Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Streszczenie

Inwazja komórek rakowych z guza pierwotnego do sąsiednich zdrowych tkanek jest wczesnym etapem przerzutów. Inwazyjne komórki nowotworowe stanowią poważne wyzwanie kliniczne, ponieważ nie istnieje skuteczna metoda ich eliminacji po ich rozsiewaniu. Lepsze zrozumienie mechanizmów regulujących inwazję komórek nowotworowych może doprowadzić do opracowania nowych, silnych terapii. Ze względu na ich fizjologiczne podobieństwo do nowotworów, sferoidy osadzone w kolagenie I były szeroko wykorzystywane przez naukowców do badania mechanizmów rządzących inwazją komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Test ten jest jednak ograniczony przez (1) brak kontroli nad osadzaniem sferoid w ECM; (2) wysoki koszt naczyń z kolagenem I i szklanym dnem, (3) nierzetelne znakowanie immunofluorescencyjne ze względu na nieefektywną penetrację przeciwciał i barwników fluorescencyjnych oraz (4) czasochłonne przetwarzanie obrazu i kwantyfikacja danych. Aby sprostać tym wyzwaniom, zoptymalizowaliśmy trójwymiarowy (3D) protokół sferoidalny, aby obrazować fluorescencyjnie znakowane komórki rakowe osadzone w kolagenie I, za pomocą filmów poklatkowych lub obrazowania podłużnego, i analizować inwazję komórek rakowych. Po pierwsze, opisujemy wytwarzanie urządzenia do obrazowania sferoidalnego (SID) w celu niezawodnego osadzania sferoid w minimalnej objętości kolagenu I, zmniejszając koszt testu. Następnie nakreślamy etapy solidnego znakowania fluorescencyjnego żywych i stałych sferoid. Wreszcie, oferujemy łatwe w użyciu makro Fidżi do przetwarzania obrazu i kwantyfikacji danych. Podsumowując, ta prosta metodologia zapewnia niezawodną i niedrogą platformę do monitorowania inwazji komórek rakowych w kolagenie I. Co więcej, protokół ten można łatwo modyfikować w celu dopasowania do potrzeb użytkowników.

Wprowadzenie

Podczas progresji nowotworu, komórki rakowe mogą uzyskać ruchliwy i inwazyjny fenotyp, co pozwala im uciec z masy guza i zaatakować otaczające tkanki¹. W końcu te inwazyjne komórki rakowe mogą dotrzeć do narządów wtórnych i rosnąć w nich, w procesie zwanym przerzutami raka¹. Przerzuty są przyczyną ponad 90% zgonów związanych z rakiem². Jednym z powodów jest to, że chociaż zlokalizowane guzy są klinicznie możliwe do opanowania, nie istnieją skuteczne metody eliminacji inwazyjnych komórek rakowych po wystąpieniu przerzutów. Dlatego pojawienie się inwazyjnych komórek nowotworowych i przejście od choroby zlokalizowanej do inwazyjnej stanowi poważne wyzwanie kliniczne. Ustalenie, w jaki sposób komórki rakowe inicjują i utrzymują inwazyjne zachowanie, może prowadzić do opracowania nowych, silnych terapii.

Model sferoidalny 3D jest idealną platformą do badania ruchliwego zachowania komórek nowotworowych w kontrolowanych, ale fizjologicznie istotnych warunkach³. Rzeczywiście, w tym teście sferoidy komórek rakowych są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), na przykład kolagen I, który naśladuje uproszczony guz. Następnie obrazowanie służy do wizualizacji inwazji komórek rakowych ze sferoidy do macierzy kolagenowej. Jednak wiele wyzwań ogranicza tę procedurę.

Pierwsze wyzwanie pojawia się na etapie osadzania, gdzie płynna matryca kolagenowa może rozprzestrzenić się po powierzchni naczynia, powodując dotknięcie sferoidy dna naczynia. W konsekwencji komórki sferoidy rozprzestrzeniały się na dwuwymiarowej (2D) powierzchni, łamiąc trójwymiarową (3D) morfologię sferoidów. Zwiększenie objętości kolagenu jest skutecznym, ale kosztownym rozwiązaniem. Aby zapobiec rozprzestrzenianiu się komórek na powierzchni 2D, przy jednoczesnym zachowaniu minimalnej objętości kolagenu, opracowaliśmy urządzenie do obrazowania sferoidalnego (SID), umieszczając wkładkę z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 1 mm z 3 otworami na szklanym dnie.

Drugim wyzwaniem testu sferoidalnego jest znakowanie komórek rakowych w sferoidach, co jest ograniczone przez słabą penetrację przeciwciał i barwników fluorescencyjnych, efekt, który zwiększa się wraz z rozmiarem sferoidy. Podczas gdy idealnym rozwiązaniem do znakowania komórek jest ustanowienie linii komórkowych o stabilnej ekspresji białek fluorescencyjnych, opcja ta jest w większości ograniczona do unieśmiertelnionych linii komórkowych i jest ograniczona dostępnością fluorescencyjnych chimer białkowych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół barwienia immunofluorescencyjnego utrwalonych sferoid, a także efektywne wykorzystanie barwnika cytoplazmatycznego do znakowania komórek bezpośrednio przed osadzeniem sferoidy.

Trzecim wyzwaniem testu sferoidalnego jest brak prostych makr Fidżi do półautomatycznego oznaczania inwazji komórek w czasie. Aby sprostać temu wyzwaniu, opisujemy prostą metodologię analizy obszaru sferoidalnego w czasie. Zalety tego protokołu ilustrujemy na przykładach linii komórkowych 4T1 i 67NR.

Protokół

1. Produkcja urządzenia do obrazowania sferoidów (SID) w celu optymalizacji osadzania sferoidów (Czas trwania: 1 dzień)

1. Utwórz przekładkę za pomocą drukarki 3D (Rysunek 1A, B i plik uzupełniający 1).
2. Odważyć stosunek 10:1 (wag./wag.) polimeru bazowego do środka sieciującego w plastikowym kubku [np. 20 g polimeru na bazie etylobenzenu i 2 g środka sieciującego z żywicy silikonowej w celu wytworzenia polidimetylosiloksanu (PDMS)].
3. Dokładnie wymieszaj roztwór PDMS w plastikowym kubku za pomocą jednorazowej pipety.
4. Umieść plastikowy kubek w komorze próżniowej, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszanki. Szybko zwolnij podciśnienie, aby usunąć niewielką ilość powietrza uwięzionego na powierzchni mieszaniny i rozproszyć pozostałe pęcherzyki powietrza.
5. Inkubuj wydrukowaną w 3D przekładkę w temperaturze 100 °C przez 5 minut, aby zwiększyć jej elastyczność.
6. Wyczyść dokładnie dwie szklane płytki, które zostaną użyte do budowy formy PDMS, przecierając je 100% izopropanolem. Jeśli szklane płytki były wcześniej używane do odlewania PDMS, należy usunąć wszelkie pozostałe stare PDMS, delikatnie zeskrobując szklane płytki żyletką i przecierając je 100% izopropanolem.
7. Zbuduj formę, umieszczając wydrukowaną w 3D przekładkę równo między dwiema czystymi szklanymi płytkami.
8. Uszczelnij formę za pomocą dużych spinaczy do segregatorów na zewnętrznych krawędziach szklanych płytek. Umieść dwa spinki do segregatora na dolnej krawędzi i jeden w górnym rogu.
9. Sprawdź górną część formy, aby upewnić się, że przekładka jest zlicowana ze szklanymi płytkami. Gwarantuje to, że nie wystąpią żadne deformacje i że zostanie utworzony równy arkusz PDMS.
   UWAGA: Jeśli wynikowy arkusz nie ma jednolitej grubości, klipsy należy nieznacznie wyregulować.
10. Odetnij końcówkę jednorazowej pipety (~2 cm od końcówki) i dodawaj mieszaninę PDMS powoli i ze stałą szybkością do lewego górnego rogu formy. Wlewaj mieszaninę powoli, aby zapobiec tworzeniu się dużych kieszeni powietrznych.
11. Umieść formę w komorze próżniowej, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które powstały podczas nalewania.
12. Utwardzić PDMS przez inkubację formy w temperaturze 100 °C przez 1 godzinę.
13. Wyjmij formę z inkubatora i pozwól jej ostygnąć w dotyku.
14. Usuń spinki do segregatora i szklane płytki z przekładki zawierającej utwardzony PDMS.
15. Użyj żyletki, aby przeciąć uszczelkę, która została utworzona ze wszystkich czterech stron formy między przekładką a szklaną płytą. Po przecięciu wszystkich czterech boków zacznij rozrywać formę, aby odsłonić arkusz PDMS w przekładce.
16. Ostrożnie oderwij nowy arkusz PDMS od przekładki za pomocą pęsety.
17. Na macie do cięcia wybij z arkusza krążki PDMS o średnicy 17,5 mm, a następnie wybij trzy równomiernie rozmieszczone otwory o średnicy 5,5 mm, używając stempli biopsyjnych o różnych rozmiarach. Tutaj te 3-otworowe dyski PDMS są określane jako "inserts" (Rysunek 1C).
    UWAGA: Niejednorodne nacięcia wykonane w PDMS lub wadliwe wiązanie poprzez obróbkę plazmową mogą spowodować przyszłe nieszczelności.
18. Wyczyść każdą wkładkę, delikatnie usuwając wszelkie cząsteczki kurzu za pomocą taśmy.
19. Przyklej wkładki na kawałku taśmy dwustronnej i owiń taśmę wokół pokrywki szalki Petriego o średnicy 10 cm.
20. Umieść pokrywkę szalki Petriego w maszynie plazmowej wraz z otwartymi naczyniami ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
21. Aktywuj powierzchnię wkładów i szkła poprzez obróbkę plazmową przez 1 minutę w temperaturze 300 mTorr. Można użyć ręcznej różdżki plazmowej.
22. Za pomocą pęsety szybko przymocuj górną stronę, tj. stronę obrobioną, jednej wkładki (Rysunek 1D) do szklanej części naczynia ze szklanym dnem (Rysunek 1E). Powtórz dla wszystkich potraw.
23. Użyj palca wskazującego i kciuka, aby wywrzeć równomierny nacisk podczas obracania szklanego dna naczynia. Zapewni to stabilne przymocowanie wkładu do naczynia ze szklanym dnem.
24. Inkubować SIDy (Rysunek 1F) w temperaturze 60 °C przez 20 minut, aby wzmocnić przyczepność między szkłem a PDMS.
25. Wykonaj drugą rundę obróbki plazmowej na identyfikatorach SID, używając tych samych ustawień, co w kroku 1.21 lub za pomocą ręcznej różdżki. Spowoduje to, że wolna powierzchnia PDMS będzie przylegać do poli-L-lizyny w roztworze powlekającym (patrz 1.26).
26. Świeżo przygotuj następujące roztwory.
    1. Roztwór powlekający: 1x PBS zawierający 0,01% (obj./obj.) poli-L-lizyny [np. dodać 10 μl 0,1% (obj./obj.) poli-L-lizyny do 90 μl 1x PBS].
    2. Roztwór sieciujący: Woda destylowana zawierająca 1x (obj./obj.) aldehyd glutarowy [np. dodać 10 μl 10x aldehydu glutarowego do 90 μl wody destylowanej].
    3. Roztwór do przechowywania: 1x PBS zawierający 10x (vol/vol) penicylina-streptomycyna [np. dodać 1 ml 100x penicyliny-streptomycyny do 9 ml 1x PBS].
27. Dodać 35 μl roztworu powlekającego na każdy otwór i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
28. Odessać poli-L-lizynę i przepłukać cały SID 3 razy wodą destylowaną.
29. Dodać 35 μl roztworu sieciującego na każdy otwór, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
30. Zassać roztwór sieciujący i 3 razy przepłukać cały SID wodą destylowaną.
31. Dodaj 70% etanolu do każdego SID i umieść w świetle ultrafioletowym (UV) na 30 minut.
32. Pod maską odessać etanol i 3 razy przepłukać SID wodą destylowaną.
33. Dodać 2,5 ml roztworu do przechowywania na każdy SID.
    UWAGA: Na tym etapie identyfikatory SID mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez tydzień. Zaobserwowano, że siła wiązania między PDMS a szkłem zmniejsza się z czasem. Po upływie tygodnia zaleca się, aby użytkownicy przetestowali identyfikatory SID pod kątem potencjalnego wycieku przed użyciem. W tym celu należy odessać roztwór do przechowywania i dodać 35 μl 1x PBS do każdego otworu. Po użyciu wkładki PDMS można zdjąć ze szklanych naczyń dolnych. Aby uzyskać optymalne czyszczenie naczyń ze szklanym dnem, należy kilkakrotnie przemyć je izopropanolem i kwasem solnym w celu usunięcia pozostałości PDMS.

2. Tworzenie i osadzanie sferoidów w kolagenie (Czas trwania: 4 dni)

UWAGA: Do obrazowania sferoidów na żywo, wzdłużnie lub w filmach poklatkowych, użyj linii komórkowej wyrażającej cytoplazmatyczne i/lub jądrowe białko fluorescencyjne. Jeśli taka linia komórkowa jest dostępna, wykonaj czynności opisane w tej sekcji. Alternatywnie, w sekcji 3, zaproponowano protokół oznaczania komórek rakowych w sferoidach za pomocą barwnika cytoplazmatycznego.

1. Uformuj sferoidy komórek 4T1 i/lub 67NR za pomocą techniki wiszącej kropli, jak opisano wcześniej^4,5,6,7, z 3 000 komórek/kroplą 40 μl i 3-dniowym czasem inkubacji. Na końcu dodaj roztwór atelokolagenu bydlęcego I i utrzymuj wszystkie roztwory na lodzie przez cały czas.
2. Zidentyfikuj prawidłowo uformowane sferoidy za pomocą mikroskopu jasnego pola.
3. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml 8 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża.
4. Zebrać sferoidy za pomocą pipety P1000 i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zwilż końcówkę pipety, pipetując i odpipetowując pełną pożywkę, aby zapobiec przywieraniu sferoid do wewnętrznych ścianek końcówki pipety i ograniczyć utratę sferoidów.
5. Pozwól, aby sferoidy opadły na dno rurki i ostrożnie umyj sferoidy, wymieniając medium. Powtórz dwa razy.
6. Przygotuj roztwór kolagenu I o stężeniu 5 mg/ml zgodnie z zaleceniami producenta (alternatywna procedura żelowania, patrz przykładowe obliczenia poniżej). Zastąp wodę destylowaną kompletnym podłożem. Przy obliczaniu objętości pożywki, która ma być użyta, należy wziąć pod uwagę, że sferoidy zostaną dodane do 20 μl kompletnej pożywki [np. dla jednego SID, potrzebne jest 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL kolagenu I o 5 mg/ml (należy przygotować 20 % ekstra, aby uwzględnić straty przy pipetowaniu podczas pracy z lepkimi płynami); 22 μL kompletnej pożywki + 10,8 μl 10 x PBS + 1,2 μL 1 M NaOH + 54 μL kolagenu 10 mg/ml I stock].
7. Zebrać wszystkie sferoidy w 20 μl pożywki za pomocą pipety P200 i dodać je do roztworu kolagenu I przygotowanego w kroku 2.6.
8. Powoli mieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, aby uniknąć niejednorodności w stężeniu kolagenu I, ograniczając tworzenie się pęcherzyków. Utrzymuj roztwór na lodzie.
9. Usunąć roztwór do przechowywania z SID i przemyć 3 razy 3 ml 1x PBS. Po ostatnim umyciu pozostaw SID(y) do wyschnięcia, aby nie rozcieńczyć roztworu kolagenu I.
10. Uruchom minutnik i dozuj 30 μl roztworu kolagenu I zawierającego jedną sferoidę do jednego z trzech otworów SID. Wizualnie upewnić się, że w 30 μl znajduje się pojedynczy sferoid.
11. Powtórz krok 2.10 jeszcze dwa razy, aby wypełnić wszystkie 3 otwory SID.
12. Użyj końcówki do pipety o pojemności 10 μl, aby ponownie wyśrodkować sferoidę, jeśli znajduje się ona blisko granicy PDMS. Jeśli dwie lub trzy sferoidy zostaną dozowane w jednym z otworów, można użyć tej samej końcówki pipety do oddzielenia sferoid od siebie. Zatrzymaj minutnik.
    UWAGA: Częste odwracanie SID do góry nogami i do góry nogami, przez cały okres polimeryzacji i krzepnięcia kolagenu I, zapewnia, że sferoida jest umieszczona w pionowym środku warstwy ECM i zapobiega inwazji komórek w 2D. Częstotliwość odwracania (odwracania) powinna być zmaksymalizowana. Ponieważ częstotliwość przewracania jest kontrolowana przez sferoidalny "czas dozowania" mierzony w 2.10-2.12, czas dozowania powinien być zminimalizowany. W naszym laboratorium czas dozowania wynosi średnio 2 minuty.
13. Aby wyśrodkować sferoidę w pionie w warstwie kolagenu, odwróć SID do góry nogami i inkubuj w temperaturze 37 °C przez czas dozowania.
14. Odwróć SID do góry nogami i inkubuj w temperaturze 37 °C przez czas dozowania.
    UWAGA: Czas, jaki sferoidy spędzają w orientacji odwróconej, powinien być równy czasowi spędzonemu w orientacji odwróconej.
15. Powtarzaj kroki 2.13 i 2.14 przez 30 minut, aż kolagen I ulegnie polimeryzacji.
16. Dodać 2,5 ml kompletnej pożywki/SID i w razie potrzeby uzyskać obraz sferoid dla początkowego punktu czasowego.
17. Powtórz kroki 2.10-2.16, jeśli używanych jest wiele identyfikatorów SID.

3. Znakowanie fluorescencyjne sferoid

1. Obrazowanie na żywo (czas trwania 6-7 dni)
   UWAGA: Jeśli dostępna jest linia komórkowa wykazująca ekspresję białka cytoplazmatycznego i/lub fluorescencji jądrowej, należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w punkcie 2. Alternatywnie, w przypadku znakowania cytoplazmatycznego, proponuje się następujący protokół.
   1. Wykonaj kroki 2.1-2.5 protokołu opisanego w sekcji 2.
   2. Rozcieńczyć barwnik cytoplazmatyczny do 25 μM w 200 μl pożywki wolnej od surowicy.
      UWAGA: Chociaż w tym eksperymencie używany jest czerwony barwnik cytoplazmatyczny, każdy inny dostępny kolor powinien być odpowiedni. Komórki rakowe znakowano wewnątrz sferoid za pomocą barwników jądrowych rozcieńczonych do 20 μM w 200 μl pożywki bez surowicy (patrz tabela materiałów).
   3. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić sferoidy w cytoplazmatycznym lub jądrowym roztworze barwnika i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Przy takim podejściu znakowanie komórek w centrum sferoidalnym nie będzie skuteczne. Aby uzyskać oznakowanie wszystkich komórek, inkubację można przedłużyć o noc, umieszczając naczynie na kołysce. Alternatywy są opisane w Dyskusji.
   4. Umyj sferoidy 3 razy w pełnym podłożu.
   5. Przejdź do kroków 2.6-2.17 protokołu opisanego w sekcji 2.
   6. Obrazowanie sferoid za pomocą obrazowania poklatkowego co 10 minut przez 24-72 godziny (Rysunek 2) lub za pomocą obrazowania podłużnego codziennie przez okres do 7 dni (Rysunek 3). Użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, obiektywu pneumatycznego 10x (apertura numeryczna 0,4 i odległość robocza 3,1 mm), 1024 x 1024 pikseli, czas naświetlania 8 μs/piksel, otwór 90 μm, 6 x 15 μm stopnie z i 3 pola widzenia - każde zawierające jedną sferoidę.
      UWAGA: W przypadku obrazowania poklatkowego należy użyć minimalnej mocy lasera i wyposażyć mikroskop w komorę środowiskową z kontrolą temperatury, wilgotności i gazu. Hodować osadzone sferoidy w temperaturze 37 °C przez > 8 godzin lub przez noc przed obrazowaniem, aby zminimalizować czas spędzony pod mikroskopem.
2. Barwienie immunofluorescencyjne sferoid (czas trwania 2 dni)
   UWAGA: Opisana tutaj procedura została dostosowana i zoptymalizowana na podstawie wcześniej opublikowanych protokołów^8,9. Metodę tę można stosować po protokole opisanym w sekcjach 2 i 3.1.
   1. Świeżo przygotuj następujące roztwory.
      1. Roztwór utrwalający: 1x PBS zawierający 4% PFA (obj./obj.) [np. dodać 5 ml 16% (obj./obj.) PFA do 15 ml 1x PBS].
      2. Roztwór utrwalający i permeabilizujący: 1x PBS zawierający 4% PFA (obj./obj.) i 0,5% Triton X-100 (obj./obj.) [np. dodać 50 μl Triton X-100 do 10 ml roztworu utrwalającego].
      3. Roztwór blokujący: 1x PBS zawierający 1% FBS (obj./obj.) i 1% BSA (wag./obj.) [np. rozpuścić 100 mg BSA w 10 ml 1x PBS, a następnie dodać 100 μL FBS].
      4. Roztwór myjący: 1x PBS zawierający 0,05% Tween 20 (vol/vol) [np. dodać 25 μL Tween 20 do 50 ml 1x PBS].
   2. Usunąć pożywkę hodowlaną z SID i przemyć raz ciepłym 1x PBS.
   3. Dodać 2 ml roztworu utrwalającego i przepuszczalnego na SID i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   4. Usunąć roztwór utrwalający i przepuszczalny i dodać 2 ml roztworu utrwalającego na SID i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   5. Umyj 3 razy roztworem myjącym.
   6. Dodać 2 ml roztworu blokującego na SID i inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, lekko wstrząsając.
      UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być inkubowane w temperaturze 4 °C przez weekend. Należy pamiętać, że dłuższy czas blokowania może zakłócić procedurę znakowania immunofluorescencyjnego.
   7. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym.
   8. Dodać 150 μl roztworu blokującego z pierwszorzędowymi przeciwciałami/basenikiem do 48-dołkowej płytki.
   9. Za pomocą cienkiej pęsety ostrożnie odłącz korek kolagenu I zawierający sferoidę i przenieś do studzienki. Powtórz tę czynność, jeśli oznaczonych jest wiele sferoid. Wytrzyj płyn, który może pozostać na pęsetze podczas pracy z różnymi przeciwciałami, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
   10. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając.
   11. Dodać 300 μl roztworu myjącego do pustych i pełnych studzienek.
   12. Ostrożnie przenieś czop kolagenu I zawierający sferoidę do studni "do mycia".
   13. Umyć 3 razy roztworem myjącym przez 2 godziny, w temperaturze pokojowej i delikatnie wstrząsając.
       UWAGA: Przeniesienie czopów kolagenu I zawierających sferoidę, zamiast zasysania roztworów, może pomóc w zmniejszeniu strat i uszkodzeń próbki.
   14. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe, 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) i/lub falloidynę w roztworze blokującym.
   15. Dodać 150 μl roztworu blokującego z przeciwciałami drugorzędowymi, DAPI i/lub falloidyną do dołka.
   16. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś czop kolagenowy zawierający sferoidy do studzienki. Powtórz tę czynność, jeśli oznaczonych jest wiele sferoid.
   17. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z łagodnym wstrząsaniem.
   18. Powtórz kroki 3.2.11 i 3.2.12.
   19. Umyć 3 razy roztworem myjącym przez 30 minut, w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
   20. Za pomocą żyletki wytnij 3-otworową wkładkę PDMS na trzy części, tak aby każda część zawierała otwór.
   21. Umieść dwa kawałki PDMS na szkiełku mikroskopowym.
   22. Dodaj kroplę roztworu montażowego za pomocą końcówki P200 z odciętym końcem. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków.
   23. Ostrożnie przenieś kolagen, który wkładam do każdego otworu.
       UWAGA: Jeśli sferoida została umieszczona w górnej części korka kolagenowego, odwróć czop kolagenowy tak, aby sferoida znalazła się bliżej szklanego szkiełka nakrywkowego.
   24. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij za pomocą taśmy.
   25. Pozostawić próbkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chroniąc ją przed światłem.
   26. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu obrazowania.

4. Przetwarzanie obrazu w celu analizy inwazji raka w czasie

UWAGA: Format wymagany dla tego makra to jednokanałowy obraz x,y,t zapisany jako plik .tiff.

1. Jeśli uzyskano wiele plasterków z (np. obraz x,y,z,t), otwórz obraz w Fidżi i wybierz Obraz | Stosy | Projekt Z. Zaleca się skorzystanie z opcji Max Intensity (Maksymalna intensywność). Alternatywnie do uruchomienia makra można użyć pojedynczego wycinka z. Zapisz obraz jako plik .tiff.
2. Utwórz osobny folder "Przetwarzanie" na pulpicie.
3. Wybierz punkt menu Plik | Zapisz jako | Sekwencja obrazów. Użyj formatu TIFF, zaktualizuj liczbę cyfr zgodnie z liczbą ramek, zaznacz pole wyboru, aby użyć etykiety plasterka jako nazwy pliku i wybierz OK. Wybierz folder "Przetwarzanie" utworzony w kroku 2.
4. Otwórz jeden obraz z folderu "Przetwarzanie". Powinien to być obraz x,y, odpowiadający pojedynczemu punktowi czasowemu.
5. Wybierz punkt menu Obraz | Dostosuj | Automatyczny próg. Z menu rozwijanego wybierz metodę Wypróbuj wszystko i zaznacz pole wyboru dla białych obiektów na czarnym tle.
6. Zostanie wyświetlony obraz montażowy przedstawiający wynik dla każdej metody automatycznego określania progów.
7. Zidentyfikuj najlepszą metodę automatycznego progowania, na przykład RenyIEntropy.
8. Aby potwierdzić wybór metody automatycznego progowania, otwórz dowolny inny obraz z folderu "Przetwarzanie" i przetestuj wybraną metodę progowania za pomocą Obraz | Dostosuj | Automatyczny próg.
9. Zamknij wszystkie obrazy.
10. Pobierz makro SpheroidAreaTime (plik uzupełniający 2).
11. Otwórz makro Fidżi, przeciągając i upuszczając.
12. W wierszu 58 zaktualizuj metodę automatycznego progowania zgodnie z potrzebami.
13. W wierszu 62 zaktualizuj zakres rozmiarów zgodnie z wymiarami komórki.
14. Wybierz pozycję Uruchom.
15. Wybierz folder "Przetwarzanie" i wpisz "Przetwarzanie" jako folder nadrzędny, a następnie wybierz przycisk OK.
16. Po zakończeniu biegu zapisz tabelę "Podsumowanie". Pierwsza kolumna wskazuje nazwę obrazu; trzecia kolumna wskazuje obszar sferoidalny; Szósta, siódma i ósma kolumna określają parametry elipsy dopasowanej do sferoidy.
17. Folder "Przetwarzanie" zawiera teraz przetworzony obraz dla każdego punktu czasowego, z rozszerzeniem _SpheroidArea.
    UWAGA: Jeśli środek sferoidy jest przyciemniony, wypełnij go kolorem białym za pomocą narzędzi do zaznaczania dla wszystkich punktów czasowych, a następnie przejdź do kroku 3. Podobnie przestrzeń wokół sferoidy można wypełnić czernią, aby "oczyścić" obraz. Jeśli obraz jest czysty, skomentuj wiersz 61, aby przyspieszyć bieg.

Wyniki

Ze względu na swoją biokompatybilność, PDMS jest szeroko stosowany do mikroprodukcji studni ograniczających, stempli i form, co zrewolucjonizowało mikrowzorce i urządzenia mikroprzepływowe. W opisanej tutaj metodzie służy do tworzenia SID, konfigurowalnych studni, które optymalizują procedurę osadzania sferoidów i obrazowania. Rysunek 1 ilustruje główne komponenty użyte do produkcji SID-ów. Aby odlać formę PDMS, drukuje się w 3D przekładkę o grubości 1 mm (Rysunek 1A,B),<...

Dyskusja

Wydrukowana w 3D przekładka została zaprojektowana do tworzenia arkuszy PDMS o grubości 1 mm, które można następnie wykorzystać do łatwego tworzenia różnych kształtów PDMS, zgodnie z wymaganiami aplikacji eksperymentalnych. Ze względu na prostotę wykonania i swobodę zmiany projektu, ta metoda odlewania PDMS została wybrana do wstępnego projektu SID. Jeśli wymagana jest duża ilość identyfikatorów SID, produkcja może być bardziej wydajna poprzez stworzenie formy wydrukowanej w 3D, która zawiera już dyski PDMS z trzema równ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 N NaOH	Honeywell Fluka	60-014-44
10X Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	SH30028.LS
16% paraformaldehyd (PFA)	Alfa Aesar	43368-9M
1X Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	20012027
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Invitrogen	D1306
48-dołkowa płytka	Falcon	T1048
Alexa Fluor 647 falloidyna	Life Technologies	A20006
Przeciwciało antykortaktynowe	Abcam	ab33333	Rozcieńczenie od 1 do 200
Anti Przeciwciało E-kadheryny	Invitrogen	13-1900	Rozcieńczenie od 1 do 100
Roztwór atelokolagenu bydlęcego I (Nutragen)	Advanced Biomatrix	501050ML
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma Aldrich	A4503-50G
CellTracker Red CMTPX Dye	Invitrogen	C34552
Rurki stożkowe	Falcon	352095
Szkiełka nakrywkowe	FisherBrand	12-548-5E
Pojemnik	jednorazowy Zszywki		Kubki plastikowe
Jednorazowa pipeta transferowa	Thermo Scientific	202
DMEM	Fisher Scientific	11965118
Taśma dwustronna	Scotch
Ethanol	Sigma	Aldrich E7023-500ML
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Bio-Techne	S11550
Fluoromount-G	eBioscience	00-4958-02
Aldehyd glutarowy	Sigma Aldrich	G5882-100mL
barwnik jądrowy Hoescht	Thermo Fischer	62249
Isopropanol	Thermo Fischer	S25371A
MatTek naczynie (naczynie ze szklanym dnem)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Metyloceluloza	Sigma Aldrich	M6385-100G
MiliQ woda
Roztwór penicyliny/streptomycyny	Thermo Fischer	15140122
szalka Petriego	Corning	353003
Końcówki do pipet	Fisherbrand	02-707
	Gilson	F167300
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920
Przeciwciała pierwszorzędowe, specyficzne dla
Rat Tail Collagen I	Corning	47747-218
Razor Blade	Personna	74-0001
Przeciwciała wtórne, specyficzne dla
Slajdy	Globe Scientific	1354W-72
Sylgard 184 Silikonowa	Dow Corning	4019862
	Scotch
Triton X100	Sigma Aldrich	10789704001
Tween 20	Sigma Aldrich	655204-100ML