Artykuł metodologiczny

Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara

DOI:

10.3791/61849

⸱

24 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, York University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodologie testu Ramsaya, mikroelektrody selektywne jonowo, technikę skanowania elektrod jonoselektywnych (SIET) oraz testy skurczowe in vitro, stosowane do badania układu wydalniczego dorosłych komarów, składającego się z kanalików Malpighiego i jelita tylnego, do wspólnego pomiaru szybkości wydzielania jonów i płynów, aktywności skurczowej i transepitelowego transportu jonów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad fizjologią owadów, szczególnie u tych gatunków, które są wektorami patogenów wywołujących choroby u ludzi i innych kręgowców, stanowią podstawę do opracowania nowych strategii zwalczania szkodników. W tym miejscu opisano szereg metod, które są rutynowo stosowane do określania funkcjonalnych ról neuropeptydów i innych czynników neuronalnych (tj. amin biogennych) w układzie wydalniczym komara, Aedes aegypti. Kanaliki Malpighiego (MT), odpowiedzialne za pierwotne tworzenie moczu, mogą funkcjonować przez wiele godzin po usunięciu z komara, co pozwala na pomiary wydzielania płynów po leczeniu hormonalnym. W związku z tym test Ramsaya jest przydatną techniką pomiaru szybkości wydzielania z izolowanych MT. Mikroelektrody jonoselektywne (ISME) mogą być sekwencyjnie używane do pomiaru stężeń jonów (tj. Na+ i K+) w wydzielanym płynie. Test ten pozwala na pomiar kilku MT w danym momencie, określając działanie różnych hormonów i leków. Technika skanowania elektrod jonoselektywnych wykorzystuje ISME do pomiaru napięcia reprezentatywnego dla aktywności jonowej w niewymieszanej warstwie przylegającej do powierzchni narządów transportujących jony w celu określenia transepitelicznego transportu jonów w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Metodę tę można wykorzystać do zrozumienia roli hormonów i innych regulatorów we wchłanianiu lub wydzielaniu jonów w nabłonku. Testy skurczu jelita grubego są również przydatnym narzędziem do charakteryzowania mioaktywnych neuropeptydów, które mogą zwiększać lub zmniejszać zdolność tego narządu do usuwania nadmiaru płynów i odpadów. Łącznie metody te zapewniają wgląd w to, w jaki sposób układ wydalniczy jest regulowany u dorosłych komarów. Jest to ważne, ponieważ koordynacja funkcjonalna narządów wydalniczych ma kluczowe znaczenie w pokonywaniu wyzwań, takich jak stres związany z wysuszeniem po eklozji i przed znalezieniem odpowiedniego żywiciela kręgowców w celu uzyskania posiłku z krwi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymanie poziomu soli i wody u owadów pozwala im odnieść sukces w wielu niszach ekologicznych i środowiskowych, wykorzystując różne strategie żywieniowe1. Większość owadów wyewoluowała mechanizmy regulujące skład ich hemolimfy w wąskich granicach, aby sprostać różnym wyzwaniom związanym z ich konkretnym środowiskiem2. Owady lądowe często stają przed wyzwaniem oszczędzania wody, a układ wydalniczy ulega antydiurezie, aby zapobiec utracie wody i niektórych niezbędnych soli, unikając w ten sposób wysuszenia. Natomiast diureza występuje, gdy owad żeruje i jest narażony na nadmiar wody i potencjalnie sole3,4. Dzięki wyspecjalizowanemu i wysoce aktywnemu układowi wydalniczemu owady wykształciły mechanizmy regulacyjne działające w celu przeciwdziałania ich wyzwaniom osmoregulacyjnym. U dorosłych komarów Aedes aegypti układ wydalniczy składa się z kanalików Malpighiego (MT) i jelita tylnego, z których ten ostatni składa się z jelita krętego przedniego i tylnej odbytnicy5. MT są odpowiedzialne za wytwarzanie moczu pierwotnego, zwykle bogatego w NaCl i/lub KCl. Mocz pierwotny jest następnie modyfikowany przez procesy wydzielnicze i reabsorpcyjne, gdy przemieszcza się w dół kanalika i wchodzi do jelita tylnego5. Końcowe odchody mogą być hiper- lub hiposmotyczne do hemolimfy, w zależności od warunków żywienia/środowiska, i są wzbogacone w toksyczne i azotowe odpady2.

MTs są idealne do badania wielu cech transportu płynu nabłonkowego i substancji rozpuszczonej, ponieważ realizują bardzo różnorodne funkcje transportowe i wydalnicze2,6. Poprzez regulację hormonalną2, MT działają poprzez wydzielanie jonów i innych substancji rozpuszczonych z krwi do kanalika lumen7, zapewniając gradient osmotyczny umożliwiający transport wody przez akwaporyny8,9, który wspólnie tworzy pierwotny mocz, zanim dotrze do reabsorpcji hindgut2. W ten sposób, zbierając wydzielany płyn z izolowanych MT, można w sposób ciągły monitorować transepiteliczny transport płynu i jonów. Pomiar szybkości wydzielania i składu moczu dostarcza informacji na temat mechanizmów odpowiedzialnych za transnabłonkowy transport jonów i płynów. Popularną metodą badania szybkości wydzielania płynów jest test Ramsaya, który został po raz pierwszy wprowadzony przez Ramsaya w 1953 roku10. W tej metodzie dystalny (zamknięty) koniec kanalika jest traktowany hormonem (lub innym badanym związkiem/lekiem), podczas gdy proksymalny (otwarty) koniec jest owinięty wokół szpilki w nasyconym wodą oleju parafinowym, który wydziela pierwotny mocz, gromadząc się w postaci kropli na końcu szpilki. Izolowane MT są w stanie przetrwać i funkcjonować przez długi czas (do 24 godzin) w zoptymalizowanych warunkach in vitro, co czyni je odpowiednimi i skutecznymi modelami do pomiaru wydzielania płynów. Owady mają otwarty układ krążenia, dlatego MT można łatwo rozciąć i usunąć, ponieważ zwykle swobodnie unoszą się w klasie hemolimf6. Dodatkowo, z wyjątkiem mszyc - które nie mają MTs11 - liczba MT u danego gatunku owadów może się znacznie różnić od czterech do setek (pięć u komarów Aedes), co pozwala na wielokrotne pomiary jednego owada.

MTs u komarów Aedes, podobnie jak inne owady endopterygote, składają się z dwóch typów komórek tworzących prosty nabłonek2,12; duże główne komórki, które ułatwiają aktywny transport kationów (tj. Na+ i K+) do światła, oraz cienkie komórki gwiaździste, które pomagają w transepitelialnym wydzielaniu Cl-13. MT nie są unerwione2, a zamiast tego są regulowane przez kilka hormonów, w tym zarówno czynniki moczopędne, jak i antydiuretyczne, co pozwala na kontrolę transportu jonów (głównie Na+, K+ i Cl-) oraz osmotycznie zobowiązaną wodę2. W licznych badaniach analizowano regulację hormonalną MT Aedes, aby zrozumieć rolę czynników endokrynnych w transepitelium transportu14,15,16,17,18. Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, protokoły w niniejszym dokumencie pokazują wpływ różnych czynników hormonalnych na wyizolowane MT od dorosłych samic komarów A. aegypti, w tym zarówno kontrolę moczopędną, jak i antydiuretyczną (Rysunek 1). Test Ramsaya służy do pokazania, w jaki sposób hormon antydiuretyczny, AedaeCAPA-1, hamuje wydzielanie płynów MT stymulowanych przez hormon moczopędny 31 (DH31) (Rysunek 1).

Mniejszy rozmiar owadów wymagał opracowania mikro metod pomiaru aktywności jonowej i stężeń w próbkach płynów lub w pobliżu powierzchni izolowanych tkanek, takich jak MT i jelita. Zaimplementowano różne metody, w tym użycie radioizotopów jonów19, co wymaga zbierania wydzielanych kropel płynu do pomiaru stężeń jonów20. Stymulowane kanaliki Aedes in vitro zazwyczaj wydzielają ~0,5 nL/min21, dlatego obsługa tak małych objętości może stanowić wyzwanie i potencjalnie powodować błąd przy przenoszeniu. W rezultacie, mikroelektrody jonoselektywne (ISME) są szeroko stosowane do pomiaru stężenia jonów w wydzielanych kropelkach MT in vitro. W tej metodzie elektroda referencyjna i ISME, wypełnione odpowiednim roztworem zasypkowym i jonoforem, są umieszczane w wydzielanej kropelce moczu w celu określenia stężenia jonów22. Zaadaptowany z Donini and associates23, ten obecny protokół wykorzystuje jonofor selektywny Na+ do pomiaru aktywności jonów w wydzielanych kropelkach ze stymulowanych MT u dorosłych komarów Aedes. Ponieważ mikroelektrody jonoselektywne mierzą aktywność jonów, dane te można wyrazić jako stężenia jonów przy założeniu, że roztwory kalibracyjne i próbki eksperymentalne mają ten sam współczynnik aktywności jonów21 (Rysunek 1B,C).

Technika Skanowania Elektrod Jonoselektywnych (SIET) również wykorzystuje ISME do pomiaru gradientów stężenia jonów w niewymieszanej warstwie przylegającej do organów, tkanek lub komórek, które transportują jony. ISME mierzą gradienty napięcia, które można następnie wykorzystać do obliczenia gradientów stężenia jonów oraz kierunku i wielkości strumienia jonów w narządzie, tkance lub komórce20. W tej technice ISME jest zamontowany na trzyosiowym manipulatorze sterowanym przez skomputeryzowane silniki mikrokrokowe, dzięki czemu jego pozycja 3D jest kontrolowana do poziomu mikrometra20. Napięcia są mierzone w dwóch punktach w warstwie niezmieszanej przy użyciu protokołu próbkowania zaprogramowanego i kontrolowanego przez oprogramowanie komputerowe. Te dwa punkty są zwykle oddalone od siebie o odległość 20–100 μm, przy czym jeden punkt znajduje się w odległości 5–10 μm od powierzchni narządu, tkanki lub komórki, a drugi punkt w odległości 20–100 μm. Różnica w wielkości napięć między dwoma punktami jest obliczana w celu uzyskania gradientu napięcia24,25,26, który jest następnie używany do obliczenia gradientu stężenia, a następnie strumienia netto za pomocą prawa Ficka24,27. Metoda ta jest przydatna do oceny transportu określonych jonów przez różne regiony jelita owada i MT lub w określonych punktach czasowych po posiłku z krwi lub ekspozycji na leczenie. Na przykład, SIET może być wykorzystany do zrozumienia, w jaki sposób procesy absorpcyjne i wydzielnicze w układzie wydalniczym komarów są regulowane przez hormony28, a także różne zachowania żywieniowe i warunki hodowli25. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem SIET ujawniły miejsca zaangażowane w transport jonów wzdłuż brodawek odbytu i odbytnicy larw i dorosłych komarów24,28. Obecny protokół, opisany wcześniej przez Paluzziego i współpracowników26, mierzy strumień Na+ przez nabłonek poduszki odbytnicy dorosłej kobiety (Rysunek 2).

Końcowy segment systemu wydalniczego komarów wymaga skoordynowanych ruchów mięśni, aby pomóc w mieszaniu jedzenia i wydzielaniu odpadów26. Niewchłanialne produkty trawienia z jelita środkowego, wraz z pierwotnym moczem wydzielanym przez MT, są przepuszczane przez zastawkę odźwiernika i dostarczane do jelita tylnego2. Spontaniczne skurcze jelita tylnego rozpoczynają się przy zastawce odźwiernika i występują w falach perystaltycznych, które są przekazywane przez jelito kręte poprzez skoordynowany skurcz mięśni okrężnych i podłużnych otaczających powierzchnię podstawy komórek nabłonka26. Wreszcie, mięśnie w odbytnicy pomagają napędzać i eliminować odpady przez kanał odbytu. Chociaż ruchliwość tylnego jelita owada jest miogeniczna, wymagając zewnątrzkomórkowego Ca2+ do wytworzenia spontanicznych skurczów, procesy te mogą być również regulowane neuronalnie26,29,30. Ta egzogenna regulacja przez układ nerwowy jest ważna po karmieniu, ponieważ zwierzę musi wydalić odpady z jelit i przywrócić równowagę hemolimfy31. W rezultacie, przeprowadzanie testów biologicznych in vitro w celu identyfikacji neuropeptydów miostymulujących lub miohamujących jest przydatne w ocenie, w jaki sposób neurochemikalia wpływają na ruchliwość jelita grubego. Obecny protokół, przeprowadzony przez Lajevardi i Paluzzi28, wykorzystuje nagrania wideo do zbadania motoryki jelita krętego w odpowiedzi na neuropeptydy (Rysunek 3). Podobnie, przetwornik siły lub konwerter impedancji może być również używany do obserwacji śladów skurczów za pomocą oprogramowania do akwizycji danych32,33. Jednak korzystanie z technologii wideo pozwala nam wizualnie ocenić narząd i dalej analizować przy użyciu podzbioru parametrów w celu określenia roli hormonów w motoryce jelita tylnego.

Korzystanie z tych technik może pomóc w scharakteryzowaniu czynników, które regulują i koordynują transport płynów i jonów wzdłuż układu wydalniczego wraz z ruchliwością jelita tylnego. Co ważne, potwierdza się funkcjonalny związek między reakcją moczopędną MT a ruchliwością jelita grubego, ponieważ stwierdzono, że hormony moczopędne, takie jak DH31 i 5HT, charakteryzujące się zdolnością do stymulowania wydzielania płynów przez MT, wykazują również działanie miotropowe wzdłuż jelita tylnego komara21,34,35. Odkrycia te podkreślają znaczenie ścisłej koordynacji między MT a jelitem tylnym podczas zdarzeń takich jak diureza poposiłkowa u owadów wymagających szybkiej eliminacji odpadów.

Tutaj opisano szczegółowe podejście do techniki testu Ramsaya do pomiaru szybkości wydzielania płynów u komara, A. aegypti, oraz użycie mikroelektrod selektywnych jonowo do określania stężeń Na+ w wydzielanym płynie MT, co w połączeniu pozwala na określenie szybkości transepitelowego transportu jonów. Dodatkowo, Technika Skanowania Elektrod Jonoselektywnych i testy skurczu jelita tylnego są opisane w celu pomiaru odpowiednio strumienia jonów i ruchliwości, co pomaga wyjaśnić regulację hormonalną jelita tylnego (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie potraw wyłożonych silikonem

UWAGA: Ten krok powinien być wykonany przed eksperymentami. Naczynia te zostaną wykonane w celu przygotowania naczynia testowego do sekcji i do eksperymentów z testem skurczowym.

  1. Przygotuj silikon za pomocą zestawu elastomerów silikonowych zgodnie z zaleceniami producenta. Wymieszaj dwuczęściowe składniki płynne w stosunku 10 do 1. Wymieszaj delikatnie i dokładnie, odwracając, ale pamiętaj, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków.
  2. Wlej elastomer silikonowy do standardowych jednorazowych naczyń do hodowli polistyrenu o średnicy 60 mm na głębokość zwykle 7–9 mm. Przygotuj tyle potraw, ile potrzeba. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą cienkiej szpilki pod mikroskopem wkrótce po wlaniu silikonu do naczyń. Umieść naczynia w bezpyłowej komorze lub szafce w temperaturze pokojowej (RT) na co najmniej 48 godzin lub w piekarniku w temperaturze 50 °C na około 4 godziny, aby utwardziły się (stwardniały) (Rysunek 5A).

2. Przygotowanie naczynia testowego Ramsaya

UWAGA: Danie może być ponownie używane od eksperymentu do eksperymentu, dlatego powtarzaj ten krok tylko wtedy, gdy naczynie jest uszkodzone lub pęka. Do sekcji używa się osobnego naczynia

.
  1. Za pomocą skalpela (ze standardowymi środkami ostrożności dotyczącymi ostrych narzędzi) utwórz studzienki w jednej z pokrytych silikonem szalek Petriego, aby przygotować szalkę testową, usuwając wystarczającą ilość silikonu, około ~5 mm, z wierzchu naczynia (powinno to zmieścić ~20 μL kropli do kąpieli). Wcześniej użyj markera permanentnego, aby zaznaczyć pozycje pod naczyniem, aby zanotować, gdzie zrobić dołki. Studzienki powinny być oddalone od siebie o ~1 cm, o średnicy około ~4 mm, aby umożliwić dopasowanie dystalnego końca kanalika. Każda studzienka będzie zawierała jedną rurkę wydzielającą płyn, dlatego naczynie zawierające 20 studzienek pozwoli na analizę do 20 MT na eksperyment.
  2. Aby przygotować kołki Minutien, umieść kołki ze stali nierdzewnej o średnicy 0,1 mm w rzędzie na kawałku taśmy opisowej, prostopadle do osi taśmy. Za pomocą nożyczek przetnij wzdłuż taśmy, tworząc równe połówki szpilek. Użyj pół szpilki do każdego dołka.
  3. Za pomocą pary kleszczy włóż każdą połówkę szpilki do pokrytego silikonem naczynia testowego, obok każdej studzienki. W zależności od długości kanalika owadziego włóż półszpilkę w odległości, która pozwoli dystalnemu końcowi kanalika zanurzyć się w soli fizjologicznej, a bliższy koniec owinąć się wokół szpilki. Ten krok można wykonać pod mikroskopem, aby łatwo zwizualizować studnie. Kołki można ponownie wykorzystać, jednak w przypadku uszkodzenia lub zgubienia należy wymienić półszpilkę. (Rysunek 5B)

3. Przygotowanie naczynia SIET pokrytego poli-L-lizyną

UWAGA: Ten krok jest ważny, aby organ przylegał do dna naczynia podczas pomiarów SIET, zapewniając, że miejsce pomiaru pozostaje takie samo dla każdej próbki. Przygotowanie tych potraw powinno nastąpić co najmniej 2 dni przed eksperymentami. Każde danie powinno być użyte tylko raz przy zastosowaniu konkretnego zabiegu. Usunąć po każdej próbce lub jeśli powłoka poli-L-lizyny jest zdrapana lub uszkodzona.

  1. Dla każdej próbki umieścić szalkę Petriego o średnicy 35 mm na równej powierzchni. Zdejmij pokrywki i odpipetuj 70 μl poli-L-lizyny (0,1 mg/ml) na środku każdego naczynia. Załóż pokrywki z powrotem i pozostaw poli-L-lizynę do wyschnięcia (~48 godzin) w spokoju.
  2. Po wyschnięciu oznacz dno naczynia okręgiem obrysowującym wysuszoną powłokę poli-L-lizyny, aby lepiej zobrazować, gdzie należy umieścić wycięty narząd po sekcjach. Jeśli to konieczne, aby zminimalizować objętość roztworów soli fizjologicznej i roztworów zabiegowych w eksperymentach, użyj gorącego pistoletu do klejenia, aby otoczyć powłokę poli-L-lizyny, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na ruch elektrody i wykonanie pomiarów tła (wystarczy ~20–25 mm średnicy sklejonego koła). Te powlekane naczynia mogą być przechowywane w nieskończoność w temperaturze RT (Rysunek 5C).

4. Przygotowanie naczyń testowych Ramsaya i skrócenia do eksperymentów

UWAGA: Naczynie może być ponownie użyte (pod warunkiem odpowiedniego umycia w celu usunięcia wcześniej używanej soli fizjologicznej), dlatego powtórz ten krok tylko wtedy, gdy talerz jest uszkodzony lub pęknie. Do sekcji używa się osobnego naczynia. Ten krok jest wykonywany w dniu eksperymentu.

  1. Do naczynia do próby skurczu użyj skalpela (ze standardowymi środkami ostrożności dotyczącymi ostrych narzędzi), utwórz dołki w jednej z pokrytych silikonem szalek Petriego, aby przygotować szalkę testową. Ustaw skalpel pod takim kątem, aby dołki przybrały kształt trójkąta, aby ułatwić przypięcie wypreparowanej tkanki do krawędzi. Studzienki powinny być wystarczająco duże, aby pomieścić do 250 μl i zmieścić cały przewód pokarmowy (zamiast kopać zbyt głęboko, poszerz studzienkę do około 0,5–1 cm) (Rysunek 5D).
  2. W przypadku płytki Ramsaya użyj pipety i napełnij studzienki do 20 μl roztworu (18 μl 1X soli fizjologicznej Aedes: pożywki Schneidera przygotowanej w kroku 5.2 i 2 μl hormonu/leku). W przypadku niestymulowanych kontroli napełnij studzienki 20 μl 1X soli fizjologicznej Aedes: pożywki Schneidera. Po napełnieniu wszystkich studzienek wlej uwodniony olej mineralny do naczynia testowego, aż studzienki i kołki Minutien zostaną zanurzone. Użyj końcówki pipety o pojemności 20 μl, aby usunąć lub usunąć pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócać wydzielane kropelki.

5. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 2X sól fizjologiczną Aedes aegypti i 10x glukozę, zgodnie z opisem w Tabeli 1, zaadaptowaną z Petzel and associate36. Roztwory podstawowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować zapasy robocze z 1X soli fizjologicznej Aedes aegypti (Tabela 1) i przechowywać w temperaturze 4 °C. W dniu eksperymentu pozwól, aby zapasy robocze dotarły do RT przed użyciem. Przygotuj świeże, jeśli istnieją jakiekolwiek oznaki rozwoju grzybów lub bakterii.
  2. Aby przygotować kroplę do kąpieli, należy zmieszać sól fizjologiczną Aedes (z kroku 5.1) z pożywką Schneidera w stosunku 1:1. Przygotuj w małych porcjach, w zależności od tego, ile jest potrzebne. Przechowuj pożywkę Schneidera w lodówce, wyrzuć, jeśli są jakiekolwiek oznaki rozwoju grzybów lub bakterii. (Ten krok należy wykonać w dniu eksperymentu).
  3. Do pomiarów strumienia Na+ za pomocą SIET, należy przygotować zmodyfikowaną sól fizjologiczną Aedes wolną od Ca2+ (Tabela 2), jak opisano wcześniej26.

6. MT komarów i rozwarstwienia jelita grubego

  1. W przypadku sekcji dorosłych komarów zbierz poczwarkę w małej zlewce i umieść w słoiku zawierającym roztwór sacharozy do karmienia. Aby określić wiek komara, wyizoluj wyklute komary i umieść je w innym słoiku, odnotowując wiek i płeć komarów do przyszłych sekcji.
  2. Na krótko umieść komary do wycięcia na podkładce CO2 i poczekaj, aż przestaną reagować. Za pomocą cienkich kleszczy podnieś komara z nogi lub skrzydła i umieść go na pokrytym elastomerem silikonowym naczyniu preparacyjnym przygotowanym w kroku 1. Umieść komara po jednej stronie (boczną stroną do góry) i za pomocą szpilki Minutien wbij się w klatkę piersiową, aby zabezpieczyć komara na miejscu. Opcjonalnie usuń skrzydła i nogi z komarów, aby ułatwić sekcję.
  3. Za pomocą pipety Pasteura dodaj kroplę soli fizjologicznej RT Aedes, aby całkowicie zanurzyć komara w soli fizjologicznej. Upewnij się, że sekcja znajduje się w całości pod solą fizjologiczną (patrz Tabela 1, aby uzyskać informacje na temat sporządzania soli fizjologicznej Aedes).
  4. Umieść naczynie preparacyjne pod mikroskopem stereoskopowym. Uszczypnij ostatni segment brzucha drobnymi kleszczami i powoli odsuń się od komara. Ten krok jest ułatwiony przez jednoczesne patrzenie pod mikroskop. Jelito środkowe, połączone z MT i jelitem tylnym, powinno być odsłonięte (Ryc. 6).
  5. W przypadku testu Ramsaya ostrożnie usuń każdą kanalik z połączenia jelita środkowego i tylnego, uważając, aby nie uszkodzić narządów. Użyj ostrych, drobnych kleszczyków, aby usunąć kanaliki pojedynczo – nie używaj uszkodzonych kanalików do testu. (Patrz krok 7, aby zapoznać się z konfiguracją).
  6. W przypadku SIET należy wyciąć jelito tylne w soli fizjologicznej Aedes wolnej od Ca2+ (krok 5.3). Upewnij się, że naczynie z poli-L-lizyną ma również stałą objętość soli fizjologicznej Aedes wolnej od Ca2+. Ostrożnie usuń naskórek z odbytnicy i umieść jelito tylne (może usunąć wszelkie inne przyczepione narządy, w zależności od tego, co jest mierzone) w naczyniu z poli-L-lizyny. Jeśli mierzysz transport jonów wzdłuż nabłonka opuszki doodbytniczej, ustaw stronę skierowaną w stronę hemolimfy co najmniej jednej elektrody doodbytniczej, aby była dostępna dla mikroelektrody (Rysunek 7).
    1. Używając kleszczy, aby chwycić najbardziej tylny koniec, sprowadź jelito tylne na dno naczynia (nie uszkadzając żadnych struktur, które będą mierzone). Gdy tylko narząd dotknie płaszcza poli-L-lizyny, przylgnie. Ta wypreparowana próbka jest gotowa do pomiarów. (Patrz kroki 14–16, aby zapoznać się z konfiguracją i pomiarami SIET).
  7. W przypadku testu skurczu jelita krętego upewnij się, że jelito tylne pozostaje przyczepione do jelita środkowego podczas rozwarstwienia (Rysunek 4D). Ostrożnie usuń MT, aby mieć niezakłócony widok na jelito tylne. Narząd ten zostanie przeniesiony do nowego naczynia przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 4.1. (Patrz krok 17, aby uzyskać filmy z testów).

7. Konfiguracja testu Ramsaya

  1. Za pomocą końcówki kleszczy ostrożnie podnieś proksymalny (otwarty) koniec kanalika, udrapując go na kleszczach (nie ściskaj kanalika) i przenieś do dołka naczynia testowego. Ten krok można również wykonać za pomocą sond z drobnego szkła.
  2. Po zanurzeniu kanalika w studzience podnieś bliższy koniec kanalika za pomocą kleszczy, usuń go z kropli do kąpieli i owiń koniec wokół szpilki. Owiń kanalik wokół szpilki dwukrotnie – i utrzymuj długość kanalika pozostałą w kropli kąpieli spójną z innymi kanalikami. W tym momencie dystalny koniec kanalika powinien znajdować się w kropli kąpieli, podczas gdy bliższy koniec owinięty wokół szpilki z dala od kropli kąpieli, umożliwiając gromadzenie się wydzielanego płynu na czubku szpilki od otwartego bliższego końca.
  3. Natychmiast po owinięciu kanalika wokół szpilki zanotuj dołki (np. A, B, C), czas (który będzie czasem rozpoczęcia, kiedy płyn zacznie być wydzielany z kanalika) oraz wszelkie inne informacje identyfikujące (np. hormon, genotyp itp.).
  4. Każdy komar ma pięć kanalików, dlatego powtórz kroki 7.1–7.3 z resztą kanalików. W przypadku leczenia kontrolnego i eksperymentalnego należy podzielić pięć kanalików w ramach różnych zabiegów. Kontynuuj następne rozbiorzenie, aż cała miska testowa zostanie wypełniona. Przy odrobinie wprawy, technika ta powinna zająć zazwyczaj 2-3 minuty na rozcięcie kanalików, przeniesienie ich do soli fizjologicznej do kąpieli i owinięcie wokół szpilki, tworząc w ten sposób 2-3 minutową różnicę w czasie rozpoczęcia między każdym kanalikiem.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu skalibruj mikrometr okularowy mikroskopu za pomocą mikrometru stolikowego pod wybranym obiektywem. Wydzielane kropelki są rutynowo mierzone pod 40-50-krotnym powiększeniem całkowitym.
  5. Po wyznaczonym czasie inkubacji można zmierzyć wydzielaną kroplę. Za pomocą mikrometru ocznego mikroskopu zmierz i zapisz średnicę wydzielanej kropli. Obliczyć średnicę (d) wydzielanej kropli, mnożąc średnicę jednostki gałki ocznej zmierzoną przez przeliczenie kalibracji (tabela 3). Oblicz objętość wydzielanej kropli za pomocą równania V = πd3/6.
  6. Aby obliczyć szybkość wydzielania (nL min-1), użyj równania, szybkość wydzielania płynu = V/czas wydzielania, gdzie V to objętość wydzielanej kropelki obliczona w kroku 7.5, a czas wydzielania odnosi się do okresu inkubacji kanalika.

8. Ustawienia ISME

  1. Umieść mikromanipulatory po obu stronach mikroskopu stereoskopowego, aby ustawić stację ISME. Chlorowanie srebrnych drutów można osiągnąć poprzez zanurzenie w roztworze chlorku żelaza i nawleczenie każdego srebrnego drutu do każdego z uchwytów mikroelektrod (lub przylutowanie drutów do koncentrycznych, jeśli to konieczne). Powtórz ten krok, gdy srebrne druty staną się niechlorkowane.
  2. Podłącz srebrne przewody do amplifier, który odczyta do systemu akwizycji danych. Skonfiguruj i skalibruj system zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku zwiększonych zakłóceń elektrycznych należy użyć odpowiednio uziemionej klatki Faradaya.

9. Przygotowanie mikroelektrod dla ISME i SIET

  1. Za pomocą ściągacza do pipet P-97 Flaming Brown wyciągnij ~5–6 kapilar ze szkła borokrzemianowego bez włókien (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 1,12 mm, długość 100 mm) końcówką 1–5 μm. Będą one używane jako mikroelektrody jonoselektywne. W przypadku mikroelektrod SIET otrzymana elektroda powinna mieć otwór końcówki ~5 μm, charakteryzujący się krótkim trzpieniem.
  2. W okapie umieść mikroelektrody na płycie grzejnej (ostrożnie dołując, aby nie złamać końcówek elektrod). Dodać dichlorodimetylosilan do szklanej szalki Petriego o średnicy 15 cm i odwrócić elektrody na płycie grzejnej. Użyj dichlorodimetylosilanu do silanizacji elektrod selektywnych jonowo, dodając hydrofobową powłokę do wszystkich powierzchni elektrody, umożliwiając jej zachowanie hydrofobowego jonoforu37. Nieużywane elektrody silanizowane można pozostawić na kilka tygodni; Dlatego ten krok jest wykonywany co kilka tygodni lub w przypadku nowo pobranych elektrod.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z dichlorodimetylosilanem – łatwopalnym, i toksycznym, patrz karta charakterystyki w celu bezpiecznego obchodzenia się.
    1. Obrócić płytę grzejną do 350 °C i pozostawić na miejscu na 75 minut. Użyć proporcji liczby mikroelektrod do objętości (μl) dichlorodimetylosilanu w stosunku 1:2, aby dodać na szklaną szalkę Petriego. Tak więc na 10 mikroelektrod dodaj 20 μl dichlorodimetylosilanu.
  3. Po 75 minutach wyłącz płytę grzejną. Po ostygnięciu elektrod i płyty grzejnej wyjmij szklaną szalkę Petriego i przenieś elektrody (z kleszkami) do pudełka do przechowywania z gliną formierską. Upewnij się, że końcówka elektrody jest skierowana do góry, aby zapobiec uszkodzeniom.
  4. Aby wykonać elektrody referencyjne dla ISME, należy wyciągnąć ~4–5 kapilar z włókna ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 100 mm). Elektrody te nie muszą być silanizowane. Oznacz i przechowuj w podobnym pudełku, unikając uszkodzenia końcówki.
  5. Elektrody referencyjne SIET wykonane są ze standardowych kapilar szklanych (średnica zewnętrzna 2 mm, średnica wewnętrzna 1,12 mm, długość 102 mm). Kapilary są wypełnione stopionym 1 M KCl + 3% agarem i powinny być przechowywane w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 1 M KCl (całkowicie zanurzonej) do czasu użycia. Można ich używać wielokrotnie, aż zaczną tworzyć się bąbelki lub jeśli agar pęknie. Jeśli jest jakaś przestrzeń powietrzna, wyrzuć szybę i użyj nowej, aby upewnić się, że obwód jest kompletny.

10. Przygotowanie strzykawek do zasypywania

UWAGA: Ten krok ma na celu stworzenie strzykawek z cienką końcówką do wypełniania elektrod dla ISME.

  1. Należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z jednorazową igłą. Wyrzucić igłę i odciągnąć strzykawkę do oznaczenia 1 ml. Pod oparem włącz palnik Bunsena i podgrzej plastikową końcówkę strzykawki, aż zacznie się topić. Używając starej pary kleszczy, ostrożnie ściśnij stopioną końcówkę strzykawki i pociągnij w dół, aby rozciągnąć końcówkę.
  2. Za pomocą nożyczek przytnij stopioną końcówkę na żądaną długość, pozostawiając średnicę wystarczająco małą, aby zmieściła się wewnątrz elektrod (patrz schemat). Po ostygnięciu strzykawki należy sprawdzić ciśnienie w strzykawce z wodą, aby upewnić się, że nie ma zatkania. Utwórz po jednym dla każdego wymaganego rozwiązania zasypki i odpowiednio oznacz (Rysunek 8).

11. Napełnianie mikroelektrody jonoselektywnej i referencyjnej dla ISME i SIET

UWAGA: Mikroelektroda może być ponownie użyta, o ile nadal działa (kalibruj przed każdym eksperymentem). W przypadku ISME ten krok można wykonać, gdy MT są inkubowane w teście Ramsaya.

  1. Aby wykonać mikroelektrodę selektywną Na+, użyj strzykawki o pojemności 1 ml utworzonej w kroku 10, aby wypełnić elektrodę 100 mM NaCl. Upewnij się, że roztwór zasypki napełnia się, aż końcówka elektrody. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, delikatnie przesuń mikroelektrodę lub usuń roztwór i ponownie napełnij. Należy to zrobić pod mikroskopem stereoskopowym, aby lepiej obrazować.
  2. Pod mikroskopem stereoskopowym zanurz końcówkę pipety o pojemności 10 μl w roztworze jonoforu selektywnego Na+. Ustawiając elektrodę prostopadle do pipety, umieść palec w rękawiczce na spodzie końcówki, aby wytworzyć ciśnienie i usunąć niewielką kroplę jonoforu. Patrząc pod wysokim obiektywem mikroskopu, ostrożnie przyłóż kroplę jonoforu do końcówki mikroelektrody, unikając złamania końcówki. Zwykle mikroelektrody są napełniane do przodu kolumną koktajlu jonoforowego o długości od 150 do 300 μm, aż granica roztworu jonofor/zasypki stanie się płaska.
    UWAGA: Ten jonofor jest toksyczny, patrz karta charakterystyki w celu bezpiecznego obchodzenia się z nim.
  3. W małej zlewce napełnij do połowy 100 mM NaCl i umieść trochę plasteliny na środku w górnej części zlewki. Po pobraniu jonoforu Na+ umieść elektrodę czubkiem do dołu na ściance zlewki, pozwalając końcówce zanurzyć się w 100 mM NaCl i trzymaj ISME w zlewce, aż będzie gotowa do użycia.
  4. Aby wykonać elektrodę referencyjną ISME, należy wypełnić elektrodę 500 mM KCl, upewniając się, że roztwór jest napełniony do końcówki (postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co powyżej). Przechowywać KCl w zlewce.

12. Kalibracja elektrod dla ISME

UWAGA: Ten krok jest wykonywany tuż przed wykonaniem pomiarów wydzielanego płynu (~10-15 minut wcześniej). Kalibracje należy wykonywać co ~5–6 pomiarów, aby upewnić się, że nachylenie jest stałe.

  1. Pokryj końcówki elektrod roztworem ~3,5% (w/v) polichlorku winylu rozpuszczonego w tetrahydrofuranie, aby uniknąć przemieszczenia jonoforu po zanurzeniu w oleju parafinowym.
    UWAGA: Jest łatwopalny, patrz karta charakterystyki w celu bezpiecznego obchodzenia się z nim.
  2. Aby skalibrować elektrodę Na+, umieść 10 μl kropelek o następujących standardowych stężeniach NaCl na krawędzi szalki Ramsaya z inkubowanymi MT: 200 mM NaCl i 20 mM + 180 mM LiCl. Umieść standardowe kropelki w odległości ~ 2 cm od siebie, przy czym wyższe stężenie znajduje się na wierzchu.
  3. Włóż zarówno elektrodę referencyjną, jak i elektrodę jonoselektywną na druty z chlorkowanego srebra i przymocuj je bezpiecznie za pomocą uchwytów elektrod przymocowanych do mikromanipulatorów. Skieruj obie elektrody w kierunku kropli NaCl o sile 200 mM za pomocą mikromanipulatorów, upewniając się, że końcówki elektrod nie dotykają dna naczynia. Włącz elektrometr, aby rozpocząć nagrywanie i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje.
  4. Zapisz odczyt i przejdź do następnego wzorca (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Oblicz nachylenie, a jeśli odczyt elektrody jest stabilny, a nachylenie mieści się w zakresie, przystąp do używania elektrody do pomiarów wydzielanych kropel. Jeśli odczyt jest niestabilny, nie daje prawidłowego zapisu lub nachylenia, lub zajmuje trochę czasu, aby się zrównoważyć, przygotuj nową elektrodę jonoselektywną lub złamij samą końcówkę elektrody referencyjnej, przesuwając chusteczkę po końcówce. Nachylenie dla Na+ powinno wynosić ~58–60 mV38, chociaż dopuszczalny zakres to 50–60 mV.

13. Zapisy i obliczenia ISME

  1. Po pomiarach szybkości wydzielania płynu (patrz krok 7.7) ostrożnie przesunąć zarówno elektrodę referencyjną, jak i jonoselektywną do wydzielanej kropli za pomocą mikromanipulatorów. Włącz nagrywanie i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje i zapisze wartość. Powtórz ten krok dla pozostałych kropel (powtarzaj pomiary kalibracyjne co ~5–6 pomiarów).
  2. Stężenia kationów są obliczane za pomocą równania opisanego wcześniej22,38, [ion] = [C] x 10ΔV/m, gdzie [C] jest stężeniem w mmol L-1 roztworu kalibracyjnego użytego do kalibracji ISME, ΔV jest zmianą napięcia między napięciem zarejestrowanym z kropelki wydzielanego płynu a napięciem tego samego roztworu kalibracyjnego, a m to różnica napięcia między dwiema standardowymi kalibracjami, która jest również nachyleniem.

14. Konfiguracja SIET

UWAGA: System SIET został opisany wcześniej27,39. Aby zredukować hałas tła, wokół mikroskopu świetlnego i sceny czołowej zainstalowano klatkę Faradaya. W eksperymentach przedstawionych w tym artykule zastosowano następujące ustawienia w oprogramowaniu Automated Scanning Electrode Technique (ASET) 2.0: 4-sekundowy okres oczekiwania, aby umożliwić pełne przywrócenie gradientów jonów po ruchach mikroelektrod, z napięciem rejestrowanym przez 0,5 s po okresie oczekiwania, odległością wychylenia 100 μm i trzema powtórzeniami dla każdego nagrania. W razie potrzeby niektóre ustawienia mogą być modyfikowane przez użytkownika w ASET.

  1. Włącz wzmacniacz jonowy/polarograficzny IPA-2, mikroskop świetlny (z dołączoną kamerą wideo) oraz komputer (komputery) podłączony do każdego z nich z uruchomionymi ASET i cellSens.
  2. Przygotuj mikroelektrody i elektrody odniesienia opisane w krokach 9.1–9.3, 9.5, 10 i 11.1–11.3. Mikroelektroda jonoselektywna będzie zawierała jonofor Na+ z wypełnieniem 100 mM NaCl, a elektroda referencyjna (z mostkami agarowymi) będzie zawsze wypełniona 3 M KCl.
  3. Umieść mikroelektrodę selektywną Na+ na uchwycie składającym się z drutu z chlorku srebra (AgCl) i podłącz ją do żeńskiego gniazda złącza. Za pomocą strzykawki napełnij uchwyt elektrody referencyjnej świeżym 3 M KCl (można przygotować przed dniem eksperymentu i przechowywać w temperaturze pokojowej).
    UWAGA: Po eksperymentach przemyj uchwyt elektrody referencyjnej za pomocą ddH2O.
  4. Wyjąć jedną elektrodę odniesienia ze zlewki zawierającej wszystkie elektrody odniesienia zanurzone w 3 M KCl, umieszczając jeden palec na jednym końcu i przechylając szklaną kapilarnę w kierunku tego palca, aby zapobiec wypadnięciu agaru. Ostrożnie umieść jeden koniec w uchwycie, upewniając się, że nie tworzą się bąbelki. Jeśli pojawi się pęcherzyk, wyjmij elektrodę odniesienia, ponownie napełnij uchwyt większą ilością 3 M KCl i powtórz. Umieść uchwyt elektrody w gnieździe złącza żeńskiego.

15. Kalibracja elektrod dla SIET

  1. Do pomiarów Na+ użyj roztworów NaCl 150 mM NaCl i 15 mM NaCl + 135 mM LiCl24. Powinna istnieć 10-krotna różnica w stężeniach Na+ między dwoma roztworami, obejmująca zakres poziomów Na+ (20 mM) w roztworze soli fizjologicznej (Tabela 2).
  2. Podczas przeprowadzania eksperymentu należy przechowywać roztwory kalibracyjne w temperaturze pokojowej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, a podwielokrotność na szalce Petriego. Ta podwielokrotność jest usuwana na koniec dnia. Jeśli w roztworach podstawowych znajdują się jakiekolwiek oznaki zanieczyszczenia, należy je usunąć i przygotować świeże roztwory.
  3. Aby przeprowadzić kalibrację, należy podzielić dwa roztwory kalibracyjne (krok 15.1) na pojedyncze szalki Petriego o średnicy 35 mm i umieścić je na stoliku mikroskopu. Za pomocą pokręteł regulacji ręcznej, które sterują silnikami krokowymi z zaznaczoną opcją "wyłącz" na komputerowej jednostce sterującej ruchem, upewnij się, że końcówka mikroelektrody jest umieszczona wewnątrz roztworu kalibracyjnego. Nie zanurzaj końcówki zbyt głęboko, ponieważ może się złamać. Jeśli końcówka pęknie, przygotuj nową mikroelektrodę jonoselektywną i ponownie skalibruj.
    1. Na komputerze podłączonym do amplifier otwórz oprogramowanie ASET. Otwórz ustawienia kalibracji. Wybierz Nachylenie Nernst jako typ kalibracji, ustaw próbkę na 3 sekundy i wprowadź stężenia roztworów kalibracyjnych. Na przykład, aby uzyskać pomiary Na+, wprowadź 150 mM do roztworu 1, umieść końcówkę mikroelektrody selektywnej Na+ i elektrodę odniesienia w tym roztworze kalibracyjnym. Odczyt napięcia na wzmacniaczu powinien być stabilny. Kliknij Rozwiązanie 1, poczekaj na zarejestrowanie napięcia (w mV). Następnie umieść mikroelektrodę i elektrodę odniesienia w roztworze 15 mM NaCl + 135 mM LiCl, wprowadź 15 mM do roztworu 2 i kliknij Roztwór 2, aby uzyskać odczyt napięcia. Nachylenie będzie różnicą między tymi dwoma napięciami, obliczoną w tych ustawieniach. Po kalibracji kliknij OK.
    2. Nachylenie dla mikroelektrod selektywnych Na+ dla dziesięciokrotnej zmiany stężenia jonów powinno wynosić około 59,0 ± 1,624. Jeśli nachylenie Nernsta znacznie odbiega od tego zakresu, należy przygotować nową mikroelektrodę lub podwielokrotne nowe wzorce (ponieważ mogą być zanieczyszczone). Kalibracja jest wymagana przed każdymi 2–3 próbkami, w zależności od stabilności napięcia. Jeśli napięcie stanie się niestabilne i zacznie ulegać wahaniom, przygotuj nową mikroelektrodę jonoselektywną.

16. Pomiary SIET

UWAGA: Przełącznik silnika w jednostce sterującej ruchem komputera powinien być zawsze przełączony na Wyłącz, z wyjątkiem sytuacji, gdy manipulujesz elektrodą za pomocą komputerowych przez ASET, lub podczas zapisów pomiarów (w którym to momencie powinien być przełączony na Włącz).

  1. Po kalibracji należy przeprowadzić sekcję narządu (patrz krok 6.6). Umieścić naczynie z poli-L-lizyny z wypreparowaną próbką na stoliku mikroskopu i włożyć końcówkę elektrody referencyjnej do soli fizjologicznej. Zanurz końcówkę mikroelektrody jonoselektywnej w soli fizjologicznej, uważając, aby nie złamać końcówki.
  2. Użyj pokręteł regulacji ręcznej, aby wyregulować położenie mikroelektrody podczas patrzenia pod mikroskop świetlny. Wyreguluj pionowe położenie mikroelektrody tak, aby jej końcówka znajdowała się w tej samej płaszczyźnie co narząd lub tkanka. Po osiągnięciu żądanej pozycji ustaw przełącznik silnika w pozycji Włącz. W tym momencie silniki krokowe mogą być obsługiwane tylko za pomocą oprogramowania komputerowego.
  3. Za pomocą strzałek komputera przesuń mikroelektrodę poziomo do pozycji oddalonej o 3 mm od tkanki, aby zmierzyć nagrania tła. Wstaw notatki, naciskając F2. Gdy wszystko będzie gotowe, rozpocznij nagrywanie (naciskając F5). Uzyskaj pięć pomiarów aktywności w tle. Średnia aktywność napięcia tła dla każdej próbki zostanie odjęta od gradientów napięcia zmierzonych wzdłuż tkanki dla tej samej próbki.
  4. Przesuń końcówkę mikroelektrody z powrotem blisko tkanki, uważając, aby nie przebić narządu. Zmniejsz czułość uderzenia, aby umieścić końcówkę mikroelektrody 2 μm bezpośrednio po prawej stronie, prostopadle do tkanki. Uzyskaj trzy zapisy w każdym miejscu wzdłuż poduszki odbytniczej, aby zidentyfikować miejsce o największej aktywności jonów. Uzyskać podstawowe pomiary soli fizjologicznej w miejscu wykazującym największą aktywność (miejsce "gorące").
  5. Przełącz silnik w pozycję Wyłącz i dodaj odpowiedni zabieg do naczynia, aby uzyskać ostateczną pożądaną dawkę. Po aplikacji utwórz nową notatkę (tj. nazwę leczenia i dawkę), przełącz silnik z powrotem na Włącz i wykonaj zapisy napięcia za pomocą F5. Jeśli celem jest obserwacja zmian w czasie, kontynuuj wykonywanie pomiarów w określonych odstępach czasu. Za pomocą SIET można utworzyć wiele protokołów dla określonych zastosowań, w zależności od celu badacza.
  6. Obserwuj, jak oprogramowanie ASET rejestruje napięcie w miejscu wzdłuż tkanki i odejmuje je od napięcia w odległości skoku (Rysunek 7) wynoszącej 100 μm od tkanki. Ponieważ pierwszy zapis jest wykonywany w tkance, dodatnia różnica napięcia wskazuje, że napięcie jest wyższe w nabłonku (tkance) (Rysunek 7A) niż z dala od nabłonka (Rysunek 7B), a zatem kation jest absorbowany. Ujemny gradient napięcia wskazuje na wydzielanie kationów.
  7. Po zabiegu należy ponownie uzyskać nagrania tła (z odległości 3 mm) i wykorzystać je do obliczenia strumienia jonów po zabiegu. Wykonaj jeden zestaw nagrań tła w "linii bazowej" i jeden zestaw po leczeniu. Przełącz silnik w pozycję Wyłącz za każdym razem, gdy mikroelektroda nie jest regulowana za pomocą komputera lub gdy napięcie nie jest rejestrowane. Wyeksportuj dane do pliku tekstowego i otwórz je za pomocą programu Excel, aby przeprowadzić wszystkie obliczenia.
  8. Oblicz strumień jonów, korzystając z równań opisanych wcześniej24,26. Strumień jonów netto dla każdego zabiegu może być wyrażony jako bezwzględna zmiana w stosunku do podstawowych pomiarów strumienia jonów. Aby zweryfikować istotność wyników, można zastosować kontrolę nośnika (tj. dodanie samej soli fizjologicznej do naczynia zamiast zabiegu). Zmiany w transporcie jonów po leczeniu hormonalnym należy oceniać w stosunku do wszelkich zmian w odpowiedzi na tę kontrolę.

17. Testy skurczu jelita grubego

  1. Napełnij jedną z studzienek w naczyniu opisanym w kroku 4.1 znaną objętością soli fizjologicznej Aedes (krok 5.1). Po sekcji (krok 6.7) ostrożnie przenieś wypreparowane jelito tylne przyczepione do jelita środkowego do dołka w drugim naczyniu, uważając, aby nie uszczypnąć badanego narządu (jelita krętego). Zanurz jelito w soli fizjologicznej wewnątrz studzienki i umieść szpilki Minutien w jelicie środkowym i odbytnicy. W ten sposób jelito kręte nie powinno być napięte i należy obserwować spontaniczne skurcze, pochodzące z zastawki odźwiernika w przedniej części jelita krętego.
  2. Podłącz kamerę wideo do mikroskopu stereoskopowego i nagrywaj filmy za pomocą oprogramowania do przechwytywania wideo (np. INFINITY CAPTURE firmy Luminera). Umieść naczynie zawierające wypreparowany narząd pod mikroskopem i nagrywaj przez 2 minuty. Będzie to warunek "Punkt odniesienia".
  3. Dodaj znaną objętość soli fizjologicznej 1X Aedes (krok 5.1) do studzienki, aby uwzględnić wszelkie zmiany w ruchliwości jelita krętego po zwiększeniu objętości w studzience. Odczekaj 1 minutę po aplikacji, a następnie nagrywaj ponownie przez 2 minuty. Jest to stan "soli fizjologicznej".
  4. Dodać znaną objętość zabiegu (z 10-krotnego stężenia podstawowego, aby uzyskać pożądaną dawkę w studzience). Odczekaj 1 minutę po aplikacji, a następnie nagrywaj ponownie przez 2 minuty. To będzie warunek "leczenia".
  5. Zapisz wszystkie filmy i przekonwertuj je na MP4. Aby przeanalizować, policz liczbę skurczów w odstępach 2-minutowych (zdefiniowanych jako fala perystaltyczna rozpoczynająca się w zastawce odźwiernika i rozciągająca się przez całe jelito kręte). Podziel tę liczbę przez 2 minuty, aby uzyskać szybkość skurczu. Można również ocenić inne parametry, takie jak czas trwania skurczu lub rozluźnienia. Po zebraniu danych pierwotnych należy wyrazić każdy parametr w stosunku do danych dla warunków "linii bazowej" dla każdej próbki. Wykreślić zmianę fałdowania dla "soli fizjologicznej" i "leczenia" w odniesieniu do "linii podstawowej".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie DH31 przeciwko niestymulowanym MT powoduje znaczny wzrost szybkości wydzielania płynów, potwierdzając jego rolę jako hormonu moczopędnego u komarów Aedes (Rysunek 1A). Gdy kanaliki są traktowane AedaeCAPA-1, obserwuje się zmniejszenie szybkości wydzielania w MT stymulowanych DH31. Rysunek 1B pokazuje użycie elektrod jonoselektywnych do pomiaru stężenia Na+ w wydzielanych kropelkach. Leczenie DH31 na MT nie m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po spożyciu posiłku z krwi owady hematophagu stają przed wyzwaniem związanym z nadmiarem substancji rozpuszczonych i wody w hemolimfie2. Aby sobie z tym poradzić, mają wyspecjalizowany układ wydalniczy, który jest ściśle kontrolowany przez czynniki hormonalne, co pozwala owadom szybko zainicjować diurezę poposiłkową. Test Ramsaya i zastosowanie mikroelektrod jonoselektywnych pozwala na pomiar szybkości wydzielania płynu wraz ze stężeniami jonów i szybkościami transportu w izolowanych MT owadów. Kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants dla AD i J-PP. AL i FS otrzymały nagrody NSERC CGS-M w ramach wsparcia swoich badań magisterskich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 mlFisher Scientific14955456
35 mm szalki PetriegoCorning Falcon (Fisher Scientific)C351008
Probówki kapilarne ze szkła borokrzemianowego
(OD 1 mm, ID 0,58 mm, długość 100 mm)		World Precision Instruments1B100F-4używane do elektrod
referencyjnych ISMERurki kapilarne z włókna kapilarnego ze szkła borokrzemianowego
(średnica zewnętrzna 2 mm, średnica wewnętrzna 1,12 mm, długość 102 mm)		World Precision Instruments1B200F-4używana do elektrod referencyjnych SIET
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego bez włókien
(OD 1,5 mm, ID 1,12 mm, długość 100 mm)		World Precision InstrumentsTW150-4używane do elektrod ISME i SIET podkładka
CO2 DiamedGEN59-114
Roztwór dimetylotrimetylosililoaminySigma-Aldrich41716
Klatka FaradayaNiestandardowaMoże być wytwarzana przez lokalny warsztat mechaniczny
Chlorek żelazaSigma-Aldrich157740
Kleszcze (Dumont # 5)Fine Science Tools91150-20
Szklana szalka PetriegoFisher Scientific08-748A
Uwodniony olej mineralnyFisher Scientific8042-47-5Konkretna marka nie jest ważna
INFINITY1-2CB kamera wideoLumineraINFINITY1-2CB
Mikromanipulatory (leworęczne i praworęczne)World Precision InstrumentsMMJL i MMJRKonkretna marka nie jest ważna, o ile wysokiej jakości manipulator
Olej mineralny, LightFisher Scientific0121-4
Kołki Minutien (stal nierdzewna 0,1 mm)Fine Science Tools26002-10
Nietwardniejąca modelinaSargent ArtSpecyficzna marka nie jest ważna
Mikroskop świetlny Olympus (DLA SIET)Niestandardowy systemOlympus
Plastikowa pipeta Pasteura (transferowa)Fisher Scientific13-711-7M
Poli-L-lizyna roztwór (0,1 mg/ml)Sigma-AldrichA-005-M84 kDa
Polichlorek winylu (PVC)Sigma-Aldrich81395
Ostrze skalpelaFine Science Tools10050-00
Rękojeść skalpelaFine Science Tools10053-09
Schneider's Drosophila mediumSystem SIET
Odpowiedniniestandardowy systemSzczegóły dostępne pod adresem: http://www.applicableelectronics.com/overview
Srebrny drutWorld Precision InstrumentsAGW1010
Koktajl jonoforu sodu II AFluka99357
Standardowe polistyrenowe naczynia Petriego (hodowla)FisherbrandFB012921Każdy rozmiar będzie odpowiedni, ale szalki 60 mm są dobre zarówno do sekcji, jak i test
Mikroskop stereoskopowy z mikrometrem ocznymNikonSMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Ściągacz do pipetSutter InstrumentsFGPN7
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Chemical CompanyNC9285739
TetrahydrofuranSigma-Aldrich401757
Zaawansowane mieszadło z płytą grzejną VWR - aluminioweVWR9578Konkretna marka nie jest ważna
Sigma-Aldrich S0146 elektroniczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
  2. Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
  3. Bradley, T. J. Physiology of osmoregulation in mosquitoes. Annual Review of Entomology. 32, 439-462 (1987).
  4. Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
  5. Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
  6. Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
  7. Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
  8. Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
  9. Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795(2015).
  10. Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
  11. Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154(2015).
  12. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800(2015).
  13. O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
  14. Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
  15. Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
  16. Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
  17. Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
  18. Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
  19. Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
  20. O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
  21. Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  22. Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
  23. Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
  24. Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
  25. Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
  26. Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386(2014).
  27. Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
  28. Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490(2020).
  29. Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
  30. Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
  31. Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
  32. Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98(2012).
  33. Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
  34. Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
  35. Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
  36. Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
  37. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144(2015).
  38. Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
  39. Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
  40. Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755(2020).
  41. Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
  42. Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
  43. Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
  44. D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997(2020).
  45. Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
  46. Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
  47. O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
  48. Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regulacja neuropeptydowacewki Malpighiegotest Ramsayamikroelektrody selektywne jonowotechnika skanuj cej elektrody selektywnej jonowotesty skurczu jelita tylnegopomiar sekrecji p ynuanaliza transportu jon wAedes aegypti

Powiązane artykuły