użyciu równania ściętego stożka37.
  6. Zaznaczyć wycięcie o obwodzie 3 mm na ogonie w odległości 20 mm od podstawy.
  7. Wykonaj skrupulatne wycięcie skóry o pełnej grubości 3 mm za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego (rozmiar 15), pozostawiając całe znajdujące się pod nią naczynia krwionośne nienaruszone pod mikroskopijnym powiększeniem chirurgicznym. Naciąć górny znak obwodowy (20 mm od podstawy ogona) najpierw przez skórę właściwą, a następnie nacięcie na całej grubości obwodowej 3 mm w kierunku dystalalnym do pierwszego nacięcia.
    1. Wykonaj prostopadłe pionowe nacięcie o pełnej grubości, aby połączyć dwa nacięcia. Użyj drobnoziarnistego podbieracza, aby uchwycić krawędź natarcia i użyj mikronożyczek, aby ostrożnie wypreparować głęboko w płaszczyźnie jałowej do skóry właściwej i powierzchownie do żyły przydankowej.
  8. Wstrzyknąć 0,1 ml błękitu izosulfanowego (1%) podskórnie proksymalnie do końca ogona.
  9. Zidentyfikuj dwa kanały limfatyczne przylegające do bocznych żył ogonowych pod mikroskopem operacyjnym. Naczynia limfatyczne będą niebieskie z powodu wstrzyknięcia izosulfanu. Przeciąć naczynia limfatyczne za pomocą prostych nożyczek mikrochirurgicznych. Użyj nożyczek, aby ostrożnie wypreparować płaszczyznę między żyłą boczną a limfatyczną. Następnie przełóż końcówkę jednego ostrza nożyczek między naczyniem limfatycznym a żyłą boczną i zamknij ostrza, aby przeciąć naczynie limfatyczne
    10. .
  10. Opatrunek rany ogona należy opatrzyć sterylnym, przylegającym, przezroczystym opatrunkiem. Codziennie sprawdzaj nacięcia pooperacyjne, aby upewnić się, że nie są zakażone lub krwawiące, i zapewnij pielęgnację rany przez 2 tygodnie.
  11. Trzymaj zwierzęta pojedynczo, aby zapobiec dalszym urazom ogona i zapobiec gryzieniu się zwierząt, co mogłoby prowadzić do powikłań chirurgicznych.

2. Ocena naczyń ogonowych za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem

plamkowym
  1. Znieczulij mysz jak w kroku 1.2.
  2. Aby użyć obrazowania z kontrastem laserowym do wizualizacji unaczynienia ogona, ustaw szerokość na 0,8 cm, wysokość na 1,8 cm, gęstość punktów na wysoką, liczbę klatek na sekundę na 44 obrazy/sekundę, czas na 30 sekund, a kolorowe zdjęcie na 1 na 10 sekund.
  3. Oceń perfuzję żylną i tętniczą pod kątem drożności. Jakościowo należy zobrazować ciągłość przepływu.

3. Funkcjonalna ocena limfy za pomocą angiografii laserowej w bliskiej podczerwieni

  1. Znieczulić zwierzę jak w kroku 1.2
  2. Odpuścić zieleń indocyjaninową (ICG) (25 mg/10 ml) i podać 0,1 ml podskórnie w dystalny ogon myszy w pobliżu końcówki.
  3. Przyciemnij światła w pokoju. Umieść angiografię laserową w bliskiej podczerwieni w ustawieniu buforowania, a następnie przechwytywanie na żywo.

4. Ogniskowe dostarczanie ładunku kwasu nukleinowego do ogona myszy za pomocą TNT

  1. Znieczulić zwierzę jak w kroku 1.2.
  2. Złuszczaj mysi ogon za pomocą miejscowego kremu złuszczającego skórę.
  3. Zanurzyć ogon myszy w roztworze kolagenazy (10 mg/ml) w temperaturze 37 °C na 5 minut.
  4. Załaduj DNA do zbiornika chipa TNT2.035.
  5. Umieść silikonowe urządzenie z chipem TNT2.0 w żądanym ognisku dostawy na ogonie za pomocą nanoigieł stykających się z ogonem.
  6. Umieść dodatnią sondę elektryczną w zbiorniku. Przymocować sondę ujemną do igły 30 G i wprowadzić igłę podskórnie w końcówkę do miejsca podania.
  7. Zastosuj stymulację elektryczną impulsem fali prostokątnej (impulsy 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika dla modelu ogona myszy dla trwałego obrzęku limfatycznego jest pokazana w Rysunek 1. Rysunek przedstawia odpowiednią anatomię modelu ogona myszy. Rysunek 2 pokazuje postępujący obrzęk i utrzymujący się obrzęk limfatyczny w ogonie myszy po indukcji obrzęku limfatycznego. Objętość ogona myszy, obliczona za pomocą równania ściętego stożka, osiąga szczyt w 4 tygodniu i utrzymuje się do 6 tygodnia, po czym następuje stopniowa poprawa, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrzęk limfatyczny jest klasyfikowany jako pierwotne (wrodzone) lub wtórne (jatrogenne uszkodzenie układu chłonnego)38,39. Wtórny obrzęk limfatyczny stanowi 99% przypadków39. Wtórny obrzęk limfatyczny jest najczęściej spowodowany infekcją (filariozą) lub leczeniem poonkologicznym za pomocą limfadenektomii lub radioterapii 4,39. Translacyjny model zwierzęcy jest trudny w przypadku w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurujących ze sobą konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty przyznane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Chirurgów Plastycznych Stypendium Akademickie i Departament Obrony W81XWH2110135 do AHH. Grant Fundacji Edukacji i Badań nad Chirurgią Estetyczną dla MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 i R01DK125835 dla CKS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tegaderm Film1626W
Leica, Wetzlar, NiemcyMSV266
Opatrunek adherentny (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626 W
(system Pericam PSI)Perimed AB, Sztokholm, Szwecja)PSIZ
Laser bliskiej podczerwieni (LUNA)Stryker (dawniej Novadaq Technologies, Toronto, Kanada)LU3000
C57BL/6Laboratories000664
Micro-Adson - 1x2 zębyFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Skalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Igła jednorazowa 30GX1Nożyczki operacyjne Fischer Scientific305128
Fischer Scientific12-460-796
Kleszczyki jubilerskie chirurgiczne, Sklar 4-1/2 wFischer Scientific50-118-4255
Nożyczki sprężynowe - proste/ostre-ostre/ 8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (limfazuryna)  50 mg/5mlMylan67457-220-05
Mikroskop chirurgiczny Plamka laserowa Myszy Jackson

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
  2. Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597(2014).
  3. Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. Filariasis: diagnosis and treatment. Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).
  4. Rockson, S. G., Rivera, K. K. Estimating the population burden of lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).
  5. Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
  6. Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 8 Suppl 2237-2249 (2012).
  7. Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
  8. Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468(2017).
  9. Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
  10. Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
  11. Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 3 Suppl 209-218 (2016).
  12. Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
  13. Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  14. Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  15. Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
  16. Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 4S Suppl 3 234-241 (2019).
  17. Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
  18. Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
  19. Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
  20. Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. Experimental lymphedema in dogs. Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).
  21. Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
  22. Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254(2006).
  23. Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
  24. Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
  25. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095(2016).
  26. Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405(2019).
  27. Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
  28. Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940(2012).
  29. Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
  30. Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
  31. Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
  32. Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
  33. Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
  34. Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157(2020).
  35. Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
  36. Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220(2020).
  37. Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
  38. Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
  39. Maclellan, R. A., Greene, A. K. Lymphedema. Seminars in Pediatric Surgery. 23 (4), 191-197 (2014).
  40. Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  41. Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podwi zywanie naczy limfatycznychobrazowanie laserowe metod plamkowanialimfangiografia z u yciem zielonej indocyjaninynanotransfekcja tkanekwyci cie pe nej grubo cipomiar obj to ci ogonawysokorozdzielcze obrazowanie laserowe metod plamkowanialimfangiografia w bliskiej podczerwienidostarczanie adunku genetycznego

Powiązane artykuły