Artykuł metodologiczny

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61895

⸱

30 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Streszczenie

Złożone modele chorób wymagają najnowocześniejszych narzędzi, które są w stanie dostarczyć fizjologicznie i patologicznie istotnych, użytecznych spostrzeżeń, a także ujawnić procesy niewidoczne w inny sposób. Zaawansowane testy komórkowe, ściśle naśladujące scenerię in vivo, stają się nowymi sposobami wizualizacji i pomiaru dwukierunkowej interakcji między guzem a gospodarzem, wpływającej na postęp raka. W tym miejscu opisujemy dwa wszechstronne protokoły do odtwarzania wysoce kontrolowanych kokultur 2D i 3D w mikrourządzeniach, naśladując złożoność mikrośrodowiska guza (TME), pod naturalnym i indukowanym terapią nadzorem immunologicznym. W sekcji 1 przedstawiono warunki eksperymentalne do monitorowania przesłuchów między przylegającymi komórkami nowotworowymi a pływającymi populacjami immunologicznymi, za pomocą mikroskopii poklatkowej w jasnym polu. Jako scenariusz aplikacyjny analizujemy wpływ leczenia przeciwnowotworowego, takiego jak tzw. immunogenne induktory śmierci komórek nowotworowych na rekrutację i aktywację komórek odpornościowych. W sekcji 2 mikrośrodowiska 3D odporne na nowotwór są zebrane w konkurencyjny układ. Różnicowy naciek immunologiczny jest monitorowany za pomocą migawek fluorescencyjnych trwających do 72 godzin, w celu oceny skojarzonych strategii terapeutycznych. W obu ustawieniach zilustrowano etapy przetwarzania obrazu w celu wyodrębnienia wielu parametrów komórek odpornościowych (np. migracji i interakcji komórek odpornościowych, odpowiedzi na środki terapeutyczne). Te proste i potężne metody można dodatkowo dostosować do symulacji złożoności TME, obejmującej heterogeniczność i plastyczność podtypów komórek nowotworowych, zrębowych i odpornościowych, a także ich wzajemne interakcje jako czynniki napędzające ewolucję raka. Zgodność tych szybko rozwijających się technologii z obrazowaniem o wysokiej zawartości w żywych komórkach może prowadzić do generowania dużych zbiorów danych informacyjnych, co rodzi nowe wyzwania. Rzeczywiście, trójkąt "kohodowle/mikroskopia/zaawansowana analiza danych" wyznacza drogę do precyzyjnej parametryzacji problemu, która może pomóc w opracowaniu dostosowanych do potrzeb protokołów terapeutycznych. Oczekujemy, że przyszła integracja układu scalonego odpornego na raka ze sztuczną inteligencją do przetwarzania o wysokiej przepustowości będzie stanowić synergię w wykorzystaniu możliwości jako narzędzi predykcyjnych i przedklinicznych dla precyzyjnej i spersonalizowanej onkologii.

Wprowadzenie

Ewolucja różnych gałęzi medycyny jako dyscyplin eksperymentalnych zależała od możliwości manipulowania populacją komórek i funkcjami organów w kontrolowanych warunkach1. Taka zdolność ma swoje korzenie w dostępności mierzalnych modeli, które są w stanie podsumować procesy zachodzące w naszym ciele.

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki2, biologia nowotworów musi korzystać z pojawiających się modeli in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym2,3.

Mikrośrodowisko nowotworu4 (TME) to złożona tkanka, w której komórki nowotworowe nieustannie oddziałują i dynamicznie współewoluują z innymi składnikami komórkowymi (immunologicznymi, zrębowymi i śródbłonkowymi) oraz niekomórkowymi (macierz zewnątrzkomórkowa, ECM). Dynamiczna natura tego złożonego krajobrazu decyduje o tym, czy komórki odpornościowe są przyjaciółmi, czy wrogami komórek nowotworowych, co silnie wpływa zarówno na postęp choroby, jak i odpowiedź na leczenie. Obecnie wielkie wysiłki onkoimmunologów, bioinformatyków i ekspertów w dziedzinie biologii systemowej zbiegają się, aby zająć się klinicznym znaczeniem heterogeniczności raka5,6, zarówno w przestrzeni (tj. w różnych regionach guza), jak i w czasie (tj. na różnych etapach progresji nowotworu)5,6oraz scharakteryzowanie fenotypu i funkcji nowotworów i komórek odpornościowych na poziomie pojedynczej komórki. Przykładem tej synergii są obecnie rutynowo stosowane zaawansowane techniki widzenia komputerowego do przestrzennego mapowania nacieku immunologicznego w próbkach histologicznych7,8.

Na froncie modeli eksperymentalnych, łączących badania na zwierzętach i tradycyjne metody in vitro, postępy w mikrofluidyce i technikach kokulturowania dają dostęp do różnych klas mikroinżynieryjnych modeli komórkowych, takich jak organoidy, systemy mikrofizjologiczne9,10,11 (MPS), oraz organs-on-chip12,13,14 (OOC). Ich wspólną cechą jest powiększanie "szerszego obrazu" ekosystemów komórkowych i rozszerzanie potencjału in vitro w celu kontrolowania czynników mikrośrodowiskowych przy jednoczesnym wykorzystaniu mikroskopii o wysokiej zawartości15 i podejść do przetwarzania obrazu.

Obecnie, najnowocześniejsze systemy MPS i OOC zaczęły uwzględniać aspekty immunologiczne, włączając różne podtypy komórek odpornościowych w istniejących tkankach i kokulturach, aby badać i mierzyć różnorodne procesy, takie jak choroby zapalne, gojenie się ran, odporność błony śluzowej i reakcja na toksyny lub codzienne produkty spożywcze16. TME-on-a-chip models10,11,12,13,14,15,16,17, również zintegrowany z perfuzyjnymi mikronaczyniami18,19,20,21, zostały opracowane w celu badania interakcji zależnych od typu komórki, zaburzeń fizycznych i chemicznych oraz aktywności cytotoksycznej naciekających limfocytów22, a także klinicznie istotnych czynników immunomodulujących23.

Tutaj oferujemy wszechstronne protokoły, począwszy od ładowania komórek w chipach, a skończywszy na narzędziach do przetwarzania obrazów, aby wykorzystać zaawansowane kohodowle mikroprzepływowe odporne na nowotwory w ustawieniach 2D (sekcja 1) i 3D (sekcja 2)16, kompatybilne z dynamicznym, wieloparametrycznym24 monitorowanie i wizualizacja funkcji komórkowych. Osiąga się to przy zachowaniu łatwości użytkowania i elastyczności zarówno w zarządzaniu próbkami, jak i analizie danych, wykorzystując darmowe oprogramowanie Fiji i jego zestawy narzędzi25,26.

Urządzenie mikroprzepływowe, opisane w sekcji 1, jest przeznaczone do przeprowadzania 2D kokultur przylegających do siebie komórek nowotworowych i pływających. Platforma ta została zwalidowana do pomiaru in vitro zachowania komórek odpornościowych w obecności mutacji genetycznych27 i/lub immunodeficiencies28. Tutaj ilustrujemy kroki śledzenia komórek odpornościowych na poklatkowych obrazach w jasnym polu, wykorzystując półautomatyczną metodę opartą na Trackmate (wtyczka zaimplementowana w oprogramowaniu Fidżi). Procedura ta umożliwia ekstrakcję kinematycznych deskryptorów migracji immunologicznej 29 i odpowiedzi (tj. czasów interakcji) na docelowe komórki nowotworowe, leczone lub nie immunogennymi induktorami śmierci komórki27.

Co ważne, te parametry, wyodrębnione z obrazów szeregów czasowych, mogą być przetwarzane za pomocą zaawansowanych maszyn matematycznych. Jako przykład potencjału tego podejścia, nasze grupy opublikowały niedawno analizę opartą na metodach matematycznych z procesów stochastycznych i mechaniki statystycznej do modelowania właściwości sieci komórkowych i dostarczania sparametryzowanego opisu zachowania komórek odpornościowych (tj. tendencyjnego lub nieskorelowanego losowego spaceru, wysoce lub nieskoordynowanego ruchu30,31).

Ustawienie 3D, przedstawione w drugiej sekcji, opiera się na protokole wspólnej hodowli w celu odtworzenia bardziej złożonych immunokompetentnych TME osadzonych w dwóch regionach żelowych z różnymi kombinacjami typów komórek i leków w konkurencyjny sposób. W tym miejscu opisano etapy przetwarzania obrazu w celu zmierzenia, w różnych punktach czasowych, infiltracji barwionych komórek odpornościowych w ludzkich komórkach czerniaka A375M hodowanych w Matrigel, w celu oceny kombinacji środków przeciwnowotworowych32. Linia A375M, linia komórkowa pochodząca z A375P charakteryzująca się wysoce przerzutowym fenotypem, została wybrana do oceny ich zdolności do przerzutów w obecności komórek odpornościowych32.

Opisane modele mogą być w pełni zgodne z różnymi źródłami komórek (między innymi unieśmiertelnione lub pierwotne linie komórkowe myszy i człowieka, organoidy, ksenoprzeszczepy). W ostatnich badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium, łącząc mikroskopię wideo o wysokiej zawartości z analizą obrazu, zastosowano konkurencyjny układ 3D do zbadania: i) odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, ADCC) i przeanalizowania roli fibroblastów w oporności na terapię trastuzumabem w modelach on-chip raka piersi HER2+33; ii) działanie komórek szpikowych (tj. makrofagów związanych z rakiem) w mechanizmach unikania nowotworu i rekrutacji limfocytów T34; iii) skuteczność schematów immunoterapeutycznych, w szczególności opartych na komórkach dendrytycznych kondycjonowanych interferonem α (IFN-DC), hodowanych z komórkami raka jelita grubego leczonymi lekami w matrycach kolagenowych, oraz w celu oceny wydajnego ruchu i następujących po nim zdarzeń fagocytozy35; iv) chemotaktyczna migracja eozynofili pochodzących ze szpiku kostnego w kierunku komórek czerniaka leczonych lub nieleczonych IL-3336.

Te zaawansowane modele mogłyby służyć jako okna obserwacyjne do zrozumienia roli tekstury immunologicznej w przerzutach raka i mechanizmach oporności, ale potrzebne są wysiłki, aby przełożyć wyniki na kliniki, wypełniając lukę w badaniach podstawowych37.

Jako wyłaniający się scenariusz, wykorzystanie mocy zautomatyzowanej mikroskopii o wysokiej zawartości w połączeniu z użyciem bardziej fizjologicznie istotnych mikrosystemów otwiera nowe potencjalne wyzwania dla obsługi, przetwarzania i interpretacji setek, a nawet tysięcy gigabajtów danych wieloparametrycznych, które mogą być wygenerowane z jednej kampanii eksperymentalnej. Oznacza to bezpośrednie powiązanie eksperymentów OOC ze sztuczną inteligencją38,39,40,41,42 (AI) algorytmy oparte zarówno na zaawansowanej automatycznej analizie, jak i generowaniu funkcji, które mogą z kolei zasilać modele krzemowe interakcji rakowo-immunologicznej43, z ekscytującymi nowymi zastosowaniami na horyzoncie, takimi jak rozwój predykcyjnych testów przesiewowych leków44.

Stale rosnący strumień wysiłków skupia się na projektowaniu modeli chorób wraz z optymalizacją strategii wdrażania wielkoskalowych ekranów perturbacyjnych z odczytami multi-omiki pojedynczej komórki. Niewątpliwie pomoże to w opracowaniu i, miejmy nadzieję, w klinicznym wdrożeniu, któremu towarzyszy odpowiedni stopień standaryzacji metody, systematycznego podejścia onkoimmunologicznego na chipie w celu uzyskania nowego wglądu w zaburzenia immunologiczne i mechanizmy rozprzestrzeniania się raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projekt chipa dla kokultur 2D komórek przylegających i pływających

UWAGA: Układ kokulturowy 2D (Rysunek 1A-C) charakteryzuje się trzema komorami (o wysokości 100 μm) połączonymi dwoma zestawami układów mikrokanałowych (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). Komora pośrednia tworzy dwa zamknięte ślepe zaułki, które blokują pływające komórki odpornościowe przelewające się do miejsca guza podczas kroku ładowania 2,5. Ten typ urządzenia jest przydatny do dwuwymiarowych pomiarów w czasie rzeczywistym ruchliwości pojedynczej komórki (przylegającej lub pływającej) oraz interakcji komórka-komórka16,27,28,30,31. Typowe badanie migracji komórek (prowadzone od kilku godzin do kilku dni) łączy mikroskopię żywych komórek z algorytmami przetwarzania obrazu45, w celu przetłumaczenia uzyskanych sekwencji obrazów na cechy numeryczne25. Na podstawie wzorców migracji można oszacować kilka wskaźników biofizycznych, takich jak przemieszczenie i prędkość komórek, a także czas trwania interakcji komórek odpornościowych i komórek docelowych24.

  1. Preparat komórek nowotworowych i PBMC
    1. Hodowla komórek nowotworowych
      UWAGA: Potrójnie ujemne komórki gruczolakoraka piersi MDA-MB-231 [receptor estrogenowy (ER)-, receptor progesteronu (PR)-i receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2)-] są rutynowo hodowane w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 IU mL-1 soli sodowej penicyliny G i 100 μg mL-1siarczan streptomycyny (pożywka wzrostowa), w standardowych warunkach hodowli (37 °C i 5% CO2 ).
      1. Aby zoptymalizować wzrost kultur komórkowych, umieść komórki MDA-MB-231 w kolbach o długości 75 cm2 o gęstości 1 × 106 komórek mL-1 w 12 do 15 ml pożywki wzrostowej.
      2. Gdy komórki osiągną 75-80% konfluencji, wyrzuć pożywkę wzrostową, umyj komórki wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby całkowicie usunąć FBS, a następnie odłącz je wstępnie podgrzaną trypsyną (1 do 2 minut w temperaturze 37 °C).
      3. Dodaj pożywkę wzrostową, aby dezaktywować aktywność enzymatyczną trypsyny i zebrać oderwane komórki. Myć komórki dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze 1 100 x g w temperaturze pokojowej (RT).
      4. Zliczyć komórki na szkiełku do liczenia komórek za pomocą testu wykluczania barwnika błękitu trypanowego, a następnie ponownie je zasiać w celu hodowli podtrzymującej (nie więcej niż 6 pasaży od rozmrażania) lub do procedur doświadczalnych.
      5. W przypadku eksperymentów mikroprzepływowych wysiewaj 1 × 106 komórek na płytkach 6-dołkowych w 3 ml pożywki wzrostowej i traktuj 25 μM doksorubicyną (DOXO) lub równą objętością rozpuszczalnika DOXO (PBS) jako kontrolą.
      6. Po upływie czterech do 6 godzin należy dwukrotnie przepłukać komórki poddane działaniu DOXO wstępnie podgrzanym PBS przez 5 minut w temperaturze 1 100 x g w temperaturze pokojowej.
      7. Policz komórki kontrolne poddane działaniu DOXO i PBS, jak powyżej (patrz krok 1.1.1.5) i ustaw kohodowlę z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) w urządzeniach mikroprzepływowych.
    2. Izolacja PBMC
      1. Pobrać pełną krew żylną (około 10 ml) od zdrowych ochotników do heparynizowanych fiolek i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę 2 do 4 razy47.
      2. Rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 PBS i nałożyć na 10 ml pożywki Lymphoprep o gradiencie gęstości w probówce o pojemności 50 ml.
        UWAGA: Upewnij się, że nakładasz warstwy bardzo delikatnie i powoli, aby krew i Lymphoprep utworzyły dwie odrębne warstwy.
      3. Probówki wirować przez 30 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C w odchylanym wiadrze bez hamulców. Utworzą się cztery odrębne warstwy: (i) osocze na górze, (ii) biała i mętna warstwa zawierająca PBMC, (iii) Lymphoprep oraz (iv) osad erytrocytów i granulocytów.
      4. Delikatnie odessać PBMC za pomocą pipety o pojemności 2 ml i natychmiast ponownie zawiesić w ciepłym podłożu wzrostowym (tym samym, które zastosowano w kroku 1.1.1) i płukać dwukrotnie przez 5 minut przy 1 100 x g w temperaturze pokojowej.
      5. Policzyć granulowane PBMC jak powyżej (patrz krok 1.1.1.5) i albo użyć do procedur doświadczalnych, albo zamrozić w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Platerowanie komórek w chipach 2D
    UWAGA: PBMC nie są barwione w tym protokole. Aby scharakteryzować określone fenotypy na chipie, subpopulacje komórek odpornościowych można wyizolować przez selekcję kulek immunomagnetycznych, wybarwić fluorescencyjnymi trackerami komórek, ponownie zmieszać z nieznakowaną pozostałą frakcją, a tym samym skonfrontować z docelowymi komórkami rakowymi, jak opisano w eksperymentach na chipie, opisanych w Vacchelli et al.27, oraz w Racioppi et al.34.
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentów z kokulturą i w celu ułatwienia dodawania odczynników, należy aktywować przechowywane chipy za pomocą plazmy tlenowej przez kilka sekund. Natychmiast napełnij zbiorniki wodą dejonizowaną lub PBS, aby powierzchnie PDMS (polidimetylosiloksan) były hydrofilowe do czasu etapów powlekania.
      UWAGA: PDMS jest wewnętrznie hydrofobowy, co może powodować trudności w obsłudze i uwięzienie pęcherzyków powietrza w mikrokanałach. Zobacz krok 7 w pliku uzupełniającym, który zawiera szczegółowe informacje na temat aktywacji plazmy tlenowej.
    2. Sterylizuj pod szafką UV przez 20 minut, umyj 2-3 razy świeżym PBS, a następnie inkubuj z pożywką hodowlaną przez 1 godzinę. Przechowuj wióry w inkubatorze do czasu wykonania etapów posiewu.
    3. Pobrać nadmiar pożywki ze wszystkich sześciu zbiorników. Uważaj, aby nie zasysać pożywki z głównych komór hodowlanych.
    4. Powoli nałóż 1 × 105 komórek rakowych zawieszonych w 10-20 μl pożywki wzrostowej w lewym górnym zbiorniku, a następnie w dolnej studzience (Rysunek 1A, zbiorniki 1 i 2). Odczekaj 5 minut, aby komórki przylgnęły do komory guza. Niektóre komórki osiądą i przyczepią się w zbiornikach.
      UWAGA: Włóż zawiesinę komórkową obok otworów kanałów. Ta procedura jest stosowana do komórek nowotworowych MDA-MB-231, inne linie będą wymagały optymalizacji gęstości komórek. Aby poprawić przyczepianie się komórek rakowych, można przeprowadzić funkcjonalizację powłok powierzchniowych (np. poli-L-lizyny, fibronektyny). Zapoznaj się z wcześniej opublikowanymi protokołami dotyczącymi etapów powlekania16, 48,49,50.
    5. Po prawej stronie delikatnie odpipetować 1 × 106 PBMC zawieszonych w 50 μl pożywki wzrostowej do studzienek 3 i 4 (patrz Rysunek 1A, zbiorniki 3 i 4).
      UWAGA: Po przepłynięciu PBMC rozprowadzi się do komory pośredniej, tworząc "przód", który stanowi punkt wyjścia eksperymentu.
    6. Napełnij wszystkie sześć zbiorników do 100-150 μl podłoża wzrostowego. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki prawidłowo rozmieściły się w komorach hodowlanych, jak pokazano na Rysunek 1D-E. Końcowe objętości mogą się różnić w zależności od wielkości zbiorników. Dostosuj głośność, aby była równa we wszystkich studzienkach.
    7. Umieść chipy z powrotem w inkubatorze na około 1 godzinę, aby ustabilizować system przed nagrywaniem poklatkowym. Dodawaj świeżą pożywkę co 3 dni, ponieważ może być narażona na straty związane z parowaniem.
      UWAGA: System jest kompatybilny zarówno z analizą żywych/martwych komórek, jak i dynamicznym profilowaniem wydzielania cytokin multipleksowych z kondycjonowanych pożywek. Do analiz chemokiny można uzyskać do 200–250 μl podwielokrotności supernatantów poprzez pobranie pożywek z dwóch zbiorników w każdym komorę. Klasyczne testy profilowania cytokin ELISA i Luminex wymagają około 50 μl supernatantów. Zobacz 51, 52 przykłady badań innych laboratoriów wykonujących profilowanie cytokin na modelach OOC.
  3. Pozyskiwanie poklatkowe nieoznakowanych komórek nowotworowych i odpornościowych
    UWAGA: Zazwyczaj 3 chipy są ułożone na jednym szkiełku mikroskopowym (patrz Rysunek 1A dla chipa 2D i Rysunek 4B dla chipa 3D). Korzystając z uchwytów scenicznych z przeznaczeniem 4 szkiełek, kokultury mogą być odpowiednie do monitorowania za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii o wysokiej zawartości w celu analizy dużych partii warunków eksperymentalnych. Chipy można łatwo montować na szkiełkach o grubości równej 1 mm lub 170 mikronach (szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego lub szkła, 6-dołkowe optyczne wielodołkowe z dnem optycznym) do obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.
    1. Rejestruj serie obrazów w jasnym polu nieoznakowanych komórek za pomocą zestawu do mikroskopii wideo wyposażonego w system inkubacji.
      UWAGA: Tutaj zestawy danych szeregów czasowych (okno czasowe: 48 godzin, liczba klatek na sekundę: 2 min) zostały pozyskane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wyposażonego w obiektyw 4x i piksele CMOS 1,3 M, zoptymalizowane tak, aby pasowały do standardowego inkubatora do hodowli komórkowych.
    2. Przed rozpoczęciem akwizycji rozgrzej mikroskop przez co najmniej 2 godziny, aby osiągnąć równowagę do 37 °C i 5% CO2 .
    3. Wybierz okno obserwacji, centrując układ mikrokanałów między guzem a przedziałem centralnym. Pozwala to na wizualizację dynamiki infiltracji immunologicznej i interakcji w regionie, w którym zasiewane są komórki rakowe.
    4. Dostosuj intensywność i skupienie oświetlenia komórek nowotworowych i odpornościowych.
    5. Aby uruchomić akwizycję poklatkową, zoptymalizuj liczbę klatek na sekundę i czas trwania zgodnie z badanym eksperymentem i typem komórki.
      UWAGA: Warunki obrazowania muszą być zoptymalizowane, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na zdjęcia przy jednoczesnym zachowaniu dobrego stosunku sygnału do szumu (SNR). Ponieważ komórki odpornościowe są bardzo ruchliwe, szybkość akwizycji musi być wystarczająco wysoka, aby śledzić interesujący nas dynamiczny proces i umożliwiać łatwe śledzenie53. Należy osiągnąć kompromis między algorytmem śledzenia, zgodnością z rozmiarem wynikowego zbioru danych oraz żywotnością, gęstością i ruchliwością obserwowanych komórek.
    6. Na końcu filmu poklatkowego użyj funkcji Importuj sekwencję obrazów i Zapisz jako w oprogramowaniu ImageJ, aby przekonwertować zestaw danych klatek na nieskompresowany plik wideo 25 kl./s.
      UWAGA: Wygenerowany plik wideo jest teraz gotowy do analizy śledzenia komórek. W tym przypadku zebrano obrazy RGB (1280x1024 pikseli) z rozdzielczością przestrzenną 1,33 μm/piksel. Film trwający 24 godziny (stos 3,5 GB) z pojedynczym polem widzenia (FOV) składa się z 720 klatek dla każdego warunku.
  4. Analiza danych: Półautomatyczna ekstrakcja nieoznakowanych ścieżek immunologicznych przez Trackmate
    UWAGA: W tym przypadku analiza ruchliwości immunologicznej na nieoznakowanych obrazach poklatkowych 2D jest przeprowadzana za pomocą TrackMate54, zestawu narzędzi typu open source dostępnego w pakiecie oprogramowania Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Dostępnych jest kilka algorytmów do automatycznego śledzenia pojedynczych cząstek55 (SPT) struktur podobnych do plamek. Zostały one skutecznie zastosowane do obrazów fluorescencyjnych, gdzie obiekty są jasne na ciemnym tle o wysokim stosunku sygnału do szumu (tj. plamki fluorescencyjne o niskiej rozdzielczości, oznaczone pęcherzyki drogowe, jądra)1,25,56,57,58. SPT opiera się głównie na dwóch sekwencyjnych krokach. Po pierwsze, obiekty są lokalizowane ze zidentyfikowanymi pozycjami w wielu ramkach (segmentacja), zgodnie ze schematem w Rysunek 2. W drugim etapie (łączenie cząstek) wykryte punkty są łączone w kolejnych klatkach w celu oszacowania ruchu i zrekonstruowania ich trajektorii w postaci toru (Rysunek 3). Cechy liczbowe można obliczać z każdej wyodrębnionej tablicy współrzędnych X, Y, Z w czasie. Rozszerzona dokumentacja jest dostępna w 54, a także online (http://imagej.net/TrackMate), zgodnie z samouczkiem Pierwsze kroki z TrackMate. Dokładność procesu można natychmiast sprawdzić za pomocą intuicyjnego graficznego interfejsu użytkownika (graficznego interfejsu użytkownika przypominającego kreatora), który umożliwia użytkownikom na każdym kroku dostosowanie ustawień. Poniższa część pokrótce przedstawia sposób korzystania z narzędzia Trackmate do etapów przetwarzania i kwantyfikacji obrazu, stosowanych do obrazów w świetle widzialnym:
    1. Przeciągnij i upuść pełnoetatowy stos filmów/obrazów na pasku narzędzi Fidżi.
    2. Konfiguracja stosu kalibracyjnego (Rysunek 2A).
      1. Sprawdź wymiarowość i przypisz właściwości obrazu, wybierając opcję Image> Properties (Właściwości obrazu). Pola Wypełnienie Jednostka długości, Wymiary w pikselach i Interwał klatek.
        UWAGA: Aby przeprowadzić kalibrację, użyj znanej długości mikrokanałów (500 μm, Rysunek 1C) i podziel przez odpowiednią zmierzoną długość w pikselach. W przypadku szeregów czasowych 2D należy pamiętać o zamianie pól Z/T, w których wpisuje się 1 jako wycinek z i poprawną liczbę klatek filmu. Jeśli nie zostanie to zrobione, ilościowe dane wyjściowe i parametry Trackmate będą raportowane w jednostkach pikseli i ramach czasowych.
    3. Wstępne przetwarzanie obrazów.
      1. Aby poprawić prawidłowe rozróżnianie komórek odpornościowych na tle zaszumionym, należy wstępnie przetworzyć obrazy w jasnym polu w celu skompensowania artefaktów. Upewnij się, że zestawy danych składają się z 8-bitowych obrazów TIFF (zakres jasności: 0-255).
        UWAGA: Nierównomierne oświetlenie, niski SNR i zanieczyszczenie małymi cząstkami zanieczyszczeń na obrazach w świetle widzialnym mogą zagrozić powodzeniu procesu śledzenia komórek. W tym przypadku zestawy danych szeregów czasowych są wstępnie przetwarzane przez odejmowanie tła, funkcję regulacji jasności/kontrastu oraz przez lokalne odejmowanie obrazu rozmycia gaussowskiego od oryginalnych obrazów. W ImageJ dostępne są inne zestawy narzędzi analitycznych do przetwarzania i segmentacji obrazów z kontrastem fazowym lub jasnym polem, w tym Empirical Gradient Threshold (EGT)59.
    4. Pierwszy panel kalibracyjny (Rysunek 2A)
      1. Po wybraniu stosu obrazów uruchom Trackmate (Plugins>Tracking). Zrewiduj/potwierdź wymiarowość i okno czasowe danych (tj. szerokość piksela i interwał klatek).
        UWAGA: TrackMate automatycznie wczytuje w polu właściwości obrazu, aby podać końcowe wyniki śledzenia w skalibrowanych jednostkach fizycznych (tj. μm i minutach).
      2. Zdefiniuj obszar zainteresowania, aby obliczyć ekstrakcję ścieżek immunologicznych, ręcznie wstawiając wartości lub rysując zamknięty obszar na aktywnym obrazie, a następnie naciskając przycisk Odśwież źródło. Aby wyodrębnić globalne ścieżki migracji immunologicznej, wybierz prostokątne regiony odpowiednio po prawej stronie mikrokanałów (komora centralna, Rysunek 1E) i po lewej (komora nowotworowa Rysunek 1D). Aby przeanalizować interakcje między nowotworem a punktami immunologicznymi, narysuj okrągłe podregiony za pomocą narzędzi ROI (przejdź do Edytuj → Wybór → Określ).
        UWAGA: Uruchamiając po raz pierwszy ten zestaw narzędzi w nowej aplikacji biologicznej, poświęć niezbędny czas na optymalizację ustawień rekonstrukcji ścieżek.
        UWAGA: Wykonaj ręczne śledzenie trajektorii komórek (około 50-100 komórek), aby empirycznie znaleźć właściwą konfigurację, a następnie zweryfikować jako punkt odniesienia niezawodność automatycznej ekstrakcji ruchów. Dodatkowo pracuj początkowo na mniejszym obszarze, aby w łatwy sposób sprawdzić dokładność wybranych parametrów.
    5. Krok wykrywania plam immunologicznych (Rysunek 2B)
      1. Wybierz domyślny detektor Laplace'a Gaussa (LoG). Detektor LoG działa w celu znalezienia jasnych, przypominających plamy, okrągłych obiektów i nałożenia filtra Laplace'a lub Gaussa na obraz dostrojony do pośrednich rozmiarów plamek (średnica od 5 do 20 pikseli).
      2. W polu Szacowana średnica plamki (tutaj 10-13 μm) wprowadź wartość nieco większą niż oczekiwany rozmiar plamki. Zwiększaj wartość progu (tutaj 1-3 μm), aż dodatkowe fałszywe plamy tła zostaną zredukowane, prawdopodobnie bez usuwania cech obiektu. Wykrycia poniżej wartości progowej (na podstawie metryk jakości) zostaną odrzucone z dalszej analizy. Zaznacz pole wyboru filtra mediany i lokalizacji subpikseli, aby poprawić jakość wykrywania punktowego.
      3. Użyj przycisku Podgląd, aby wyświetlić i szybko sprawdzić zidentyfikowane komórki odpornościowe nałożone na obrazy za pomocą kół w kolorze magenta.
        UWAGA: Błędy podczas wykrywania będą miały znaczący wpływ na proces linkowania. Inne niechciane wykrycia można skorygować w kolejnych menu za pomocą filtrów zdefiniowanych przez użytkownika (np. według intensywności plamki, rozmiaru lub pozycji).
    6. Gdy będziesz zadowolony z wyborów, naciśnij Next.
      UWAGA: Ustawienia te mogą się różnić w zależności od konfiguracji eksperymentalnej i modalności obrazowania akwizycji (np. FOV, powiększenie obiektywu, obrazy w jasnym polu lub obrazy fluorescencyjne), typu komórek (komórki przylegające lub pływające), od wolnej lub szybkiej ruchliwości, rodzaju zachowania komórek (oddziaływanie lub nie) oraz niskiej/średniej/wysokiej gęstości w obszarze obserwacji.
    7. Kontynuuj i pomiń menu Wstępne progowanie. Wybierz okno Hyperstack Displayer.
    8. Ustaw filtry w panelu spotów (Rysunek 2C).
      1. Wybierz: Jednolity kolor. Filtry, jak pokazano na rysunku Rysunek 2C, można dodać, aby zachować oznaczone miejsca z wartościami cech, wyświetlanymi w histogramie, powyżej lub poniżej odwracalnego progu.
    9. Etap wyboru trackera (Rysunek 3A). Wybierz Prosty tracker LAP, jako algorytm łączenia cząstek proszący o wypełnienie trzech pól (w tym przypadku "Maksymalna odległość łączenia": 30-50 μm, "Maksymalna odległość zamykania przerwy": 25-50 μm, "Maksymalna przerwa zamykania przerwy": 4-6). Detektor ten zarządza zdarzeniami zamykania luk, a koszty są obliczane wyłącznie na podstawie ich odpowiedniej odległości.
      UWAGA: Maksymalna dozwolona odległość łączenia ogranicza przestrzenny zakres wyszukiwania dla pasujących miejsc kandydujących, odpowiadający maksymalnemu dozwolonemu przemieszczeniu, jakie przebyto między dwiema kolejnymi klatkami (Rysunek 3D).
      1. Podaj większe wartości maksymalnego przemieszczenia, gdy zauważy się fragmentację śladów bardzo ruchliwych cząstek.
        UWAGA: Dwa połączenia nie zostaną połączone, jeśli ruch między klatkami jest większy niż podana maksymalna wartość odległości. Jeśli segmenty źle łączą dwie różne komórki, zmniejsz wartość maksymalnego przemieszczenia.
      2. Spróbuj ponownie połączyć brakujące miejsca, zmieniając wartości "maksymalnej odległości do zamknięcia odstępu" i "maksymalnego odstępu między ramkami".
        UWAGA: Te parametry dotyczą zdarzeń zamykania odstępów w niesąsiadujących ramkach. W przypadku niektórych klatek może wystąpić zniknięcie punktowe (np. nieostre cząstki, komórki pominięte i w polu widzenia, awarie segmentacji na zaszumionym obrazie).
        UWAGA: Aby obsłużyć zdarzenia dzielenia lub scalania, wybierz konsolidator LAP jako detektor, który wprowadza kary za macierz kosztów linkowania.
    10. Kliknij przycisk Dalej, aby uruchomić obliczenia śledzenia. Naciśnij Dalej.
    11. Panel Filtrowanie ścieżek (Rysunek 3B). Zmień kolor ścieżek immunologicznych, wybierając z menu rozwijanego "ID ścieżki" lub inne funkcje ścieżki. W tym momencie wybierz opcjonalnie, aby ustawić funkcjonalne filtry interaktywne, aby poprawić jakość wyniku i ponownie przejrzeć procedurę.
      UWAGA: Fałszywe plamy powstają w wyniku szumów na obrazie i utraty jakości funkcji. Spowoduje to wygenerowanie krótkich segmentów, podczas gdy interesujące komórki mogą być śledzone w wielu klatkach.
      1. Aby usunąć krótkie ścieżki, spróbuj je odfiltrować na podstawie liczby zawartych w nich miejsc. Dodatkowo, sortuj ścieżki za pomocą kombinacji opcji, takich jak Przemieszczenie ścieżki, Czas trwania ścieżki lub Minimalna/Średnia/Maksymalnaprędkość, aby wykluczyć fałszywe lub niechciane ścieżki (z mniejszą liczbą klatek w stosunku do całkowitego czasu trwania filmu poklatkowego lub zawierające brudne lub nieruchome cząstki) z dalszego przetwarzania końcowego.
        UWAGA: Wybór filtrów może się różnić w zależności od konkretnego zastosowania i systemu biologicznego.
    12. Sprawdź wszystkie ścieżki w interfejsie opcji wyświetlania, przewiń w czasie i sprawdź, jak dokładne ścieżki pasują do ścieżek migracji komórek. Menu rozwijane zawiera kody kolorystyczne punktów i ścieżek, które ułatwiają wizualizację i filtrowanie według kilku modalności (np. parametrów kinetycznych, intensywności, pozycji czasowej lub przestrzennej).
      UWAGA: W przypadku śledzenia kultur o dużej gęstości lub komórek o dużej ruchliwości, zwiększ liczbę klatek na sekundę akwizycji, minimalizując przemieszczenie komórek przebyte w kolejnych odstępach czasu.
    13. Ręczna korekta błędów segmentacji i linkowania (Rysunek 3E).
      1. Aby jeszcze bardziej poprawić jakość wyników, ręcznie edytuj plamy (cząstki gruzu, nieruchome komórki) i usuwaj błędne ślady wynikające z wykrytych granic guza podczas analizy ROI interakcji guz-układ odpornościowy.
      2. Najpierw wybierz narzędzie TrackMate na pasku narzędzi ImageJ. Aby wyeliminować istniejące miejsce w całym stosie, naciśnij Shift i utwórz kursorem myszy maskę ROI nad punktem docelowym (edytowaną w zielonym kółku), a następnie naciśnij DEL.
      3. Aby dodać nowy punkt (w przypadku brakujących śladów z powodu zniknięcia miejsc) naciśnij A, kładąc mysz we wskazanym miejscu. Po tym kroku powtórz proces obliczania łączenia ścieżek.
    14. Po spełnieniu oczekiwań wybierz opcję Analiza w panelu Opcje wyświetlania, aby wygenerować trzy pliki tekstowe (Rysunek 3C i 3F). Tabela w "Spoty w statystykach ścieżek" zawiera współrzędne czasoprzestrzenne plam immunologicznych (pozycje X-Y-Z komórek oznaczonych skojarzoną ramką i numerem ścieżki). "Linki w statystykach ścieżek" i "Statystyki ścieżek" zawierają informacje dotyczące ścieżek: czas trwania ścieżek, liczbę wykrytych przerw lub punktów, klatkę początkową i końcową ścieżki itp. Zapisywanie i eksportowanie dla każdego zestawu danych.
      UWAGA: Po kliknięciu wiersza w oknach wyników, odpowiednie miejsce, link lub ścieżka są aktywowane w filmie poklatkowym w celu kontroli wizualnej. Powtórz kroki filtrowania, aby wybrać/usunąć utwory. Wszystkie wyeksportowane w przyszłości dane zostaną zaktualizowane. WSKAZÓWKA: Śledzenie wartości początkowych i końcowych klatek oraz czasu trwania śledzenia można wykorzystać do obliczenia czasu kontaktu między rakiem a komórkami odpornościowymi podczas przetwarzania zwrotu z inwestycji w interakcję.
    15. Naciśnij przycisk Zapisz, aby wygenerować wynikowy plik XML zawierający wszystkie wartości parametrów, ścieżkę do obrazów i pozycje punktowe w czasie. Polecenie ''Load TrackMate file'' (Plugins> Tracking) przywraca całą sesję procesu dla każdego pliku filmowego z osobna.
    16. Przejdź do ostatniego panelu graficznego interfejsu użytkownika o nazwie Wybierz akcję. Na liście użyj funkcji Captureoverlay > Exeeee, aby utworzyć wideo z nałożonymi ścieżkami. WSKAZÓWKA: Opcja "Wykres N-punktów w funkcji czasu" może być użyta do obliczenia gęstości przestrzennej komórek odpornościowych w ROI (Rysunek 6B, prawy panel).
    17. Analiza po przetwarzaniu i statystyki migracji
      1. Analizuj surowe dane pozycyjne bezpośrednio w Trackmate lub eksportuj dane, aby obliczyć kompleksowe parametry kinetyczne29 (tj. całkowita długość trajektorii, odległość euklidesowa, współczynnik zamknięcia, przemieszczenie średniokwadratowe56, średnia lub chwilowa prędkość toru, współczynnik zatrzymania, rozkład kątów migracji, wskaźnik migracji do przodu, średnia prędkość w linii prostej), aby sklasyfikować zachowanie migracji komórek odpornościowych (np. ukierunkowane lub dyfuzyjne motion30,31) i odpowiedź na docelowe komórki nowotworowe (np. leczone vs kontrolne).
        UWAGA: Dodatkowe przydatne wtyczki, takie jak The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/), udostępniają różne wykresy (np. wykresy Rose lub sektorowe, takie jak przedstawione na Rysunek 6) oraz testy statystyczne do zaawansowanej analizy i wizualizacji eksperymentalnych danych migracji i chemotaksji. Połączenie algorytmów śledzenia i segmentacji komórek24,25,45 może umożliwić pomiary wskaźników morfologicznych na poziomie pojedynczej komórki (tj. powierzchni komórki, długości osi głównej i pomocniczej oraz proporcji komórki).

2. 3D immunokompetentny model on-chip raka w konkurencyjnym teście

UWAGA: Projekt chipa 3D, przedstawiony w Rysunek 4, składa się z 5 głównych przedziałów: centralnego do pobierania pływających komórek odpornościowych, dwóch bocznych regionów do osadzania komórek nowotworowych w matrycach hydrożelowych (wysokość 150-250 μm) oraz komór perfuzyjnych mediów. Komory immunologiczne i nowotworowe są połączone dwoma zestawami wąskich układów mikrokanałów (200×12×10 μm3, L×W×H, Rysunek 4E). Regularnie rozmieszczone w trapezowych mikrofilarach równoramiennych o wielkości 100 μm (około 25-30 interfejsów dla każdego bocznego obszaru żelu, Rysunek 4C) działają jako bariery dla uwięzienia roztworu żelu podczas wstrzykiwania, wykorzystując równowagę między napięciem powierzchniowym a siłami kapilarnymi60,61 i łączą regiony guza z dwiema bocznymi dodatkowymi komorami pożywki w celu ustawienia interfejsu żel-ciecz (Rysunek 5). Szczegółowe cechy testu konkurencyjnego 3D są pokazane w Rysunek 4. Preferencyjne migracje komórek odpornościowych w kierunku dwóch przedziałów hydrożelowych, w których znajdują się komórki nowotworowe, które przeszły różne zabiegi, mogą być monitorowane i określane ilościowo. Szczególny układ konkurencyjny może być zastosowany do zbadania wielu różnych fenotypów biologii raka (np. lekooporny kontra agresywny, pierwotny lub przerzutowy, respondenci kontra niereagujący). Dodatkowo, regiony osadzone w żelu można łatwo zintegrować z różnymi populacjami komórek w celu odtworzenia bardziej heterogenicznych TME, w tym komponentów zrębu (fibroblasty, komórki śródbłonka)23 lub w celu symulacji specyficznego środowiska immunosupresyjnego34 (np. makrofagi) w celu analizy mechanizmów oporności na leki i unikania nowotworów.
UWAGA: Barwienie jądrowe i aktywne kaspazy, przy użyciu komercyjnych zestawów do testów żywych/martwych (np. Thermo Fisher Scientific, odczynniki Incucyte), może być wdrożone do oceny zdarzeń śmierci mitotycznej lub apoptotycznej, jak opisano w Nguyen et al.33.

  1. Przygotowanie roztworu matrycowego z komórkami i załadowanie do urządzenia
    UWAGA: W następujących warunkach eksperymentalnych dwa regiony żelu zawierają mieszaniny ludzkich linii komórkowych czerniaka A375M, hodowanych w roztworze matrycowym (np. Matrigel), wystawionych na działanie środków terapeutycznych stosowanych w monoterapii lub w skojarzeniu. To ustawienie pozwoliło nam ocenić skuteczność kombinacji dwóch leków w odniesieniu do pojedynczych leków w sposób konkurencyjny oraz określić ilościowo ich zdolność do przyciągania PBMC.
    1. Rozmrozić zapas roztworu matrycowego (np. Matrigel), umieszczając go na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C na jeden dzień przed eksperymentem.
      UWAGA: Nie wystawiaj produktu na wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania, ponieważ staje się "grudkowaty". Inne protokoły syntetycznych lub naturalnych hydrożeli mogą być odpowiednie do stosowania w tym ustawieniu. Proszę zapoznać się z 33,34,35 w celu przygotowania komórek rakowych w matrycach kolagenowych.
    2. Zawiesić ludzkie komórki czerniaka A375, wybarwione żywym kompatybilnym łącznikiem komórek zielonej fluorescencji PKH67 w roztworze matrycowym (2 mg mL-1). Tam, gdzie jest to wskazane, dodać 5-aza-2'-deoksycytydynę (DAC; 2,5 μM), określaną jako DAC, i/lub IFN-α2b, określaną jako IFN, w odpowiednich dawkach32.
      UWAGA: Dopasuj partię # na karcie specyfikacji butelki z matrycą. Na podstawie stężenia oblicz objętość pożywki potrzebną do przygotowania do 2 mg mL-1 Dostosuj optymalne stężenie białka i stężenie zawiesiny komórek rakowych odpowiednio do interesującej Cię aplikacji.
    3. Ostrożnie pipetuj w górę i w dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Podczas mieszania trzymaj probówkę mikrowirówki na lodzie, aby zapobiec niepożądanej polimeryzacji.
    4. Po sterylizacji umieść urządzenia na lodzie (za pomocą wiaderka z lodem i pokrywki), aby uniknąć zestalenia roztworu matrycy podczas całej procedury ładowania komórek.
    5. Powoli wstrzyknąć dwie mieszaniny IFN i DAC/IFN Matrigel/komórki nowotworowe (2-4 μl) do lewego i prawego portu żelu, odpowiednio za pomocą mikropipety 10 μl przy użyciu zimnych końcówek (Rysunek 5A). Delikatnie dociśnij, aby popchnąć roztwór matrycy z jednej strony, aż dotrze do przeciwnej.
      UWAGA: Objętość roztworu matrycowego została dobrana tak, aby uniknąć przelewania się do sąsiednich kanałów. Nie należy wywierać nadmiernego nacisku na pipetowanie, aby zapobiec wyciekaniu roztworu do mediów i kanałów centralnych. Jeśli podczas ładowania ścieżka żelu jest zablokowana wzdłuż kanału, spróbuj wprowadzić roztwór z drugiego wlotu, aż czoła żelu się spotkają. Wyjmując mikropipetę z wlotów, należy przytrzymać tłok, w przeciwnym razie podciśnienie spowoduje zassanie roztworu matrycowego.
    6. Umieścić urządzenie w inkubatorze w pozycji pionowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut, aby umożliwić żelowanie roztworu matrycy (Rysunek 5B). Obchodź się z wiórami pielęgnacyjnymi z osadzonym niespolimeryzowanym żelem, aby zapobiec wyciekaniu z kanału żelowego.
    7. W międzyczasie ponownie zawiesić PBMC znakowane PKH67 (1x106 komórek) w 10 μl kompletnego DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco).
    8. Po zżelowaniu matrycy należy napełnić kanały pożywki (50-100 μl) tą samą podwielokrotnością pożywki hodowlanej we wszystkich sześciu zbiornikach, aby zapobiec wysychaniu żelu w wiórach. Przechowywać w inkubatorze do momentu wysiewu zawiesiny komórek odpornościowych.
      UWAGA: Sprawdź pod mikroskopem prawidłowe i jednorodne rozmieszczenie komórek nowotworowych w żelu oraz integralność barier polimeryzowanego żelu. Częściowo lub niejednorodne zżelowane obszary lub pęcherzyki w mieszaninie prowadzą do przedwczesnego przepływu PBMC w kanałach pożywki żelowej w punkcie początkowym eksperymentu z powodu początkowych wahań ciśnienia.
    9. Zassać pożywkę z sześciu dołków i umieścić końcówkę w pobliżu wlotu kanału pożywki, aby delikatnie wstrzyknąć zawiesinę komórek PBMC o umiarkowanym ciśnieniu. Sekwencja czasowa ładowania jest przedstawiona w Rysunek 5C:
      1. PBMC w pożywce o stężeniu 10 μl do górnej studzienki środkowej.
      2. 50-100 μL pożywki do każdej z czterech studzienek kanałów bocznych.
      3. 40-90 μL pożywki do górnej studzienki środkowej.
      4. 50-100 μL pożywki do dolnej studzienki środkowej.
    10. Upewnij się pod mikroskopem, że dystrybucja PBMC pozostaje zamknięta w centralnej komorze po etapie ładowania. (Rysunek 7A).
      UWAGA: Jeśli nie jest optymalny, w razie potrzeby dostosuj stężenie i powtórz etapy wysiewu, używając nieskazitelnie czystych wiórów. Przy obliczaniu objętości dla planowanych warunków doświadczalnych należy odnieść się do nadmiaru chipów (15-20%), aby uwzględnić potencjalne błędy i korekty. Objętości i stężenia powinny być zoptymalizowane w zależności od konkretnego zastosowania.
    11. Umieścić zmontowane urządzenia na równej powierzchni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu późniejszego uzyskania obrazowania fluorescencyjnego. Ostrożnie obchodzić się z chipami po załadowaniu komórek odpornościowych, które unoszą się na wodzie.
      UWAGA: Kompensuj straty objętości spowodowane parowaniem w zbiornikach, wymieniając media co 2-3 dni. W celu profilowania chemokiny można odessać do 100 μl z każdej z dwóch studzienek komór hodowlanych, patrz krok 2.7, w kroku 1.
  2. Automatyczne zliczanie zrekrutowanych PBMC w jednokanałowych obrazach fluorescencyjnych w ImageJ
    UWAGA: Klasyczne metody immunofluorescencji do konfokalnego obrazowania w wysokiej rozdzielczości mogą być stosowane do operacji na chipie jako pomiary końcowe. Podstawowa procedura barwienia obejmuje utrwalanie komórek na chipie, przepuszczalność, blokowanie, wiązanie przeciwciał, barwienie jąder z etapami płukania pomiędzy nimi. Nieznakowane komórki odpornościowe infiltrowane w regionach żeli 3D z osadzonymi mikrośrodowiskami raka mogą być utrwalone w żądanych punktach czasowych i wybarwione pod kątem markerów ekspresji aktywacji / wyczerpania / dojrzewania (np. W przypadku komórek CD8, monitorowanie markerów CD69, CD95, PD1, TIM3). W Parlato i wsp.35 fagocytozę komórek apoptotycznych SW620 oceniano za pomocą mikroskopii konfokalnej, przy użyciu urządzeń zamontowanych na szkiełkach nakrywkowych o grubości 170 μm. IFN-DC zostały wybarwione dodając wbudowaną anty-ludzką powłokę HLA-DR-FITC Ab aliquots.
    Aby obliczyć zakres infiltrowanych, barwionych fluorescencyjnie żywych komórek odpornościowych, które zostały poddane sygnałom konkurencyjnym, typowy przepływ pracy analizy obrazu jest ustawiony w następujący sposób (Rysunek 7D-G):
    1. Uzyskaj, w określonych punktach końcowych czasu, kontrast fazowy i mikrofotografie fluorescencyjne kanałów czerwonych/zielonych lewych i prawych regionów żelu zawierających odpowiednio komórki nowotworowe wystawione na działanie jednego lub kombinacji schematów farmakologicznych.
      UWAGA: Tutaj obrazy zostały wykonane przez mikroskop fluorescencyjny EVOS-FL po załadowaniu komórek (0 h), po 48 godzinach i po 72 godzinach inkubacji (Rysunek 7A-B). Powiększenie 4x-10x zostało wykorzystane do uzyskania komory centralnej, układów mikrokanałów oraz dwóch zestawionych ze sobą kanałów bocznych zawierających A375 plus IFN i A375 plus DAC/IFN.
      1. Wykonując operacje akwizycji, należy wziąć pod uwagę parametry, które mają być mierzone, i unikać nasycenia obiektów, które mają być zliczane. Optymalne wyniki segmentacji zależą od charakteru uzyskanych obrazów, ze względu na zmienność samych próbek biologicznych, jakość barwienia oraz techniki mikroskopowe wykorzystywane w zastosowaniach zorientowanych na użytkownika.
    2. Załaduj dane jednokanałowe fluorescencji (w tym przypadku czerwony = PBMCs) na Fidżi, przeciągając je do głównego okna (Rysunek 7D). Zduplikuj obraz, aby uniknąć nadpisywania surowych danych podczas wyboru filtrów przetwarzania wstępnego aż do ostatecznej segmentacji.
      1. Jeśli obraz jest obrazem kolorowym (RGB), naciśnij Obraz > Wpisz 8 lub 16-bitowy, aby przekonwertować na skalę szarości. Sprawdź, czy opcja Edytuj > Opcje > Konwersjajest ustawiona na skalowanie podczas konwersji.
    3. Wstępne przetwarzanie surowych danych poprzez usuwanie szumów i artefaktów.
      1. Przejdź do menu Przetwarzaj > Odejmij tło, stosując algorytm toczącej się kuli, aby skorygować nierównomierne tło szumów z dużymi przestrzennymi zmianami intensywności. Ustaw promień co najmniej na taki sam rozmiar, jak największa cząstka pierwszego planu. Wybierz pole Podgląd, aby przejść do procedury prób i błędów, aby uzyskać optymalne wyniki. Zbyt małe wartości mogą nieprawidłowo usuwać interesujące nas struktury.
      2. W poleceniu Jasność i kontrast przeciągnij suwaki Minimum/Maksimum, aby zmienić zakres intensywności na histogramie. Przesuń suwak Maksimum w lewo, aby zwiększyć jasność bez funkcji rozmycia. Przesuń suwak Minimum w prawo, aby zwiększyć kontrast obrazu, unikając znikania mniej widocznych elementów w tle. Kliknij przycisk Zastosuj, aby naprawić zmiany.
    4. Poprawa obrazu.
      1. Przejdź do Process > Filters i poeksperymentuj z medianą, filtrami Gaussa na obrazach (Rysunek 7E).
        UWAGA: Promień filtrowania wstępnego powinien być dostosowany do pikseli szumu obrazu. Nieliniowy filtr Mediana zastępuje wartość piksela medianą wartości sąsiadów, aby zredukować szum soli i pieprzu. "Rozmycie gaussowskie" służy do wygładzania obrazu cyfrowego poprzez zastąpienie pikseli średnią ważoną otaczających pikseli. Wagi pochodzą z rozkładu prawdopodobieństwa Gaussa, więc najbliższe piksele mają większy wpływ.
      2. Opcjonalnie przejdź do opcji Przetwarzaj > matematykę > Gamma z zaznaczonym polem Podgląd, aby zwiększyć kontrast.
        UWAGA: Intensywności ustawione w panelu B&C są skalowane między dwoma limitami minimalnymi i maksymalnymi. Wartości < 1,0 uwydatniają różnice między niskimi intensywnościami, podczas gdy wartości > 1,0 uwydatniają różnice między wysokimi intensywnościami. Korekcja gamma służy do znajdowania zakresu wyświetlania, pokazując najciemniejsze obiekty bez nasycania najjaśniejszych.
    5. Tworzenie binarnej maski obrazu.
      1. Przejdź do opcji Obraz > Dostosuj > próg. Najprostsza metoda określania progów opiera się na analizie histogramu poziomów intensywności, jak pokazano na rysunku Rysunek 7F. W rozwijanym menu baw się różnymi globalnymi metodami progowania (w naszym przypadku stosowane jest Otsu).
      2. Ręcznie przewiń lub wpisz znany zakres intensywności pikseli w panelach histogramu, obserwuj zmianę czerwonego wzoru nakładającego się na obraz, który w większości przypomina rzeczywisty obszar komórki. Przycisk Resetuj usuwa nakładkę. Po spełnieniu wymagań kliknij przycisk Zastosuj, aby wygenerować binarną wersję obrazu. Zaznacz opcję Process > Binary > Options, aby kontrolować sposób wyświetlania obrazów z progami i sposób identyfikowania obiektów przez analizator cząstek.
    6. Użyj polecenia menu Cząstki Proces/Binarne/Zlewnia, aby podzielić cząstki częściowo nakładające się lub scalone podczas progu. Watershed często może je dokładnie rozdzielić, dodając linię o grubości 1 piksela. Wykonuj operacje morfologiczne, takie jak operacje rozszerzania lub erozji, aby powiększyć lub usunąć piksele z niedosyconych lub nadmiernie nasyconych pikseli.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z sekcją Polecenia menu lub zapoznaj się z MorphoLibJ, zintegrowaną biblioteką opartą na morfologii matematycznej do przetwarzania danych binarnych.
    7. Ilościowy opis funkcji obrazu.
      1. Po uzyskaniu zadowalającego rozpoznania obiektu otwórz Analizator cząstek z Analyze > Analyze Particles. Cząstki można wykluczyć ze względu na ich rozmiar i kołowość, wyrażoną w pikselach lub w skalibrowanej jednostce miary (sprawdź poprawną skalę względem ustawień mikroskopu w obszarze Właściwości > obrazu). Aby uwzględnić wszystko, zachowaj wartość domyślną 0-nieskończoność i domyślny zakres kołowości na 0,00 - 1,00 (0 = linia prosta, 1 = idealne koło).
      2. Aby filtrować małe piksele "szumu" lub obiekty, które nie są interesujące, ustaw minimalny i maksymalny zakres. Zaznacz opcje Uwzględnij otwory, Pokaż, Kontur i Wyświetl wyniki w polu okna. Opcja Wyklucz na krawędziach spowoduje odrzucenie cząstek wykrytych na obramowaniach obrazu. Dodaj do menedżera dodaje uzyskany wybór do menedżera ROI w celu dalszej analizy, zachowując informacje o położeniu cząstki.
        UWAGA: W "Menedżerze ROI" możliwe jest skorygowanie automatycznej segmentacji zarejestrowanych danych wyjściowych (scalanie podzielonych komórek, dzielenie scalonych komórek). Za pomocą narzędzi do zaznaczania na pasku narzędzi Fidżi wybierz ROI wewnątrz obu regionów żelu, w których osadzone są komórki rakowe, aby oszacować infiltrację immunologiczną.
    8. Wyeksportuj uzyskane wartości do arkusza kalkulacyjnego, aby przeprowadzić analizę statystyczną, jak pokazano na rysunku Rysunek 7G. "Wyniki" wyświetla tabelę danych odnoszącą się do ponumerowanych zarysowanych właściwości cząstek. "Podsumowanie" otwiera okno z nazwą obrazu, całkowitą liczbą i innymi informacjami dla całego obrazu.
      1. Przejdź do sekcji Analizuj > ustaw pomiary, aby uwzględnić szeroki zakres parametrów.
    9. Opcjonalnie zarejestruj makro (wybierając opcję Wtyczki > Makra > Nagrywaj), aby zautomatyzować przepływ pracy przetwarzania i zaoszczędzić czas na analizie dużych zestawów danych.
      1. Użyj tej samej procedury przetwarzania do analizy kanału zielonej fluorescencji w tych samych regionach do analizy zmian morfologicznych komórek nowotworowych w regionach 3D16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Infiltracja immunologiczna guza jest parametrem odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza. Guzy są heterogeniczne pod względem składu, gęstości, lokalizacji i stanu funkcjonalnego infiltrujących leukocytów, których oddziaływania z komórkami rakowymi mogą dostarczać istotnych klinicznie informacji pozwalających przewidzieć przebieg choroby i odpowiedź na terapię. W tym sensie technologie mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane jako komplementarne i uprzywilejowane narzędzia in vitro do badania kontekstury immunologicznej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane metody mają na celu zaprojektowanie ogólnego podejścia do podsumowania, z modulowalnym stopniem złożoności, dwóch istotnych aspektów w dziedzinie onkoimmunologii, które mogą skorzystać na przyjęciu bardziej odpowiednich modeli in vitro. Pierwszy z nich dotyczy populacji komórek nowotworowych, gdzie zajęcie się charakterystyką pojedynczych komórek może prowadzić do lepszego opisu heterogeniczności i skorelowanego znaczenia biologicznego i klinicznego, w tym oporności na terapię, skłonności do przerzutów, komórek m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. AS jest wspierany przez Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) i Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS i FM są wspierane przez Włoskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem (AIRC) nr 21366 do G.S.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały do hodowli komórkowych 
probówki 50 mlCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828probówki wirówkowe
5-aza-2'-deoksycytydyna DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656Środek hipometylujący DNA
Płytki 6-dołkoweCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS3506szalki hodowlane
75 cm2 kolbapoddawana działaniu hodowli komórkowychCorning, Nowy Jork, NY430641Ukolby hodowlane
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAbr/> CVCL_B222ludzka linia komórkowa czerniaka
chlorowodorek doksorubicynyMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515antybiotyk antracyklinowy 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Mediolan, WłochyECM0728LPożywka hodowlana dla komórek SK-MEL-28 
Bufor fosforanowy Dulbecco Saline bez wapnia bez magnezuEuroClone Spa, Mediolan, WłochyECB4004Lroztworu buforowego soli
Płodowa surowica bydlęcaEuroClone Spa, Mediolan, WłochyECS0180Lpomocniczy do hodowli komórkowych
FicollGE-Heathcare17-1440-02oddzielanie komórek jednojądrzastych od ludzkiej krwi.
hemocytometrNeubauerLicznik komórek
Fiolki z heparynąThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFiolki do pobierania krwi żylnej
interferon alfa-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595rekombinowana ludzka cytokina
L-Glutamina 100XEuroClone Spa, Mediolan, WłochyECB3000Dpomocnicze do hodowli komórkowych
Pożywka
Cedarlane Labs, Burlington, KanadaSeparacja limfocytów przez wirowanie w gradiacji gradientu gęstości
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Norwegia
MatrigelCorning, Nowy Jork, NY354230wzrostu zredukowany macierz błony podstawnej
MDA-MB-231 Kolekcja Kultur Typu Amerykańskiego (ATCC), Manassas, VA&nbsp; HTB-26ludzka linia komórkowa raka piersi
Penicylina/ Streptomycyna 100X   EuroClone Spa, Mediolan, WłochyECB3001Dpomocnicze do hodowli komórkowych
Pomoc do pipetowaniaDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Obsługa cieczy
PKH26 Łącznik komórek czerwonej fluorescencjiMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLczerwony barwnik fluorescencyjny
PKH67 Zielony fluorescencyjny łącznik komórekMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLzielony barwnik fluorescencyjny
RPMI-1640EuroClone Spa, Mediolan, WłochyECM2001LPożywka hodowlana do pipet serologicznych komórek MDA-MB-231
(2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)Corning-Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490do pracy z cieczami
(1-10 μ L, 10-20 μ L, 20-200 μ L, 1000 μ L)EuroClone Spa, Mediolan, WłochyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005końcówki do mikropipet
Timer
Trypan Blue roztwórThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061barwienie komórek do oceny żywotności komórek
TrypsynaEuroClone Spa, Mediolan, WłochyECM0920Dodczynnik dysocjacyjny do przylegających komórek
Sprzęt do hodowli komórkowych fluorescencyjny strong>
EVOS-FLThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAMikroskop fluorescencyjny do żywych komórek
Inkubator do hodowli komórek humifikatowych Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Inkubator COInkubator ciepła bezpośredniego; TC 230Inkubacja kultur komórkowych w temperaturze 37 °; C, 5% CO2
Juli MicroscopeNanoentek
Laboratoryjna lodówka (4 &stopnie; C)FDM
(klasa II)Sterylny VBH 72 MPOkap z przepływem laminarnym
Mikroskop optycznyZeiss
Wirówka chłodniczaBeckman Coulter
Kąpiel
< mocna > materiały do mikrofabrykacji 
3-Aminopropylo)trietoksysilan (Aptes)Sigma AldrichA3648środek silanizujący do klejenia PDMS z plastikowym szkiełkiem nakrywkowym
Maski z kwarcu chromowego / 4"x4", HRC / No AZ MB W& A,  Niemcymaski optyczne do fotolitografii
Szkiełko nakrywkowe, szkło D 263 M Schott,  (170 ± 5 &mikro; m)Ibidi, Niemcy10812
Roztwór nadtlenku wodoru 30%Carlo Erba Odczynniki412081odczynniki do roztworu piranii
Odczynniki do ketonu metylowo-izobutylowegoCarlo Erba461945Wywoływacz oporności wiązki elektronów PMMA
Szkiełka mikroskopowe (zestaw 50 szkiełek) 76,2 mm x 25,4 mm Podłoża Sail Brand7101do klejenia wiórów
Dziurkacz do biopsji Miltex z tłokiem, ID 1,0 mmStemple dodo zbiorników na wióry
PMMA  950 kDaAllresist, NiemcyAR-P. 679.04Dodatnie rezystu elektroniczne do modelowania masek optycznych
Szkiełka nakrywkowe polimerowe nieobrobioneIbidi, Niemcy10813podłoża do klejenia wiórów
Prime CZ-Si Wafel,  4", (100), domieszkowany boremGambetti Xenologia Srl, Włochy30255
Odczynniki Propan-2-olCarlo Erba415238
Octan eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 odporny na wywoływacz
SU-8 3005Technologia mikrorezystu, NiemcyC1.02.003-0001Negatywny Fotorezystu
SU-8 3050Technologia mikrorezystu, NiemcyC1.02.003-0005Zestaw fotorezystorów
ujemnych Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80stemple do biopsji skórnej do zbiorników na wióry
Kwas siarkowy 96%Carlo Erba Odczynniki410381odczynniki do roztworu piranii
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDowsil, Dow Corning11-3184-01Elastomer silikonowy (PDMS)
Trimetylochlorosilan (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLśrodek silanizujący do wzorców SU-8 masters
Sprzęt do mikrofabrykacji
100 kV litografia wiązki elektronicznejRaith-Vistec EBPG 5HR
grzewcza
Optyczny system litograficznyEV-420 dwutwarzowa maska-wyrównywacz
Reaktywny system trawienia jonowegoOxford plasmalab 80 plus
Eksykator
< fizjologicznej do separacji komórek limfolitów z ciekłym azotem czynnik Sterylne końcówki Laboratoryjna szafa bezpieczeństwa termostatyczna biopsji skórnej Tedpella płyta System próżniowy

Bibliografia

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, Suppl 1 282(2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235(2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639(2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737(2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450(2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093(2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664(2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217(2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985(2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine - Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789(2019).
  54. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT - Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014(2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Nikon. , Available from: http://www.microscope.healthcare.nikon.com/produc (2020).
  84. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  85. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  86. Ingber, D. E. Developmentally inspired human 'organs on chips.'. Development. , Cambridge. (2018).
  87. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  88. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  89. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16(2019).
  90. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  91. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcje immunologiczne guzarekrutacja kom rek odporno ciowychmikroskopia w polu jasnymmikroskopia fluorescencyjnaanaliza przetwarzania obrazuterapie antynowotworowetr jwymiarowy model guzaobrazowanie ywych kom rekmigracja kom rek odporno ciowych

Powiązane artykuły