Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61881

⸱

20 października 2020

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Streszczenie

Technologiczne osiągnięcia proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas (MS) otwierają wiele nieodkrytych możliwości analizy globalnego proteomu organizmu w różnych warunkach. Ta potężna strategia zastosowana do interakcji patogenów mikrobiologicznych z pożądanym gospodarzem kompleksowo charakteryzuje obie perspektywy wobec infekcji. W niniejszym artykule opisano bezznacznikową kwantyfikację (LFQ) infektomu Cryptococcus neoformans, grzybowego fakultatywnego patogenu wewnątrzkomórkowego, który jest czynnikiem sprawczym śmiertelnej choroby kryptokokozy, w obecności unieśmiertelnionych komórek makrofagów. Protokół szczegółowo opisuje właściwe techniki przygotowania białek zarówno dla komórek patogenów, jak i ssaków w ramach jednego eksperymentu, co skutkuje odpowiednim zgłoszeniem peptydu do analizy metodą chromatografii cieczowej (LC)-MS/MS. Wysokoprzepustowy ogólny charakter LFQ pozwala na szeroki zakres dynamiczny identyfikacji i kwantyfikacji białek, a także możliwość przenoszenia do dowolnego środowiska infekcji gospodarz-patogen, przy zachowaniu ekstremalnej czułości. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem katalogowania obszernych, bezstronnych profili obfitości białek patogenu w warunkach naśladujących infekcję. W szczególności zademonstrowana tutaj metoda dostarcza istotnych informacji na temat patogenezy C. neoformans, takich jak produkcja białek niezbędnych do wirulencji i identyfikacji krytycznych białek gospodarza reagujących na inwazję drobnoustrojów.

Wprowadzenie

Częstość występowania inwazyjnych infekcji grzybiczych znacznie wzrasta i jest skorelowana z niedopuszczalnie wysokimi wskaźnikami śmiertelności, najczęściej zgłaszanymi u osób z predyspozycjami do niedoboru odporności1. Cryptococcus neoformans jest znanym oportunistycznym patogenem grzybowym zdolnym do przetrwania wewnątrzkomórkowego w komórkach makrofagów gospodarza. Nieodpowiednia interwencja przeciwgrzybicza powoduje rozprzestrzenianie się grzybicy i zagrażające życiu objawy kryptokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych2,3. Globalny wzrost statusu osób z obniżoną odpornością wymagał równoległego wzrostu stosowania środków przeciwgrzybiczych, w których wiele gatunków grzybów, w tym C. neoformans, w coraz większym stopniu rozwinęło odporność na 4,5,6. Dlatego konieczne jest wdrożenie solidnych i wydajnych technologii, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania biologiczne dotyczące odpowiedzi obronnej gospodarza i patogenezy drobnoustrojów.

Nowa era postępu technologicznego w spektrometrii mas (MS), w tym generowanie potężnych potoków obliczeniowych i bioinformatycznych, stanowi podstawę dla integracyjnej wizji dla wielkoskalowej analizy badań nad patogenami gospodarza7,8. Konwencjonalna analiza proteomiczna oparta na patogenezie zwykle profiluje widok infekcji z perspektywy gospodarza lub patogenu, w tym kompleksowe metodologie, takie jak profilowanie korelacji białek, chromatografia powinowactwa w połączeniu z proteomiką i interaktomika9. Badania nad zjadliwością niebezpiecznych patogenów w systemie gospodarza mają ogromne znaczenie kliniczne; Jednak zastosowanie analizy podwójnej perspektywy w jednym eksperymencie było wcześniej uważane za nieosiągalne. Na przykład, perspektywa patogenu wobec infekcji jest często przytłoczona przez bardzo obfite białka gospodarza, co skutkuje zmniejszoną czułością wykrywania mało obfitych białek grzybów7. Co więcej, wysoka złożoność próbki zachęca do zbadania wielu celów w jednym systemie eksperymentalnym i okazuje się wyzwaniem w wyjaśnieniu mechanizmów działania określonego białka patogenu.

Proteomika oddolna to popularna technika MS, która umożliwia łatwe przygotowanie próbki, w której peptydy są generowane przez specyficzne dla sekwencji trawienie enzymatyczne, a następnie separację metodą chromatografii cieczowej, identyfikację i kwantyfikację przez MS10,11. W tym miejscu przedstawiamy metodę demonstrującą strategię pozyskiwania zależną od danych, której celem jest osiągnięcie bezstronnego pokrycia proteomu lub "infektomu" opartego na infekcji. W szczególności kwantyfikacja bez znaczników (LFQ) zmniejsza zależność od etykiet chemicznych lub metabolicznych w celu solidnej i dokładnej identyfikacji zmian poziomu białka w wielu proteomach, redukując etapy obsługi i przetwarzania próbki12,13. To uniwersalne zastosowanie bada białka wytworzone w danym momencie w komórce, niezależnie od oczekiwanej produkcji białka; W ten sposób można odkryć nowe informacje, które mają kluczowe znaczenie dla infekcji.

Opisany tutaj przepływ pracy jest zoptymalizowany do badania zmian poziomu białka C. neoformans podczas warunków naśladujących infekcję z komórkami odpornościowymi gospodarza (Rysunek 1). Zamiast polegać na izolacji i separacji typów komórek, podejście to polega na ekstrakcji proteomu gospodarza i patogenu razem oraz wykorzystaniu separacji bioinformatycznej przy użyciu dwóch specyficznych dla organizmu baz danych w celu rozróżnienia produkcji białek specyficznych dla gatunku. Metoda ta oferuje korzyści w postaci nieograniczonej liczby próbek, które można przetworzyć bez dodatkowych kosztownych etapów przygotowania niezbędnych w badaniach znakowania izotopowego lub frakcjonowaniu. Co więcej, ten przepływ pracy obsługuje zoptymalizowane protokoły ekstrakcji białek, które można przenieść do szerokiej gamy patogenów grzybowych i bakteryjnych, zdolnych do celowania w komórki odpornościowe gospodarza i infekowania ich. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten przedstawia kroki prowadzące do zakończenia bezstronnej ekstrakcji białek i przetwarzania próbek dla stwardnienia rozsianego o wysokiej rozdzielczości, a następnie dane i analizę statystyczną, które mogą dostarczyć bogactwa wiedzy na temat białek grzybów istotnych dla infekcji w połączeniu z kompleksowym profilowaniem odpowiedzi obronnej gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W poniższym protokole, zatwierdzonym przez University of Guelph Animal Utilization Protocol 4193, wykorzystano unieśmiertelnioną linię makrofagów pochodzących od myszy BALB/c. Należy zauważyć, że do opisanego protokołu można zastosować inne szczepy myszy lub inne źródła unieśmiertelnionych komórek, pod warunkiem przeprowadzenia wystarczających testów w celu optymalizacji szczegółowych parametrów. Poniższy protokół opisuje kroki rozpoczynając od zamrożonej fiolki z komórkami makrofagów. Komórki są przechowywane w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 1% L-glutaminy, 5% mieszaniny Pen/Strep (penicylina-streptomycyna) oraz 20% DMSO (dimetylosulfoksyd).

1. Hodowla C. neoformans

  1. Korzystając z zamrożonego banku w glicerolu, wykonaj posiew kreskowy szczepu dzikiego C. neoformans (H99) na płytkę z agarem YPD (Yeast-extract peptone dextrose), aby wyizolować pojedyncze kolonie.
  2. Inkubuj przez noc przez 16 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze statycznym.
  3. Wybierz pojedynczą kolonię szczepu dzikiego C. neoformans i hoduj w 5 mL bulionu YPD w probówce 10 mL z luźno zakręconą nakrętką. Procedurę wykonaj w czterech powtórzeniach.
  4. Inkubuj przez noc przez 16 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 200 rpm.
  5. Następnego dnia wykonaj subkulturę każdej nocnej hodowli w rozcieńczeniu 1:100 w 3 mL bulionu YPD.
  6. Zmierz wartości gęstości optycznej (OD600nm) hodowli grzybowej, aby wyznaczyć środkową fazę logarytmiczną. W zależności od spektrofotometru szczep dziki C. neoformans zazwyczaj osiąga środkową fazę logarytmiczną po 6 do 8 h inkubacji w YPD, przy ogólnych wartościach OD600nm w zakresie od 1,0 do 1,5.
  7. Po osiągnięciu przez komórki środkowej fazy logarytmicznej, pobierz 10 µL zawiesiny komórek grzyba do czystej probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL i rozcieńcz 1:100 w sterylnym 1x roztworze PBS (phosphate buffered saline). Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.

2. Hodowla komórek makrofagów

UWAGA: Przed przystąpieniem do hodowli komórkowych należy upewnić się, że środowisko pracy zostało wysterylizowane.

  1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowej
    1. Pożywka z dodatkiem antybiotyków: Do pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) dodać 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 1% L-glutaminy oraz 5% mieszaniny Pen/Strep (penicylina-streptomycyna). Pożywkę przefiltrować przez kompletny system filtracyjny 0,2 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Pożywka bez antybiotyków: Postępować zgodnie z tym samym protokołem, pomijając dodanie mieszaniny Pen/Strep.
  2. Wysiew komórek makrofagów
    UWAGA: Pożywkę z dodatkiem antybiotyków (2.1.1.) należy ogrzać do 37°C przed rozpoczęciem prac z hodowlą komórkową.
    1. Szybko rozmrozić fiolkę z komórkami makrofagów w łaźni kuleczkowej o temperaturze 37 °C.
    2. Przemyć komórki z roztworu do mrożenia, resuspendując je w 1 mL pożywki z dodatkiem antybiotyków.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć lizy komórek podczas zbyt gwałtownego pipetowania.
    3. Przenieść resuspendowane komórki do sterylnej probówki 15 mL.
    4. Zzagregować komórki poprzez wirowanie przy 400 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    5. Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
    6. Delikatnie resuspendować osad w 10 mL pożywki z dodatkiem antybiotyków.
    7. Ostrożnie nanieść resuspendowane komórki pipetą do naczynia hodowlanego 60 x 15 mma przeznaczonego do hodowli komórkowej.
    8. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez noc.
  3. Pierwsze pasażowanie komórek makrofagów
    UWAGA: Zamrożone zapasy komórek zazwyczaj zawierają od 5 do 10 milionów komórek na fiolkę (ok. 1 mL). Następnego dnia komórki makrofagów, które przeżyły protokół wysiewu, przywrą do dna naczynia hodowlanego i będą gotowe do pasażowania.
    1. Przed rozpoczęciem prac z hodowlą komórkową ogrzać pożywkę z dodatkiem antybiotyków (krok 2.1.1) do 37 °C. Upewnić się, że środowisko pracy zostało wysterylizowane. Sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że są przytwierdzone i zdrowe.
    2. Usunąć pożywkę hodowlaną z naczynia za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
    3. Delikatnie dodać 5-7 mL sterylnego PBS (solanka fosforanowa) w temperaturze pokojowej do naczynia 60 x 15 mm.
    4. Delikatnie przechylić naczynie, aby przemyć przytwierdzone komórki.
    5. Usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
    6. Dodać do komórek 1 mL zimnego PBS (przechowywanego w 4 °C), przechylić naczynie, aby PBS rozprowadził się na wszystkie komórki, i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 min.
    7. Odczepić komórki poprzez delikatne opukiwanie naczynia, pipetowanie zimnego PBS przeciwko komórkom lub za pomocą skrobaka do komórek.
    8. Dodać do naczynia 9 mL pożywki z dodatkiem antybiotyków.
    9. Do nowego naczynia 60 x 15 mm dodać 9 mL świeżej pożywki z dodatkiem antybiotyków oraz 1 mL resuspendowanych komórek z naczynia pierwotnego.
    10. Po wypełnieniu pożądanej liczby płytek do pasażowania, resuspendowane komórki z naczynia pierwotnego można usunąć.
    11. Inkubować nowe naczynie w ustawieniach wspomnianych powyżej (krok 2.2.8).
    12. Kolejne pasażowanie przeprowadzać, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji (około co 2 dni, zależnie od linii komórkowej i użytej pożywki).
      UWAGA: Komórki makrofagów powinny zostać spasażowane co najmniej pięć razy przed eksperymentami z infekcją. W zależności od linii komórkowej, eksperymenty z infekcją należy przeprowadzić do 25-30 pasażu. Po 25-30 pasażach komórki należy zamrozić lub usunąć. Wybór między sekcją 2.4 a 2.5 zależy od planu eksperymentalnego. W kolejnych sekcjach będzie stosowana procedura z sekcji 2.4.
  4. Wysiew komórek makrofagów przed infekcją
    1. Wykonać kroki protokołu pasażowania od 2.3.1 do 2.3.7.
    2. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek określić gęstość komórek (komórki/mL).
    3. Przenieść 0,3 x 106 komórek makrofagów do pojedynczego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej.
    4. Dopełnić całkowitą objętość dołka do 1 mL za pomocą pożywki z dodatkiem antybiotyków (krok 2.1.1).
    5. Powtarzać kroki 2.4.3 i 2.4.4, aż wypełnione zostanie 8 dołków (po 4 dołki w dwóch oddzielnych płytkach).
    6. Opcjonalnie wypełnić pozostałe dwa dołki 1 mL PBS w temperaturze pokojowej, aby utrzymać poziom wilgotności podczas inkubacji.
    7. Pozostawić komórki do wzrostu w warunkach inkubacji opisanych w kroku 2.2.8 przez 2 dni przed infekcją.
  5. Wysiew komórek makrofagów w dniu infekcji
    1. Wykonać kroki protokołu pasażowania od 2.3.1 do 2.3.7.
    2. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek określić gęstość komórek (komórki/mL).
    3. Wysiać 1,2 x 106 komórek makrofagów do pojedynczego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej.
    4. Dopełnić całkowitą objętość dołka do 1 mL za pomocą pożywki z dodatkiem antybiotyków (2.1.1).
    5. Powtarzać kroki 2.4.3 i 2.4.4, aż wypełnione zostanie 8 dołków (po 4 dołki w dwóch oddzielnych płytkach).
    6. Opcjonalnie wypełnić pozostałe dwa dołki 1 mL PBS w temperaturze pokojowej, aby utrzymać poziom wilgotności podczas inkubacji.
    7. Inkubować komórki w warunkach opisanych w kroku 2.2.8 przez 3 h, aby umożliwić ich przytwierdzenie do dołków.

3. Infekowanie makrofagów C. neoformans

UWAGA: Po osiągnięciu 70-80% konfluencji w każdej studzience znajdzie się ok. 1.2 x 106 makrofagów. Aby uzyskać pożądaną wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 100:1, dla każdej reakcji wymagane jest 1.2 x 108 komórek grzyba. Hodowle należy przygotować odpowiednio w czterech powtórzeniach biologicznych.

ZASTRZEŻENIE: MOI na poziomie 100:1 pozwoliło na uzyskanie pożądanych wyników w naszej grupie badawczej i jest traktowane jako sugestia dla czytelników. Niższe MOI może być wymagane w przypadku bardziej zakaźnych szczepów C. neoformans lub mniej odpornych linii komórkowych makrofagów. Weryfikacja infekcji (sekcja 3.5) może zostać wykorzystana do określenia optymalnego MOI dla konkretnych kombinacji C. neoformans – makrofagów .

  1. Przygotowanie komórek grzyba
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 1 w celu hodowli C. neoformans do średniej fazy logarytmicznej.
    2. Zebierz komórki i wiruj przy 1,500 x g przez 10 min, delikatnie przemyj osad sterylnym PBS w temperaturze pokojowej i powtórz czynność łącznie trzy razy.
    3. Resuspenduj komórki w pożywce do hodowli komórkowej bez antybiotyków (krok 2.1.2), aby uzyskać stężenie 1.2 x 108 komórek/mL.
  2. Przygotowanie komórek makrofagów
    1. Obejrzyj każde wgłębienie w płytce 6-dołkowej, aby upewnić się, że komórki osiągnęły 70-80% konfluencji. Alternatywnie można zmierzyć liczbę komórek, aby uzyskać ok. 1.2 x 106 komórek makrofagów na wgłębienie.
    2. Postępuj zgodnie z krokami od 2.3.1 do 2.3.4.
  3. Współhodowla C. neoformans i komórek makrofagów
    1. Do 4 wgłębień zawierających komórki makrofagów przygotowane w sekcji 3.2 dodaj 1 mL resuspendowanych komórek C. neoformans (krok 3.1.3).
      UWAGA: Liczbę wymaganych płytek należy obliczyć przed rozpoczęciem eksperymentu. Do pustych wgłębień dodaj 1 mL pożywki bez antybiotyków (krok 2.1.2).
    2. Inkubuj komórki w wymienionych warunkach (krok 2.2.8) przez 3 h.
    3. Usuń pożywkę z płytki za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
    4. Delikatnie dodaj 1 mL sterylnego PBS w temperaturze pokojowej.
    5. Delikatnie przechyl płytkę, aby wypłukać nieprzytwierdzone lub nefagocytowane zewnątrzkomórkowe komórki C. neoformans.
    6. Usuń PBS za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego i powtórz czynność łącznie trzy razy. Powtórz kroki 3.3.4 do 3.3.5 jeszcze dwa razy.
  4. Makrofagi niezainfekowane
    1. Analogicznie, wykorzystaj 4 wgłębienia płytki 6-dołkowej jako próbki zawierające wyłącznie makrofagi. Do tych wgłębień dodaj 1 mL pożywki bez antybiotyków (krok 2.1.2).
    2. Powtórz kroki od 3.3.2 do 3.3.6.
  5. Weryfikacja infekcji
    UWAGA: Efektywność infekcji można zmierzyć za pomocą testu cytotoksyczności. Poniższy protokół opisuje zastosowanie produktu do testów cytotoksyczności w celu pomiaru uwalniania LDH (dehydrogenazy mleczanowej). Można również stosować inne produkty do pomiaru cytotoksyczności.
    1. Przygotowanie infekcji komórek makrofagów przez C. neoformans
      1. Powtórz kroki 1, 2 i 3 (do 3.5). Jeśli jest to preferowane, test LDH można wykonać w trzech powtórzeniach.
      2. Po kroku 3.3.6 do każdego wgłębienia w płytce 6-dołkowej dodaj 1 mL pożywki bez antybiotyków (2.1.2).
      3. Powtarzaj kroki 2.4.3 i 2.4.4, aż wypełnione zostanie 3 wgłębienia oraz 3n wgłębień (gdzie n to liczba mierzonych punktów czasowych).
      4. Inkubuj komórki w warunkach wymienionych w kroku 2.2.8.
      5. W wybranych punktach czasowych (np. po 1, 3, 6, 12 i 24 godzinach) pobierz nadsącz do pomiaru uwalniania LDH zgodnie z instrukcjami producenta.
      6. W tych samych punktach czasowych niezainfekowane komórki makrofagów zostaną poddane lizie w celu określenia wartości maksymalnej cytotoksyczności.
      7. Oblicz cytotoksyczność w następujący sposób:
        figure-protocol-1

4. Pobieranie próbek

  1. Współhodowla i pobieranie niezinfekowanych makrofagów
    1. Dodać 1 mL zimnego PBS do komórek (z punktów 3.3.6 i 3.4.2) i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 min.
    2. Uwolnić komórki z płytki poprzez delikatne stuknięcie płytki lub ostrożne pipetowanie zimnego PBS w kierunku komórek.
      UWAGA: Należy unikać stosowania skrobaka do komórek, ponieważ może to spowodować ich lizę.
    3. Przenieść resuspensowane komórki pipetą do probówki 15 mL.
    4. Odwirować komórki z prędkością 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć nadsącz.
    5. Przetworzyć komórki (zgodnie z opisem w kroku 5) niezwłocznie lub zamrozić je gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej obróbki.

5. Proteom komórkowy

UWAGA: Należy zoptymalizować stopień lizy dla analizowanego typu komórek (tzn. liczba cykli i amplituda zależą od wielkości osadu komórkowego oraz procentowej mocy modelu sonikatora z sondą).

  1. Liza zakażonych makrofagów
    1. Resuspenduj osad z komórek (krok 4.1.5) w 300 µL 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) zawierającego świeżo rozpuszczoną tabletkę koktajlu inhibitorów proteaz.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu jedną tabletkę koktajlu inhibitorów proteaz dodaje się do 10 mL lodowatego 100 mM Tris-HCl (pH 8.5).
    2. Poddaj komórki sonikacji za pomocą sondy w łaźni lodowej przez 15 cykli (30 s włączone, 30 s wyłączone), aby zlizować komórki.
    3. Odwiruj krótko komórki przez 30 s przy 400 x g, uważając, aby nie utworzyć osadu, a jedynie usunąć ciecz ze ścianek probówek, a następnie przenieś próbkę do probówki mikroodwirowej 2 mL typu Lo-bind.
    4. Dodaj 1:10 objętości 20% SDS do stężenia końcowego 2%.
    5. Dodaj 1:100 objętości 1 M ditiotreitolu (DTT) do stężenia końcowego 10 mM i dokładnie wymieszaj próbkę pipetując, a następnie inkubuj na bloku grzejnym w temperaturze 95 °C przez 10 min przy mieszaniu 800 rpm. Następnie schłodź do temperatury pokojowej (chłodzenie można przeprowadzić na lodzie).
    6. Dodaj 1:10 objętości 0,55 M jodOAcetamidu (IAA), aby uzyskać stężenie końcowe 55 mM, i dokładnie wymieszaj próbkę pipetując. Inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 min.
    7. Dodaj 100% aceton, aby uzyskać stężenie końcowe 80% acetonu, i przechowuj próbkę przez noc w temperaturze -20°C w celu wytrącenia białek.
  2. Trawienie białek
    1. Następnego dnia zbierz osad przez wirowanie przez 10 min przy 10 000 x g i 4 °C. Odlej naddatek i przemyj osad 500 µL 80% acetonu. Powtórz czynność, aby w sumie wykonać dwa przemycia. Po przemyciu wysusz osad na powietrzu w temperaturze pokojowej.
    2. Ponownie rozpuść osad białkowy w 100 µL 8 M mocznika/40 mM HEPES; aby zapewnić całkowite rozpuszczenie, wymieszaj w wortexie lub poddaj sonikacji w łaźni wodno-lodowej przez 15 cykli (30 s włączone, 30 s wyłączone).
      UWAGA: Dostosowanie objętości mocznika/HEPES zależy od wielkości wytrąconego osadu komórkowego; w przypadku zmian należy odpowiednio skorygować wszystkie kolejne objętości.
    3. Oznacz stężenie białka za pomocą testu białkowego (np. testu BCA) zgodnie z instrukcją producenta i skoryguj pomiar tła poprzez normalizację próbą ślepą z 8 M mocznika/40 mM HEPES.
    4. Dodaj 300 µL 50 mM wodorowęglanu amonu, aby uzyskać stężenie końcowe 2 M mocznika.
      UWAGA: Jest to okazja do normalizacji stężenia białka dla dalszych pomiarów; zaleca się strawienie 100 µg białka, a pozostałą niestrawioną próbkę zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w -20 °C krótkoterminowo lub w -80 °C długoterminowo.
    5. Dodaj mieszaninę proteaz trypsyny/Lys-C w stosunku enzymu do białka 2:50 (v/w) na lodzie i delikatnie opukaj probówkę, aby wymieszać; inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
    6. Po inkubacji zatrzymaj trawienie, dodając 1:10 objętości roztworu stopującego (20% acetonitrylu, 6% kwasu trifluorooctowego) i odwiruj próbki przy 10 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    7. Zbierz naddatek (zawierający strawione peptydy) i odrzuć wszelkie osady lub zanieczyszczenia.
  3. Odsalanie peptydów
    1. Aktywuj końcówkę do ekstrakcji C18 Stop And Go Extraction (STAGE) (składającą się z 3 warstw żywicy C18 w końcówce pipety 200 µL), dodając 100 µL 100% acetonitrylu, i odwiruj przy 1 000 x g przez 2 min.
    2. Zrównoważ końcówkę C18 STAGE, dodając 50 µL Buforu B (80% (v/v) acetonitrylu, 0,5% (v/v) kwasu octowego) i odwiruj przy 1 000 x g przez 2 min.
    3. Zrównoważ końcówkę C18 STAGE, dodając 200 µL Buforu A (2% (v/v) acetonitrylu, 0,1% (v/v) kwasu trifluorooctowego, 0,5% (v/v) kwasu octowego) i odwiruj przy 1 000 x g przez 3-5 min.
    4. Nałóż ~50 µg strawionej próbki na końcówkę C18 STAGE i odwiruj przy 1 000 x g przez 3-5 min lub do momentu, aż próbka przejdzie przez kolumnę. Pozostałą strawioną próbkę zamroź gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w -20°C do czasu użycia.
    5. Przemyj końcówkę C18 STAGE 200 µL Buforu A i odwiruj przy 1 000 x g przez 3-5 min.
    6. Dodaj 50 µL Buforu B do końcówki C18 STAGE i odwiruj przy 500 x g przez 2 min. Zbierz eluowane peptydy do probówek PCR 0,2 mL.
    7. Wysusz eluowane peptydy w wirówce próżniowej przez 30-40 min przy maksymalnej prędkości. Całkowicie wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej lub w -20 °C do czasu przetworzenia.
      UWAGA: Wysuszone i odsolone peptydy są odpowiednią formą próbek przekazywanych do ośrodków spektrometrii mas w celu analizy i mogą być transportowane w temperaturze otoczenia.

6. Spektrometria mas

  1. Przygotować roztwory peptydów w 10 µL Buforu A i zmierzyć stężenie niezbędne do wstrzyknięcia ok. 1,5 do 3 µg peptydów na kolumnę MS. Ilość próbki zależy od zastosowanej aparatury.
  2. Zastosować wcześniej określony gradient acetonitrylu (ok. 5-60%) w 0,5% kwasie octowym w wybranym czasie (np. 2 h), aby rozdzielić peptydy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, a następnie przeprowadzić jonizację elektrospray do spektrometru mas.
  3. Wyonać skany MS przy użyciu spektrometru mas wysokiej rozdzielczości w trybie akwizycji zależnej od danych (m/z 300 do 1650).
    UWAGA: Procentowy skład i długość gradientu są określone przez eksperyment i użytkownika. Precyzyjne ustawienia spektrometru mas zależą od aparatury, eksperymentu i preferencji użytkownika.

7. Analiza danych

UWAGA: Dane MS mogą być przetwarzane za pomocą licznych potoków bioinformatycznych. W niniejszym protokole opisujemy przetwarzanie z wykorzystaniem ogólnodostępnych platform MaxQuant oraz Perseus, jednak zalecamy poszczególnym użytkownikom ocenę narzędzi bioinformatycznych odpowiednich dla danej analizy, preferencji oraz zastosowania.

  1. Załaduj nieprzetworzone pliki danych (bezpośrednio z instrumentu MS) przy użyciu oprogramowania MaxQuant. Zidentyfikuj białka zgodnie z zmodyfikowanymi parametrami wyszukiwania MaxQuant; do identyfikacji białek wymagane są minimum dwa unikalne peptydy przy zastosowaniu podejścia target-decoy dla poziomu fałszywych odkryć (FDR) wynoszącego 1%, zastosuj ilościowanie bezetykietowe (LFQ) z dopasowaniem między przebiegami (matching between runs), uwzględnij plik FASTA organizmów pobrany z bazy danych UniProt (tj. Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus), aby zidentyfikować i ilościowo określić obecne peptydy za pomocą silnika wyszukiwania Andromeda. Zapoznaj się z publicznymi narzędziami online MaxQuant w celu uzyskania szczegółowych instrukcji (patrz Tabela Materiałów).
  2. Prześlij plik wyjściowy z MaxQuant („proteingroups.txt”) do programu Perseus.
  3. Przefiltruj wiersze zawierające potencjalne wyniki fałszywie dodatnie i zanieczyszczenia, a także peptydy zmodyfikowane tylko w konkretnych miejscach (modified by site), korzystając z funkcji „Filter rows based on categorical column”.
  4. Przekształć wartości danych na skalę log2.
  5. Utwórz grupy zestawów danych, przypisując adnotacje kategoryczne do wierszy.
  6. Przefiltruj zestaw danych według wartości poprawnych (valid values), aby zdefiniować próg detekcji białek.
    UWAGA: Dla rygorystycznej i solidnej analizy sugerowany jest wskaźnik identyfikacji >50%. Na przykład, jeśli przetworzono cztery powtórzenia, wybrano by minimalną liczbę trzech wartości poprawnych.
  7. W razie potrzeby przeprowadź imputację danych, zastępując brakujące wartości wartościami z rozkładu normalnego.
    UWAGA: Wartości imputowane są optymalizowane na podstawie rozkładu normalnego i zapewniają losową intensywność LFQ w miejsce znaczników „NaN”, aby symulować typowe pomiary obfitości. Imputacja ta stanowi podstawę do dalszych analiz statystycznych wymagających danych ilościowych.
  8. Dodaj adnotacje do wierszy białek (np. nazwy białek, terminy Gene Ontology).
    UWAGA: Wygenerowany w ten sposób przepływ pracy w programie Perseus stanowi teraz solidną podstawę do dalszego przetwarzania bioinformatycznego, analiz statystycznych i wizualizacji danych; zapoznaj się z publicznymi narzędziami online Perseus w celu uzyskania szczegółowych instrukcji (patrz Tabela Materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany powyżej protokół umożliwia identyfikację i kwantyfikację białek pochodzących zarówno z grzybiczego patogenu, C. neoformans, jak i z gospodarza, czyli makrofagów, w ramach jednego eksperymentu. Po kokulturze komórki są zbierane i przetwarzane wspólnie, a następnie rozdzielane bioinformatycznie na podstawie profili peptydowych specyficznych dla każdego gatunku. Jest to potężne podejście do definiowania interakcji w relacji gospodarz-patogen podczas infekcji. Liczba białek zidentyfikowanych w eksperymencie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki w protokole obejmują przygotowanie komórek makrofagów i pobranie próbek z kohodowli do przetwarzania białek przy minimalnym zakłóceniu komórek. Ważne jest, aby delikatnie i ostrożnie wykonywać etapy mycia, zaszczepiania i usuwania przylegających komórek makrofagów, aby zapobiec niepotrzebnej lizie komórek przed pobraniem. Ustalenie prawidłowego MOI dla eksperymentu ma również kluczowe znaczenie, ponieważ inokulacja zbyt wysokim MOI może spowodować szybką śmierć komórek makrofagów oraz trudności w pobierani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Jonathanowi Kriegerowi z Bioinformatics Solutions Inc. za obsługę spektrometru mas do reprezentatywnych eksperymentów, a także członkom grupy Geddes-McAlister za pomoc w przygotowaniu eksperymentu i informacji zwrotnej na temat manuskryptu. Autorzy potwierdzają wsparcie finansowe, częściowo, ze strony Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425) oraz Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) dla J.G.M., a także NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship dla B.B. oraz Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology dla AS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 mM Tris-HCl, pH 8,5Fisher ScientificBP152-1Utrzymuj na poziomie 4°
C 60 x 15 mm Talerz, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific174888
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychThermoFisher Scientific140675
Acetonitryl, klasa MSPierceTS-51101
Kwas octowySigma Aldrich1099510001
AcetonSigma Aldrich34850-1L
Amon wodorowęglan (ABC)ThermoFisher ScientificA643-500Przygotuj podstawowy roztwór ABC o stężeniu 50 mM, stabilny w temperaturze pokojowej przez okres do jednego miesiąca.
Bel-Art i handel; System pobierania aspiratora próżniowego HiFlowFisher Scientific13-717-300Nie jest to konieczne, do usuwania pożywki można używać pipet serologicznych.
Żywica C18Skrobaki do komórek 3M Empore3M2215
VWR10062-906Nie jest to konieczne, można zastosować inne metody uwalniania komórek makrofagów.
Odśrodkowy koncentrator próżniEppendorf07-748-15
Kompletna jednostka filtrującaVWR10040-436
Stożkowe rurki sokoła (15 ml)Fisher Scientific05-539-12
Automatyczny licznik komórek Countess IIThermoFisher ScientificAMQAX1000Nie jest to konieczne, hemocytometr może być używany jako alternatywa.
CytoTox 96 Nieradioaktywny test cytotoksycznościPromegaG1780
Ditiothreitol (DTT)ThermoFisher ScientificR0861Przygotować masowy roztwór podstawowy 1 M DTT, błyskawicznie zamrożony i przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAXThermoFisher Scientific10566016
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ThermoFisher Scientific 12483020Inaktywacja ciepła przez inkubację w temperaturze 60& C przez 30 minut. Przygotować 50 ml porcji i błyskawicznie zamrozić. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki
HemocytometrVWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375Przygotować 40 mM HEPES/8 M mocznika w roztworze podstawowym luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20° C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
Wysokowydajny system chromatografii cieczowejThermoFisher ScientificLC140Długość gradientu jest oparta na złożoności próbki, zalecany gradient 120 minut dla próbek zakaźnych.
Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczościThermoFisher Scientific726042
Jodoacetamid (IAA)Sigma AldrichI6125Przygotować 0,55 M roztwór podstawowy luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20° C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
L-glutaminaThermoFisher Scientific25030081Może być porcjowana i zamrożona do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.
Probówki do mikrowirówek LoBindEppendorf13-698-794
MaxQuanthttps://maxquant.org/MaxQuant to publiczna platforma oferująca samouczki, takie jak Letnia Szkoła MaxQuant, przedstawiające etapy analizy obliczeniowej dużych zbiorów danych MS
MikrowirówkaEppendorf13864457
Penicylina : Streptomycyna 10k/10kVWRCA12001-692Może być podwielokrotny i zamrożony do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.
Kolumny do separacji peptydówThermoFisher ScientificES803
Perseus Softwarehttp://maxquant.net/perseus/
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiVWRCA12001-676Kupowanie nie jest wymagane. Można również przygotować PBS, ale przed użyciem należy przeprowadzić sterylną filtrację.
Test białka Pierce BCAThermoFisher Scientific  23225
Pipeta, jednorazowa serologiczna (10 ml)Fisher Scientific13-678-11E
Pipeta, jednorazowa serologiczna (25 mL) Sonda BasixFisher Scientific14955235
Sonciator ThermoFisherScientific100-132-894
Inhibitor proteazy w tabletce koktajlowejRoche4693159001
Dodecylosiarczan soduThermoFisher Scientific2836420% (w/v)
Spektrofotometr (Nanodrop)ThermoFisher ScientificND-2000
STAGE Wirówka z wywrotemSonationSTC-V2
Wytrząsarka termicznaVWRNO89232-908
Kwas trifluorooctowyThermoFisher Scientific85183
Mieszanina proteazy trypsyny/Lys-C, Klasa MSPierceA40007Utrzymuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Kąpiel ultradźwiękowaBransonicA89375-450Przechowywana w chłodni (4C)
MocznikSigma AldrichU1250-1KGPrzygotować 40 mM HEPES/8 M mocznik w roztworze podstawowym luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
Ekstrakt z drożdży, bulion dekstrozowy peptonowyBD DifcoBM20

Bibliografia

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
  2. Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
  4. Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
  5. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
  6. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
  7. Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
  8. Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
  9. Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
  10. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  11. Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
  12. Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  13. Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
  14. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  15. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  16. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
  17. Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
  18. Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
  19. Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
  20. Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
  21. Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
  22. Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
  23. Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
  24. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  25. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  26. Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
  27. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
  28. Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
  29. Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
  30. Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cryptococcus neoformanszakażenie makrofagówanaliza LC-MS/MSprzygotowanie białekanaliza głównych składowychgrupowanie hierarchiczneFDR Benjamini-Hochbergtest cytotoksyczności
Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.