Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Gabriela C. Schröder; Flora Meilleur

doi:10.3791/61903

Method Article

Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

DOI:

10.3791/61903

⸱

December 1st, 2020

Gabriela C. Schröder¹^,² , Flora Meilleur¹^,²

¹Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, ²Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia białek neutronowych to technika strukturalna, która pozwala na lokalizację atomów wodoru, dostarczając tym samym ważnych szczegółów mechanistycznych funkcji białek. Przedstawiamy tutaj przebieg pracy montażu kryształu białka, zbieranie danych dyfrakcji neutronów, udoskonalanie struktury i analizę map gęstości długości rozpraszania neutronów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia neutronów to technika strukturalna, która pozwala na określenie pozycji atomów wodoru w makrocząsteczkach biologicznych, dostarczając mechanistycznie ważnych informacji o stanach protonacji i hydratacji, jednocześnie nie wywołując uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Natomiast dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego dostarcza tylko ograniczonych informacji na temat położenia atomów światła, a wiązka promieniowania rentgenowskiego szybko indukuje uszkodzenia promieniowania kofaktorów światłoczułych i centrów metali. Poniżej przedstawiono przebieg pracy zastosowany na liniach badawczych IMAGINE i MaNDi w Oak Ridge National Laboratory (ORNL) w celu uzyskania struktury dyfrakcji neutronów po wyhodowaniu kryształu białka o odpowiedniej wielkości (> 0,1^mm3). Demonstrujemy montaż uwodornionych kryształów białka w kapilarnach kwarcowych w celu zbierania danych dyfrakcji neutronów. Przedstawiono również proces wymiany parowej zamontowanych kryształów z buforem zawierającym_{D 2}O, aby zapewnić zastąpienie atomów wodoru w miejscach wymiennych deuterem. Włączenie deuteru zmniejsza tło powstające w wyniku niekoherentnego rozpraszania atomów wodoru i zapobiega znoszeniu gęstości spowodowanemu ich ujemną długością rozpraszania koherentnego. Strategie dopasowywania próbek i zbierania danych o temperaturze pokojowej zilustrowano za pomocą danych gromadzonych przez IMAGINE w reaktorze izotopowym o wysokim strumieniu (HFIR). Co więcej, montowanie kryształów i szybkie zamrażanie w ciekłym azocie w celu zbierania danych kriogenicznych w celu wychwytywania labilnych produktów pośrednich reakcji zademonstrowano na instrumencie MaNDi do pomiaru czasu przelotu w Spalacyjnym Źródle Neutronów (SNS). Omówione zostanie również przygotowanie plików danych współrzędnych i dyfrakcyjnych modelu oraz wizualizacja map gęstości długości rozpraszania neutronów (SLD). Na koniec omówione zostanie udoskonalanie struktury na podstawie samych danych neutronowych lub na podstawie połączonych danych rentgenowskich/neutronowych w celu uzyskania struktury całkowicie atomowej białka będącego przedmiotem zainteresowania. Proces wyznaczania struktury neutronowej zostanie zademonstrowany przy użyciu kryształów monooksygenazy polisacharydowej Neurospora crassa LPMO9D, metaloproteiny zawierającej miedź, biorącej udział w degradacji opornych polisacharydów poprzez oksydacyjne rozszczepienie wiązania glikozydowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia makromolekularna neutronów to technika, która daje unikalne okno na strukturę i chemię leżącą u podstaw białek. Koncepcyjnie podobna do dyfrakcji rentgenowskiej, dyfrakcja neutronów dostarcza atomistycznych szczegółów struktury makromolekularnej, jednak oddziaływanie neutronów z jądrami umożliwia lokalizację lekkich atomów, często trudną do wykrycia za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej¹. Podczas dyfrakcji rentgenowskiej promienie rentgenowskie rozpraszają się od chmury elektronów, co sprawia, że lekkie atomy, takie jak wodór (H), są słabo widoczne na mapach gęstości elektronów, które nie mają rozdzielczości bliskiej poniżej Ångströma². Natomiast intensywność rozpraszania neutronów zależy od złożonych oddziaływań z jądrem, przy czym izotopy tego samego pierwiastka wykazują różne długości rozpraszania. Dlatego lekkie atomy i ich izotopy, takie jak wodór (¹H) i deuter (²H lub D), mają porównywalną widoczność do szkieletu atomów węgla, azotu i tlenu na mapach gęstości rozpraszania neutronów (SLD). Ponadto, ponieważ wielkość rozpraszania neutronów jest niezależna od liczby elektronów, rozpraszanie od lekkich pierwiastków nie jest przesłonięte przez ciężkie pierwiastki, gdy znajdują się one w bliskiej odległości od siebie, jak to obserwuje się w rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego. Zwiększona widoczność H i jego izotopu D przy zastosowaniu dyfrakcji neutronów dostarcza cennych informacji o stanie protonacji katalitycznie ważnych reszt, kofaktorów i ligandów oraz pomaga w orientacji cząsteczek wody, ujawniając ważne informacje o mechanizmach katalitycznych i chemii białek³. Dyfrakcja neutronowa ma również tę zaletę, że jest techniką nieniszczącą, szczególnie przydatną do próbek biologicznych wrażliwych na jonizację, takich jak białka z centrami metalowymi lub światłoczułymi kofaktorami redoks². Głównym celem tego artykułu jest przedstawienie przeglądu procesu przepływu pracy w celu uzyskania wysokiej jakości struktury krystalicznej białka neutronowego. Odsyłamy zainteresowanego czytelnika do Podjarny et al.⁴, Blakeley⁵, Blakeley et al.⁶ oraz O'Dell et al.³ w celu uzyskania doskonałego przeglądu dyfrakcji białek neutronowych oraz Ashkar et al.⁷ do dalszych zastosowań rozpraszania neutronów.

Neutrony są głównie generowane podczas reakcji jądrowych wykorzystujących jeden z dwóch procesów: rozszczepienie jądra atomowego w źródłach reaktora lub spalację w źródłach opartych na akceleratorze⁸. Źródła reaktorowe wytwarzają ciągłą wiązkę neutronów, wykorzystując rozszczepienie jądrowe izotopu ²³⁵U, podczas gdy źródła neutronów spalacyjnych wytwarzają pulsacyjną wiązkę neutronów, bombardując cel, na przykład ciekły metal, taki jak rtęć, protonami⁹. W Oak Ridge National Laboratory (ORNL) w Oak Ridge w stanie Tennessee znajduje się zarówno źródło neutronów w stanie ustalonym w reaktorze izotopowym o wysokim strumieniu (HFIR), jak i źródło impulsowe o częstotliwości 60 Hz w spulacyjnym źródle neutronów (SNS). Linia badawcza IMAGINE, znajdująca się w HFIR, to dyfraktometr neutronowy zoptymalizowany pod kątem makrocząsteczek biologicznych (rysunek uzupełniający 1)¹⁰. IMAGINE wykorzystuje detektor neutronowych płytek obrazowych do pomiaru danych quasi-Laue przy użyciu wąskiego pasma przepustowego w zakresie 2,8 – 4,5 A od monokryształów o krawędziach komórek elementarnych <150 A. Makromolekularny dyfraktometr neutronów (MaNDi), znajdujący się w SNS, jest dyfraktometrem neutronów Laue z funkcją czasu przelotu (TOF) wyposażonym w ramkę z matrycą detektora sferycznego (DAF) (rysunek uzupełniający 2)¹¹. MaNDi mierzy dane z monokryształów z krawędziami komórek elementarnych w zakresie 10 – 300 A, wykorzystując przestrajalne pasmo o długości fali 2 A w zakresie 2,0 – 6,0 Å¹².

Proces generowania neutronów jest bardzo energochłonny, co skutkuje stosunkowo słabymi strumieniami wiązki neutronów w porównaniu ze strumieniami wiązki promieniowania rentgenowskiego w źródłach synchrotronowych¹³. Aby zapewnić wystarczający stosunek sygnału do szumu podczas zbierania danych, konieczne jest wyhodowanie kryształów o odpowiedniej wielkości i jakości¹⁴. Zazwyczaj kryształy o objętościach > 0,1 mm³ są potrzebne do zbierania danych z odpowiednimi statystykami¹⁵. Oprócz niższych strumieni należy wziąć pod uwagę nieodłączne właściwości oddziaływania między neutronami a jądrami próbki¹⁶. Długość rozpraszania neutronów różni się w zależności od izotopów tego samego pierwiastka, właściwość, która może być korzystnie wykorzystana w rozpraszaniu neutronów pod małym kątem (SANS) do maskowania lub podświetlania obszarów próbki – proces znany jako dopasowanie kontrastu¹⁷. W eksperymentach dyfrakcyjnych ujemna koherentna długość rozpraszania neutronów wynosząca H (-3,741 fm dla ¹H) może prowadzić do zniesienia cech mapy gęstości rozpraszania neutronów od czasu spójnych długości rozpraszania neutronów innych biologicznie istotnych atomów, w tym węgla (6,6511 fm dla ¹²C), azotu (9,37 fm dla ¹⁴N), tlenu (5,803 fm dla ¹⁶O), fosfor (5,13 fm dla ³¹P) i siarka (2,804 fm dla ³²S) są dodatnie (Tabela 1)¹²^,¹⁴. Co więcej, duża niekoherentna długość rozpraszania H (25,274 fm) zwiększa tło podczas zbierania danych, pogarszając jakość zestawu danych i pogarszając rozdzielczość danych⁷. Aby obejść te ograniczenia wprowadzone przez H, konieczne jest, dla dyfrakcji neutronów, zamiana H na jego izotop deuteru, ²H(D), który ma dodatnią długość rozpraszania neutronów koherentnych (6,671 fm) i znacznie niższą długość rozpraszania niekoherentnego (4,04 fm)¹⁹. Można to osiągnąć poprzez perdeuterację, proces, w którym białko ulega ekspresji przez organizmy hodowane w całkowicie deuterowanych pożywkach, zapewniając całkowite włączenie D w miejscach H²⁰. Możliwa jest również częściowa deuteryzacja białka poprzez zastąpienie H przez D wyłącznie w miejscach wymiennych (grupach miareczkowalnych), podczas gdy niewymienne miejsca związane z węglem pozostają uwodornione²¹. Można to osiągnąć poprzez wzrost uwodornionych kryształów białka w deuterowanym ługu macierzystym²². Najczęściej jednak wymiana H/D uwodornionych białek odbywa się poprzez wymianę parową po wzroście odpowiednio dużych kryształów w buforze opartym na H₂O²³. W takich przypadkach kryształy są umieszczane w kapilarze kwarcowej i równoważone parą z ługiem macierzystym na bazie D₂0.

Ograniczone strumienie neutronów w źródłach neutronów skutkują dłuższym czasem zbierania danych, od dni do kilku tygodni²⁴. W ORNL zarówno IMAGINE, jak i MaNDi wykorzystują wąskie pasmo przepustowe o długości fali w zakresie 2–6 A, aby zoptymalizować gromadzenie danych²⁵. Dane można zbierać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze kriogenicznej. Gromadzenie danych kriogenicznych może potencjalnie poprawić jakość danych i otworzyć możliwość zatrzymywania przez zamarzanie produktów pośrednich. Po zebraniu danych dyfrakcji neutronów, zestaw danych rentgenowskich jest zwykle zbierany na tym samym kryszale w tej samej temperaturze lub na kryszale hodowanym w identycznych warunkach²⁶. Gromadzenie danych w tej samej temperaturze pozwala na udoskonalenie struktury zarówno na podstawie danych rentgenowskich, jak i neutronowych, zapobiegając wszelkim potencjalnym artefaktom wywołanym temperaturą, takim jak zmiany widoczności i położenia wód lub zajmowanie pozostałości o alternatywnych konformacjach²⁷. Wspólne udoskonalanie danych neutronów rentgenowskich zwiększa stosunek danych do parametrów i ma tę zaletę, że pozwala na doprecyzowanie współrzędnych szkieletu białka w stosunku do danych rentgenowskich, podczas gdy dane dyfrakcji neutronów są wykorzystywane do uściślenia położenia atomów H/D ²⁸. Jest to szczególnie przydatne w przypadku stosowania próbek częściowo deuterowanych, w których występuje anulowanie gęstości spowodowane atomami H w niewymiennych miejscach białka. Chociaż liczba struktur rentgenowskich znacznie przewyższa liczbę struktur neutronowych zdeponowanych w Banku Danych Białkowych (PDB), pakiety oprogramowania początkowo zaprojektowane do udoskonalania danych rentgenowskich zostały rozszerzone o dane neutronowe³^,²⁹^,³⁰. Po zebraniu danych modele można udoskonalić za pomocą pakietów uściślających, takich jak phenix.refine, CNSsolve (nCNS) lub SHELXL²⁸^,³¹^,³²^,³³. Podczas procesu uszlachetniania mapy gęstości rozpraszania neutronów mogą być wizualizowane w celu ręcznego dopasowania za pomocą COOT³⁴. Po rozwiązaniu struktury, współrzędne oraz pliki danych dyfrakcji neutronów i/lub promieniowania rentgenowskiego mogą zostać przesłane do PDB, który zatwierdzi i zdeponuje model, udostępniając go do publicznego dostępu¹⁸^,²⁹^,³⁰.

Analiza strukturalna białek to wieloaspektowe podejście, w którym wykorzystywane są liczne techniki do badania ich funkcji i mechanizmu³⁵. Krystalografia białek neutronowych dostarcza cennych informacji chemicznych, które rozszerzają i uzupełniają wyniki dodatkowych badań, takich jak dyfrakcja rentgenowska, spektroskopia, magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) lub dyfrakcja elektronów mikrokrystalicznych (microED)³⁶. Dyfrakcja białek neutronowych ma wyjątkową pozycję, aby zapewnić wgląd w mechanizmy enzymatyczne, ponieważ atomy H mają kluczowe znaczenie dla ich chemii. Brak uszkodzeń radiacyjnych indukowanych przez neutrony sprawia, że są one wyjątkowo odpowiednie do badania metaloprotein³⁷. Przedstawiamy tutaj reprezentatywny przykład procesu dyfrakcji białek neutronowych od przygotowania próbki do zebrania, udoskonalenia i analizy danych (Rysunek 1). Kryształy o rozmiarach wystarczających do eksperymentów dyfrakcji neutronowej zostały wyhodowane z metaloproteiny Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). NcLPMO9D jest metaloproteiną zawierającą miedź biorącą udział w degradacji opornej celulozy poprzez wstawienie atomu tlenu w wiązaniu glikozydowym³⁸^,³⁹. Miejsce aktywne NcLPMO9D zawiera jednojądrzaste centrum miedzi w charakterystycznym "nawiasie histydyny" złożonym z N-końcowej histydyny i drugiej konserwatywnej histydyny (rysunek uzupełniający 3)⁴⁰. N-koniec grzybowych LPMO jest metylowany, ale modyfikacja poprzejściowa nie zachodzi podczas ekspresji rekombinowanej w drożdżach. W stanie spoczynku NcLPMO9D centrum miedzi jest obecne na stopniu utlenienia Cu²⁺ i jest aktywowane przez redukcję pojedynczego elektronu do Cu¹⁺, umożliwiając wiązanie tlenu cząsteczkowego i aktywację przez szybką redukcję do gatunku ponadtlenkowego⁴¹^,⁴². Ogólna reakcja NcLPMO9D wymaga dalszego dodania jednego elektronu i dwóch protonów w celu utworzenia hydroksylowanego iloczynu polisacharydowego⁴³. Tożsamość aktywowanej formy tlenu odpowiedzialnej za abstrakcję atomów wodoru (HAA) z substratu polisacharydowego nie została zidentyfikowana, a obecnie trwają intensywne badania strukturalne i obliczeniowe⁴⁴^,⁴⁵. Biorąc pod uwagę skład chemiczny redoks w miejscu aktywnym NcLPMO9D, łagodzenie uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem jest szczególnie istotne. Ilustrujemy tutaj gromadzenie danych o temperaturze pokojowej i kriotemperaturze na kryształach NcLPMO9D w celu określenia struktury NcLPMO9D odpowiednio w stanie spoczynku i w aktywowanej formie zredukowanej⁴⁶. Nacisk zostanie położony na montaż kryształów białka, konfigurację instrumentów linii badawczej do zbierania danych, przygotowanie plików danych i współrzędnych oraz etapy udoskonalania niezbędne do modelowania struktury neutronowej składającej się ze wszystkich atomów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ocena wielkości kryształu

Zmierz wielkość kryształów za pomocą mikroskopu wyposażonego w światło normalne i spolaryzowane. Wybierz kryształy o minimalnej objętości ~0,1 mm³ (rysunek uzupełniający 4).
Oznacz studzienki wystarczająco dużymi kryształami i zwróć uwagę na warunki krystalizacji użyte do wytworzenia tych kryształów.

2. Przygotowanie deuterowanego buforu krystalizacyjnego

Rozpuścić składniki buforu krystalizacyjnego w D₂O, aby wytworzyć deuterowany bufor krystalizacyjny.
Dostosuj pH buforu, obliczając pD roztworu, stosując następujące równanie:
(1)
gdzie_pomiary pH to pH mierzone za pomocą standardowej elektrody szklanej. Pierwotne pH buforu krystalizacyjnego NcLPMO9D wynosiło 6,0, dlatego użyjemy_pomiarów pH 5,6 dla deuterowanego buforu krystalizacyjnego przy pD 6,0.
Zanurz elektrodę pH-metru w D₂O na dziesięć minut przed użyciem (Rysunek uzupełniający 5).
Dostosować_{pH do 5,6} za pomocą zasady NaOD lub kwasu DCl.

3. Zbieranie kryształów

Umieść silikonowane okrągłe szkiełka podstawowe o średnicy 22 mm obok tacki krystalizacyjnej, z której będą zbierane kryształy. Użyj szkiełka z czystego szkła na kryształ (Rysunek 2A).
Otwórz szczelnie zamknięte pudełko na kanapki zawierające kryształy białka w 9-dołkowej płytce ze szkła silikonowanego o dużej objętości.
Usunąć 10-20 μl z roztworu zbiornika krystalizacji za pomocą mikropipety i umieścić roztwór na szkiełku podstawowym (Rysunek 2B).
Zbierz kryształ za pomocą mikropętli o odpowiednim rozmiarze i umieść kryształ w roztworze zbiornika, upuść go na szklanym szkiełku, aby usunąć zanieczyszczenia, które często są zbierane wraz z kryształem (Rysunek 2C i Rysunek 2D).
UWAGA: Konieczna będzie szybka praca, ponieważ kropelki o małej objętości mogą wyparować. Zebrane kryształy są również narażone na wysychanie pod wpływem atmosfery. Może być konieczne dodanie roztworu rezerwuarowego do kropli białka, aby zapobiec wysychaniu kryształów w małych objętościach kropli krystalizacji.

4. Montaż kryształu

UWAGA: Protokoły montażu kapilarnego różnią się w zależności od preferencji eksperymentatorów. Aby zapobiec uszkodzeniu kryształów, kapilary, które należy skrócić, należy naciąć kamieniem tnącym lub papierem ściernym, aby zapewnić gładkie pęknięcie.

Napełnij jeden koniec kwarcowej kapilary o średnicy 2 mm i długości 50 mm buforem zbiornika przez działanie kapilarne lub bezpośrednio pipetując ~ 10 μl buforu zbiornika do kapilary (Rysunek 3A).
UWAGA: Zachęca się użytkowników do korzystania z kwarcowych rurek kapilarnych, ponieważ oprócz ich wytrzymałości mechanicznej konieczne jest ograniczenie absorpcji wiązki neutronów i zmniejszenie udziału tła z kapilary. Szklane kapilary wprowadzają wysokie tło i pochłaniają neutrony, pogarszając jakość danych.
Delikatnie umieść kryształ w buforze zbiornika w kapilarze kwarcowej za pomocą pętli montażowej (Rysunek 3B i Rysunek 3C).
Delikatnie postukaj w rurkę, aby przesunąć bufor zbiornika i zanurzony w nim kryształ w dół kapilary (Rysunek 3D).
Umieść kryształ nie bliżej niż 13,5 mm i nie dalej niż 27,5 mm od jednego końca kapilary; będzie to koniec montażowy (rysunek uzupełniający 6).
Zassać roztwór buforowy wokół kryształu za pomocą długiej, cienkiej końcówki pipety, pozostawiając kryształ lekko wilgotny. Nie dotykaj kryształu (Rysunek uzupełniający 7A).
Osusz ścianki kapilary cienkim papierowym (rysunek uzupełniający 7B).
Odpipetować 20-50 μl deuterowanego roztworu buforowego na koniec kapilary naprzeciwko końca montażowego (Rysunek 4A).
Rozpuść wosk pszczeli za pomocą "różdżki" termicznej i delikatnie włóż kapilar do tego stopionego wosku pszczelego. Powtarzaj, aż utworzy się hermetyczne uszczelnienie (Rysunek 4B i Rysunek 4C).
Odpipetować bardzo małą ilość deuterowanego buforu, około 5 μl w końcówce montażowej kapilary, aby działała jako "radiator" dla gorącego wosku pszczelego. Zanurz ten koniec w stopionym wosku pszczelim, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie, jak opisano wcześniej, aby utworzyć kapilarnę uszczelnioną na obu końcach (Rysunek 4D).
Po zamontowaniu sprawdź zamontowany kryształ za pomocą mikroskopu, aby upewnić się, że jest szczelny (Rysunek 4E).
Ostrożnie zabezpiecz zamontowane kryształy chusteczkami Kim w pojemniku, takim jak 15-milimetrowa probówka Falcona lub szalka Petriego i przechowuj poziomo w temperaturze, w której kryształy były hodowane (Rysunek 4F).

5. Wymiana pary

Wymień zdeuterowany bufor na świeży bufor dwa dni po zamontowaniu kryształu.
Rozpuść uszczelkę woskową najbardziej oddaloną od kryształu za pomocą pętli grzewczej i użyj pipety i papierowych, aby usunąć bufor.
Napełnij kapilarnę 20-50 μl deuterowanego roztworu buforowego i uszczelnij woskiem.
Powtórz wymianę deuterowanego buforu jeszcze dwa razy w odstępach czterodniowych, aby upewnić się, że wymiana oparów deuterowanego buforu jest pełna i umożliwić wymianę pary przez co najmniej dwa tygodnie.

6. Dyfrakcja białek neutronowych

UWAGA: Czytelników zainteresowanych specyfiką linii belki IMAGINE zachęcamy do zapoznania się z Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 2018¹⁰^,⁴⁷.

Gromadzenie danych o temperaturze pokojowej na linii badawczej IMAGINE w HFIR
1. Przykładowy montaż
  1. Zabezpiecz kryształ zamontowany na kapilarze na goniometrze za pomocą szpachli.
  2. Zamontuj goniometr na patyczku do pobierania próbek i wyśrodkuj kryształ w wiązce za pomocą stacji wyrównującej off-line.
  3. Zamocuj patyczek do próbek na instrumencie sample stage (Rysunek uzupełniający 1B).
  4. Upewnij się, że klatka doświadczalna jest opuszczona i otwórz migawkę linii badawczej w celu zebrania danych neutronowych.
2. Gromadzenie danych
  1. Otwórz program do akwizycji danych na komputerze sterującym linią i kliknij zakładkę Ustawienia, aby ustawić strategię zbierania danych. W sekcji Parametry eksperymentu wpisz nazwę próbki w polu Nazwa próbki i wprowadź numer oferty w polu Propozycja. W obszarze Nazewnictwo obrazu wybierz opcję Folder template (Szablon folderu) i ustaw miejsce docelowe dla zapisu pobranych danych, a następnie wybierz opcję Image Prefix (Prefiks obrazu) i wpisz odpowiednią nazwę ramki (Rysunek uzupełniający 8).
  2. Otwórz graficzny interfejs użytkownika optyki i kliknij 2,78 dla λ_min i 4,78 dla λ_max, aby ustawić zakres quasi-Laue dla zbierania danych (rysunek uzupełniający 9).
  3. Przełącz na zakładkę Zbieraj i w obszarze Parametry następnego skanowania wprowadź czas ekspozycji w sekundach w obszarze Ekspozycja, liczbę klatek w obszarze N klatek i kąty zbierania danych w obszarze Δ φ/klatkę. Nazwij klatkę, która ma zostać zebrana, w polu Prefiks obrazu i rozpocznij zbieranie danych, klikając przycisk Rozpocznij skanowanie (Rysunek uzupełniający 10).
  4. Dyfrakowane neutrony zostaną wykryte przez detektor płytek pamięciowych. Pod koniec każdej ekspozycji zostanie odczytana płyta obrazowa, a wzór zostanie wyświetlony w graficznym interfejsie użytkownika do gromadzenia danych (rysunek uzupełniający 11).
  5. Ramki są indeksowane, integrowane, normalizowane i skalowane za pomocą Lauegen, Lscale⁵⁰ i Scala przez odpowiedzialnego naukowca linii badawczej, który po zebraniu danych dostarczy użytkownikowi scalony plik odbicia (Rysunek uzupełniający 12).
    UWAGA: Zbieranie danych zarówno w IMAGINE, jak i MaNDi będzie odbywać się w trybie quasi-Laue, przy użyciu metodologii i oprogramowania opracowanego do zbierania danych dyfrakcyjnych Laue, opracowanego przez Helliwell et al.⁴⁸ i Nieh et al.⁴⁹.
  6. Zebrać odpowiedni zestaw danych rentgenowskich na tym samym krysztale w tej samej temperaturze po zebraniu danych dyfrakcji neutronów (rysunek uzupełniający 13).
    UWAGA: Kryształ wyhodowany z tej samej kropli lub w tych samych warunkach krystalizacji może być również używany do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w celu wspólnego oczyszczania neutronów/promieniowania rentgenowskiego.
Zbieranie danych kriogenicznych na linii badawczej MaNDi na SNS
UWAGA: Czytelników zainteresowanych specyfiką linii wiązki zachęcamy do zapoznania się z Coates et al. (2015), Meilleur et al. 2018¹⁰^,¹¹.
1. Przykładowy montaż
  1. Przygotować zdeuterowany roztwór nasączający askorbinianem do redukcji kryształów i deuterowanego krioprotektantu. Umieść 20 μl kropli każdego z tych roztworów w studzienkach z kroplami do siedzenia na płytce krystalizacyjnej.
    UWAGA: Roztwór krioprotektantu jest zwykle krioprotektantem, który okazał się skuteczny w zbieraniu danych dyfrakcji rentgenowskiej w kriotemperaturze przygotowanych w D_2O. Ten krioprotektant może być dodatkowo zoptymalizowany (np. pod kątem stężenia) w celu zbierania danych neutronowych, jeśli to konieczne.
  2. Wybierz pętle do montażu próbki i przymocuj je do magnetycznej podstawy kriogenicznej zgodnie z wytycznymi MaNDi (rysunek uzupełniający 14).
  3. Napełnij piankowy krio-Dewara ciekłym azotem. Umieść metalową tuleję krioochronną w ciekłym azocie, aby ostygła (rysunek uzupełniający 15A).
  4. Usuń zatyczki woskowinowe z obu końców kapilary i postukaj w kapilarę, aby przesunąć korek buforowy tak, aby zamontowany kryształ był zanurzony w buforze. Wypłukać kryształ do zbiornika o pojemności 20 μl, wpuścić kroplę do kropli do siedzenia (rysunek uzupełniający 15B i rysunek uzupełniający 15C).
    UWAGA: Ten etap nie jest wymagany, jeśli wymiana H/D została przeprowadzona przez zrównoważenie kropli krystalizacji z deuterowanym buforem lub przez bezpośrednie zanurzenie kryształu w deuterowanym buforze.
  5. Zanurz kryształ w roztworze askorbinianu na dwie godziny. Zamontuj kryształ w mikropętli przymocowanej do magnetycznej podstawy kriogenicznej. Zanurz zamontowany kryształ w krioprotekcie na 10 sekund i zanurz kryształ i uchwyt kriogeniczny w ciekłym azocie w celu zamrożenia (rysunek uzupełniający 15D).
  6. Po zamrożeniu kryształu użyj wstępnie schłodzonych szczypiec do szpilek kriogenicznych i zamontuj kryształ na stoliku MaNDi wyposażonym w strumień kriogeniczny. Delikatnie otwórz szczypce do szpilek kriogenicznych i upewnij się, że kryształ pozostaje w strumieniu kriogenicznym (rysunek uzupełniający 2C).
2. Gromadzenie danych
  1. Otwórz oprogramowanie do zbierania danych, w którym informacje o eksperymencie zostaną automatycznie wypełnione.
  2. Kliknij na środek kryształu, aby wyśrodkować go za pomocą goniometru sterowanego komputerowo (Rysunek Uzupełniający 16).
  3. W obszarze Tabela skonfiguruj strategię zbierania danych, wprowadzając kąty zbierania danych w polu "phi", a także całkowitą ekspozycję wiązki neutronów na klatkę w polu Wartość (rysunek uzupełniający 17).
  4. Kliknij Prześlij, aby rozpocząć zbieranie danych.
  5. W miarę gromadzenia danych, neutron ulegający dyfrakcji będzie widoczny (rysunek uzupełniający 17). Plamy dyfrakcyjne staną się wyraźniejsze wraz ze wzrostem czasu ekspozycji, poprawiając stosunek sygnału do szumu (Rysunek 5).
  6. Ramki zostaną zindeksowane, zintegrowane, znormalizowane i przeskalowane za pomocą Mantid i Lauenorm przez odpowiedzialnego naukowca linii badawczej, który dostarczy użytkownikowi scalony plik intensywności po zebraniu danych⁵¹.

7. Udoskonalenie struktury

Wspólne udoskonalanie danych rentgenowskich i neutronowych
1. Przygotowanie struktury
  1. Uściślij dane rentgenowskie, aby uzyskać strukturę białka za pomocą pakietu oprogramowania phenix.refine i Coot do ręcznego budowania, aby uzyskać kompletną strukturę.
  2. Otwórz CCP4 i wybierz program Konwertuj na/modyfikuj/rozszerz MTZ, aby dopasować flagi danych wolnych od R danych neutronowych do tych z danych rentgenowskich. Wybierz tę opcję, aby zaimportować plik odbicia w formacie MTZ. W obszarze Prześlij uzyskany plik MTZ neutronów i prześlij plik mtz promieniowania rentgenowskiego w obszarze Importuj FreeR MTZ (Rysunek uzupełniający 18). Nadaj nazwę nowemu plikowi MTZ w obszarze Out (Wyjście) i kliknij przycisk Run (Uruchom).
  3. Otwórz pakiet oprogramowania Phenix i kliknij ReadySet w obszarze Narzędzia udoskonalania. Obok pozycji Prześlij plik współrzędnych PDB udoskonalony na podstawie danych rentgenowskich. Wybierz opcję Dodaj wodór do modelu, jeśli jest nieobecny, i wybierz H/D w miejscach wymiennych, H w innym miejscu z menu rozwijanego. Wybrać Dodaj deutery do cząsteczek rozpuszczalnika i pozostawić pozostałe opcje na ich wartościach domyślnych (Rysunek uzupełniający 19A).
    UWAGA: Jeśli używane jest białko perdeuterowane, wybierz opcję Dodaj wodór do modelu, jeśli jest nieobecny, i wybierz H/D w miejscach wymiennych, D w innym miejscu.
2. Udoskonalenie struktury
  1. Otwórz program phenix.refine w zakładce Udoskonalanie, aby skonfigurować udoskonalanie przy użyciu zarówno danych rentgenowskich, jak i neutronowych. Na karcie Konfiguruj w Plikach wejściowych wprowadź plik PDB ze struktury rentgenowskiej, który został przetworzony za pomocą ReadySet oraz niezbędny plik ograniczeń CIF dla wszystkich odpowiednich ligandów. Prześlij plik MTZ z danych neutronowych z flagami Rfree przypisanymi za pomocą CCP4 i przypisz go jako "Dane neutronowe" i "Wolne od neutronów" pod nagłówkiem Typ danych. Prześlij plik MTZ z danych rentgenowskich i przypisz go jako "Dane rentgenowskie" i "Promieniowanie rentgenowskie R-free" pod nagłówkiem Typ danych. Grupa przestrzeni i etykiety danych zostaną automatycznie wypełnione po przekazaniu danych (rysunek uzupełniający 19B).
    UWAGA: Podczas wykonywania uszlachetniania i wprowadzania informacji o krysztale należy użyć komórki elementarnej wyznaczonej na podstawie danych rentgenowskich.
  2. Na karcie Konfiguracja w ustawieniach uściślenia zachowaj standardową strategię uściślania. Zwiększ liczbę cykli do pięciu (rysunek uzupełniający 20)
  3. Wybierz Wszystkie parametry, kliknij Zaawansowane i wybierz Wodory.... Zmień model udoskonalania wodoru na indywidualny i wyłącz jazdę siłową adp (rysunek uzupełniający 20).
  4. Wybierz Wszystkie parametry i otwórz opcję Wyszukaj parametry. Wyszukaj słowo nuclear i wybierz opcję Użyj odległości jądrowych dla X-H/D (rysunek uzupełniający 20).
  5. Wybierz pozycję Uruchom, aby zainicjować uściślenie.
3. Modelarstwo
  1. Po udoskonaleniu w Phenix kliknij Otwórz w Coot w zakładce Wyniki, aby wyświetlić mapy gęstości elektronów w promieniowaniu rentgenowskim i neutronów SLD. Kliknij zakładkę Menedżer wyświetlania, a następnie w sekcji Mapy kliknij Usuń mapę obok map _neutron, aby usunąć mapy neutronowe (Rysunek uzupełniający 21). Kliknij Plik> Otwórz MTZ, mmCIF, fcf lub phs.... Wybierz bieżące pliki uściślania i otwórz plik .mtz. Zarówno dla opcji Amplituda, jak i Fazy wybierz dane WT_no_fill_neutron 2F_OF_C z menu rozwijanego. Powtórz tę czynność i otwórz dane WT_neutronF_{O F C}. Otwórz Menedżera wyświetlania i przełącz na Przewijanie zarówno dla mapy neutronowej, jak i rentgenowskiej 2F_OF_CWT, a następnie przewiń, aby zmniejszyć wartość rmsd map 2F_OF_CWT do 1,00 (Rysunek uzupełniający 21). Przełącz na przewijanie zarówno dla map neutronowych, jak i rentgenowskich F_OF_CWT i przewiń, aby zmniejszyć wartość rmsd map F_OF_CWT do 3,00.
  2. Przeprowadź oględziny pozostałości, aby określić, czy model pasuje do danych. Określ prawidłową orientację i obłożenie H/D wszystkich wymiennych lokalizacji, analizując piki mapy gęstości różnicowej. Obejmuje to grupy hydroksylowe seryny, treoniny i tyrozyny; azot zawarty w histydynie, glutaminie, asparaginie i lizynie; sulfhydryl cysteiny; grupy karboksylowe asparaginianu i glutaminianu; grupy amidów szkieletowych; ligandy; kofaktory i wszelkie potencjalne funkcjonalizowane pozostałości (Rysunek 6).
  3. Zmień orientację cząsteczek wody zgodnie z gęstością neutronów i oddziaływaniami wiązań wodorowych, obracając je za pomocą funkcji Rotate Translate Zone/Chain/Molecule (rysunek uzupełniający 22A i rysunek uzupełniający 22B). Dostosuj pozycje miejsc wymiennych H/D reszt białkowych za pomocą narzędzia Edytuj kąty Chi i funkcji Obróć strefę/łańcuch/cząsteczkę translacji (rysunek uzupełniający 22C i rysunek uzupełniający 22D).
Udoskonalanie struktury – udoskonalanie tylko danych neutronowych
1. Przygotowanie struktury
  1. Otwórz Phenix i wybierz "Wymiana molekularna" i wybierz "Phaser-MR (w pełni funkcjonalny)", aby wyprowadzić fazę skalowanych intensywności dostarczonych przez naukowca instrumentu przez zastąpienie molekularne w celu wygenerowania początkowego pliku współrzędnych w formacie pdb. Wprowadź początkową strukturę pdb w zakładce "Opcje wejściowe i ogólne" i uzupełnij opcje Zespoły, zawartość ASU i Procedura wyszukiwania.
  2. Otwórz Narzędzia modelu i wybierz Narzędzia PDB. Wstaw plik pdb jako plik wejściowy. Przejdź do zakładki Opcje i w obszarze Usuń zaznaczenie atomu wybierz nazwy rozpuszczalnika, ligandów, kofaktorów i metali. W ten sposób usuwane są wszystkie cząsteczki wody, kofaktory, ligandy i jony metali, aby wygenerować minimalny model. Ponadto wybierz opcję Usuń alternatywne zgodności z modelem (Rysunek uzupełniający 23).
  3. Wybierz Udoskonalenie w Phenix i otwórz ReadySet. Wprowadź edytowany plik współrzędnych pdb obok pliku PDB. Wybierz opcję Dodaj wodór do modelu, jeśli jest nieobecny, i wybierz H/D w miejscach wymiennych, H w innym miejscu z rozwijanego menu opcji uszlachetniania neutronów (rysunek uzupełniający 23).
2. Udoskonalenie struktury
  1. Otwórz program phenix.refine na karcie Udoskonalenie w Phenix. Na karcie Konfiguracja wprowadź plik PDB, który został przetworzony za pomocą ReadySet, w polu Pliki wejściowe. W polu Pliki wejściowe prześlij plik MTZ z danych neutronowych i przypisz go jako dane rentgenowskie i wolne od promieniowania rentgenowskiego w kolumnie Typ danych, mimo że są to dane neutronowe. Konfiguracja uściślania ustawiona w następnym kroku zostanie użyta do potraktowania pliku odbicia jako danych neutronowych. Grupa Przestrzeń i Etykiety danych zostaną automatycznie wypełnione po przekazaniu danych (Rysunek uzupełniający 24A).
  2. Na karcie Konfiguracja w ustawieniach uściślenia zachowaj standardową strategię uściślania. Zwiększ liczbę cykli do pięciu. W obszarze Inne opcje wybierz neutron z menu rozwijanego Tabela rozpraszania. Usuń zaznaczenie opcji Aktualizuj wody (Rysunek uzupełniający 24B).
  3. Wybierz Wszystkie parametry>Zaawansowane>Wodory. W nowym oknie wybierz opcję Indywidualny z menu rozwijanego Model uszlachetniania wodoru i wyłącz opcję Jazda siłowa adp (rysunek uzupełniający 20).
  4. Wybierz opcję Wszystkie parametry > Wyszukaj parametry. Wyszukaj słowo nuclear i wybierz opcję Użyj odległości jądrowych dla X-H/D (rysunek uzupełniający 20).
  5. Wybierz opcję Uruchamiaj, aby zainicjować uściślanie.
    UWAGA: Po wstępnym dopracowaniu, konieczne będzie wizualne sprawdzenie map SLD neutronów i ręczne zbudowanie modelu w Coot. Może być konieczne wstawienie ligandów/kofaktorów obecnych w modelu. Kolejne udoskonalenia będą wymagały niezbędnego pliku ograniczeń CIF dla wszystkich odpowiednich ligandów, które należy przesłać w zakładce Konfiguracja na stronie phenix.refine.
3. Modelarstwo
  1. Po udoskonaleniu w Phenix, kliknij Otwórz w Coot w zakładce Wyniki, aby wyświetlić mapy i strukturę neutronów SLD. Kliknij kartę Menedżer wyświetlania, a następnie w obszarze Mapy kliknij opcję Usuń mapę, aby usunąć mapy 2F_OF_CWT i F_OF_CWT (Rysunek uzupełniający 25). Kliknij Plik> Otwórz MTZ, mmCIF, fcf lub phs.... Wybierz bieżący folder uściślania i wybierz plik .mtz. Zarówno dla opcji Amplituda, jak i Fazy wybierz dane WT_no_fill 2F_OF_C z menu rozwijanego. Powtórz tę czynność, klikając na File > Open MTZ, mmCIF, fcf lub phs... i wybierz dane F_O_{F C}WT z menu rozwijanego zarówno dla opcji Amplituda, jak i Fazy. Otwórz Menedżera wyświetlania i przełącz na Przewiń dla mapy 2F_OF_CWT_no_fill, a następnie przewiń, aby zmniejszyć wartość rmsd danych WT_no_fill 2F_OF_Cdo 1,00 (Rysunek uzupełniający 25). Przełącz na przewijanie dla mapy F_OF_CWT i przewiń, aby zmniejszyć wartość rmsd danych F_OF_CWT do 3.00.
  2. Przeprowadź oględziny struktury białka, aby określić, czy model pasuje do mapy SLD neutronów.
  3. Jak opisano w ppkt 7.1.3.2, określić prawidłowe ułożenie i zajętość H/D pozostałości i grup z miejscami wymiennymi H/D. Dostosuj pozycje pozostałości za pomocą narzędzia Obróć translację i Edytuj kąty chi (Rysunek 6). W razie potrzeby można użyć Real Space Refine Zone. Napraw atomy D, które eksplodują od pozostałości, ręcznie za pomocą edytora tekstu, aby wstawić prawidłowe współrzędne atomów
    UWAGA: Strefa rafinacji w przestrzeni rzeczywistej nie jest zoptymalizowana pod kątem map neutronowych SLD w Coot i może powodować nieregularne długości wiązań dla atomów związanych z D, nazywane eksplodującymi pozostałościami (Rysunek Uzupełniający 26). Zaleca się ręczną edycję niezbędnych współrzędnych atomowych i unikanie korzystania ze strefy uściślania w przestrzeni rzeczywistej.
  4. Wstawianie i reorientacja cząsteczek wody zgodnie z gęstością neutronów. Aby dodać wodę w Coot, wybierz ikonę Umieść atom na wskaźniku i wybierz, aby wstawić cząsteczkę wody (Rysunek uzupełniający 27A). Coot domyślnie wstawi atom O w tej pozycji.
  5. Aby dodać atomy D do atomów O w wodach wstawionych do Coot, użyj Phenix. Otwórz menu Uściślanie i kliknij ReadySet. Obok opcji Opcje uszlachetniania neutronów zaznacz tylko opcję Dodaj deutery do cząsteczek rozpuszczalnika. Usuń zaznaczenie opcji Dodaj wodór do modelu, jeśli jest nieobecny (Rysunek uzupełniający 27B i Rysunek uzupełniający 27C).
    UWAGA: Budowanie modeli przy użyciu samych danych neutronowych różni się od budowania modelu wspólnej struktury rentgenowsko-neutronowej, ponieważ nie ma danych rentgenowskich, które mogłyby przyczynić się do doprecyzowania współrzędnych szkieletu i cięższych atomów. W ramach wspólnego udoskonalenia, mapa gęstości elektronów jest początkowo używana do określenia szkieletu białka i współrzędnych łańcucha bocznego. Model ten jest następnie wykorzystywany we wspólnym udoskonalaniu danych rentgenowskich/neutronowych, w którym orientacja i zajętość atomów H/D jest wyprowadzana z mapy neutronów SLD. W przypadku udoskonalania wyłącznie neutronów, cała struktura pochodzi z analizy map SLD neutronów, co wymaga zbudowania cząsteczek wody, szkieletu, łańcuchów bocznych i ligandów oprócz atomów H/D (Rysunek 6). Stosunek danych do parametrów jest niski w przypadku udoskonaleń w stosunku do samych danych neutronowych i należy zachować ostrożność, aby nie przesadzić z danymi.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane dyfrakcji neutronów na kryształach monooksygenazy litycznej polisacharydowej z Neurospora crassa (NcLPMO9D) zostały zebrane na IMAGINE w HFIR w temperaturze pokojowej i na MaNDi w SNS w warunkach kriogenicznych zgodnie z protokołem opisanym powyżej. Użyto kryształów uwodornionego białka wyhodowanego w buforze na bazie_H2O o objętości większej niż 0,1^mm3 (ilustracyjny przykład dużych kryształów pokazano na rysunku uzupełniającym 4 i kolejnych rysunkach). Kryształy zamontowano w kapilarach kwarcowych, a wymianę pary z buforem na bazie D₂O prowadzono przez trzy tygodnie przed zebraniem danych (Rysunek 4).

Zbieranie danych o temperaturze pokojowej zostało przeprowadzone na linii badawczej IMAGINE (Rysunek 1). Czterogodzinny test wiązki białej doprowadził do dyfrakcji o wysokiej rozdzielczości, co sugeruje, że kryształ miał odpowiedni rozmiar i jakość do zebrania pełnego zestawu danych. Oprócz dostarczenia wstępnych informacji na temat jakości dyfrakcyjnej kryształu, początkowa ekspozycja w szerokim paśmie przepustowym może być wykorzystana do indeksowania wzoru dyfrakcyjnego i wyznaczenia matrycy orientacji kryształu. Biorąc pod uwagę grupę przestrzenną P2₁ kryształu, wdrożono strategię zbierania danych składającą się z 18 klatek z czasem zbierania 20 godzin na klatkę. Podobnie jak w przypadku zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej, grupy przestrzeni o wyższej symetrii wymagają mniejszej liczby klatek (tj. mniejszego pokrycia kątowego) do zebrania pełnego zestawu danych. Dane zebrano w trybie quasi-Laue przy użyciu zakresu długości fal 2,8 – 4,0 A. Po zebraniu danych dane zostały zindeksowane, zintegrowane, przeskalowane i połączone, aby uzyskać plik SLD neutronów w formacie MTZ o rozdzielczości 2,14 A. Dane oceniono jako wystarczającą jakość zgodnie z podobnymi wytycznymi dotyczącymi analizy danych rentgenowskich, chociaż kompletność na poziomie 80% i CC_1/2 wynosząca co najmniej 0,3 zostały uznane za dopuszczalne, ponieważ dyfrakcja białek neutronowych jest techniką o ograniczonym strumieniu.

Po zebraniu danych dyfrakcji neutronów w temperaturze pokojowej, ten sam kryształ został użyty do zebrania zestawu danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej o rozdzielczości 1,90 A (Rysunek uzupełniający 13). Dane rentgenowskie wykorzystano do określenia pozycji "cięższych" atomów, w tym C,N,O i S. Struktura udoskonalona na podstawie samych danych rentgenowskich została następnie wykorzystana jako model wyjściowy do przeprowadzenia wspólnego udoskonalenia w stosunku do danych rentgenowskich i neutronowych. Phenix ReadySet został użyty do dodania atomów H w miejscach niewymiennych, atomów H i D w miejscach wymiennych oraz atomów D do cząsteczek wody w początkowym modelu rentgenowskim. Po przygotowaniu modelu przeprowadzono iteracyjne udoskonalenia w odniesieniu do obu zestawów danych (rysunek uzupełniający 19 i rysunek uzupełniający 20). Interaktywne budowanie modelu przeprowadzono w Coot poprzez wizualną inspekcję map gęstości w celu odpowiedniego zorientowania łańcuchów bocznych i cząsteczek wody (rysunek uzupełniający 22). Dane neutronowe wykorzystano przede wszystkim do określenia stanów protonacji i orientacji cząsteczek wody. Porównanie mapy gęstości elektronowej reszt, takich jak seryna i tryptofan, z odpowiadającą jej mapą SLD neutronów ilustruje informacje, które można uzyskać na temat stanów protonacji w miejscach wymiennych H/D z dyfrakcji białek neutronowych (Rysunek 7). Nakładka map SLD elektronów i neutronów dla cząsteczek wody wskazuje również, że podczas gdy interakcje wiązań wodorowych można wywnioskować z danych rentgenowskich, neutrony dostarczają jasnych informacji dotyczących orientacji tych wiązań wodorowych (Rysunek 8). Wygenerowano mapy neutronów SLD F_O-F _C w celu określenia stanów protonacji i orientacji H/D łańcuchów bocznych. Zilustrowano mapy neutronów SLD uzyskane dla reszt tyrozyny i treoniny, w których mapy neutronów F_o-F _C wyraźnie wskazują dodatnie piki oznaczające obecność H/D (Rysunek 9). Zebrane dane dyfrakcji neutronów dostarczyły również cennych informacji na temat wielu stanów protonacji, takich jak grupa -ND₃⁺ Lys (Rysunek 10). Statystyki udoskonalania (_praca R i_swoboda R) były ściśle monitorowane podczas optymalizacji modelu, aby zapobiec nadmiernemu dopasowaniu. Końcowe statystyki wykazały_pracę R promieniowania rentgenowskiego na poziomie 12,77% i_{wolną od} R na poziomie 18,21%, a_pracę R na poziomie neutronów na poziomie 14,48% i_{wolną od} R na poziomie 21,41% przy obecnych 389 cząsteczkach wody (rysunek uzupełniający 28).

Dane dotyczące temperatury kriogenicznej zostały zebrane na NcLPMO9D po wygrzewaniu askorbinianu w celu zmniejszenia miejsca aktywnego miedzi z Cu^II do Cu^I na linii badawczej MaNDi (Rysunek uzupełniający 2 i Rysunek uzupełniający 15)⁴⁵. Dane zebrano w trybie TOF Laue po teście dyfrakcji neutronów przy użyciu 4-godzinnej ekspozycji w celu sprawdzenia jakości dyfrakcji. Biorąc pod uwagę grupę przestrzenną kryształu, opracowano strategię zbierania danych składającą się z 18 klatek z dawką zbierania 80 kulombów na klatkę. Dane zebrano w trybie TOF-Laue w zakresie długości fal 2,0 – 4,0 A. Po zebraniu danych dane zostały zindeksowane, zintegrowane, przeskalowane i połączone, aby uzyskać plik odbicia w formacie MTZ w rozdzielczości 2,40 Å⁵¹^,⁵².

Po zebraniu danych, zestaw danych o dyfrakcji neutronów 2,40A został użyty do udoskonalenia danych dotyczących wyłącznie neutronów. Dane dotyczące neutronów zostały poddane fazie wymiany molekularnej przy użyciu PDB 5TKH jako modelu wyjściowego. Phenix ReadySet został użyty do dodania atomów H w miejscach niewymiennych i atomów H/D z częściowym zajęciem w miejscach wymiennych. Cząsteczki wody usunięto z modelu wyjściowego za pomocą narzędzi PDB (rysunek uzupełniający 23). Po przygotowaniu modelu nastąpiła udoskonalanie za pomocą phenix.refine przy użyciu tabeli rozpraszania neutronów (rysunek uzupełniający 24). Interaktywne budowanie modelu przeprowadzono w Coot, dodając cząsteczki wody przy użyciu dodatnich pików mapy F_O-F _c i ustawiając je zgodnie z potencjalnymi oddziaływaniami wiązań wodorowych (Rysunek 11A i Rysunek 11B). Analizując mapy neutronowe SLD, cząsteczki wody są wyraźnie widoczne, jeśli są wysoce uporządkowane, jednak ich gęstość może być sferyczna lub elipsoidalna, jeśli nie są dobrze uporządkowane (Rysunek 11C-E). Mapy neutronowe SLD zostały wykorzystane do dostarczenia cennych informacji na temat orientacji reszt, takich jak asparagina, w których rozróżnienie między grupami karbonylowymi i aminowymi może być trudne przy użyciu samych danych dyfrakcji rentgenowskiej (Rysunek 12A i Rysunek 12B). Piki w mapach pominięcia F_O-F _C neutronów SLD były również bardzo pouczające w określaniu stanów protonacji reszt histydyny w pozycji_ε N_δ lub N (Rysunek 12C i Rysunek 12D). Stan protonacji pozostałości z wieloma miejscami wymiennymi H/D można również określić za pomocą map neutronowych SLD. Zostało to wyraźnie zilustrowane mapą F_O-F _C neutronów SLD pomijających argininę, o której wiadomo, że ma ładunek dodatni (Rysunek 12E i Rysunek 12F). Podobnie jak poprzednio, nadmiernemu dopasowaniu zapobieżono poprzez monitorowanie_pracy języka R i_wolnego języka R. Końcowe statystyki dały_pracę R na poziomie 22,58% i_wolną od R na poziomie 30,84% (rysunek uzupełniający 29). Biorąc pod uwagę, że dyfrakcja białek neutronowych jest techniką ograniczoną strumieniem, w której należy wziąć pod uwagę ujemną długość rozpraszania i duży niekoherentny współczynnik rozpraszania H, można się spodziewać, że udoskonalenie danych tylko na neutronach miałoby gorsze statystyki niż połączone udoskonalenie danych rentgenowskich i neutronowych z mniejszą liczbą widocznych cząsteczek wody (Rysunek Uzupełniający 28 i Rysunek Uzupełniający 29).

Podczas analizy map SLD neutronów stanie się oczywiste, że zniesienie gęstości spowodowane ujemną długością rozpraszania neutronów H nastąpi dla uwodornionych białek, które zostały poddane wymianie pary z buforem krystalizacji D₂zawierającym O. Z tego powodu mapy neutronowe SLD, w których niewymienne atomy H są przyłączone do węgla, wydają się niekompletne w porównaniu z ich odpowiednikiem na mapie gęstości elektronów (Rysunek 13A). Efekt anulowania jest często bardziej widoczny przy gorszych rozdzielczościach, co sprawia, że konieczne jest uzyskanie kryształów białkowych o wysokiej jakości. Dlatego zaleca się przeprowadzenie wspólnego udoskonalania próbki za pomocą zarówno danych rentgenowskich, jak i neutronowych, w których dane rentgenowskie mogą być wykorzystane do określenia położenia szkieletu białkowego (Rysunek 13B). Co więcej, atomy siarki w cysteinie i metioninie mogą być słabo widoczne, co wymaga danych rentgenowskich do dokładnego rozmieszczenia atomów (Rysunek 13C i Rysunek 13D). Metale o słabych długościach rozpraszania neutronów mogą być również trudne do modelowania na mapach SLD neutronów, co widać na naszych mapach LPMO9D. Zebranie zestawu danych rentgenowskich o niskiej dawce (wolnego od uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem) na tym samym krysztale jest zatem przydatne, ponieważ pozwala na pozycjonowanie atomów metalu za pomocą map gęstości elektronów (Rysunek 13E i Rysunek 13F).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przepływu pracy w krystalografii białek neutronowych. Produkcja białka. Aby uzyskać strukturę neutronową, najpierw ulega ekspresji białka. Ekspresja bakteryjna w pożywkach na bazie_H2O- lub_D2Ojest zwykle stosowana do uzyskania wysokiej wydajności odpowiednio uwodornionego lub perdeuterowanego białka rekombinowanego. Białko jest oczyszczane w buforze na bazie_H2O, a następnie krystalizowane w buforze krystalizacyjnym na bazie_H2O- lub_D2O, aby wyhodować kryształy do minimalnej wielkości 0,1 mm³. Przygotowanie próbki: Przed zebraniem danych dyfrakcji neutronów, kryształy H₂O hodowane w O przechodzą wymianę H / D w celu wymiany białek dających się miareczkować atomów H z D. Wymiana H / D może odbywać się przez bezpośrednie zanurzenie kryształów w deuterowanym buforze krystalizacji, zrównoważenie kropli krystalizacji ze zbiornikiem na bazie D₂O lub przez zamontowanie kryształów w kapilarach kwarcowych w celu wymiany pary z deuterowanym buforem krystalizacyjnym. Zbieranie danych neutronowych: Po wymianie H/D kryształy potencjału są przesiewane w celu określenia jakości dyfrakcji. Kryształy o minimalnej rozdzielczości 2,5 A są uważane za odpowiednie do zebrania pełnego zestawu danych. Kryształy są montowane w kapilarnach kwarcowych w celu zbierania danych w temperaturze pokojowej lub zamrażane w pętli kriogenicznej w celu zbierania danych w temperaturze kriogenicznej. Zestaw danych rentgenowskich jest zbierany na tym samym (lub identycznym) krysztale w tej samej temperaturze. Budynek modelarski: Uszlachetnianie odbywa się za pomocą phenix.refine zarówno na podstawie danych neutronowych, jak i rentgenowskich lub tylko na podstawie danych neutronowych. Ręczne budowanie modelu struktury białka odbywa się w Coot z wykorzystaniem map neutronowych SLD. Pełna struktura: Po skompletowaniu struktury białka model współrzędnych jest weryfikowany i deponowany w Banku Danych Białkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zbieranie kryształów białka. (A) Kryształy są badane pod mikroskopem. (B) Otwiera się zapieczętowane pudełko kanapkowe zawierające silikonowaną płytkę szklaną. Bufor zbiornika jest pipetowany na szkiełka silikonowane. (C) Kryształ jest zbierany za pomocą mikropętli. (D) Kryształ umieszcza się w kropli ługu macierzystego, aby zmyć wszelkie zanieczyszczenia, które często są zbierane wraz z kryształem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przeniesienie kryształu do kapilary kwarcowej. (A) Koniec kapilary kwarcowej jest wypełniony buforem zbiornikowym. (B) Kryształ przenosi się do kapilary kwarcowej i (C) zanurza w buforze zbiornika. (D) Kryształ jest przenoszony w dół kapilary za pomocą bufora zbiornika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Uszczelnienie kapilary kwarcowej. (A) Deuterowany bufor jest dodawany na końcu kapilary w celu utworzenia "korka". (B) Wosk topi się za pomocą "różdżki". (C) Kapilarę umieszcza się w stopionym wosku w celu uszczelnienia. (D) Na obu końcach formowane są korki woskowinowe w celu uszczelnienia kapilary. (E) Kryształ po zamontowaniu. (F) Zapieczętowaną kapilarnę umieszcza się na szalce Petriego i utrzymuje na miejscu za pomocą kitu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zwiększony stosunek sygnału do szumu we wzorze dyfrakcji neutronów. W miarę postępu zbierania danych plamy dyfrakcyjne stają się bardziej intensywne. (UWAGA: prezentowane tutaj obrazy dyfrakcji na żywo mają charakter ilustracyjny i zostały wykonane z różnych kryształów.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Interaktywne budowanie modelu z wykorzystaniem danych neutronowych w Coot. (A) Dodatni pik gęstości SLD neutronów F_{O-F C} (zielony) wskazujący na serynę musi zostać przeorientowany przez edycję kątów chi. Mapa SLD neutronów 2F_O-F _C jest wyświetlana na fioletowo, a mapa gęstości elektronów 2F_OFA _C jest wyświetlana na niebiesko. (B) Prawidłowo umieszczona seryna. (C) Dodatnie i ujemne piki gęstości neutronów SLD F_{O-F C} (odpowiednio zielone i czerwone) wskazujące, że tryptofan musi być obracany/przekształcany, aby dopasować się do piku gęstości różnicy zdań. (D) Prawidłowo zorientowany tryptofan. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Dodatkowe informacje z map SLD neutronów. (A) Mapa gęstości elektronów 2F_O-F _C (niebieska) przedstawia położenie "cięższych" atomów w serynie. (B) Mapa SLD neutronów 2F_{O-F C} (fioletowa) wyraźnie pokazuje położenie "lżejszego" atomu D w serynie. (C) Mapa gęstości elektronów 2F_O-F _C (niebieska) pokazuje pozycje "cięższych" atomów w tryptofanie. (D) Mapa SLD neutronów 2F_{O-F C} (fioletowa) wyraźnie pokazuje położenie "lżejszego" atomu D w tryptofanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Umiejscowienie cząsteczek wody. (A) Kulisty kształt mapy gęstości elektronów 2F_{O-F C} (niebieski) dla wody. (B) Mapa SLD neutronów 2F_{O-F C} (fioletowa) dostarcza informacji o orientacji wody i oddziaływaniu wiązań wodorowych. (C) Nakładanie map elektronowych i neutronowych SLD wody. Mapa SLD neutronów 2F_O-F _C jest wyświetlana na fioletowo, a mapa gęstości elektronów 2F_OFA _C jest wyświetlana na niebiesko. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Neutrony SLD F _O-F C pomijają mapy. (A) Mapa F_O-F _C neutronów SLD (zielona) dostarcza jasnych informacji na temat orientacji H/D reszt tyrozyny. Mapa SLD neutronów 2F_O-F _C jest wyświetlana na fioletowo, a mapa gęstości elektronów 2F_OFA _C jest wyświetlana na niebiesko. (B) Pozostałość tyrozyny o prawidłowej orientacji H/D. (C) Mapa SLD NEUTRONÓW F_O-F _C (zielona) dostarcza jasnych informacji na temat orientacji H/D retonów treoniny. (D) Pozostałość treoniny o prawidłowej orientacji H/D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Wiele stanów protonacji wyświetlanych na mapach SLD neutronów. (A) Mapa gęstości elektronów 2F_O-F _C (niebieska) podaje tylko położenie atomu N grupy lizyny ε-amonowej. (B-E) Mapa pominięcia SLD NEUTRONÓW F_O-F _C (zielona) wyraźnie pokazuje dodatnio naładowaną grupę -NH₃. Mapa SLD neutronów 2F_O-F _C jest wyświetlana na fioletowo, a mapa gęstości elektronów 2F_OFA _C jest wyświetlana na niebiesko. (F) Nakładanie map gęstości elektronów i neutronów SLD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Pojawienie się cząsteczek wody na mapach neutronowych SLD. (A) Cząsteczki wody są rozmieszczone zgodnie z mapami F, O-FC, SLD neutronów (zielony) i potencjalnymi wiązaniami wodorowymi. Mapa SLD neutronów 2F_{O-F C} jest wyświetlana w kolorze fioletowym. (B) Prawidłowo ustawiona cząsteczka wody. (C-E) Różne kształty neutronów SLD odwzorowują cząsteczki wody w zależności od czynników B i oddziaływań wiązań wodorowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Informacje o orientacji aminokwasów i protonacji dostarczane przez mapy neutronów SLD. (A) Piki mapy neutronów SLD_{F O-F} _C (zielone) wskazują na nieprawidłową orientację reszty asparaginy. Mapa SLD neutronów 2F_O-F _C jest wyświetlana na fioletowo, a mapa gęstości elektronów 2F_OFA _C jest wyświetlana na niebiesko. (B) Mapa SLD neutronów 2F_{O-F C} (fioletowa) prawidłowej orientacji asparaginy. (C) Pik mapy neutronów SLD_{F O-F} _C (zielony) wskazuje na pojedyncze protonowanie histydyny w N_ε. (D) Mapa 2F_O-F _C neutronów SLD (fioletowa) histydyny N_ε -protonacji. (E) Neutrony SLD_{F O-F} _C pomijają piki mapy (kolor zielony) potwierdzają dodatni ładunek argininy. (F) Mapa 2F_O-F _C neutronów SLD (fioletowa) dodatnio naładowanej argininy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rysunek 13: Nieciągłe mapy SLD neutronów. (A) Mapa SLD neutronów 2F_{O-F C} (fioletowa) uwodornionego, parowego białka wymienianego H/D. Kwas glutaminowy wykazuje anulowanie mapy neutronów SLD ze względu na ujemną długość rozpraszania niewymiennych atomów H. (B) Nałożona mapa gęstości elektronów 2F_{O-F C} (niebieska) wyraźnie pokazuje gęstość kwasu glutaminowego. (C) Atom siarki w metioninie jest słabo widoczny na mapach SLD neutronów 2F_{O-F C} (fioletowy). (D) Nałożona na siebie mapa gęstości elektronów wyraźnie pokazuje gęstość metioniny. (E) Atomy metali, w tym przypadku miedzi, są słabo widoczne na mapach neutronów 2F_O-F _C SLD (fioletowych). (F) Nałożona na siebie mapa gęstości elektronów 2F_O-F _C (niebieska) wyraźnie pokazuje gęstość skoordynowanego atomu miedzi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. jezdnego TGL TGL pkt. ma pkt. pkt. pkt. propozycji pkt. pkt.

izotop	Długość rozpraszania koherentnego (fm)	Niekoherentna długość rozpraszania (fm)
1 godz	-3,741	Klasa 25 274
2 godz.	6,671	Norma 4.04
12C	Numer katalogowy: 6,6511	0
14N	Godzina 9,37	cyfra arabska
16O	5,803	0
23Nie	Rejon 3,63	Rejon 3,59
24 mg	Klasa 5,66	0
31P	Klasa 5.13	0,2
32S	2,804	0
35Cl	Godzina 11,65	6.1
39 tys.	3,74	1.4
40Ca	Rozdział 4.8	0
55 mln	-3,73	Pytanie 1,79
56Fe	9,94	0
63Cu	Godzina 6,43	0,22
64Zn	Norma 5,22	0

Tabela 1: Długości rozpraszania neutronów i niespójne wartości rozpraszania. Na podstawie Sears, 1992¹⁶.

Rysunek uzupełniający 1: Instrument IMAGINE w reaktorze izotopowym o wysokim strumieniu. (A) Instrument IMAGINE w hali przewodnika zimnych neutronów. (B) Próbka zamontowana w kapilarze kwarcowej przymocowanej kitem do goniometru. Stół próbki i detektora zamyka się, aby umieścić kryształ i cylindryczną płytkę obrazową w wiązce neutronów. Zmodyfikowano za zgodą Międzynarodowej Unii Krystalografii⁵³. Zdjęcia udostępnione za zgodą Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2: Instrument MaNDi w źródle neutronów spalacyjnych. (A) Układ detektorów kamer MaNDi Anger. Reprodukcja za zgodą Międzynarodowej Unii Krystalografii¹¹. (B) Ruchomy stolik na próbkę MaNDi. (C) Próbka zamontowana w kapilarze kwarcowej zamontowanej na goniometrze w MaNDi w celu zbierania danych dotyczących temperatury pokojowej. Zdjęcia udostępnione za zgodą Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 3: Struktura monooksygenazy polisacharydowej NcLPMO9D. Miejsce aktywne miedzi NcLPMO9D znajduje się na płaskiej powierzchni wiążącej polisacharydy. Miedź jest koordynowana przez dwie reszty histydyny w klasycznym "nawiasie histydyny", a także osiową resztę tyrozyny. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 4: Kryształ o wystarczającej objętości na tacy do krystalizacji kropli siedzącej. (A) Duże kryształy są hodowane w kroplach do siedzenia umieszczonych w 9-dołkowych płytkach ze szkła silikonowanego. (B i C) Kryształy są mierzone w celu identyfikacji tych o objętości > 0,1 mm³. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 5: Miernik pH ustawiony do odczytów buforu deuterowanego. Elektroda pH jest moczona w D₂O przed użyciem. NaOD i DCl służą do regulacji pH deuterowanych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 6: Wytyczne dotyczące montażu próbki MaNDi. Maksymalne wymiary kapilary kwarcowej i pozycji próbki do zbierania danych o temperaturze pokojowej.
Reprodukcja z: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 7: Usuwanie nadmiaru bufora. (A) Nadmiar buforu jest zasysany z kapilary kwarcowej za pomocą końcówek mikrokapilarnych. (B) Pozostały bufor usuwa się cienkim papierowym, aby całkowicie wysuszyć kapilarę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 8: Graficzny interfejs użytkownika do pozyskiwania danych. Okno wejściowe "Parametry eksperymentu" do zbierania danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 9: Graficzny interfejs użytkownika optyki. Wybór zakresu quasi-Laue do zbierania danych i monitorowania szybkości zliczania neutronów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 10: Gromadzenie danych w graficznym interfejsie użytkownika akwizycji danych. Czas naświetlania, liczba klatek i kąty zbierania danych są określone w zakładce "Collect". Zbieranie danych jest następnie inicjowane za pomocą polecenia "Rozpocznij skanowanie". Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 11: Wykryto i wyświetlono dyfrakcyjne neutrony. Pod koniec czasu naświetlania odczytywany jest czuły na neutrony detektor płytki obrazującej, a wzór dyfrakcyjny jest wyświetlany w graficznym interfejsie użytkownika akwizycji danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 12: Przetwarzanie danych po dyfrakcji neutronów. Ramki są indeksowane, integrowane, normalizowane i skalowane długości fali za pomocą Lauegen, Lscale i Scala w celu wygenerowania scalonego pliku odbicia po zebraniu danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 13: Zbieranie danych rentgenowskich. Domowy generator promieniowania rentgenowskiego z kwarcowym kryształem kapilarnym do zbierania danych o temperaturze pokojowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 14: Wytyczne montażowe do zbierania danych kriogenicznych MaNDi. Wymiary CrystalCaps i wysokość pinów do zbierania danych kriogenicznych w MaNDi.
Reprodukcja z: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 15: Błyskawiczne zamrażanie do zbierania danych z dyfrakcji krioneutronów. (A) Konfiguracja do namaczania kryształów, zbierania za pomocą mikropętli i zamrażania w ciekłym azocie przy użyciu pojemnika kompatybilnego z krio, takiego jak pianka Dewara. Zamontowany kryształ jest przenoszony bezpośrednio na goniometr kriogeniczny linii badawczej za pomocą wstępnie schłodzonych szczypiec do kriologów. (B) Pieczęć woskowa jest topiona w celu usunięcia kryształów. (C) Kryształ jest przepłukiwany do końca kapilary kwarcowej w celu zbioru. (D) Kryształ jest kolejno moczony w buforze askorbinianowym, a następnie w krioprotektantze, a następnie błyskawicznie zamrażany w ciekłym azocie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 16: Przykładowy interfejs wyrównania. Wyrównanie kryształów w wiązce neutronów, reprezentowanej przez niebieski krzyż, odbywa się przez centrowanie metodą wskazywania i klikania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 17: Graficzny interfejs użytkownika CSS do zbierania danych. Strategia gromadzenia danych, w tym dawki i kąty ekspozycji, są przesyłane do graficznego interfejsu użytkownika CSS. W miarę postępu zbierania danych, dyfrakowane neutrony wykryte przez detektor czasu rzeczywistego będą wyświetlane w górnym panelu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 18: Dopasowanie flag R-free w CCP4. Flagi wolne od R danych neutronowych są dopasowywane do flag wolnych od R danych rentgenowskich zebranych na tym samym lub identycznym krysztale w celu rozdrobnienia połączeń. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 19: Przygotowanie i doskonalenie struktury. (A) Narzędzie Phenix ReadySet służy do dodawania podwójnego obłożenia H/D w wymiennych lokalizacjach. (B) Zarówno dane neutronowe, jak i dane rentgenowskie są wykorzystywane do wspólnego udoskonalania, podczas gdy początkowy model wejściowy został udoskonalony na podstawie zestawu danych rentgenowskich zebranych na tym samym krysztale. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 20: Konfiguracja ustawień uściślania. Model uściślania, jak również odległości jądrowe są skonfigurowane do wspólnego udoskonalania danych rentgenowskich/neutronowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 21: Wybór danych do budowy modelu łyski. Plik wyjściowy phenix MTZ zawierający dane rentgenowskie i niewypełnione dane neutronowe jest otwierany w Coot w celu wygenerowania map SLD elektronów i neutronów w celu interaktywnego budowania modeli. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 22: Interaktywne budowanie modelu w Coot podczas wspólnego udoskonalania. (A) Dodatni i ujemny szczyt gęstości neutronów SLD F_{O-F C} (odpowiednio zielony i czerwony) wskazujący, że woda musi zostać przeorientowana przez rotację/translację. Mapa SLD neutronów 2F_O-F _C jest wyświetlana na fioletowo, a mapa gęstości elektronów 2F_OFA _C jest wyświetlana na niebiesko. (B) Prawidłowo umieszczona woda. (C) Dodatni pik mapy neutronów_{FL OC} _C (ZIELONY) wskazuje, że treonina musi zostać obrócona, aby dopasować się do piku gęstości różnicowej poprzez edycję kątów chi. (D) Prawidłowo zorientowana treonina. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 23: Przygotowanie struktury do udoskonalania danych tylko dla neutronów. Początkowy plik współrzędnych jest przygotowywany do udoskonalenia przez usunięcie atomów wody w PDBTools i dodanie podwójnego zajętości H/D w wymiennych miejscach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 24: Udoskonalanie danych neutronowych. (A) Dane neutronowe są przesyłane wraz z przygotowanym modelem początkowym. (B) Ustawienia do uściślania danych neutronowych korzystają z tabeli rozpraszania neutronów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 25: Wybór danych do budowy modelu łyski. Niewypełnione dane neutronowe są otwierane w Coot w celu interaktywnego budowania modelu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 26: Rzeczywiste udoskonalenie przestrzeni w Coot dla pozostałości deuterowanych. (A) Dodatnie i ujemne piki gęstości neutronów F_O-F _C SLD (odpowiednio zielone i czerwone) wskazujące, że reszta argininy musi zostać przesunięta, aby pasowała do piku gęstości F_O-F _C. Mapa SLD neutronów 2F_O-F _C jest wyświetlana na fioletowo, a mapa gęstości elektronów 2F_OFA _C jest wyświetlana na niebiesko. (B) Wykorzystanie funkcji Real Space Refine powoduje "eksplozję" atomów D z powodu braku bibliotek ograniczeń geometrii Coot. (C) Atomy D nie poruszają się wraz z pozostałymi atomami reszty. (D) Pozycje atomu D można ustalić ręcznie za pomocą edytora tekstu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 27: Dodawanie cząsteczek wody. (A) Cząsteczki wody mogą być ręcznie dodawane do dodatnich pików gęstości neutronów F_{O-F C} SLD (zielony). Wstawione cząsteczki wody będą początkowo reprezentowane przez atom O w łysce. (B) Phenix ReadySet służy do dodawania atomów D do atomów O dla cząsteczek wody. (C) Cząsteczka wody deuterowanej jest pomyślnie dodawana. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 28: Statystyki udoskonalenia. Końcowe statystyki udoskonalania danych po wspólnym udoskonaleniu promieniowania rentgenowskiego i neutronów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 29: Statystyki udoskonalenia. Końcowe statystyki udoskonalania danych po uściślaniu danych neutronowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia białek neutronowych jest bardzo czułą techniką badania stanów protonacji i orientacji cząsteczek wody w białkach. Informacje te rzucają światło na mechanizmy katalityczne białek, ponieważ zmiany w oddziaływaniach protonowania i wiązań wodorowych są często kluczowe dla chemii enzymów¹⁰. Krystalografia białek neutronowych, choć jest techniką informacyjną, obejmuje szereg czynników, które należy wziąć pod uwagę przed planowaniem przeprowadzenia eksperymentu dyfrakcji neutronów, a mianowicie:

Wymóg dużych kryształów białkowych do zbierania danych.
Właściwości rozpraszania wodoru i innych pierwiastków, takich jak jony metali.
Ograniczenia w oprogramowaniu do udoskonalania konstrukcji i budowania modeli podczas pracy z próbkami deuterowanymi.

Krystalografia białek neutronowych jest techniką o ograniczonym strumieniu. W przeciwieństwie do zestawów danych dyfrakcji rentgenowskiej, w przypadku zestawów danych neutronów oczekuje się wyższych współczynników R i niższej kompletności, redundancji i stosunku sygnału do szumu ze względu na nieodłączne ograniczenia techniki (ograniczony strumień, quasi-Laue, dłuższe fale). Zbieranie danych z pojedynczej klatki trwa zwykle od 12 do 18 godzin. Powodzenie eksperymentu w dużym stopniu zależy od wielkości i jakości próbki, przy czym kryształy o wielkości 0,1 mm³ często stanowią minimalny wymóg³. Dyfrakcja neutronów wymaga produkcji dużych ilości białka w celu wytworzenia kropli krystalizacji w zakresie od 10 do 800 μl. Minimalną objętość do wyhodowania wystarczająco dużych kryształów można oszacować za pomocą kalkulatora objętości, biorąc pod uwagę parametry kryształu i próbki (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Wzrost dużych kryształów najczęściej odbywa się przez dyfuzję pary³. Krystalizacja w wiszących kroplach pozwala na wzrost kryształów w dużych kroplach o pojemności od 10 do 25 μL, podczas gdy większe krople do ~ 50 μL można ustawić za pomocą dostępnego na rynku sprzętu do upuszczania w pozycji siedzącej^14,54. Silikonowane dziewięciodołkowe płytki szklane mogą być używane do ustawiania bardzo dużych kropli, o objętości do 800 μl. Te szklane talerze są umieszczane w "pudełkach kanapkowych" dostępnych na rynku w Hampton Research. Dalsze techniki krystalizacji obejmują krystalizację okresową, w której granica wielkości kropli jest podyktowana przez naczynie. Konfiguracja eksperymentu z krystalizacją wsadową może wynosić od mikrolitrów do^{mililitrów 55}. Krystalizację można również przeprowadzić przy użyciu techniki dializy, w której białko jest równoważone z osadem za pomocą membrany dializacyjnej lub przez przeciwdyfuzję wzdłuż gradientu stężenia strącającego lub przez porowaty czopek, taki jak agaroza^56,57. Wysiew to kolejna alternatywa dla uzyskania kryształów o pożądanej objętości. Mikro- i makrowysiewy są z powodzeniem stosowane do wzrostu dużych kryształów, w tym dużych kryształów NcLPMO9D⁴⁵. Pewna wiedza na temat diagramu faz białek, w tym wpływu temperatury na rozpuszczalność, pomaga w dużym wzroście kryształów.

Planując eksperyment dyfrakcji neutronów, niezbędna jest optymalizacja preparatu białka w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu podczas zbierania danych dyfrakcyjnych⁷. Aby obejść anulowanie gęstości i wysokie niekoherentne rozpraszanie powodowane przez atomy H, mapy neutronowego SLD można ulepszyć, wymieniając atomy H na jego izotop D, który ma dodatnią koherentną długość rozpraszania i niską niekoherentną długość rozpraszania. Aby to osiągnąć, przeprowadza się wymianę parową uwodornionego kryształu białka na zdeuterowany bufor krystalizacyjny. Zapewnia to wymianę H/D cząsteczek rozpuszczalnika i labilnych, dających się miareczkować atomów H^{białka 23}. Wymiana parowa odbywa się poprzez zamontowanie uwodornionego kryształu w kapilarze kwarcowej z deuterowanymi "korkami" buforowymi krystalizacji na bazie D₂O i stanowi skuteczną, delikatną technikę, która jest najczęściej stosowana 14,23,35. Wymiana może trwać kilka tygodni i najlepiej wymagać częstej wymiany zdeuterowanego bufora, aby zapewnić maksymalną wymianę H/D. Wymiana H/D może być również przeprowadzona poprzez bezpośrednie zanurzenie kryształu w deuterowanym buforze. Aby uniknąć narażenia kryształu na naprężenia spowodowane ekspozycją na D₂O, proces namaczania należy przeprowadzać stopniowo, stopniowo zwiększając stosunek D₂O: H₂O⁵⁸. Oprócz tego krystalizację uwodornionego białka można również przeprowadzić w deuterowanym buforze do wymiany H/D w labilnych miejscach H^22,59. Należy jednak zauważyć, że bufor na bazie D₂O ma wpływ na rozpuszczalność białek, co wymaga dalszego dostosowania znanych warunków na bazie_H2O ^3,59. Zaobserwowano również, że na bazie_{D 2}O prowadzą w niektórych przypadkach do mniejszych kryształów⁵⁹. Pełną wymianę miareczkowalnych i związanych z węglem atomów H na D można osiągnąć poprzez ekspresję białek w pożywkach deuterowanych w celu wytworzenia perdeuterowanej próbki²⁰. Otrzymane mapy SLD neutronów w perdeuterowanej próbce zostaną znacznie ulepszone, nie wyświetlając już zniesienia gęstości odpowiednika próbki uwodornionej. Jest to korzystne przy charakteryzowaniu H/D związanych w miejscach niewymiennych w białku lub kofaktorze. Jednak ekspresja białka perdeuterowanego jest zarówno kosztowna, jak i niska pod względem wydajności⁶⁰. Centrum Strukturalnej Biologii Molekularnej (CSMB) Oak Ridge National Laboratory (ORNL) oferuje urządzenie do deuteracji dla użytkowników chcących wygenerować perdeuterowaną próbkę (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Ekspresja perdeuterowana jest zwykle przeprowadzana w bioreaktorze w skali 1 l, co daje ~ 50 mg oczyszczonego białka⁶¹.

Po zebraniu danych dyfrakcji neutronów przeprowadzane jest udoskonalanie i interaktywne budowanie modelu. Udoskonalanie można uruchomić przy użyciu wielu pakietów oprogramowania, w tym phenix.refine, nCNS lub SHELXL 28,31,32,33^. Pakiet Phenix jest najczęściej używanym oprogramowaniem do udoskonalania danych dyfrakcji neutronów w połączeniu z Coot, który jest używany do ręcznego budowania modelu na podstawie map neutronów SLD³⁴. Chociaż zarówno Phenix, jak i Coot pozwalają na przetwarzanie danych dyfrakcji neutronów, mogą brakować im pewnych funkcji niezbędnych do przetwarzania idiosynkrazji związanych z danymi neutronowymi i próbkami deuterowanymi. Na przykład Coot nie zawiera optymalizacji geometrii dla pozostałości deuterowanych, co może prowadzić do komplikacji podczas budowania modelu, ponieważ funkcja "Real Space Refine" powoduje "eksplodowanie" pozostałości (Rysunek uzupełniający 26)⁶². Problem ten można rozwiązać, generując pliki utwierdzeń dla wszystkich pozostałości deuterowanych. Jest to jednak intensywny proces i takie biblioteki nie są obecnie publicznie dostępne. Podczas wprowadzania ulepszeń w Phenix, wymienne miejsca H/D zostaną początkowo ustawione na 0,50 obłożenia dla H i D. W miarę dokonywania udoskonaleń, zajętość H i D będzie udoskonalana zgodnie z mapami neutronów SLD. Podczas interaktywnego budowania modeli, mapy gęstości różnicowej F_o-F _c są bardzo pouczające w ocenie zajętości H/D. Mapy mogą być wykorzystane do określenia, które miejsca mają wysokie zapylenie D, co jest szczególnie pouczające w miejscu aktywnym, w którym stany protonacji są katalityczne⁶³. Niejednoznaczne sytuacje pojawiają się jednak, gdy zajętość H:D jest bliska 0,70:0,30, co skutkuje całkowitym anulowaniem sygnału na mapach neutronowych SLD⁶⁴. Należy również wziąć pod uwagę, że zbiory danych neutronowych quasi-Laue często mają kompletność około 80%, czyli niższą niż rutynowo obserwowana ≥ 98% dla danych dyfrakcji rentgenowskiej. Podczas rafinacji danych dyfrakcji neutronów w Phenix, brakujące obserwowane amplitudy (F_o) są zatem obliczane na podstawie modelu, aby uzupełnić listę odbić, wprowadzając w ten sposób odchylenie modelu. Aby uwzględnić to potencjalne odchylenie, mapy "no_fill" powinny być sprawdzane podczas budowania modeli interaktywnych, a nie mapy "wypełnione".

Użytkownicy mogą zdecydować się na wspólne udoskonalanie danych rentgenowskich i neutronowych swojej struktury lub udoskonalanie tylko danych neutronowych. Wizualizacja map SLD neutronów, szczególnie w niższej rozdzielczości, może początkowo być niepokojąca, szczególnie w przypadku uwodornionego białka, w którym H jest nadal obecne w miejscach niewymiennych pomimo wymiany parowej H/D. Powoduje to anulowanie map gęstości neutronów, co sprawia wrażenie map nieciągłych^65,66. Zebranie odpowiedniego zestawu danych rentgenowskich korzystnie uzupełnia te anulowania we wspólnym udoskonaleniu (Rysunek 13A i Rysunek 13B). Strategia udoskonalania stawów zazwyczaj polega na udoskonalaniu współrzędnych szkieletu białka w stosunku do danych rentgenowskich, podczas gdy dane dyfrakcji neutronów są wykorzystywane do doprecyzowania położenia i zajętości atomów H/D w miejscach wymiennych²⁸. Ponieważ wprowadzenie wspólnego obłożenia H/D w wymiennych lokalizacjach zwiększa liczbę dopracowywanych parametrów, wspólne udoskonalenie za pomocą danych rentgenowskich zwiększa również stosunek danych do parametrów. Wspólne udoskonalanie wymaga zebrania odpowiedniego zestawu danych rentgenowskich w tej samej temperaturze na tym samym krysztale lub krysztale wyhodowanym w tych samych warunkach. W przypadku danych dyfrakcji neutronów zbieranych w temperaturze pokojowej (300 K), odpowiedni zestaw danych dotyczących promieniowania rentgenowskiego powinien być zbierany w temperaturze pokojowej przy użyciu strategii zbierania danych o niskich dawkach w celu ograniczenia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Z kolei próbki perdeuterowane zapewniają ulepszone i ciągłe mapy SLD neutronów, ponieważ nie mają tej samej wielkości anulowania sygnału H/D. Jednak długość rozpraszania neutronów niektórych pierwiastków, w tym metali i siarki, sprawia, że są one słabo widoczne na mapach neutronów SLD, nawet jeśli białko zostało perdeuterowane (Rysunek 13C-F)¹⁸. Jeśli metal musi zostać scharakteryzowany, najlepiej jest wykorzystać dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego w wspólnym udoskonalaniu lub zastosować techniki spektroskopowe w celu uzupełnienia eksperymentów dyfrakcyjnych. Udoskonalanie danych tylko na neutronach jest często wykonywane, gdy zestaw danych neutronów ma wysoką rozdzielczość lub jeśli użyto białka perdeuterowanego. Ponadto, udoskonalanie danych tylko na neutronach jest szczególnie przydatne, jeśli badane jest białko bardzo wrażliwe na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, ponieważ struktura pochodząca z promieniowania rentgenowskiego może zawierać artefakty wywołane promieniowaniem. Jeżeli ma być przeprowadzone udoskonalanie wyłącznie danych neutronowych, należy upewnić się, czy odpowiedni zestaw danych neutronowych jest wystarczająco kompletny i rozdzielczy.

ORNL oferuje dwa urządzenia do zbierania danych dyfrakcji neutronów: linię badawczą IMAGINE w HFIR oraz linię MaNDi w SNS^36,67. Chociaż oba instrumenty zapewniają skuteczne metody zbierania danych dyfrakcji neutronów przy użyciu podobnych zasad, każdy instrument ma unikalne specyfikacje, które należy wziąć pod uwagę przy ubieganiu się o czas wiązki. IMAGINE zbiera dane quasi-Laue i jest zoptymalizowany pod kątem zbierania danych o temperaturze pokojowej na kryształach z komórkami elementarnymi do ~100 A. MaNDi może być używany do zbierania danych o temperaturze pokojowej i kriotemperaturze za pomocą zbierania TOF-Laue na kryształach z komórkami elementarnymi do ~ 300 A. Przed zebraniem pełnego zestawu danych na krysztale przeprowadza się test w celu oceny jakości uzyskanego wzoru dyfrakcyjnego, w którym kryształ jest wystawiony na działanie wiązki neutronów dla pojedynczej klatki. Jeśli kryształ jest odpowiedniej jakości, pełny zestaw danych dyfrakcji neutronów zostanie zebrany, zindeksowany, zintegrowany, przeskalowany i połączony w procesie analogicznym do przetwarzania danych rentgenowskich. IMAGINE wykorzystuje Lauegen i Lscale, a MaNDi wykorzystuje pakiet Mantid i wykorzystuje trójwymiarowe dopasowanie profili 48,50,51,68,69,70. Naukowcy, którzy staną się użytkownikami którejkolwiek z tych placówek, otrzymają zestaw danych w formacie MTZ lub HKL do dalszej analizy.

Dyfrakcja neutronów jest nieniszczącą, bardzo czułą techniką badania stanu protonowania i oddziaływań wiązań wodorowych makrocząsteczek biologicznych. Jest szczególnie przydatny w przypadku białek światłoczułych i metaloprotein. Przed przeprowadzeniem eksperymentu należy wziąć pod uwagę kilka kwestii dotyczących techniki, a także przetwarzania danych, jednak wynik daje wyniki, które mogą dać cenny wgląd w mechanizm katalityczny białka będącego przedmiotem zainteresowania. Krystalografia białek neutronowych uzupełnia badania obliczeniowe, strukturalne, biochemiczne i spektroskopowe, co czyni ją cennym narzędziem w zestawie technik stosowanych przez biologów do charakteryzowania makrocząsteczek biologicznych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z ekspresją, oczyszczaniem i krystalizacją białek przeprowadzono w Centrum Strukturalnej Biologii Molekularnej (CSMB), Instytucie Badań Biologicznych i Środowiskowych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych w Oak Ridge National Laboratory. Dane dyfrakcji neutronów zostały zebrane w BL-11B MaNDi w Spallation Neutron Source (SNS) w ORNL, które jest sponsorowane przez Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Autorzy dziękują Brendanowi Sullivanowi za pomoc w redukcji danych. Dane dyfrakcji rentgenowskiej zostały zebrane w obiektach Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej, które jest wspierane przez stan Karolina Północna. GCS dziękuje za wsparcie częściowo ze strony Narodowej Fundacji Badawczej (NRF), Republiki Południowej Afryki i programu Graduate Opportunities (GO!) w ORNL. FM potwierdza wsparcie ze strony USDA NIFA Hatch 211001.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chłonne punkty papierowe Rozmiar #30-#40, długość 60 mm	DiaDent/DiaVet	218-292
Wosk kapilarny	Hampton	HR4-328
CCP4		Wersja 7.0.077
Stożkowe probówki wirówkowe (15 ml)	Corning	CLS430790
stożkowe probówki wirówkowe (50 ml)	Corning	CLS430828
Coot		Wersja 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Kleszcze z zakrzywioną końcówką	Mitegen	TW-CTF-1
Roztwór chlorku deuteru, 35 % wag. w D2O, ≥ 99 atomów % D	Sigma-Aldrich	543047
Tlenek deuteru 99,9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Pętle MicroLoops o podwójnej grubości 1000 i mikro; m	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH-metr F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Pianka Dewars Standardowe naczynie 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Czterokolorowa glina montażowa	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, do biologii molekularnej, ≥ 99,5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
Dyfraktometr rentgenowski z anodą obrotową o wysokim strumieniu z detektorem EIGER 4M	Rigaku, Oxford Cryostream i Dectris	XtaLAB Synergy-R	Dyfraktometr rentgenowski Home source
Różdżka magnetyczna Straight	Mitegen	MR-1013198
Mikroloader, końcówka do napełniania Femtotips i innych mikrokapilar szklanych (tylko do użytku badawczego), 0,5 – 20 &mikro; L, 100 mm, jasnoszary, 192 szt. (2 stojaki i czasy; 96 szt.)	Eppendorf	930001007
Mikroprobówki o pojemności 1,5 ml	Eppendorf	Z606340
szalki Petriego z przezroczystą pokrywką Średnica 100 mm	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Wersja 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	MR-1013196
Objętość pipety 0,1-2,5 μ L	Eppendorf Research	Z683779
Pojemność pipety 100-1000 μ L	Eppendorf Research	Z683825
Pojemność pipety 10-100 μ L	Eppendorf Research	Z683809
Pojemność pipety 20-200 μ L	Eppendorf Research	Z683817
Poli(glikol etylenowy) BioXtra, średnia masa 3,350, proszek	Sigma-Aldrich	P4338
Kapilara kwarcowa, średnica wewnętrzna 1,00 mm, długość 80 mm	Hampton	HR6-146	Cienkościenny kapilarny
mikroskop badawczy	Olympus	SZX16
Podstawy goniometru wielokrotnego użytku B3 (SSRL/SAM Style)	Mitegen	GB-B3-R
Round - Miniaturowe rurki z pustego szkła (VitroTubes) Przezroczysty topiony kwarc / średnica wewnętrzna 1,00 mm, długość 100 mm	VitroCom	CV1012	Grubościenne kapilarne
pudełko na kanapki z pokrywą	Hampton	HR3-132
Silikonowana 9-dołkowa szklana płyta	Hampton	HR3-134
Płytka krystalizacyjna do siedzenia (24 duże dołybki)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Roztwór deuterotlenek sodu, 40 % wag. w D2O, 99 atomów % D	Sigma-Aldrich	176788
Grube silikonowane okrągłe szkiełka podstawowe (22 mm x 0,96 mm)	Hampton	HR3-247
Uniwersalne końcówki do pipet, 0,1 - 10 &mikro; L	VWR	76322-528
Uniwersalne końcówki do pipet, 1 - 100 &mikro; L	VWR	76322-136
Uniwersalne końcówki do pipet, 100 - 1000 &mikro; L	VWR	76322-154
Uniwersalne końcówki do pipet, 20 - 200 &mikro; L	VWR	76322-150
Uniwersalne końcówki do pipet, 1 - 20 i mikro; L	VWR	76322-134
Długopis woskowy	Hampton	HR4-342

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).">Neumann, P., Tittmann, K. Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).
Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).">Pynn, R. Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).
Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).">O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).">Niimura, N., Podjarny, A. Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).
Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).">Blakeley, M. P. P. Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).
Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).">Blakeley, M. P., Cianci, M., Helliwell, J. R., Rizkallah, P. J. Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).
Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).">Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).
New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).">Teixeira, S. C. M., et al. New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).
Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).">Furrer, A., Mesot, J., Strässle, T. Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).
The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).">Meilleur, F., Coates, L., Cuneo, M. J., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).
The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).">Coates, L., et al. The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).
The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).">Coates, L., Stoica, A. D., Hoffmann, C., Richards, J., Cooper, R. The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).
Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).">Koetzle, T. F., Piccoli, P. M. B., Schultz, A. J. Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).
Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).">Ng, J. D., et al. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).">Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).">Sears, V. F. Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).
Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).">Weik, M., Patzelt, H., Zaccai, G., Oesterhelt, D. Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).
Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).">Helliwell, J. R. Fundamentals of neutron crystallography in structural biology. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).">Niimura, N., Bau, R. Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).
High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).">Hazemann, I., et al. High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).
High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).">Niimura, N., Chatake, T., Ostermann, A., Kurihara, K., Tanaka, I. High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).
Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).">Meilleur, F., Contzen, J., Myles, D. A. A., Jung, C. Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).
On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).">Bennett, B. C., Gardberg, A. S., Blair, M. D., Dealwis, C. G. On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).
Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).">Meilleur, F., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. IMAGINE: The neutron protein crystallography beamline at the high flux isotope reactor. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802(2018).">Wang, X. P., et al. A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802(2018).
A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).">Wlodawer, A., Hendrickson, W. A. A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).
Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).">Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).">Adams, P. D., Mustyakimov, M., Afonine, P. V., Langan, P. Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).
The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).">Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).
Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).">Liebschner, D., Afonine, P. V., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).
Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).">Afonine, P. V., Mustyakimov, M., Grosse-Kunstleve, R. W., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).
Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).">Brünger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).
Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).">Gruene, T., Hahn, H. W., Luebben, A. V., Meilleur, F., Sheldrick, G. M. Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).
Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).">Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).">Lakey, J. H. Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).
IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).">Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).
Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).">Halsted, T. P., et al. Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).
Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).">Meier, K. K., et al. Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).
Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).">Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., Marletta, M. A. Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).
On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).">Walton, P. H., Davies, G. J. On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).
Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).">Bertini, L., et al. Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).
Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).">Hedegård, E. D., Ryde, U. Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).
Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).">Hangasky, J. A., Detomasi, T. C., Marletta, M. A. Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).
Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).">Bacik, J. P., et al. Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).
Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).">O'Dell, W. B., Agarwal, P. K., Meilleur, F. Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).
Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).">O'Dell, W. B., Swartz, P. D., Weiss, K. L., Meilleur, F. Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).
The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).">Meilleur, F., et al. The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).
The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).">Helliwell, J. R., et al. The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).
Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).">Nieh, Y. P., et al. Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).
LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).">Arzt, S., Campbell, J. W., Harding, M. M., Hao, Q., Helliwell, J. R. LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).
Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).">Sullivan, B., et al. Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).
BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).">Sullivan, B., et al. BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).
IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).">Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).
Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).">Blum, M. M., et al. Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).
Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).">Tomanicek, S. J., et al. Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).
The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).">Metcalfe, C., et al. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).
Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).">Hughes, R. C., et al. Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).
Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).">Bennett, B. C., Meilleur, F., Myles, D. A. A., Howell, E. E., Dealwis, C. G. Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).
Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).">Snell, E. H., et al. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).">Golden, E., Attwood, P. V., Duff, A. P., Meilleur, F., Vrielink, A. Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).
Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).">Munshi, P., et al. Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).
Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).">Logan, D. T. Interactive model building in neutron macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).">Koruza, K., Lafumat, B., Végvári,, Knecht, W., Fisher, S. Z. Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).
Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).">Fisher, S. J., et al. Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).
Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).">Chen, J. C. H., Hanson, B. L., Fisher, S. Z., Langan, P., Kovalevsky, aY. Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).
Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).">Cuypers, M. G., et al. Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).
Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).">Coates, L., Sullivan, B. The macromolecular neutron diffractometer at the spallation neutron source. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).">Ren, Z., Kingman, N. G., Borgstahl, G. E. O., Getzoff, E. D., Moffat, K. Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).
LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).">Campbell, J. W., Hao, Q., Harding, M. M., Nguti, N. D., Wilkinson, C. LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).
Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).">Arnold, O., et al. Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles