Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

DOI:

10.3791/61879

⸱

14 marca 2021

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie ludzkich kardiomiocytów (CM), fibroblastów serca (CF) i komórek śródbłonka (EC) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) dostarczyło unikalnej okazji do zbadania złożonych zależności między różnymi typami komórek sercowo-naczyniowych, które napędzają rozwój tkanek i choroby. W obszarze modeli tkanki serca kilka zaawansowanych podejść trójwymiarowych (3D) wykorzystuje indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CMs) do naśladowania znaczenia fizjologicznego i natywnego środowiska tkankowego za pomocą kombinacji macierzy zewnątrzkomórkowych i środków sieciujących. Jednak systemy te są skomplikowane do wytworzenia bez wiedzy z zakresu mikrofabrykacji i wymagają kilku tygodni na samodzielny montaż. Co najważniejsze, wielu z tych systemów brakuje komórek naczyniowych i fibroblastów serca, które stanowią ponad 60% niemiocytów w ludzkim sercu. W tym miejscu opisujemy pochodzenie wszystkich trzech typów komórek serca z iPSC w celu wytworzenia mikrotkanek serca. Ta łatwa technika formowania replik umożliwia hodowlę mikrotkanek serca na standardowych wielodołkowych płytkach do hodowli komórkowych przez kilka tygodni. Platforma umożliwia zdefiniowaną przez użytkownika kontrolę nad rozmiarami mikrotkanek w oparciu o początkową gęstość wysiewu i wymaga mniej niż 3 dni na samodzielny montaż, aby osiągnąć obserwowalne skurcze mikrotkanek serca. Ponadto mikrotkanki serca mogą być łatwo trawione przy zachowaniu wysokiej żywotności komórek do badania pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i sekwencjonowania jednokomórkowego RNA (scRNA-seq). Przewidujemy, że ten model in vitro mikrotkanek serca pomoże przyspieszyć badania walidacyjne w zakresie odkrywania leków i modelowania chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrywanie leków i modelowanie chorób w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych napotyka na kilka wyzwań z powodu braku klinicznie istotnych próbek i nieodpowiednich narzędzi translacyjnych1. Wysoce złożone modele przedkliniczne lub nadmiernie uproszczone modele pojedynczych komórek in vitro nie wykazują warunków patofizjologicznych w powtarzalny sposób. W związku z tym powstało kilka zminiaturyzowanych platform inżynierii tkankowej, które pomagają wypełnić tę lukę, mając na celu osiągnięcie równowagi między łatwością aplikacji w sposób wysokoprzepustowy a wiernym odwzorowaniem funkcji tkanki2,3. Wraz z pojawieniem się technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), narzędzia inżynierii tkankowej mogą być stosowane do komórek specyficznych dla pacjenta z lub bez choroby sercowo-naczyniowej, aby odpowiedzieć na pytania badawcze4,5,6. Takie modele inżynierii tkankowej o składzie komórkowym podobnym do tkanki serca mogą być wykorzystane w pracach nad opracowaniem leków w celu zbadania kardiotoksyczności i dysfunkcji wywołanych patologicznymi zmianami w zachowaniu jednego lub wielu typów komórek.

Samoorganizujące się mikrotkanki lub organoidy pochodzące z ludzkich iPSC to trójwymiarowe (3D) struktury, które są miniaturowymi zespołami tkankopodobnymi, wykazującymi funkcjonalne podobieństwa do swoich odpowiedników in vivo. Istnieje kilka różnych podejść, które umożliwiają tworzenie organoidów in situ poprzez ukierunkowane różnicowanie iPSC lub poprzez tworzenie ciał embrionalnych4. Uzyskane w ten sposób organoidy są niezbędnym narzędziem do badania procesów morfogenetycznych, które napędzają organogenezę. Jednak obecność różnych populacji komórek i różnice w samoorganizacji mogą prowadzić do zmienności wyników między różnymi organoidami5. Alternatywnie, wstępnie zróżnicowane komórki, które samoorganizują się w mikrotkanki z typami komórek specyficznymi dla tkanek w celu zbadania lokalnych interakcji komórka-komórka, są doskonałymi modelami, w których możliwe jest wyizolowanie samoorganizujących się składników. Szczególnie w badaniach nad sercem u ludzi, opracowanie trójwymiarowych mikrotkanek serca z komponentami wielokomórkowymi okazało się wyzwaniem, gdy komórki pochodzą z różnych linii pacjentów lub ze źródeł komercyjnych.

Aby poprawić nasze mechanistyczne zrozumienie zachowań komórek w fizjologicznie istotnym, spersonalizowanym modelu in vitro, idealnie byłoby, gdyby wszystkie typy komórek składowych pochodziły z tej samej linii pacjenta. W kontekście ludzkiego serca, prawdziwie reprezentatywny model serca in vitro uchwyciłby wzajemne oddziaływanie między dominującymi typami komórek, a mianowicie kardiomiocytami (CM), komórkami śródbłonka (EC) i fibroblastami serca (CFs)6,7. Wierna rekapitulacja mięśnia sercowego wymaga nie tylko biofizycznego rozciągnięcia i stymulacji elektrofizjologicznej, ale także sygnalizacji komórka-komórka, która powstaje dzięki wspierającym typom komórek, takim jak EC i CFs8. CF biorą udział w syntezie macierzy zewnątrzkomórkowej i utrzymaniu struktury tkanki; a w stanie patologicznym mukowiscydozy mogą indukować zwłóknienie i zmieniać przewodnictwo elektryczne w CMs9. Podobnie, EC mogą regulować właściwości skurczowe CM poprzez sygnalizację parakrynną i zaspokajanie niezbędnych potrzeb metabolicznych10. W związku z tym potrzebne są ludzkie mikrotkanki serca składające się ze wszystkich trzech głównych typów komórek, aby umożliwić przeprowadzanie fizjologicznie istotnych eksperymentów o wysokiej przepustowości.

Tutaj opisujemy podejście oddolne do wytwarzania mikrotkanek serca poprzez uzyskanie ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC (iPSC-CMs), komórek śródbłonka pochodzących z iPSC (iPSC-ECs) i fibroblastów serca pochodzących z iPSC (iPSC-CFs) oraz ich hodowli 3D w jednolitych układach mikrotkanek serca. Ta prosta metoda generowania spontanicznie bijących mikrotkanek serca może być wykorzystana do modelowania chorób i szybkiego testowania leków w celu funkcjonalnego i mechanistycznego zrozumienia fizjologii serca. Co więcej, takie wielokomórkowe platformy mikrotkanek serca można wykorzystać za pomocą technik edycji genomu w celu naśladowania postępu choroby serca w czasie w przewlekłych lub ostrych warunkach hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pożywka, odczynnik, przygotowanie płytki hodowlanej

  1. Roztwór do przemywania komórek do hodowli komórek: Użyj 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) bez wapnia lub magnezu.
  2. Pożywki różnicowania kardiomiocytów
    1. Przygotuj pożywkę różnicującą #1, dodając 10 ml suplementu (50x B27 plus insulina) do 500 ml pożywki podstawowej kardiomiocytów (RPMI 1640).
    2. Przygotuj pożywkę różnicującą #2, dodając 10 ml suplementu (50x B27 minus insulina) do 500 ml pożywki podstawowej kardiomiocytów (RPMI 1640).
    3. Przygotuj pożywkę oczyszczającą #3, dodając suplement (50x B27 plus insulina) do 500 ml podłoża podstawowego kardiomiocytów (RPMI 1640) minus glukoza.
  3. Pożywki wzrostowe śródbłonka i odczynniki do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS)
    1. Przygotuj pożywkę do wzrostu śródbłonka (EGM) z dostępnym w handlu zestawem suplementów do wzrostu komórek śródbłonka.
    2. Przygotować roztwór buforowy do sortowania separacji komórek, rozcieńczając roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stosunku 1:20 roztworem do płukania.
  4. Pożywka do różnicowania fibroblastów serca: Przygotuj pożywkę do różnicowania fibroblastów sercowych z podłożem podstawowym fibroblastów (DMEM-wysoka glukoza) i zestawem czynników życia fibroblastów bez surowicy.
  5. Pożywka do wytwarzania i konserwacji mikrotkanek serca: Przygotować przefiltrowaną pożywkę z podłożem podstawowym kardiomiocytów (RPMI 1640) z suplementem (50x B27 plus insulina) i EGM w stosunku 70/30 v/v%.
  6. Roztwory podstawowe dla małych cząsteczek i czynników wzrostu
    1. W celu różnicowania wszystkich trzech typów komórek należy przygotować 200 μl podwielokrotności inhibitora GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-dichlorofenylo)-5-(5-metylo-1H-imidazol-2-ylo)-2-pirymidynylo]amino]etylo]amino]-3-pirydynokarbonitryl); Inhibitor Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-diokso-4,7-metano-2H-izoindol-2-ylo)-N-8-chinolinylo-benzamid; oraz inhibitor transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β) SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-ylo)-5-(2-pirydynylo)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) przy stężeniu 10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. W celu różnicowania iPSC-EC u ludzi należy przygotować 100 μl podwielokrotności podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) (20 μg/ml), czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 165 (VEGF165; 50 μg/ml) i białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4; 20 μg/ml) w 0,1% (w/v) BSA w ultraczystej wodzie destylowanej. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C; w przypadku długotrwałego przechowywania podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
  7. Płyty do wstępnego powlekania do konserwacji iPSC-CM, iPSC-EC i iPSC-CF.
    1. Przygotować 6-dołkowe płytki z matrycą membrany podstawnej pokryte podłożem do ponownego powlekania iPSC-CM poprzez rozcieńczenie podłoża o matrycy membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) w DMEM/F12 w stosunku 1:200. Dodać 2 ml rozcieńczonej pożywki z matrycą membrany podstawnej do każdego dołka płytki 6-dołkowej i pozostawić do zastygnięcia na co najmniej 2 do 4 godzin.
    2. Wstępnie pokryj 6-dołkową płytkę lub 10-centymetrowe naczynie żelatyną. Skroplić 2% roztwór żelatyny w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i przygotować przefiltrowaną 0,2% (v/v) żelatynę w PBS w odpowiedniej objętości w zależności od potrzeb. Przed użyciem pokryć płytkę hodowlaną 10 ml 0,2% żelatyny przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Płytki żelatynowe mogą być używane zarówno do iPSC-CF, jak i iPSC-EC po MACS.
  8. Wytwarzanie form do mikrotkanek: Przygotuj 2% niskotopliwy roztwór agarozy w PBS w suchej szklanej butelce o pojemności 100 ml. Sterylizuj agarozę w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 20 minut przed użyciem. Autoklawować odlewnicze mikroformy silikonowe w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 15 min.
  9. Roztwory do trawienia, barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej
    1. Do trawienia mikrotkanek należy przygotować bufor do trawienia enzymatycznego składający się z dypazy I (1 U/ml) i liberazy (3 U/ml) w PBS. Trzymaj ten roztwór na lodzie.
    2. Zarówno do utrwalania komórek, jak i mikrotkanek należy użyć lodowato dostępnego w handlu odczynnika do utrwalania zawierającego 4,2% paraformaldehydu (PFA).
    3. Przygotuj 0,25% Triton X-100 w PBS do przepuszczalności i 0,1% Tween-20 do prania. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej.
    4. Do analiz sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) należy przygotować bufor FACS [PBS lub HBSS z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS)] i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Do barwienia immunologicznego przygotuj 2% normalną surowicę kozią/osła/królika w PBS. Wybierz gatunek surowicy na podstawie gospodarza, w którym wyhodowano przeciwciała.

2. Różnicowanie i oczyszczanie serca

UWAGA: Wszystkie iPSC powinny być utrzymywane na poziomie ~75% do 80% konfluencji przed różnicowaniem kardiomiocytów. iPSC użyte w tym protokole zostały uzyskane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) za pomocą przeprogramowania wirusa Sendai przeprowadzonego w Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

  1. Przed różnicowaniem hoduje kolonie iPSC aż do pasażu (P20).
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną iPSC z płytki 6-dołkowej i przemyć komórki raz 2 ml PBS.
  3. W dniu 0 rozpocznij indukcję mesendodermy, dodając 2 ml pożywki różnicującej #1 z CHIR (6 μM final) do każdej studzienki. Końcowe stężenie może wahać się od 6 do 9 μM dla różnych linii iPSC. Dlatego zaleca się testowanie różnych stężeń CHIR na płytce 6-dołkowej w celu określenia optymalnej indukcji mezodermy serca.
  4. W dniu 2 odzyskaj komórki, zastępując je świeżą pożywką #1 o pojemności 2 ml w każdym dołku.
  5. W dniu 3 zastąp pożywkę w każdym dołku 2 ml pożywki różnicującej #1 z inhibitorem Wnt IWR-1-endo (5 μM), aby wywołać specyfikację linii sercowej.
  6. W 5 dniu odzyskaj komórki, zastępując pożywkę świeżą pożywką o pojemności 2 ml #1 w każdym dołku.
  7. W dniu 7 zastąp pożywkę 2 ml pożywki #2 w każdym dołku. Spontaniczne bicie kardiomiocytów można zaobserwować już w 8-9 dobie. W przypadku niektórych linii bijące komórki mogą pojawić się dopiero w 11 dniu.
  8. W celu oczyszczenia kultury różnicującej zastąp 2 ml minus glukoza Podłoże #3 w każdym dołku w dniu 10.
  9. W dniu 13 odzyskaj komórki, zmieniając pożywkę z 2 ml plus pożywka glukozy #2 w każdym dołku.
  10. W dniu 16 wykonaj drugą rundę oczyszczania z 2 ml pożywki #3 w każdym dołku.
  11. Odzyskaj komórki w dniu 19 z 2 ml plus glukoza Medium #2.
  12. W dniu 20 przemyć studzienki raz 1 ml PBS i dysocjować komórki za pomocą 1 ml 10x trypsyny przez 6 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji komórki są podnoszone z powierzchni studzienki do pojedynczych komórek przez mniej niż 15 s i dodawane do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z równą objętością pożywki #2 w celu zneutralizowania enzymu. Odwirować zawiesinę komórkową przez 3 minuty przy 270 x g.
  13. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml pożywki #3. Policz komórki i dodaj odpowiednią objętość pożywki #3, aby pokryć łącznie ~ 3 miliony komórek w każdym dołku nowej 6-dołkowej płytki pokrytej podłożem z matrycą błony podstawnej. Drugiego dnia po ponownym posiewie zastąp pożywkę świeżą pożywką o pojemności 2 ml #2 i uzupełniaj 2 ml pożywki #2 co drugi dzień, aż do trypsynizacji kardiomiocytów do zamrożenia lub przyszłych eksperymentów.

3. Różnicowanie komórek śródbłonka i MACS

  1. Przy zbieganiu iPSC od 75% do 80% umyj płytkę PBS, 2 ml na studzienkę.
  2. Rozpocznij różnicowanie w dniu 0, zastępując 2 ml pożywki różnicującej #1 6 μM CHIR.
  3. W dniu 2 zastąp pożywkę 2 ml pożywki różnicującej #1 2 μM CHIR.
  4. W 4 dniu zastąp pożywkę 2 ml EGM uzupełnionymi 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 i 20 ng BMP4.
  5. Zmieniaj pożywkę na 2 ml EGM uzupełnionego czynnikami wzrostu co 2 dni od 6 do 10 dnia. Dodanie inhibitora TGFβ (SB431542) w stężeniu 8 μM jest opcjonalne w celu promowania ekspansji śródbłonka i zahamowania różnicowania innych typów komórek pochodzenia mezenchymalnego.
  6. W dniu 12 rozpocznij kroki dla MACS od przepłukania każdej studzienki 1 ml PBS, a następnie dysocjacji komórek przy użyciu 1 ml 10x trypsyny w każdym dołku 6-dołkowej płytki przez 8 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Przygotować równą objętość pożywki EGM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w celu zneutralizowania enzymu dysocjacyjnego. Umieścić sitko o wielkości 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przepuścić przez nie zdysocjowaną zawiesinę komórek. Wymieniaj filtr co 2 do 3 zdysocjowanych studzienek.
  8. Wylicz całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą 0,4% błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  9. Zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g osadzać przez 5 minut w wstępnie schłodzonej wirówce ustawionej na 4 °C.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w odpowiedniej objętości buforu sortującego w oparciu o całkowitą liczbę w kroku 3.8.
    UWAGA: Dodać 80 μl buforu sortującego na 107 komórek ogółem.
  11. W celu etykietowania kulkami magnetycznymi dodać 20 μl odczynnika blokującego FcR na 107 komórek i inkubować przez 5 minut.
  12. Dodaj 20 μl mikrogranulek CD144 lub CD31 na 10-7 komórek i dobrze wymieszaj. Inkubować zawiesinę komórkową w ciemności w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  13. Dodać 20 ml buforu sortującego w celu umycia oznakowanych komórek i zagnieździć komórki w ilości 300 x g przez 5 minut w wstępnie schłodzonej wirówce ustawionej na 4 °C.
  14. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu sortującego i pozostawić go na lodzie.
  15. Przygotuj kolumnę separacji magnetycznej, umieszczając kolumnę w wycięciu separatora.
  16. Wyrównać kolumnę, przepłukując ją 3 ml buforu sortującego i zebrać przepływ do stożkowej rurki odpływowej.
  17. Po przepłynięciu buforu płuczącego należy dokładnie zawiesić zawiesinę komórek, aby rozbić wszelkie grudki i nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę.
  18. Po przepłynięciu zawiesiny komórek przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml buforu sortującego, aby usunąć wszelkie nieoznakowane komórki.
  19. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml do elucji komórek CD144+/CD31+.
  20. Dodać 5 ml buforu sortującego do kolumny i natychmiast przepłukać magnetycznie oznakowane komórki za pomocą tłoka.
  21. Określ liczbę żywotnych komórek za pomocą 0,4% błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  22. Odwirować zawiesinę komórkową we wstępnie schłodzonej wirówce o stężeniu 300 x g przez 3 minuty.
  23. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości EGM za pomocą 5-8 μM inhibitora TGFβ (SB431542) w oparciu o całkowitą liczbę w kroku 3.21.
  24. Umieść to przejście 0 (P0) komórek o odpowiedniej gęstości komórek (4 x 104 komórki/cm2) na wstępnie pokrytej 0,2% płytce żelatynowej o stężeniu 0,2%.
  25. W przypadku P0 i P1 należy kontynuować uzupełnianie pożywki świeżym EGM co 2 dni za pomocą inhibitora TGFβ. Z P2 komórki można hodować w pożywce wzrostowej śródbłonka bez inhibitora TGFβ.

4. Różnicowanie fibroblastów serca

  1. Pozwól, aby iPSC stały się zlewające się w 90% do 95%; umyj każdą studzienkę 1 ml PBS.
  2. Rozpocznij różnicowanie w dniu 0, dodając 2 ml pożywki różnicującej #1 z 11 μM CHIR. W przypadku wrażliwych linii iPSC stężenie może wahać się w granicach 9-10 μM.
  3. W dniu 1 obserwuj tabliczkę. Normalne jest obserwowanie znacznej śmierci komórek przy ~ 30% do 40% komórek przylegających do płytki.
  4. W dniu 3 dodaj 2 ml pożywki różnicującej #1 z 5 μM IWR-1-endo, aby promować ekspansję komórek progenitorowych serca.
  5. W 4 dniu zastąp pożywkę 2 ml pożywki do różnicowania fibroblastów serca. Wymieniaj na świeże podłoże co 2 dni do 16 dnia.
  6. W dniu 18 odłącz komórki, używając 1 ml 10x trypsyny w każdym dołku 6-dołkowej płytki przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Dokładnie rozbić warstwę komórkową i przepuścić zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej równą objętość pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 5% FBS.
  8. Określ liczbę żywotnych komórek za pomocą 0,4% błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  9. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad.
  10. Przy pierwszym ponownym posiewie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej i płytkę o gęstości komórek (6 x 104 komórki/cm2) na płytce pokrytej 0,2% żelatyną aż do 90% zgrywu.
  11. Podziel płytkę i utrzymuj fibroblasty serca w zwykłym DMEM / F12 z 10% surowicą na płytkach pokrytych żelatyną.

5. Odlewanie form mikrotkanek serca i wysiewanie komórek

  1. Rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej w szklanej butelce o pojemności 100 ml, aż się zagotuje. Spryskaj butelkę z agarozą i umieść ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Pozostaw agarozę do ostygnięcia przez ~3 min.
  2. Odpipetować 700 μl stopionej agarozy w silikonowej mikroformie o układzie 9 x 9. Należy unikać wytwarzania pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
  3. Ostrożnie umieść formę na wstępnie schłodzonym bloku lodu, aby przyspieszyć żelowanie agarozy.
  4. Upewnij się, że po zżelowaniu agaroza staje się półprzezroczysta. Ostrożnie zegnij krawędzie mikroformy, aby poluzować replikę agarozy. Następnie delikatnie odklej replikę ze wszystkich stron, aby odczepić replikę agarozy od silikonowej mikroformy.
  5. Przenieść tackę na mikrotkanki agarozowe zawierającą 81 okrągłych wgłębień (średnica 800 μm; głębokość 800 μm) do sterylnej płytki 12-dołkowej.
  6. Dodaj 2 ml PBS do tacki na mikrotkanki agarozy i sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma uwięzionych pęcherzyków lub studzienek o nieregularnych kształtach.
  7. Zanurz tackę z agarozą w 2 ml 70% etanolu na noc, a następnie poddaj ją działaniu promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 1 godzinę.
  8. Przed użyciem usuń 70% etanolu i przemyj dwukrotnie wodą destylowaną, a na koniec 2 ml PBS.
  9. Trypsynizuj, neutralizuj i policz iPSC-CM, iPSC-EC i iPSC-CFs, a następnie umieść zawiesiny komórek na lodzie.
  10. Ostrożnie wyjmij PBS ze studzienki i komory wysiewu komórek, nie dotykając wgłębień.
  11. W nowej probówce wymieszaj iPSC-CMs, iPSC-EC i iPSC-CF odpowiednio w stosunku 7:2:1, aby uzyskać końcową gęstość komórek 10-6 komórek/ml. Większa gęstość komórek spowoduje powstanie większych mikrotkanek.
    UWAGA: Nie przekraczaj 2 x 106 komórek/ml.
  12. Ostrożnie dodać kroplami 200 μl zawiesiny komórek do komory wysiewu.
  13. Pozostawić komórki do osadzenia w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2 godziny.
  14. Dodaj pożywkę do produkcji mikrotkanek otaczającą pleśń agarozową, aby pokryć tylko powierzchnię komory wewnętrznej.
  15. Po 24 godzinach ogniwa samoorganizują się i znacznie zagęszczają w okrągłych wgłębieniach. Wymieniaj na świeże podłoże co 2 dni w celu konserwacji.

6. Utrwalanie i przenikanie komórek i mikrotkanek serca do barwienia immunologicznego

  1. Dla każdego indywidualnego typu komórek hoduj komórki oddzielnie na pożywce z matrycą błony podstawnej lub szkiełkach komorowych pokrytych żelatyną (około 2,5-3 x 105 komórek/ml). Mikrotkanki serca można pobrać do stożkowej rurki o pojemności 15 ml, delikatnie wypłukując je z okrągłych wgłębień.
  2. Odessać pożywkę i przepłukać komórki lub mikrotkanki 1 ml PBS, a następnie utrwalić buforem utrwalającym zawierającym 4,2% PFA przez 20 minut dla szkiełek w komorze i 1 godzinę dla mikrotkanek w temperaturze pokojowej.
  3. Zassać PFA i dodać 1 ml roztworu przepuszczalnego (0,25% Triton X-100 w PBS) przez 5 do 7 minut w przypadku szkiełek komorowych i 20 minut w przypadku mikrotkanek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, próbki mogą być delikatnie kołysane na bujanej platformie stołowej.
  4. Zassać roztwór przepuszczalny i spłukać raz 2 do 3 ml PBS.
  5. Inkubować komórki z 500-1000 μl roztworu blokującego (2% do 5% normalnej surowicy koziej lub surowicy osła) przez co najmniej 1 godzinę w przypadku szkiełek komorowych i 3 do 4 godzin w przypadku mikrotkanek.
  6. Inkubować komórki lub mikrotkanki serca ze sprzężonymi przeciwciałami przygotowanymi w roztworze blokującym wystarczającym do pokrycia próbki. Inkubować z antysercową troponiną T (cTnT2) (1:50), anty-CD31 (1:75) i anty-DDR2/wimentyną (1:50) przez 1 godzinę dla szkiełek komorowych i przez noc w temperaturze 4 °C dla mikrotkanek serca.
  7. Umyj szkiełka komory trzykrotnie 500 μL 0,1% Tween-20 przez 5 minut między każdym myciem a końcowym myciem PBS.
  8. W przypadku mikrotkanek serca przemyj je 2 ml 0,1% Tween-20 pięć razy w odstępie 20 minut między każdym myciem. Wykonaj ostatni etap prania przez dodatkowe 20 minut.
  9. Inkubować komórki lub mikrotkanki z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) (1 μg/ml) przed mikroskopią konfokalną.
  10. W przypadku mikrotkanek serca ostrożnie przenieś do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i dodaj PBS, aby zanurzyć mikrotkanki.
  11. W przypadku obrazowania 3D, przy użyciu obiektywu zanurzonego w oleju 20x lub 40x, uzyskujesz centralną ostrość mikrotkanki i dostosowujesz parametry ekspozycji dla każdego fluoroforu.
  12. Aby uzyskać stos Z, ustaw pierwszą i ostatnią współrzędną w trybie Live z całkowitą głębokością obrazowania 100-200 μm z odstępem między warstwami 5-10 μm.

7. Trawienie mikrotkanek serca i przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej

  1. Aby strawić mikrotkanki, delikatnie wypłucz mikrotkanki pożywką #1 z okrągłych wgłębień za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze 1 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Pozostawić mikrotkanki do opadnięcia i ostrożnie zassać pożywkę, a następnie przepłukać komórki lub mikrotkanki 1 ml PBS i dodać 200-300 μl buforu do trawienia enzymatycznego przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Po 10 minutach delikatnie mieszać mikrotkanki przez 1 minutę i ponownie inkubować w temperaturze 37 °C przez pozostały czas.
  3. Po inkubacji użyj zwykłej końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby energicznie wymieszać mikrotkanki, aby uzyskać mętną zawiesinę komórek.
  4. Gdy mikrotkanki zostaną wystarczająco strawione do pojedynczych komórek, natychmiast zneutralizuj zawiesinę komórkową za pomocą 5 ml pożywki zawierającej 5% FBS i przecedź zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm. Policzyć całkowitą liczbę komórek i odwirować zawiesinę jednokomórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić 1 x 105-1 x 106 komórek w 100 μl buforze wiążącym anektynę z aneksyną V FITC i 100 μg/ml jodku propidyny (PI) lub barwnikiem wykluczającym martwe komórki To-Pro3 przez 10 minut na lodzie.
  6. Po inkubacji dodać 300 μl buforu wiążącego aneksynę do zawiesiny komórek i przenieść do probówki FACS z okrągłym dnem w celu analizy cytometrii przepływowej. Do wybranych fluoroforów należy używać odpowiednich laserów i filtrów emisyjnych.
  7. W celu ilościowego określenia markerów powierzchni komórek przy użyciu komórek stałych, należy przeprowadzić utrwalanie i przenikanie osadu komórkowego zgodnie z opisem w krokach 6.2 i 6.3.
  8. Po permeabilizacji przepłukać osad komórkowy i inkubować komórki z odpowiednimi sprzężonymi przeciwciałami przez 1 godzinę. Przemyć osad komórkowy w 4 ml buforu FACS (2% FBS w PBS) i odwirować przy 300 x g przez 3 min. Powtórzyć etap mycia dwukrotnie.
  9. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 200-300 μl w celu analizy cytometrii przepływowej.
  10. Dostosuj właściwości rozproszenia do przodu i bocznego za pomocą niebarwionej próbki i rozważ użycie kontroli izotypu dla każdego fluoroforu w celu dostosowania napięcia lasera. Zbierz co najmniej 20 000 zdarzeń na potrzeby analizy danych.

8. Wykonywanie analiz skurczowych spontanicznie bijących mikrotkanek serca

  1. Nagrywaj filmy z mikrotkankami serca, aby uchwycić co najmniej trzy uderzenia. Ustaw rozdzielczość nagrywania na co najmniej 1280 x 720 pikseli przy liczbie klatek na sekundę >30 klatek na sekundę i zapisz wideo w .AVI formacie.
  2. Uruchom skrypt MotionGUI11 w środowisku MATLAB, aby uruchomić interfejs użytkownika.
  3. Znajdź .AVI lokalizację pliku w folderze, aby załadować wideo. Następnie wprowadź liczbę klatek na sekundę, z jaką wideo zostało przechwycone, w panelu Wejście.
  4. W panelu wprowadzania zaawansowanego można określić rozmiar piksela na podstawie rozdzielczości i powiększenia przechwytywanego obrazu.
  5. Można określić odpowiedni rozmiar piksela makrobloku (domyślnie 16) i wykrywalny ruch piksela w zależności od siły skurczu mikrotkanek.
  6. Po dostosowaniu parametrów kliknij Pobierz wektory ruchu, aby rozpocząć analizę.
  7. Wybierz obszar zainteresowania za pomocą przycisku radiowego Wybierz AOI, aby wykluczyć obszary otaczające pojedynczą mikrotkankę w okrągłym wgłębieniu.
  8. Użyj funkcji Map Time Ave, aby wygenerować mapę cieplną średniego skurczu na podstawie ruchu wykrytego na osiach X i Y.
  9. W przypadku danych śledzenia pików użyj funkcji Pobierz dane skurczu, aby automatycznie zmierzyć piki skurczu i rozluźnienia.
  10. W przypadku niskiego stosunku sygnału do szumu należy zastosować próg wysokości i odległości piku, aby poprawnie oznaczyć maksymalną prędkość skurczu (niebieska kropka) i maksymalną prędkość relaksacji (czerwony trójkąt).
  11. Po ustawieniu prawidłowych progów wybierz opcję Analizuj szczyty, aby uzyskać wartości skurczu i relaksacji z szybkością dudnień i interwałem uderzeń.
  12. Uzyskaj pomiary z co najmniej 25 pojedynczych mikrotkanek do analiz statystycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej CM, EC i CF pochodzących z iPSC
Aby wygenerować mikrotkanki serca złożone z iPSC-CM, iPSC-EC i iPSC-CFs, wszystkie trzy typy komórek są różnicowane i charakteryzowane indywidualnie. W ciągu ostatnich kilku lat poprawiło się różnicowanie in vitro między iPSC a iPSC-CM. Jednak wydajność i czystość iPSC-CM różnią się w zależności od linii. Obecny protokół daje ponad 75% czystych iPSC-CM, które spontanicznie zaczynają bić około...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wygenerować mikrotkanki serca ze wstępnie zróżnicowanych iPSC-CM, iPSC-EC i iPSC-CF, konieczne jest uzyskanie wysoce czystej hodowli w celu lepszej kontroli liczby komórek po zahamowanym kontaktowo zagęszczeniu komórek w mikrotkankach serca. Ostatnio Giacomelli i inni. al.18 zademonstrowali wytwarzanie mikrotkanek serca przy użyciu iPSC-CM, iPSC-EC i iPSC-CFs. Mikrotkanki serca wygenerowane opisaną metodą składają się z ~5 000 komórek (70% iPSC-CMs, 15% iPSC-EC i 15% iPSC-CFs). W tej metodzie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. jest współzałożycielem Khloris Biosciences, ale nie ma konkurencyjnych interesów, ponieważ prezentowane tu prace są całkowicie niezależne. Pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Amandzie Chase za jej pomocne opinie na temat manuskryptu. Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez Program Badań nad Chorobami Związanymi z Tytoniem (TRDRP) Uniwersytetu Kalifornijskiego, T29FT0380 (D.T.) i 27IR-0012 (J.C.W.); Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne 20POST35210896 (H.K.) i 17MERIT33610009 (J.C.W.); oraz National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 i NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 12-dołkoweFisher Scientific08-772-29
Mikroformy 3D Mikrotkanki6-dołkowe formatu12-81
Fisher Scientific08-772-1B
Roztwór do płukania AutoMACSThermo Fisher ScientificNC9104697
Suplement B27 bez InsulinLife TechnologiesA1895601
Suplement B27 plus InsulinLife Technologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, matryca z kwalifikacją hESCBD Biosciences354277
Przeciwciało T przeciwko troponinie sercowejMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Kadheryna)Mikrokulki Miltenyi130-097-857
Przeciwciało CD31Miltenyi130-110-670
CD31 MikrogranulkiMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
Zestaw do apoptozy martwych komórek z załącznikiem V FITC i PIThermo Fisher ScientificV13242
Dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, wysoka zawartość glukozy (4,5 g / l) bez pożywki glutaminy11960044
podstawowa DMEM/F-12Gibco11320033
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS), bez wapnia, bez magnezuLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Bydło płodowe surowicaLife Technologies10437
FibroLife Zestaw LifeFactors bez serumLifeLIne Cell TechnologyLS-1010
Glukoza bez glukozy RPMI mediumLife Technologies11879-020
Kozia surowicaLife Technologies16210-064
Ludzka FGF-basicThermo Fisher Scientific13256029
Ludzki VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS Kolumny sortująceMiltenyi130-042-401
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi130-091-376
Bufor płuczący MACSMiltenyi130-091-222
Separator MidiMACSMiltenyi130-042-302
RPMI średniLife Technologies11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Naukoweczerwone
przeciwciało sprzężone z Vimentin Alexa Fluor® 488R& D SystemsIC2105G
Płytki pożywka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166(2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64(2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948(2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39(2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886(2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108(2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrotkanki sercafrakcja naczyniowo zr bowacytometria przep ywowasekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekmikroskopia konfokalnatechnika formowania w agarozieg sto zasiewu kom rekanaliza funkcji kurczliwo cibarwienie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły