Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Abstract

Technologiczne osiągnięcia proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas (MS) otwierają wiele nieodkrytych możliwości analizy globalnego proteomu organizmu w różnych warunkach. Ta potężna strategia zastosowana do interakcji patogenów mikrobiologicznych z pożądanym gospodarzem kompleksowo charakteryzuje obie perspektywy wobec infekcji. W niniejszym artykule opisano bezznacznikową kwantyfikację (LFQ) infektomu Cryptococcus neoformans, grzybowego fakultatywnego patogenu wewnątrzkomórkowego, który jest czynnikiem sprawczym śmiertelnej choroby kryptokokozy, w obecności unieśmiertelnionych komórek makrofagów. Protokół szczegółowo opisuje właściwe techniki przygotowania białek zarówno dla komórek patogenów, jak i ssaków w ramach jednego eksperymentu, co skutkuje odpowiednim zgłoszeniem peptydu do analizy metodą chromatografii cieczowej (LC)-MS/MS. Wysokoprzepustowy ogólny charakter LFQ pozwala na szeroki zakres dynamiczny identyfikacji i kwantyfikacji białek, a także możliwość przenoszenia do dowolnego środowiska infekcji gospodarz-patogen, przy zachowaniu ekstremalnej czułości. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem katalogowania obszernych, bezstronnych profili obfitości białek patogenu w warunkach naśladujących infekcję. W szczególności zademonstrowana tutaj metoda dostarcza istotnych informacji na temat patogenezy C. neoformans, takich jak produkcja białek niezbędnych do wirulencji i identyfikacji krytycznych białek gospodarza reagujących na inwazję drobnoustrojów.

Introduction

Częstość występowania inwazyjnych infekcji grzybiczych znacznie wzrasta i jest skorelowana z niedopuszczalnie wysokimi wskaźnikami śmiertelności, najczęściej zgłaszanymi u osób z predyspozycjami do niedoboru odporności¹. Cryptococcus neoformans jest znanym oportunistycznym patogenem grzybowym zdolnym do przetrwania wewnątrzkomórkowego w komórkach makrofagów gospodarza. Nieodpowiednia interwencja przeciwgrzybicza powoduje rozprzestrzenianie się grzybicy i zagrażające życiu objawy kryptokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych^2,3. Globalny wzrost statusu osób z obniżoną odpornością wymagał równoległego wzrostu stosowania środków przeciwgrzybiczych, w których wiele gatunków grzybów, w tym C. neoformans, w coraz większym stopniu rozwinęło odporność na ^4,5,6. Dlatego konieczne jest wdrożenie solidnych i wydajnych technologii, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania biologiczne dotyczące odpowiedzi obronnej gospodarza i patogenezy drobnoustrojów.

Nowa era postępu technologicznego w spektrometrii mas (MS), w tym generowanie potężnych potoków obliczeniowych i bioinformatycznych, stanowi podstawę dla integracyjnej wizji dla wielkoskalowej analizy badań nad patogenami gospodarza^7,8. Konwencjonalna analiza proteomiczna oparta na patogenezie zwykle profiluje widok infekcji z perspektywy gospodarza lub patogenu, w tym kompleksowe metodologie, takie jak profilowanie korelacji białek, chromatografia powinowactwa w połączeniu z proteomiką i interaktomika⁹. Badania nad zjadliwością niebezpiecznych patogenów w systemie gospodarza mają ogromne znaczenie kliniczne; Jednak zastosowanie analizy podwójnej perspektywy w jednym eksperymencie było wcześniej uważane za nieosiągalne. Na przykład, perspektywa patogenu wobec infekcji jest często przytłoczona przez bardzo obfite białka gospodarza, co skutkuje zmniejszoną czułością wykrywania mało obfitych białek grzybów⁷. Co więcej, wysoka złożoność próbki zachęca do zbadania wielu celów w jednym systemie eksperymentalnym i okazuje się wyzwaniem w wyjaśnieniu mechanizmów działania określonego białka patogenu.

Proteomika oddolna to popularna technika MS, która umożliwia łatwe przygotowanie próbki, w której peptydy są generowane przez specyficzne dla sekwencji trawienie enzymatyczne, a następnie separację metodą chromatografii cieczowej, identyfikację i kwantyfikację przez MS^10,11. W tym miejscu przedstawiamy metodę demonstrującą strategię pozyskiwania zależną od danych, której celem jest osiągnięcie bezstronnego pokrycia proteomu lub "infektomu" opartego na infekcji. W szczególności kwantyfikacja bez znaczników (LFQ) zmniejsza zależność od etykiet chemicznych lub metabolicznych w celu solidnej i dokładnej identyfikacji zmian poziomu białka w wielu proteomach, redukując etapy obsługi i przetwarzania próbki^12,13. To uniwersalne zastosowanie bada białka wytworzone w danym momencie w komórce, niezależnie od oczekiwanej produkcji białka; W ten sposób można odkryć nowe informacje, które mają kluczowe znaczenie dla infekcji.

Opisany tutaj przepływ pracy jest zoptymalizowany do badania zmian poziomu białka C. neoformans podczas warunków naśladujących infekcję z komórkami odpornościowymi gospodarza (Rysunek 1). Zamiast polegać na izolacji i separacji typów komórek, podejście to polega na ekstrakcji proteomu gospodarza i patogenu razem oraz wykorzystaniu separacji bioinformatycznej przy użyciu dwóch specyficznych dla organizmu baz danych w celu rozróżnienia produkcji białek specyficznych dla gatunku. Metoda ta oferuje korzyści w postaci nieograniczonej liczby próbek, które można przetworzyć bez dodatkowych kosztownych etapów przygotowania niezbędnych w badaniach znakowania izotopowego lub frakcjonowaniu. Co więcej, ten przepływ pracy obsługuje zoptymalizowane protokoły ekstrakcji białek, które można przenieść do szerokiej gamy patogenów grzybowych i bakteryjnych, zdolnych do celowania w komórki odpornościowe gospodarza i infekowania ich. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten przedstawia kroki prowadzące do zakończenia bezstronnej ekstrakcji białek i przetwarzania próbek dla stwardnienia rozsianego o wysokiej rozdzielczości, a następnie dane i analizę statystyczną, które mogą dostarczyć bogactwa wiedzy na temat białek grzybów istotnych dla infekcji w połączeniu z kompleksowym profilowaniem odpowiedzi obronnej gospodarza.

Protocol

Nieśmiertelna linia makrofagów pochodzących od myszy BALB/c została wykorzystana do następującego protokołu zatwierdzonego przez University of Guelph Animal Utilization Protocol 4193. Warto zauważyć, że inne szczepy myszy lub inne źródła unieśmiertelnionych komórek można zastosować do przedstawionego protokołu z wystarczającymi testami w celu optymalizacji szczegółowych parametrów. Poniższy protokół przeprowadzi przez kolejne kroki, zaczynając od zamrożonej fiolki z komórkami makrofagów. Komórki są przechowywane w 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 1% L-glutaminie i 5% mieszaninie Pen/Strep (penicylina-streptomycyna) do DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) i 20% DMSO (dimetylosulfotlenek).

1. Hodowla C. neoformans

1. Używając bulionu glicerynowego, nałóż szczep C. neoformans typu dzikiego (H99) na płytkę agarową z dekstrozą peptonową z ekstraktem drożdżowym (YPD) w celu wyizolowania pojedynczych kolonii.
2. Inkubować przez noc przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze statycznym.
3. Wybierz pojedynczą kolonię dzikiego szczepu C. neoformans i zahoduj ją w 5 ml bulionu YPD w luźno zamkniętej probówce o pojemności 10 ml. Występuj w poczwórnym powiększeniu.
4. Inkubować przez noc przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
5. Następnego dnia subkulturuj każdą nocną hodowlę w rozcieńczeniu 1:100 do 3 ml bulionu YPD.
6. Zmierz wartości gęstości optycznej (OD_{600 nm}) kultury grzybów, aby określić środkową fazę logarytmiczną. W zależności od spektrofotometru, szczep C. neoformans typu dzikiego osiąga fazę mid-log, zwykle po 6 do 8 godzinach inkubacji w YPD z ogólnymi wartościami OD_{600 nm} w zakresie od 1,0 do 1,5.
7. Gdy komórki osiągną środkową fazę logarytmiczną, weź 10 μl porcji zawiesiny komórek grzybów do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozcieńcz w stosunku 1:100 w sterylnym 1x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.

2. Hodowla komórek makrofagów

UWAGA: Upewnij się, że środowisko pracy jest wysterylizowane przed rozpoczęciem pracy z hodowlą komórkową.

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych
   1. Pożywka uzupełniona antybiotykami: Dodaj 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 1% L-glutaminy i 5% mieszaniny Pen/Strep (penicylina-streptomycyna) do DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Przefiltrować medium przez kompletny system filtracyjny 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Pożywka wolna od antybiotyków: Postępuj zgodnie z identycznym protokołem, ale pomiń mieszaninę Pen/Strep
   .
2. Wysiew komórek makrofagów
   UWAGA: Pożywkę uzupełnioną antybiotykiem (2.1.1.) należy ogrzać do 37°C przed rozpoczęciem pracy z hodowlą komórkową.
   1. Szybko rozmrozić fiolkę z komórkami makrofagów w kąpieli perełkowej w temperaturze 37 °C.
   2. Umyć komórki roztworem zamrażającym poprzez ponowne zawieszenie komórek w 1 ml pożywki uzupełnionej antybiotykiem.
      UWAGA: Należy zachować dodatkowe środki ostrożności, aby upewnić się, że komórki nie ulegną lizie w wyniku ostrego pipetowania.
   3. Przenieś zawieszone komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
   4. Komórki osadu przez odwirowanie w ilości 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
   6. Delikatnie zawiesić osad w 10 ml pożywki uzupełnionej antybiotykiem.
   7. Delikatnie odpipetować zawieszone komórki w naczyniu o wymiarach 60 x 15 mm poddanym hodowli komórkowej.
   8. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 przez} noc.
3. Początkowe pasaż komórek makrofagów
   UWAGA: Zamrożone zapasy komórek zwykle zawierają od 5 do 10 milionów komórek na fiolkę (ok. 1 ml). Następnego dnia komórki makrofagów, które przetrwały protokół wysiewu, przylgną do dna naczynia do hodowli komórkowej i będą gotowe do pasażowania.
   1. Podgrzać pożywkę uzupełnioną antybiotykiem (etap 2.1.1) do temperatury 37 °C przed rozpoczęciem hodowli komórkowej. Upewnij się, że środowisko pracy jest wysterylizowane przed pracami nad hodowlą komórkową. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego, aby upewnić się, że komórki są przylegające i zdrowe.
   2. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z naczynia za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
   3. Delikatnie dodaj 5-7 ml sterylnego PBS (soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) o temperaturze pokojowej do naczynia o wymiarach 60 x 15 mm.
   4. Delikatnie przechyl naczynie, aby umyć przylegające komórki.
   5. Usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
   6. Dodać 1 ml zimnego PBS (przechowywanego w temperaturze 4 °C) do komórek, przechylić naczynie, aby rozprowadzić PBS na wszystkich komórkach i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 minutę.
   7. Uwolnij komórki poprzez delikatne stukanie w naczynie, pipetowanie zimnego PBS na komórki lub za pomocą skrobaka do komórek.
   8. Dodaj 9 ml pożywki uzupełnionej antybiotykiem do naczynia.
   9. W nowym naczyniu o wymiarach 60 x 15 mm dodaj 9 ml świeżej pożywki uzupełnionej antybiotykiem i 1 ml zawieszonych komórek z oryginalnego naczynia.
   10. Po napełnieniu żądanej liczby płytek pasażujących, zawieszone komórki z oryginalnego naczynia można wyrzucić.
   11. Inkubuj nowe naczynie przy ustawieniach wymienionych powyżej (krok 2.2.8).
   12. Wykonaj kolejne pasażowanie, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji (mniej więcej co 2 dni, w zależności od użytej linii komórkowej i pożywki).
       UWAGA: Komórki makrofagów powinny być pasażowane co najmniej pięć razy przed eksperymentami z infekcją. W zależności od linii komórkowej eksperymenty z infekcją powinny być wykonywane przez 25 do 30 pasaży. Po 25 do 30 przejściach komórki należy zamrozić lub wyrzucić. Sekcja 2.4 lub 2.5 może być wybrana na podstawie planów doświadczalnych. Sekcja 2.4 będzie używana w kolejnych sekcjach.
4. Wysiewanie komórek makrofagów przed infekcją
   1. Wykonaj kroki protokołu przejścia od 2.3.1 do 2.3.7.
   2. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek określ gęstość komórek (komórki/ml).
   3. Przenieś 0,3 x 10⁶ komórek makrofagów do pojedynczego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórek.
   4. Dostosować całkowitą objętość studzienki do 1 ml za pomocą pożywki uzupełnionej antybiotykiem (krok 2.1.1).
   5. Powtarzać kroki 2.4.3 i 2.4.4, aż do napełnienia 8 studzienek (4 studzienki wypełnione dwiema oddzielnymi płytkami).
   6. Opcjonalnie napełnij pozostałe dwie studzienki 1 ml PBS o temperaturze pokojowej, aby utrzymać poziom wilgoci podczas inkubacji.
   7. Pozwolić komórkom rosnąć w warunkach inkubacji wymienionych w kroku 2.2.8 przez 2 dni przed zakażeniem.
5. Wysiew komórek makrofagów w dniu infekcji
   1. Wykonaj kroki protokołu przejścia od 2.3.1 do 2.3.7.
   2. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek określ gęstość komórek (komórki/ml).
   3. Zasiać 1,2 x 10⁶ komórek makrofagów w pojedynczym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórek.
   4. Dostosować całkowitą objętość studzienki do 1 ml za pomocą pożywki z dodatkiem antybiotyków (2.1.1).
   5. Powtarzać czynności 2.4.3 i 2.4.4, aż do napełnienia 8 studzienek (4 studzienki wypełnione dwiema oddzielnymi płytkami).
   6. Opcjonalnie napełnij pozostałe dwie studzienki 1 ml PBS o temperaturze pokojowej, aby utrzymać poziom wilgoci podczas inkubacji.
   7. Inkubować komórki w warunkach wymienionych w kroku 2.2.8 przez 3 godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie do studzienek.

3. Zakażenie komórek makrofagów C. neoformans

UWAGA: Po osiągnięciu 70-80% konfluencji, na studzienkę będzie przypadać ok. 1,2 x 10⁶ komórek makrofagów. Aby osiągnąć pożądaną wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 100:1, do każdej reakcji potrzeba^1,2 x 10 8 komórek grzyba. Kultury muszą być odpowiednio ustawione w biologicznym poczwórnym poczwórnym.

ZASTRZEŻENIE: MOI 100:1 osiągnęło pożądane wyniki w naszej grupie badawczej i ma służyć jako sugestia dla czytelników. Niższy MOI może być wymagany w przypadku bardziej zakaźnych szczepów C. neoformans lub mniej odpornych linii komórkowych makrofagów. Weryfikacja zakażenia (sekcja 3.5) może być wykorzystana do określenia idealnego MOI dla poszczególnych kombinacji C. neoformans – makrofagów.

1. Przygotowanie komórek grzybów
   1. Wykonaj krok 1, aby uzyskać wzrost C. neoformans do środkowej fazy logarytmicznej.
   2. Zebrać i odwirować komórki w ilości 1 500 x g przez 10 minut, delikatnie przemyć granulki sterylnym PBS o temperaturze pokojowej i powtórzyć w sumie trzy płukania.
   3. Zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych bez antybiotyków (krok 2.1.2), aby osiągnąć stężenie 1,2 x 10⁸ komórek/ml.
2. Przygotowanie komórek makrofagów
   1. Wizualizuj każdą studzienkę w płytce 6-dołkowej, aby upewnić się, że komórki osiągnęły 70-80% zbieżności. Alternatywnie można zmierzyć komórki, aby uzyskać ok. 1,2 x 10⁶ komórek makrofagów na studzienkę.
   2. Wykonaj kroki od 2.3.1 do 2.3.4.
3. Kohodowla C. neoformans i komórek makrofagów
   1. Dodać 1 ml zawieszonych komórek C. neoformans (etap 3.1.3) do 4 studzienek zawierających komórki makrofagów przygotowanych w sekcji 3.2.
      UWAGA: Liczba wymaganych płytek będzie musiała zostać obliczona przed rozpoczęciem eksperymentu. Dodać 1 ml pożywki wolnej od antybiotyków (krok 2.1.2) do pustych studzienek.
   2. Pozostawić komórki do inkubacji w wymienionych warunkach (etap 2.2.8) przez 3 godziny.
   3. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z płytki za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
   4. Delikatnie dodaj 1 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej.
   5. Delikatnie przechyl płytkę, aby umyć nieprzyłączone lub niefagocytozowane zewnątrzkomórkowe komórki C. neoformans.
   6. Usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego, powtórzyć w sumie trzy płukania. Powtórzyć czynności od 3.3.4 do 3.3.5 jeszcze dwa razy.
4. Niezakażone makrofagi
   1. Podobnie, użyj 4 dołków z 6-dołkowej płytki, aby służyły jako próbki tylko makrofagów. Dodać 1 ml pożywki wolnej od antybiotyków (krok 2.1.2) do tych studzienek.
   2. Powtórz kroki od 3.3.2 do 3.3.6.
5. Weryfikacja infekcji
   UWAGA: Za pomocą testu cytotoksyczności można zmierzyć biegłość w zakażeniu. Poniższy protokół podkreśli zastosowanie produktu cytotoksycznego do pomiaru uwalniania LDH (dehydrogenazy mleczanowej). Można również stosować inne produkty cytotoksyczności.
   1. Przygotowanie zakażenia komórek makrofagów C. neoformans
      1. Powtarza kroki 1, 2 i 3 (do 3,5). Test LDH można przeprowadzić w trzech egzemplarzach, jeśli jest to preferowane.
      2. Po kroku 3.3.6 dodać 1 ml pożywki wolnej od antybiotyków (2.1.2) do każdego dołka w płytce 6-dołkowej.
      3. Powtarzać kroki 2.4.3 i 2.4.4, aż zostaną wypełnione 3 dołki plus 3n dołków (gdzie n jest liczbą zmierzonych punktów czasowych).
      4. Inkubować komórki w warunkach wymienionych w kroku 2.2.8.
      5. W wybranych punktach czasowych (np. 1, 3, 6, 12 i 24 godziny) pobrać supernatant do pomiaru uwalniania LDH zgodnie z instrukcją producenta
      6. W tym samym czasie niezakażone komórki makrofagów zostaną poddane lizie do określonej wartości w celu uzyskania maksymalnej cytotoksyczności.
      7. Obliczyć cytotoksyczność w następujący sposób:
         

4. Pobieranie próbek

1. Kokultura i kolekcja niezakażonych makrofagów
   1. Dodać 1 ml zimnego PBS do komórek (z 3.3.6 i 3.4.2) i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 minutę.
   2. Uwolnić komórki z płytki poprzez delikatne stukanie w płytkę lub delikatne pipetowanie zimnego PBS do komórek.
      UWAGA: Należy unikać skrobaków do komórek, ponieważ może to spowodować lizę komórek.
   3. Odpipetować ponownie zawieszone komórki w probówce o pojemności 15 ml.
   4. Odwirować komórki o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
   5. Komórki przetwarzane (zgodnie z opisem w kroku 5) należy natychmiast lub błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego przetwarzania.

5. Proteom komórkowy

UWAGA: Wystarczająca liza musi być zoptymalizowana dla analizowanego typu komórki (tj. ilość cykli i amplitud zależy od wielkości ogniwa i procentu mocy modelu sonikatora).

1. Zakażona liza komórek makrofagów
   1. Zawiesić granulowane komórki (krok 4.1.5) w 300 μl 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) składającym się ze świeżo rozpuszczonej tabletki koktajlowej inhibitora proteazy.
      UWAGA: Jedną tabletkę koktajlową inhibitora proteazy dodaje się do 10 ml lodowatego 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. Sonduj komórki sonikujące w łaźni lodowej przez 15 cykli po 30 s włączania i 30 s przerwy, aby lizować komórki.
   3. Odwirować komórki krótko przez 30 s przy 400 x g, uważając, aby nie utworzyć osadu, tylko w celu usunięcia płynu z boków probówek, a następnie przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej Lo-bind o pojemności 2 ml.
   4. Dodać 1:10 objętość 20% SDS do końcowego stężenia 2%.
   5. Dodać 1 M ditiotreitol (DTT) w objętości 1:100 do końcowego stężenia 10 mM i dokładnie wymieszać próbkę przez pipetowanie, a następnie inkubować w termicznym bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez 10 minut przy mieszaniu 800 obr./min. Następnie schłodzić do temperatury pokojowej (chłodzenie można przeprowadzić na lodzie).
   6. Dodać 0,55 M jodoacetamidu (IAA) w stosunku 1:10 do uzyskania końcowego stężenia 55 mM i dokładnie wymieszać próbkę przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut.
   7. Dodać 100% acetonu, aby uzyskać końcowe stężenie 80% acetonu i przechowywać próbkę przez noc w temperaturze -20°C w celu wytrącenia białek.
2. Trawienie białek
   1. Następnego dnia zebrać osad przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i 4 °C. Wyrzucić supernatant i przemyć osad 500 μl 80% acetonu. Powtórz w sumie dwa prania. Suchy granulat na powietrzu w temperaturze pokojowej po praniu.
   2. Rozpuść osad białkowy w 100 μl 8 M mocznika/40 mM HEPES, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność, wirować lub sonikować w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 cykli po 30 s włączenia i 30 s wyłączenia.
      UWAGA: Regulacja objętości mocznika/HEPES zależy od wielkości wytrąconego osadu komórkowego, jeśli wystąpią zmiany, wszystkie dalsze objętości muszą być odpowiednio dostosowane.
   3. Określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu białkowego (np. testu białka BCA) zgodnie z instrukcjami producenta i dostosować do pomiaru tła przez normalizację ślepej próby za pomocą 8 M mocznika/40 mM HEPES.
   4. Dodać 300 μl 50 mM wodorowęglanu amonu, aby uzyskać końcowe stężenie 2 M mocznika.
      UWAGA: Możliwość normalizacji stężenia białka dla dalszych pomiarów, sugerowana jest trawienie 100 μg białka i przechowywanie pozostałej niestrawionej próbki przez błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie, a następnie przechowywanie w temperaturze -20 °C przez krótki czas lub w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas.
   5. Dodaj stosunek enzymu do białka 2:50 (v/w) mieszaniny trypsyny/proteazy Lys-C na lodzie i delikatnie postukaj w probówkę, aby wymieszać, inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
   6. Po inkubacji przerwać trawienie, dodając roztwór zatrzymujący objętość w stosunku 1:10 (20% acetonitrylu, 6% kwasu trifluorooctowego) i odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Zebrać supernatant (składa się z strawionych peptydów) i wyrzucić wszelkie granulowane szczątki lub osad.
3. Odsalanie peptydów
   1. Aktywuj końcówkę do ekstrakcji C18 Stop And Go (STAGE) (składającą się z 3 warstw żywicy C18 w końcówce do pipety o pojemności 200 μl), dodając 100 μl 100% acetonitrylu i odwirowując przy 1 000 x g przez 2 minuty.
   2. Zrównoważyć końcówkę C18 STAGE, dodając 50 μl buforu B (80% (v/v) acetonitrylu, 0,5% (v/v) kwasu octowego) i odwirować przy 1 000 x g przez 2 min.
   3. Zrównoważyć końcówkę C18 STAGE, dodając 200 μl buforu A (2% (v/v) acetonitrylu, 0,1% (v/v) kwasu trifluorooctowego, 0,5% (v/v) kwasu octowego) i odwirować przy 1 000 x g przez 3-5 minut.
   4. Dodać ~50 μg strawionej próbki na końcówkę C18 STAGE i odwirować przy 1,000 x g przez 3-5 minut lub do momentu, gdy próbka przejdzie przez kolumnę wirową. Pozostałą strawioną próbkę należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu, gdy będzie potrzebna.
   5. Umyj końcówkę C18 STAGE 200 μl buforu A i odwiruj przy 1 000 x g przez 3-5 minut.
   6. Dodać 50 μl buforu B do końcówki C18 STAGE i wirować przy 500 x g przez 2 min. Zebrać elucjowane peptydy w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml.
   7. Suszyć eluowane peptydy w wirówce próżniowej przez 30-40 minut z maksymalną prędkością. Całkowicie wysuszone próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej lub w temperaturze -20 °C do czasu przetworzenia.
      UWAGA: Wysuszone i odsolone peptydy są odpowiednimi próbkami przesyłanymi do urządzeń zajmujących się spektrometrią mas w celu przetworzenia i mogą być wysyłane w temperaturze otoczenia.

6. Spektrometria mas

1. Rozpuść peptydy w 10 μl buforu A i zmierz stężenie niezbędne do wstrzyknięcia ~1,5 do 3 μg peptydów do kolumny MS. Ilość próbki będzie zależeć od oprzyrządowania.
2. Użyj wcześniej ustalonego gradientu acetonitrylu (ok. 5-60%) w 0,5% kwasie octowym przez żądany czas (np. 2 godziny), aby oddzielić peptydy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, a następnie jonizacji elektronrozpylanej do spektrometru mas.
3. Rejestruj skany MS za pomocą spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości w trybie akwizycji zależnej od danych (m/z 300 do 1650).
   UWAGA: Procent i długość gradientu są określane przez eksperyment i użytkownika. Precyzyjne ustawienia spektrometru mas zależą od oprzyrządowania, eksperymentu i preferencji użytkownika.

7. Analiza danych

UWAGA: Dane MS mogą być przetwarzane za pomocą wielu procesów bioinformatycznych. W tym protokole opisujemy przetwarzanie przy użyciu publicznie dostępnych platform MaxQuant i Perseus, ale zalecamy indywidualnym użytkownikom ocenę narzędzi bioinformatycznych odpowiednich do analizy, preferencji i użytkowania.

1. Załaduj nieprzetworzone pliki danych (bezpośrednio z urządzenia MS) za pomocą oprogramowania MaxQuant. Identyfikacja białek w zmodyfikowanych parametrach wyszukiwania MaxQuant; co najmniej dwa unikalne peptydy niezbędne do identyfikacji białek przy użyciu podejścia opartego na wabiku docelowym dla wskaźnika fałszywych odkryć wynoszącego 1%, wdrożenie kwantyfikacji bez znaczników z dopasowaniem między seriami, włączenie pliku FASTA organizmów uzyskanego z bazy danych UniProt (tj. Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) w celu identyfikacji i ilościowego określenia obecnych peptydów za pomocą wyszukiwarki Andromeda. Zapoznaj się z publicznymi narzędziami online MaxQuant, aby uzyskać szczegółowe samouczki (patrz Spis materiałów).
2. Prześlij plik wyjściowy MaxQuant ("proteingroups.txt") do Perseusa.
3. Filtruj wiersze zawierające potencjalne wyniki fałszywie dodatnie i zanieczyszczenia, a także modyfikowane tylko przez peptydy lokalizacji z opcją "Filtruj wiersze na podstawie kolumny kategorii".
4. Przekształcanie wartości danych w skali logarytmu₂.
5. Utwórz grupy zestawów danych, dodając adnotacje kategorii do wierszy.
6. Filtruj zestaw danych według prawidłowych wartości, aby zdefiniować punkt odcięcia dla wykrywania białek.
   UWAGA: W celu przeprowadzenia rygorystycznej i solidnej analizy sugerowany jest współczynnik identyfikacji >50%. Na przykład, jeśli przetworzono cztery powtórzenia, zostanie wybrana minimalna liczba trzech prawidłowych wartości.
7. Jeśli jest to preferowane, imputuj dane, zastępując brakujące wartości z rozkładu normalnego.
   UWAGA: Wartości podstawione są optymalizowane na podstawie rozkładu normalnego i zapewniają losową intensywność LFQ, która zastępuje symbole zastępcze "NaN" w celu symulacji typowych pomiarów obfitości. Imputacja ta stanowi platformę do dalszych analiz statystycznych, które wymagają danych wymiernych.
8. Dodaj adnotacje do wierszy białek (np. nazwy białek, terminy ontologii genów).
   UWAGA: Ten przepływ pracy wygenerowany przez Perseusa jest teraz solidną ramą do dalszego przetwarzania bioinformatycznego, analizy statystycznej i wizualizacji danych, zapoznaj się z publicznymi narzędziami online Perseusa, aby uzyskać szczegółowe samouczki (patrz Tabela materiałów).

Results

Protokół opisany powyżej umożliwia identyfikację i kwantyfikację białek pochodzących zarówno z patogenu grzybowego, C. neoformans, jak i gospodarza, komórek makrofagów, w jednym eksperymencie. Po wspólnej hodowli komórki są zbierane i przetwarzane razem oraz bioinformatyczne rozdzielane na podstawie profili peptydowych specyficznych dla każdego gatunku. Jest to skuteczne podejście do definiowania wzajemnych oddziaływań między gospodarzem a patogenem podczas infekcji. Liczba białek zidentyfikowanych w eksperymenc...

Discussion

Kluczowe kroki w protokole obejmują przygotowanie komórek makrofagów i pobranie próbek z kohodowli do przetwarzania białek przy minimalnym zakłóceniu komórek. Ważne jest, aby delikatnie i ostrożnie wykonywać etapy mycia, zaszczepiania i usuwania przylegających komórek makrofagów, aby zapobiec niepotrzebnej lizie komórek przed pobraniem. Ustalenie prawidłowego MOI dla eksperymentu ma również kluczowe znaczenie, ponieważ inokulacja zbyt wysokim MOI może spowodować szybką śmierć komórek makrofagów oraz trudności w pobierani...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8,5	Fisher Scientific	BP152-1	Utrzymuj na poziomie 4°
C 60 x 15 mm Talerz, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitryl, klasa MS	Pierce	TS-51101
Kwas octowy	Sigma Aldrich	1099510001
Aceton	Sigma Aldrich	34850-1L
Amon wodorowęglan (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Przygotuj podstawowy roztwór ABC o stężeniu 50 mM, stabilny w temperaturze pokojowej przez okres do jednego miesiąca.
Bel-Art i handel; System pobierania aspiratora próżniowego HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	Nie jest to konieczne, do usuwania pożywki można używać pipet serologicznych.
Żywica C18	Skrobaki do komórek 3M Empore	3M2215
	VWR	10062-906	Nie jest to konieczne, można zastosować inne metody uwalniania komórek makrofagów.
Odśrodkowy koncentrator próżni	Eppendorf	07-748-15
Kompletna jednostka filtrująca	VWR	10040-436
Stożkowe rurki sokoła (15 ml)	Fisher Scientific	05-539-12
Automatyczny licznik komórek Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Nie jest to konieczne, hemocytometr może być używany jako alternatywa.
CytoTox 96 Nieradioaktywny test cytotoksyczności	Promega	G1780
Ditiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Przygotować masowy roztwór podstawowy 1 M DTT, błyskawicznie zamrożony i przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Scientific 12483020		Inaktywacja ciepła przez inkubację w temperaturze 60& C przez 30 minut. Przygotować 50 ml porcji i błyskawicznie zamrozić. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki
Hemocytometr	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Przygotować 40 mM HEPES/8 M mocznika w roztworze podstawowym luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20° C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
Wysokowydajny system chromatografii cieczowej	ThermoFisher Scientific	LC140	Długość gradientu jest oparta na złożoności próbki, zalecany gradient 120 minut dla próbek zakaźnych.
Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości	ThermoFisher Scientific	726042
Jodoacetamid (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Przygotować 0,55 M roztwór podstawowy luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20° C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
L-glutamina	ThermoFisher Scientific	25030081	Może być porcjowana i zamrożona do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.
Probówki do mikrowirówek LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant to publiczna platforma oferująca samouczki, takie jak Letnia Szkoła MaxQuant, przedstawiające etapy analizy obliczeniowej dużych zbiorów danych MS
Mikrowirówka	Eppendorf	13864457
Penicylina : Streptomycyna 10k/10k	VWR	CA12001-692	Może być podwielokrotny i zamrożony do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.
Kolumny do separacji peptydów	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	VWR	CA12001-676	Kupowanie nie jest wymagane. Można również przygotować PBS, ale przed użyciem należy przeprowadzić sterylną filtrację.
Test białka Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23225
Pipeta, jednorazowa serologiczna (10 ml)	Fisher Scientific	13-678-11E
Pipeta, jednorazowa serologiczna (25 mL) Sonda Basix	Fisher Scientific	14955235
Sonciator ThermoFisher	Scientific	100-132-894
Inhibitor proteazy w tabletce koktajlowej	Roche	4693159001
Dodecylosiarczan sodu	ThermoFisher Scientific	28364	20% (w/v)
Spektrofotometr (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE Wirówka z wywrotem	Sonation	STC-V2
Wytrząsarka termiczna	VWR	NO89232-908
Kwas trifluorooctowy	ThermoFisher Scientific	85183
Mieszanina proteazy trypsyny/Lys-C, Klasa MS	Pierce	A40007	Utrzymuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Kąpiel ultradźwiękowa	Bransonic	A89375-450	Przechowywana w chłodni (4C)
Mocznik	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Przygotować 40 mM HEPES/8 M mocznik w roztworze podstawowym luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
Ekstrakt z drożdży, bulion dekstrozowy peptonowy	BD Difco	BM20