Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie bezkomórkowych rusztowań nerkowych u szczurów

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61856

⸱

18 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine and Biomedical Research Institute, Pusan National University Hospital, 2Biomedical Research Institute, Pusan National University Hospital, 3Department of Plastic Surgery, Pusan National University Hospital, 4Department of Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery, Yangsan Pusan National University Hospital, 5Department of Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery, Pusan National University Hospital, 6Department of Pathology, Pusan National University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wprowadza metodę tworzenia rusztowania przy użyciu pozbawionych komórek nerek szczurów. Protokół obejmuje procesy decelularyzacji i recelularyzacji w celu potwierdzenia biodostępności. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu Triton X-100 i dodecylosiarczanu sodu.

Streszczenie

Inżynieria tkankowa to najnowocześniejsza dyscyplina w biomedycynie. Techniki hodowli komórkowych mogą być stosowane do regeneracji funkcjonalnych tkanek i narządów w celu zastąpienia chorych lub uszkodzonych narządów. Rusztowania są potrzebne, aby ułatwić wytwarzanie trójwymiarowych narządów lub tkanek przy użyciu zróżnicowanych komórek macierzystych in vivo. W tym raporcie opisujemy nowatorską metodę tworzenia unaczynionych rusztowań przy użyciu pozbawionych komórek nerek szczurów. W tym badaniu wykorzystano ośmiotygodniowe szczury Sprague-Dawley, a heparynę wstrzyknięto do serca, aby ułatwić przepływ do naczyń nerkowych, umożliwiając heparynę przenikającą do naczyń nerkowych. Otwarto jamę brzuszną i pobrano lewą nerkę. Pobrane nerki były perfundowane przez 9 godzin przy użyciu detergentów, takich jak Triton X-100 i dodecylosiarczan sodu, w celu decelularyzacji tkanki. Pozbawione komórek rusztowania nerkowe zostały następnie delikatnie przemyte 1% penicyliną/streptomycyną i heparyną w celu usunięcia resztek komórkowych i pozostałości chemicznych. Oczekuje się, że przeszczepianie komórek macierzystych za pomocą bezkomórkowych rusztowań naczyniowych ułatwi wytwarzanie nowych narządów. W ten sposób unaczynione rusztowania mogą w przyszłości stanowić podstawę inżynierii tkankowej przeszczepów narządowych.

Wprowadzenie

Techniki hodowli komórkowych są stosowane do regeneracji funkcjonalnych tkanek i organów w celu zastąpienia chorych lub uszkodzonych narządów. Allogeniczne przeszczepienie narządów jest obecnie najczęstszą metodą leczenia nieodwracalnych uszkodzeń narządów; Takie podejście wymaga jednak zastosowania immunosupresji, aby zapobiec odrzuceniu przeszczepionego narządu. Co więcej, pomimo postępów w immunologii transplantacyjnej, 20% biorców przeszczepów może doświadczyć ostrego odrzucenia przeszczepu w ciągu 5 lat, a w ciągu 10 lat po przeszczepieniu 40% biorców może stracić przeszczepiony przeszczep lub umrzeć1.

Postępy w technologiach inżynierii tkankowej zaowocowały nowym paradygmatem przeszczepiania nowych organów bez odrzucania immunologicznego przy użyciu zróżnicowanych komórek macierzystych. Po różnicowaniu komórek macierzystych potrzebne jest rusztowanie, zwane syntetyczną macierzą zewnątrzkomórkową, aby ułatwić wytwarzanie trójwymiarowych narządów i umożliwić rozwój nowej tkanki w organizmie biorcy. Rusztowania z pozbawionych komórek narządów natywnych mają zalety, w tym bardziej efektywne środowisko do tworzenia komórek i zwiększania proliferacji komórek macierzystych, chociaż mechanizmy te nie zostały w pełni wyjaśnione2. W szczególności nerka jest odpowiednim narządem do wytwarzania rusztowań, ponieważ ma obfite krążenie i niszę do tworzenia komórek macierzystych. Dodatkowo, ze względu na złożoną budowę nerki, trudno jest sztucznie zregenerować nerki do przeszczepu narządów.

W tym raporcie przedstawiamy metodę tworzenia unaczynionych rusztowań przy użyciu bezkomórkowych organów w modelu szczurzym, aby ułatwić przyszłe badania na zwierzętach dla celów inżynierii tkankowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez administrację Pusan National University of Medicine i zostało przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami. (Certyfikat nr 2017-119). Przed przystąpieniem do jakichkolwiek badań na zwierzętach należy uzyskać zgodę instytucjonalną.
UWAGA: Wszystkie instrumenty/sprzęt chirurgiczny i anestezjologiczny oraz odczynniki zalecane do pomyślnego przedstawienia chirurgicznego i obrazowania narządów jamy brzusznej są wyszczególnione w Tabeli 1.

1. Procedury przygotowawcze do pobierania nerek szczurów

  1. W ramach przygotowań do zabiegu umieść 8-tygodniowe szczury Sprague-Dawley (o wadze 200–250 g) na podkładce rozgrzewającej. Umieść sondę termometru doodbytniczego w odbytnicy, aby monitorować temperaturę rdzenia.
  2. Znieczulić szczura 5% mieszaniną izofluranu (indukcja: 5%, utrzymanie: 3%).
  3. Aby rozpocząć operację, po podaniu znieczulenia należy ułożyć szczura w pozycji leżącej. Zamontuj cztery kończyny szczura na stole operacyjnym za pomocą taśmy.
  4. Ogol i oczyść brzuch szczura dawcy mydłem bakteriobójczym. Stosuj 2% betadyny przez co najmniej 1-2 minuty i przetrzyj 70% roztworem etanolu. Powtórz tę sekwencję trzy razy.
  5. Przykryj pole operacyjne sterylnym obłożeniem z okienkami.
  6. Wykonaj pionowe nacięcie brzucha i odsłoń lewą nerkę, moczowód, aortę brzuszną i żyłę główną dolną.
  7. Wizualizuj i wypreparuj lewą nerkę, moczowód, aortę brzuszną i żyłę główną dolną tuż przed przecięciem szypułki.

2. Perfuzja przezsercowa

  1. Przed zabiegiem należy przygotować roztwór perfuzyjny.
    1. Przygotować 50 ml roztworu perfuzyjnego na szczura.
    2. Zmieszać 1x PBS z około 10 U/ml heparyny (1 fiolka 25 kU da 2,5 l PBS+Hep).
    3. Wymieszaj równe objętości 8% paraformaldehydu z 1x PBS, aby uzyskać 4% roztwór PFA/1xPBS.
      UWAGA: 8% PFA wyprodukowanego w wodzie można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy. Jednak 4% PFA rozcieńczony w PBS jest stabilny tylko przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C. Rozcieńczenie powinno być świeże.
  2. Przedłuż pionowe nacięcie brzucha czaszki. Pamiętaj, aby odsunąć nożyczki od narządów podczas cięcia, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych.
  3. Kontynuuj nacięcie przez klatkę piersiową, a następnie przetnij przeponę, unosząc mostek.
  4. Przypnij luźny płat skóry i uwolnij serce, rozrywając tkankę łączną kleszczami.
    UWAGA: Nie używaj nożyczek do uwolnienia serca, ponieważ może to spowodować niepożądane krwawienie.
  5. Otwórz linię soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i upewnij się, że linia płynie przed umieszczeniem igły w lewej komorze. Delikatnie przytrzymaj serce kleszczami i użyj hemostatu, aby kontrolować igłę. Igła powinna być włożona nie więcej niż 1/4 cala.
    UWAGA: Wprowadzenie większej niż 1/4 cala może spowodować perforację na drugą stronę tkanki.
  6. Podpierając serce igłą i hemostatem, zlokalizuj prawy przedsionek i przetnij go nożyczkami do irydektomii. Oprzyj hemostat na ciele szczura i upewnij się, że igła jest nadal umieszczona w sercu.
    UWAGA: Jeśli cięcie jest wystarczające, w jamie ciała powinna znajdować się krew, ponieważ ciśnienie z PBS wpływającego do szczura jest zmniejszane.
  7. Ostrożnie odpiąć przednie nóżki i płat skóry.
  8. Kontynuuj perfuzję PBS przez 4 minuty lub dłużej, jeśli w nerkach i wątrobie nadal widoczna jest krew.

3. Pobieranie nerek i decelularyzacja

  1. Zbierz lewą nerkę z aortą brzuszną i żyłą główną dolną.
  2. Podwiązać moczowód, aortę piersiową, żyłę główną górną i gałęzie aorty brzusznej.
  3. Utrzymuj narząd nawodniony w PBS (DPBS) firmy Dulbecco na 10-centymetrowej szalce Petriego.
  4. Kankaniuj aortę brzuszną i żyłę główną dolną za pomocą cewnika o rozmiarze 23. Aby usunąć resztki krwi, podłącz kaniulę do pompy perystaltycznej i przemyj DPBS (500 ml) i 16 μ/ml heparyny przez 90 minut z szybkością 5 obr./min w temperaturze 37 °C.
  5. Aby usunąć komórkowość nerki, należy perfundować nerkę 1% Triton X-100 (1 l) przez 3 godziny, a następnie 0,75% roztworem dodecylosiarczanu sodu (SDS) (2 l) przez 6 godzin pod stałym ciśnieniem 40 mmHg,
    UWAGA: Nerka stanie się przezroczysta po 8 godzinach.
  6. Aby usunąć pozostałości SDS, należy perfuzjować próbkę z 1% penicyliną w wodzie destylowanej (6 l) przez 18 godzin (przez noc), a następnie sterylnym DPBS (500 ml) i heparyną 16 U/ml przez 90 minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Makroskopowa morfologia nerek szczura była ciemnoczerwona (Rysunek 1A). Po decelularyzacji nerka stała się blada i półprzezroczysta (Rysunek 1D). Pozostałe DNA genomowe oceniono za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcją producenta w decelularyzowanych rusztowaniach nerkowych i porównano z jego ilością w nerkach natywnych (kontrola). Analiza ilościowa potwierdziła, że genomowe DNA tkankowe zostało niemal całkowicie usunięte po decelularyzacji. Z 14 przy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Do decelularyzacji narządów i innych tkanek stosowano różne protokoły. Optymalny protokół decelularyzacji powinien zachować trójwymiarową architekturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ogólnie rzecz biorąc, takie protokoły polegają na lizie błony komórkowej poprzez przetwarzanie fizyczne lub roztwory jonowe, dysocjacji cytoplazmy i jądra od ECM przez przetwarzanie enzymatyczne lub detergenty, a następnie usuwaniu resztek komórkowych z tkanki3. Procesy fizyczne obejmują skrobanie, mieszanie roztwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant Instytutu Badań Biomedycznych z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego w Pusan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 cc (sondy iniekcyjne i roztwory do pojazdówBecton Dickinson305217
10-0 ethilon do zespolenia naczyńEthicon9032G
Igła prowadząca o średnicy 25 cali (do cewników naczyniowych)Becton Dickinson305145
3-0 PDS szczur zamykający nacięcieEthiconZ316H
3-0 Szczurzamykający nacięcie prolenuEthicon8832H
3-0 jedwabna szpula dostępu naczyniowego/podwiązania u szczurówBraintree ScientificSUT-S 110
4-0 Mysz z nacięciem PDSEthiconZ773D
4-0 Mysz z nacięciem prolenowymEthicon8831H
5-0 jedwabna szpula dostęp naczyniowy/podwiązanie u myszyBraintree ScientificSUT-S 106
Cienkie nożyczki do cięcia powięzi / tkanki łącznejFine Science Tools14058-09
Uchwyt igły HalseyFine Science Tools12001-13
Kelly Hemostat dla szczurów: zacisk mięśniowy minimalizujący krwawienie po przecięciuFine Science Tools13018-14
Rurka z polietylenu 50, rurka cewnika 100 stópBraintreeScientific.023" & razy; .038"
Zaciski naczyniowe Schwartz microserrefineFine Science Tools18052-01 (proste)
18052-03 (zakrzywione)
Nożyczki chirurgiczne do cięcia skóryFine Science Tools14002-12
Vannas-Tubingen Nożyczki sprężynowe do arteriotomiiFine Science Tools15003-08

Bibliografia

  1. Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
  2. Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
  3. Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
  4. Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
  5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
  6. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  7. Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).
  8. Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
  9. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  10. Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
  11. Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  12. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Decelularyzacja nerki szczuraperfuzja Tritonem X-100dodecylosiarczan soduperfuzja heparynąanaliza zawartości DNAprzygotowanie rusztowania naczyniowegotransplantacja rusztowania narządowegorusztowania w inżynierii tkankowejzachowanie ultrastruktury ECM
Przygotowanie bezkomórkowych rusztowań nerkowych u szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.