Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu szczelinowania hydraulicznego na strumienie przy użyciu mikrobiologicznych sygnatur molekularnych

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61904

⸱

4 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Juniata College, 2Wright Labs, LLC, 3Department of Biological Sciences, Michigan Technological University, 4Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 5Department of Civil and Environmental Engineering, University of Tennessee

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu szczelinowania hydraulicznego na pobliskie strumienie, analizując ich wodne i osadowe zbiorowiska mikroorganizmów.

Streszczenie

Szczelinowanie hydrauliczne (HF), powszechnie nazywane "szczelinowaniem", wykorzystuje mieszaninę wody pod wysokim ciśnieniem, piasku i chemikaliów do rozłupywania skał, uwalniając ropę i gaz. Proces ten zrewolucjonizował amerykański przemysł energetyczny, ponieważ daje dostęp do zasobów, które wcześniej były nieosiągalne, a obecnie produkuje dwie trzecie całkowitego gazu ziemnego w Stanach Zjednoczonych. Chociaż szczelinowanie miało pozytywny wpływ na gospodarkę USA, kilka badań podkreśliło jego szkodliwy wpływ na środowisko. Szczególne zaniepokojenie budzi wpływ szczelinowania hydraulicznego na strumienie górne, które są szczególnie ważne ze względu na ich nieproporcjonalnie duży wpływ na zdrowie całego działu wodnego. Bakterie w tych strumieniach mogą być wykorzystywane jako wskaźniki zdrowia strumienia, ponieważ oczekuje się, że obecne bakterie i ich liczebność w zakłóconym strumieniu będą się różnić od tych w innym porównywalnym, ale niezakłóconym strumieniu. W związku z tym protokół ten ma na celu wykorzystanie społeczności bakteryjnej do określenia, czy szczelinowanie wpłynęło na strumienie. W tym celu należy pobrać próbki osadów i wody ze strumieni w pobliżu szczelinowania hydraulicznego (potencjalnie dotkniętych) i znajdujących się w górę rzeki lub w innym dziale wodnym działalności szczelinowania (niedotkniętych). Próbki te są następnie poddawane ekstrakcji kwasów nukleinowych, przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu w celu zbadania składu społeczności drobnoustrojów. Analiza korelacyjna i modele uczenia maszynowego mogą być następnie wykorzystane do określenia, które cechy wyjaśniają zmienność w społeczności, a także do identyfikacji predykcyjnych biomarkerów wpływu szczelinowania. Metody te mogą ujawnić szereg różnic w zbiorowiskach mikrobiologicznych między strumieniami górnymi, w oparciu o bliskość szczelinowania hydraulicznego i służyć jako podstawa do przyszłych badań nad wpływem szczelinowania na środowisko.

Wprowadzenie

Szczelinowanie hydrauliczne (HF), lub "fracking", to metoda wydobycia gazu ziemnego, która staje się coraz bardziej powszechna wraz ze wzrostem popytu na paliwa kopalne. Technika ta polega na użyciu sprzętu wiertniczego o dużej mocy do wstrzykiwania mieszanki wody, piasku i chemikaliów do bogatych w metan złóż łupkowych, zwykle w celu uwolnienia uwięzionych gazów1.

Ponieważ te niekonwencjonalne techniki pozyskiwania drewna są stosunkowo nowe, ważne jest zbadanie wpływu takich praktyk na pobliskie drogi wodne. Działania związane ze szczelinowaniem wymagają oczyszczenia dużych połaci ziemi pod transport sprzętu i budowę studni. Około 1,2-1,7 hektara ziemi musi zostać oczyszczone dla każdej podkładki studni2, co może mieć wpływ na spływ i jakość wody w systemie3. Brakuje przejrzystości co do dokładnego składu chemicznego płynu szczelinującego, w tym tego, jakie biocydy są używane. Dodatkowo, ścieki ze szczelinowania są zwykle bardzo zasolone2. Ponadto ścieki mogą zawierać metale i naturalnie występujące substancje radioaktywne2. Dlatego możliwość wycieków i rozlania płynu szczelinującego z powodu błędu ludzkiego lub nieprawidłowego działania sprzętu jest niepokojąca.

Ekosystemy strumieniowe są znane z tego, że są bardzo wrażliwe na zmiany w otaczających krajobrazach4 i są ważne dla utrzymania różnorodności biologicznej5 i prawidłowego obiegu składników odżywczych6 w całym zlewni. Mikroorganizmy są najliczniejszymi organizmami w strumieniach słodkowodnych, a zatem są niezbędne do obiegu składników odżywczych, biodegradacji i produkcji pierwotnej. Skład i funkcja społeczności mikrobiologicznej służą jako doskonałe narzędzia do pozyskiwania informacji o ekosystemie ze względu na ich wrażliwość na perurbance, a ostatnie badania wykazały wyraźne zmiany w obserwowanych zbiorowiskach bakteryjnych w oparciu o bliskość aktywności szczelinowania7,8. Na przykład Beijerinckia, Burkholderia i Methanobacterium zostały zidentyfikowane jako wzbogacone w strumieniach w pobliżu szczelinowania, podczas gdy Pseudonocardia, Nitrospira i Rhodobacter zostały wzbogacone w strumieniach nie w pobliżu szczelinowania7.

Sekwencjonowanie nowej generacji genu rybosomalnego RNA (rRNA) 16S to przystępna metoda określania składu społeczności bakteryjnej, która jest szybsza i tańsza niż metody sekwencjonowania całego genomu9. Powszechną praktyką w dziedzinie ekologii molekularnej jest wykorzystanie wysoce zmiennego regionu V4 genu 16S rRNA do rozdzielczości sekwencjonowania, często aż do poziomu rodzaju z szerokim zakresem identyfikacji9, ponieważ jest to idealne rozwiązanie dla nieprzewidywalnych próbek środowiskowych. Technika ta została szeroko zastosowana w opublikowanych badaniach i została z powodzeniem wykorzystana do identyfikacji wpływu operacji szczelinowania na środowisko wodne7,8. Warto jednak zauważyć, że bakterie mają różną liczbę kopii genu 16S rRNA, co wpływa na wykrywane przez nie liczebności10. Istnieje kilka narzędzi, które to wyjaśniają, ale ich skuteczność jest wątpliwa10. Inną praktyką, która szybko zyskuje na popularności i nie ma tej słabości, jest sekwencjonowanie metatranskryptomiczne, w którym sekwencjonowane jest całe RNA, co pozwala naukowcom zidentyfikować zarówno aktywne bakterie, jak i ekspresję ich genów.

Dlatego, w przeciwieństwie do metod z poprzednio opublikowanych badań7,8,11,12, ten protokół obejmuje również pobieranie, przechowywanie, przetwarzanie i analizę próbek w celu zbadania funkcji społeczności drobnoustrojów (metatranskryptomiki). Kroki opisane w niniejszym dokumencie pozwalają naukowcom zobaczyć, jaki wpływ, jeśli w ogóle, miało szczelinowanie hydrauliczne na geny i szlaki wyrażane przez drobnoustroje w ich strumieniach, w tym geny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Co więcej, poprawiono poziom szczegółowości prezentowany przy pobieraniu próbek. Chociaż kilka kroków i notatek może wydawać się oczywistych dla doświadczonych badaczy, mogą być one nieocenione dla tych, którzy dopiero rozpoczynają badania.

Tutaj opisujemy metody pobierania i przetwarzania próbek w celu generowania danych genetycznych bakterii jako sposób na zbadanie wpływu szczelinowania hydraulicznego na pobliskie strumienie, opierając się na kilkuletnim doświadczeniu naszych laboratoriów. Dane te mogą być wykorzystane w dalszych zastosowaniach do identyfikacji różnic odpowiadających statusowi szczelinowania.

Protokół

1. Pobieranie próbek osadów do ekstrakcji kwasów nukleinowych

  1. Zanurz sterylną stożkową rurkę o pojemności 50 ml w strumieniu wody. Podczas pobierania próbek należy nosić rękawiczki, aby uniknąć wprowadzenia niepożądanego zanieczyszczenia przez ludzi. Wykonaj ten krok z brzegu lub skierowany w górę rzeki, jeśli jesteś w wodzie.
  2. Gdy stożkowa rurka jest zanurzona, zdejmij nakrętkę i użyj jej do nabrania około 3 ml osadu z głębokości od 1 do 3 cm do stożkowej rurki.
  3. Wyjmij stożkową rurkę z wody i wylej całą wodę, z wyjątkiem cienkiej warstwy pokrywającej próbkę osadu (około 1 ml).
  4. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i odpowiednich końcówek do pipet dodać 3 ml środka konserwującego DNA/RNA (specyfikacja środka konserwującego znajduje się w Tabeli materiałów) do pobranej próbki. Końcówki do pipet należy przechowywać w sterylnym pudełku na końcówki do pipet i zakładać je wyłącznie bezpośrednio przed użyciem i wyrzucać po użyciu. Odwróć zakręconą stożkową rurkę 10 razy, aby upewnić się, że środek konserwujący i próbka są dokładnie wymieszane.
    UWAGA Krok 1.4 nie jest konieczny, ale jest zdecydowanie zalecany, jeśli RNA ma być później ekstrahowane z osadów.
  5. Umieść próbki na lodzie do końca pobierania próbek. Po powrocie z pobrania przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C, jeśli próbki mają być użyte do analizy 16S (DNA) lub -70 °C, jeśli mają być wykorzystane do analizy metatranskryptomicznej (RNA).

2. Kolekcja filtrów do ekstrakcji kwasów nukleinowych

  1. Zdjąć nakrętkę ze sterylnej butelki o pojemności 1 l. Stojąc w górę rzeki lub od brzegu, napełnij butelkę wodą ze strumienia do góry, a następnie wylej ją. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, aby kondycjonować butelkę. Napełnij całą butelkę po raz czwarty i zakręć ją.
    UWAGA: W przypadku ponownego użycia butelki o pojemności 1 litra można ją wysterylizować, spłukując 10% wybielaczem przez 2 minuty, następnie trzykrotnie spłukując wodą dejonizowaną, a następnie raz 70% etanolem, a na koniec autoklawowanie z ustawieniami: 30 min czasu ekspozycji w temperaturze 121,1 °C i 15 min czasu schnięcia. Podczas autoklawowania nakrętka na butelce powinna być bardzo luźna, aby uniknąć ściśnięcia butelki w tym procesie.
  2. Po znalezieniu się na stabilnej powierzchni użyj sterylnej strzykawki typu Luer Lock i nabierz pełną objętość. Następnie podłącz strzykawkę do sterylnego i wolnego od DNA/RNA filtra polieterosulfonowego o średnicy 1,7 cm i wielkości porów 0,22 μm i przepchnij całą objętość przez filtr, naciskając tłok do końca. Powtarzaj ten proces, aż całkowita objętość zebrana w butelce (1 l) zostanie przepchnięta przez filtr.
    UWAGA: Objętość strzykawki może być zmienna, jeśli śledzona jest całkowita ilość wody przepychanej przez filtr. Jednak ogólnie rzecz biorąc, preferowane jest 60 ml. Podczas gdy 1 l jest idealny, anegdotycznie objętość co najmniej 200 ml prawdopodobnie nadal zbierałaby wystarczającą ilość biomasy (zakładając ~ 20 000 komórek na ml) do ekstrakcji DNA i RNA.
  3. Usunąć nadmiar wody z filtra, pobierając około 20 ml powietrza do strzykawki i przepychając je przez filtr.
    UWAGA: Pomoże to zapobiec utracie konserwantu, jeśli zostanie wykonany krok 2.4.
  4. Za pomocą mikropipety P1000 dodaj 2 ml środka konserwującego DNA/RNA, wypuszczając go przez większy otwór filtra (w miejscu, w którym był przymocowany do strzykawki), trzymając filtr poziomo. Końcówka pipety powinna znajdować się w cylindrze filtra, gdy pipeta jest wciśnięta, aby zapewnić, że środek konserwujący dostanie się do filtra. Wymieniaj końcówkę po każdym użyciu.
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku zbierania osadów, ten krok nie jest konieczny, ale jest zdecydowanie zalecany w celu późniejszego zwiększenia wydajności kwasów nukleinowych, szczególnie w przypadku RNA.
  5. Oderwij jeden kwadrat folii parafinowej i owiń go szczelnie wokół każdego otworu/końca filtra, aby uszczelnić. Umieść filtr owinięty folią parafinową w sterylnej torbie na próbki, a następnie umieść cały worek na lodzie podczas pobierania.
    UWAGA: Upewnij się, że strona użyta do owinięcia filtra jest sterylna, tj. nie była wcześniej narażona na działanie środowiska.
  6. Po powrocie z pobierania próbek przechowywać filtry w temperaturze -20 °C dla 16S lub -70 °C dla metatranskryptomiki.

3. Ekstrakcja i kwantyfikacja kwasów nukleinowych

  1. Oczyść obszar roboczy 10% wybielaczem i 70% etanolem przed rozpoczęciem przenoszenia próbki.
  2. W przypadku osadu (od kroku 1.5) zwykle używa się ~0,25 g próbki. Wysterylizuj metalowe narzędzie płomieniem, zanurzając je w zlewce z 70% etanolem i spalając etanol między próbkami.
  3. W przypadku filtrów (od kroku 2.6) przenieś bibułę filtracyjną do sterylnej probówki w celu ekstrakcji. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Stwórz sterylną, wolną od DNA i RNA powierzchnię, składając folię aluminiową tak, aby wewnętrzna część fałdy nie była narażona na działanie środowiska zewnętrznego i autoklawując złożony element z ustawieniami: 121,1 °C i 5 minutowym czasem schnięcia.
    2. Wysterylizuj uchwyt imadła 70% etanolem i otwartym ogniem. Następnie za pomocą imadła otwórz obudowę filtra na sterylnej powierzchni i wyjmij rdzeń z obudowy.
    3. Użyj sterylnego skalpela, aby odciąć bibułę filtracyjną od rdzenia, krojąc na górze i na dole, a następnie wzdłuż szwu. Złóż bibułę filtracyjną za pomocą sterylnej pęsety, a następnie pokrój filtr na małe kawałki za pomocą skalpela.
    4. Umieść kawałki filtra w probówce mikrowirówkowej w celu ekstrakcji. Upewnij się, że bibuła filtracyjna nie styka się z żadnymi powierzchniami, które nie są sterylizowane lub które mogą zawierać kwas nukleinowy, ponieważ doprowadziłoby to do niepożądanego zanieczyszczenia próbki.
  4. Wykonaj izolację DNA zgodnie z wcześniejszym opisem13 lub korzystając z dostępnego na rynku zestawu opartego na kolumnach (patrz Tabela materiałów). Kroki dla wymienionego zestawu komercyjnego są pokrótce opisane poniżej.
    1. Poddać lizie komórki w próbce, przenosząc ją do probówki perełkowej i poddając działaniu urządzenia rozbijającego komórki z dużą prędkością przez co najmniej 5 minut. Odwirować i przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki.
    2. Dodać bufor do lizy do supernatantu (objętość 1:1) i przenieść do dostarczonego filtra (żółty). Odwirować filtr.
    3. Przenieś filtr do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Dodać bufor przygotowawczy (400 μl), odwirować i odrzucić przepływ.
    4. Dodać bufor płuczący (700 μl), odwirować i odlać przepływ. Następnie dodać bufor płuczący (400 μl), odwirować i ponownie wylać przepływ.
    5. Przenieś filtr do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Eluować 50 μl wody wolnej od DNaz/RNaz i odstawić na 5 minut w temperaturze pokojowej przed odwirowaniem.
    6. W tym okresie kubacji należy przygotować filtr III-HRC, umieszczając go w probówce zbiorczej i dodając do niego roztwór przygotowawczy HRC (600 μl), a następnie przeprowadzić etap wirowania trwający 3 minuty przy 8 000 x g.
    7. Przenieś przygotowany filtr na sterylną probówkę do mikrowirówki. Przenieść wymyte DNA z kroku 3.4.5 do tego filtra i odwirować przy 16 000 x g przez 3 minuty. Przepływ zawiera wyekstrahowane DNA.
  5. Ekstrakty DNA zarówno do osadów, jak i filtrów należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Ekstrakty DNA mogą być przechowywane przez około 8 lat w temperaturze -20 °C przy założeniu stabilnej temperatury, ograniczonej ekspozycji na światło i braku szkodliwych zanieczyszczeń14.
  6. Wykonaj izolację RNA zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    1. Poddać lizie komórki w próbce, przenosząc ją do rurki z kulkami i poddając działaniu urządzenia zakłócającego tworzenie komórek z dużą prędkością przez co najmniej pięć minut. Odwirować i przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki.
    2. Dodać bufor do lizy do supernatantu (objętość 1:1) i przenieść do przewidzianej kolumny (żółta). Odwirować kolumnę.
    3. Dodaj równą objętość 95-100% etanolu do przepływającego i wymieszaj, pipetując pięć razy w górę i w dół.
    4. Umieść kolumnę IICG (zieloną) na sterylnej probówce do mikrowirówki. Przenieś zmieszany roztwór do kolumny i odwiruj.
    5. Dodać bufor do płukania (400 μl), odwirować i odlać przepływ.
    6. Dodać 5 μl DNazy I i 75 μl buforu do wytrawiania DNA do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    7. Dodać bufor przygotowawczy (400 μl), odwirować i odrzucić przepływ.
    8. Dodać bufor płuczący (700 μl), odwirować i odlać przepływ. Następnie dodać bufor płuczący (400 μl), odwirować i ponownie wylać przepływ.
    9. Przenieść kolumnę do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Eluować 50 μl wody wolnej od DNaz/RNaz i odstawić na 5 minut przed odwirowaniem.
    10. Podczas tego okresu inkubacji należy przygotować filtr III-HRC, umieszczając go w probówce zbiorczej i dodając do niej roztwór przygotowawczy HRC (600 μl), a następnie przeprowadzić etap wirowania trwający 3 minuty przy 8 000 x g.
    11. Przenieś przygotowany filtr na sterylną probówkę do mikrowirówki. Przenieść wymyty RNA z kroku 3.6.9 do tego filtra i odwirować przy 16 000 x g przez 3 minuty. Przepływ zawiera wyekstrahowany RNA.
      UWAGA: Ekstrakty RNA mogą być przechowywane tylko przez rok, zanim zaczną ulegać degradacji15. Zarówno ekstrakty DNA, jak i RNA ulegają degradacji przez wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie. Niektóre protokoły pozwalają na ekstrakcję zarówno DNA, jak i RNA z tej samej próbki16,17.
  7. Określić ilościowo wyekstrahowane próbki DNA i RNA za pomocą fluorometru lub spektrofotometru. Patrz tabela 1, aby zapoznać się z przykładowymi wartościami stężenia DNA fluorometru. Przykładowy protokół kwantyfikacji spektrofotometru można znaleźć w reference18. Wartości stężenia DNA w osadzie z zestawem wymienionym w Tabeli materiałów zwykle wahają się od 1 do 40 ng / μL, podczas gdy wartości stężenia DNA filtra wahają się od 0,5 do 10 ng / μL. Wartości stężenia RNA osadu z zestawem wymienionym w Tabeli materiałów zwykle wahają się od około 1 do 20 ng / μL, podczas gdy wartości stężenia RNA w filtrze są zwykle niższe, zwykle w zakresie od 0,5 do 5 ng/μl.

4. Tworzenie biblioteki 16S rRNA

  1. Oczyść miejsce pracy 10% wybielaczem i 70% etanolem. Obszar roboczy powinien być zamkniętą przestrzenią zdolną do wytwarzania warunków przepływu laminarnego (okap z przepływem laminarnym).
  2. Użyj ekstraktów DNA (z kroku 3.5) i przygotuj próbki do sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA za pomocą standardowego protokołu PCR, takiego jak ten opisany na stronie internetowej Earth Microbiome, który amplifikuje hiperzmienny region V4 16S rRNA19 w warunkach przepływu laminarnego.
  3. Przygotuj 2% żel agarozowy, jak opisano wcześniej, i pozwól mu zastygnąć17. Wymieszaj 7 μl produktu PCR i 13 μl wody wolnej od DNaz. Dodaj barwnik w żelu do końcowego stężenia 1x. Po zestaleniu się agarozy załaduj tę mieszankę produktów PCR na 2% żel agarozowy.
    UWAGA: Alternatywnie można zamiast tego użyć żelu do prefabrykatów, ponieważ żele te działają szybciej i są gotowe do spożycia.
  4. Uruchom żel pod napięciem 90 V przez 60-90 minut, aby sprawdzić, czy rozmiar pasma wynosi 386 jako udana amplifikacja amplikonów 16S rRNA V4, przy użyciu protokołu Mikrobiomu Ziemi.

5. Oczyszczanie biblioteki rRNA DNA 16S

  1. Zebrać 10 μl produktów PCR dla próbek, które dały jasne prążki i 13 μl dla próbek, które dały słabe prążki, w sterylnej probówce do mikrowirówek o odpowiedniej wielkości.
  2. Sprawdź stężenie powstałej puli za pomocą fluorometru lub spektrofotometru i przygotuj 2% żel agarozowy jak poprzednio. Idealnie byłoby, gdyby w puli stężenie wynosiło co najmniej 10 ng/μl, a w większości próbek stężenie wynosiło około 25 ng/μl.
  3. Jeśli pozwala na to stężenie i objętość, załaduj około 150-200 ng do studzienki z 2% żelem agarozowym.
  4. Uruchom żel na 60-90 minut przy napięciu 90 woltów.
  5. Oczyść bibliotekę w puli, uruchamiając 2% żel agarozowy.
    1. Usuń pasmo DNA o długości 386 pz z żelu i oczyść bibliotekę puli za pomocą dostępnego na rynku zestawu, jak opisano wcześniej20. Eluować oczyszczone DNA za pomocą 30 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8,5). Wykonaj ten krok w innym obszarze niż ekstrakcja DNA lub RNA, aby zapobiec przyszłemu zanieczyszczeniu, ponieważ przecięcie żelu spowoduje rozprzestrzenienie amplikonów PCR zarówno na eksperymentatora, jak i na jego otoczenie.
  6. Sprawdzić stężenie w oczyszczonej puli za pomocą fluorometru lub spektrofotometru. Jeśli oczyszczanie przebiegło pomyślnie, jego stężenie powinno wynosić co najmniej połowę stężenia w nieoczyszczonej puli. Generalnie końcowe stężenie powinno wynosić od 5 do 20 ng/μL.
  7. Wyślij oczyszczone biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji. Upewnij się, że są one utrzymywane w chłodzie podczas transportu, umieszczając suchy lód w pojemniku transportowym.

6. Tworzenie i oczyszczanie biblioteki RNA

  1. Do tworzenia bibliotek RNA można wykorzystać kilka komercyjnych zestawów. Niezależnie od tego, który z nich jest używany, postępuj zgodnie z protokołem producenta napisanym podczas pracy w sterylnym środowisku przepływu laminarnego. Bardzo skrócona wersja protokołu dla zestawu w Tabeli Materiałów jest przedstawiona poniżej21.
    1. Wykonać główną mieszankę syntezy cDNA pierwszej nici (8 μl wody wolnej od nukleaz i 2 μl mieszanki Enyzme do syntezy pierwszej nici) i dodać ją do próbki. Umieścić próbkę w termocyklerze w warunkach określonych w protokole.
    2. Przygotować główną mieszaninę syntezy cDNA drugiej nici (8 μl buforu reakcyjnego syntezy drugiej nici, 4 μl mieszanki enzymów syntezy drugiej nici i 48 μl wody wolnej od nukleaz) na lodzie i dodać ją do próbki. Umieścić w termocyklerze ustawionym na 16 °C na jedną godzinę.
    3. Oczyść reakcję, dodając dostarczone kulki (144 μL) i wykonując dwa płukania 80% etanolem (200 μL).
    4. Eluować za pomocą dostarczonego buforu TE (53 μl) i przenieść 50 μl supernatantu do czystej probówki PCR. Umieść probówkę do PCR na lodzie.
    5. Przygotuj główną mieszankę przygotowania końcowego (7 μl buforu reakcyjnego przygotowania końca i 3 μl mieszanki enzymów przygotowania końcowego) na lodzie i dodaj ją do probówki do PCR. Umieścić probówkę PCR w termocyklerze z warunkami określonymi w protokole.
    6. Wymieszaj rozcieńczony łącznik (2,5 μl), roztwory Ligation Master Mix (30 μl) i Ligation Enhancer (1 μl) na lodzie. Dodać zmieszane roztwory do próbki i umieścić w termocyklerze na 15 minut w temperaturze 20 °C.
    7. Oczyść reakcję, dodając dostarczone kulki (87 μl) i przeprowadzając płukanie etanolem (200 μl) i elucję jak poprzednio, z wyjątkiem dodania tylko 17 μl TE.
    8. Dodać indeksy (10 μl) i roztwór Q5 Master Mix (25 μl) i umieścić w termocyklerze w warunkach opisanych w protokole.
    9. Oczyść reakcję, dodając dostarczone kulki (45 μl) i wykonując dodawanie dwóch płukań etanolem (200 μl) i eluować 23 μl TE. Przenieś 20 μl do czystej probówki PCR.
  2. Sprawdź biblioteki pod kątem wykrywalnych stężeń RNA za pomocą bioanalizatora, fluorometru lub spektrofotometru.
  3. Połącz biblioteki metatranskryptomiczne w mniej więcej równym stosunku.
  4. Oczyść bibliotekę zgodnie z tym samym protokołem dla oczyszczania biblioteki 16S, z wyjątkiem fragmentów wyciętych między 250 a 400 pz. Podczas gdy biblioteka 16S miała wyraźne pasmo reprezentujące amplifikowany region, wynikiem jest rozmazanie.
  5. Sprawdź stężenie oczyszczonej biblioteki jak poprzednio.
  6. Wyślij oczyszczoną bibliotekę z suchym lodem do zakładu sekwencjonowania.
    UWAGA: Alternatywnie, ekstrakty RNA mogą być wysyłane do uniwersytetu lub prywatnej firmy w celu przygotowania i sekwencjonowania biblioteki.

7. Analiza społeczności mikrobiologicznej

  1. Po zakończeniu sekwencjonowania uzyskaj dostęp do przykładowych danych. Pobierz go na nadający się do użytku komputer.
    UWAGA: Idealnie, urządzenie powinno mieć co najmniej 16 gigabajtów pamięci RAM. Aby zapoznać się z omówieniem wymagań obliczeniowych (dla Qiime2), zobacz https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808.
  2. Użyj oprogramowania, takiego jak mothur, QIIME2 i R, do analizy danych 16S rRNA. Tutaj https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ zapoznać się z przykładowym samouczkiem dotyczącym analizy QIIME2 16S.
  3. W przypadku danych metatranskryptomicznych (RNA) należy użyć HUMAnN2 i ATLAS, aby określić, które geny i szlaki są obecne w próbkach.
    UWAGA: Przykładowy potok metatranskryptomiczny, którego kulminacją jest analiza różnorodności i losowej lasów, znajduje się w pliku z informacjami uzupełniającymi. Wszystkie polecenia są uruchamiane za pośrednictwem wiersza poleceń, np. Terminal dla użytkowników komputerów Mac.

Wyniki

Powodzenie ekstrakcji DNA i RNA można ocenić za pomocą różnych urządzeń i protokołów. Zazwyczaj każde wykrywalne stężenie któregokolwiek z nich uznaje się za wystarczające, aby stwierdzić, że ekstrakcja zakończyła się sukcesem. Analizując Tabelę 1, można zauważyć, że wszystkie ekstrakcje, z wyjątkiem jednej, można by uznać za udane. Niepowodzenie na tym etapie jest często spowodowane niską początkową biomasą, niewłaściwym przechowywaniem próbek lub błędem ludzkim podczas ekstrakcji. W przypadku filtrów ekstrakcja mogła zakończyć się sukcesem, nawet jeśli stężenie jest poniżej poziomu detekcji. Jeśli z tych ekstraktów nie uzyskano prążków w reakcji PCR (w przypadku analizy 16S) lub nie stwierdzono wykrywalnego stężenia po przygotowaniu biblioteki (metatranskryptomika), oznacza to, że prawdopodobnie rzeczywiście nie powiodły się.

Jeśli zastosowano protokół 16S, jasne prążki po amplifikacji PCR, widoczne w dołkach 4 i 6 na Rysunku 1, wskazują na sukces, natomiast brak prążków, widoczny w pozostałych dołkach górnego rzędu, świadczy o niepowodzeniu. Ponadto jasny prążek w ścieżce żelu zawierającej negatywną kontrolę PCR również wskazywałby na błąd, ponieważ ryzykowne byłoby założenie, że zanieczyszczenie wpływające na kontrolę(e) negatywną nie wpłynęło na próbki.

W przypadku sekwencjonowania 16S oraz metatranskryptomiki sukces sekwencjonowania można ocenić, analizując liczbę uzyskanych sekwencji (Rycina 2). Próbki 16S powinny posiadać minimum 1,000 sekwencji, przy czym wartość co najmniej 5,000 jest idealna (Rycina 2A). Analogicznie, próbki metatranskryptomiczne powinny posiadać minimum 500,000 sekwencji, przy czym wartość co najmniej 2,000,000 jest idealna (Rycina 2B). Próbki z liczbą sekwencji niższą niż te minima nie powinny być wykorzystywane do analiz, ponieważ mogą one nie oddawać wiernie składu społeczności bakteryjnej. Jednakże próbki, których liczba sekwencji mieści się między wartością minimalną a idealną, mogą być nadal używane, choć wyniki należy interpretować z większą ostrożnością, jeśli wiele próbek mieści się w tym zakresie.

Sukces późniejszych analiz downstream można określić po prostu na podstawie tego, czy uzyskano oczekiwane pliki wynikowe. W każdym razie programy takie jak QIIME2 i R (Rycina 3) powinny umożliwić ocenę potencjalnych istotnych różnic między społecznościami bakteryjnymi w zależności od szczelinowania hydraulicznego. Dane do Ryciny 3 uzyskano poprzez pobranie próbek osadów z dwudziestu jeden różnych stanowisk w trzynastu różnych strumieniach do analizy 16S i metatranskryptomiki. Z tych dwudziestu jeden stanowisk dwanaście znajdowało się poniżej miejsca prowadzenia szczelinowania hydraulicznego i zostało zaklasyfikowanych jako HF+, a dziewięć znajdowało się powyżej miejsca prowadzenia szczelinowania lub w zlewni, w której szczelinowanie nie miało miejsca; strumienie te zaklasyfikowano jako HF-. Poza obecnością aktywności szczelinowania hydraulicznego strumienie były w pozostałych aspektach porównywalne.

Różnice te mogłyby przybrać formę spójnych przesunięć w składzie w zależności od statusu szczelinowania hydraulicznego. Gdyby tak było, należałoby oczekiwać, że próbki HF+ i HF- będą tworzyć oddzielne skupiska na wykresie PCoA, co ma miejsce w Rycina 3A i Rysunek 3B. Aby potwierdzić, że te wyraźne przesunięcia nie są jedynie artefaktem metody ordynacji, niezbędna jest dalsza analiza statystyczna. Przykładem może być analiza PERMANOVA22 test macierzy odległości, która Rysunek 3A i Rysunek 3B opierają się na ujawnionym istotnym grupowaniu w zależności od statusu szczelinowania hydraulicznego, co oznacza, że rozdzielenie zaobserwowane na wykresie jest zgodne z różnicami między społecznościami bakteryjnymi próbek, a nie jest artefaktem ordynacji. Istotny wynik testu PERMANOVA lub ANOSIM stanowi silną przesłankę do stwierdzenia spójnych różnic między próbkami HF+ a HF-, co wskazywałoby na wpływ szczelinowania hydraulicznego na próbki HF+, podczas gdy wysoka wartość p wskazywałaby na brak takiego wpływu. Dane metatranskryptomiczne można w analogiczny sposób zwizualizować i ocenić, stosując te same metody.

Analiza cech różnicujących (mikrobów lub funkcji) może dostarczyć dowodów na to, że próbki zostały również poddane oddziaływaniu. Jedną z metod wyznaczania cech różnicujących jest stworzenie modelu lasów losowych (random forest). Model ten można wykorzystać, aby sprawdzić, jak trafnie można sklasyfikować status szczelinowania hydraulicznego w próbkach. Jeśli model działa lepiej, niż wynikałoby to z przypadku, stanowi to dodatkowy dowód na istnienie różnic zależnych od statusu szczelinowania. Co więcej, najważniejsze predyktory wskażą, które cechy miały kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozróżnienia próbek (Ryc. 3C). Cechy te musiały zatem wykazywać konsekwentnie różne wartości w zależności od statusu szczelinowania. Po wyznaczeniu tych cech różnicujących można przejrzeć literaturę, aby sprawdzić, czy były one wcześniej wiązane ze szczelinowaniem. Jednak znalezienie badań, które określiły funkcje różnicujące, może być trudne, ponieważ większość z nich opierała się wyłącznie na danych dotyczących składu 16S rRNA. Dlatego w celu oceny znaczenia funkcji różnicujących jedną z możliwych metod byłoby sprawdzenie, czy były one wcześniej wiązane z potencjalną odpornością na biocydy powszechnie stosowane w płynach do szczelinowania lub czy mogłyby pomagać w tolerowaniu warunków wysokiego zasolenia. Ponadto analiza profilu funkcjonalnego interesującego taksonu może ujawnić dowody na wpływ szczelinowania (Ryc. 3D). Na przykład, jeśli takson zostanie zidentyfikowany jako różnicujący przez model lasów losowych, jego profil oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w próbkach HF+ można porównać z profilem w próbkach HF- i jeśli będą one znacząco odbiegać od siebie, może to sugerować, że do strumienia przedostał się płyn do szczelinowania zawierający biocydy.

Identyfikator próbkiStężenie (ng/µL)
11.5
21.55
30.745
40.805
57.82
60.053
70.248
80.945
91.82
100.804
110.551
121.69
134.08
14Poniżej granicy oznaczalności
157.87
160.346
172.64
181.15
190.951

Tabela 1: Przykładowe stężenia DNA na podstawie analizy wysokiej czułości Fluorometer 1x DS DNA. Ekstrakcje dla wszystkich tych próbek, z wyjątkiem próby 14, zostałyby uznane za udane ze względu na wykrycie mierzalnych ilości DNA.

Wynik elektroforezy w żelu agarozowym wykazujący rozdział DNA; widoczna drabinka mas cząsteczkowych.
Rycina 1: Przykład żelu e-gel z produktami PCR. Żel został uprzednio zabarwiony i wizualizowany w świetle UV, co spowodowało fluorescencję obecnego na nim DNA. Reakcja PCR przebiegła pomyślnie dla próbek w dołkach 4 i 6 w pierwszym rzędzie, ponieważ w obu pojawił się pojedynczy, jasny prążek o oczekiwanej wielkości (na podstawie drabinki). Reakcja PCR dla próbek w pozostałych sześciu dołkach nie powiodła się, gdyż nie wytworzyły one żadnych prążków. Kontrola pozytywna (pierwszy dołek, drugi rząd) wykazała jasny prążek, co wskazuje na prawidłowe przeprowadzenie PCR, natomiast kontrole negatywne (dołki 6 i 7, drugi rząd) nie wykazały żadnych prążków, co świadczy o braku kontaminacji próbek. Gdyby kontrola negatywna wykazała prążek tak jasny jak w próbkach, PCR zostałby uznany za nieudany, ponieważ ryzykowne byłoby założenie, że amplikony w próbkach nie są jedynie wynikiem zanieczyszczenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozkład danych z sekwencjonowania; wykres gęstości; proporcje względem sekwencji; wykres analizy porównawczej
Rysunek 2: Przykładowa liczba sekwencji. (A) Przykładowa liczba sekwencji 16S. Prawie wszystkie z tych próbek 16S miały ponad 1 000 sekwencji. Nieliczne próbki, które miały mniej niż 1 000 sekwencji, powinny zostać wykluczone z dalszych analiz, ponieważ posiadały one zbyt mało sekwencji, aby dokładnie reprezentować ich społeczności bakteryjne. Kilka próbek miało od 1 000 do 5 000 sekwencji; choć nie jest to idealne, nadal byłyby one użyteczne, ponieważ przekraczają absolutne minimum, a większość próbek przekracza również idealne minimum wynoszące 5 000. (B) Przykładowa liczba sekwencji z metatranskryptomiki. Wszystkie próbki przekroczyły zarówno liczbę minimalną (500 000), jak i idealną minimalną (2 000 000) sekwencji. W związku z tym sekwencjonowanie wszystkich próbek zakończyło się sukcesem i wszystkie mogły zostać wykorzystane w dalszych analizach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza PCA i wykresy statystyczne porównujące zmienne w badaniu nad szczelinowaniem hydraulicznym; obejmują wykresy kołowe i rozrzutu.
Rycina 3: Przykładowa analiza. (A) Wykres PCoA oparty na współrzędnych obliczonych z macierzy odległości Weighted Unifrac, utworzonej i zwizualizowanej za pomocą QIIME2. (B) Wykres PCoA oparty na współrzędnych obliczonych z macierzy odległości Weighted Unifrac wyeksportowanej z QIIME2. Współrzędne zwizualizowano przy użyciu pakietów Phyloseq i ggplot2 w środowisku R. Wektory metadanych dopasowano do wykresu za pomocą pakietu Vegan. Każdy punkt reprezentuje społeczność bakteryjną próbki, przy czym punkty położone bliżej siebie wskazują na bardziej podobny skład społeczności. Zaobserwowano grupowanie w zależności od statusu szczelinowania hydraulicznego dla tych próbek osadów 16S (PERMANOVA, p=0.001). Co więcej, wektory ujawniają, że próbki HF+ miały tendencję do wyższych poziomów baru, bromku, niklu i cynku, co odpowiadało innemu składowi społeczności bakteryjnej w porównaniu z próbkami HF-. (C) Wykres najlepszych predyktorów dla modelu random forest, który testował, czy liczebność bakterii może być wykorzystana do przewidzenia statusu szczelinowania hydraulicznego wśród próbek. Model random forest utworzono w programie R przy użyciu pakietu randomForest. Przedstawiono 20 najważniejszych predyktorów oraz wynikowe spadki nieczystości (miara liczby próbek HF+ i HF- pogrupowanych razem) w formie średniego spadku indeksu Giniego (Mean Decrease in Gini Index) podczas wykorzystywania ich do rozdzielania próbek. (D) Wykres kołowy przedstawiający profil oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe rzędu Burkholderiales na podstawie danych metatranskryptomicznych. Sekwencje zostały najpierw adnotowane za pomocą Kraken2 w celu określenia, do których taksonów należą. Następnie BLAST został wykorzystany wraz z tymi adnotowanymi sekwencjami i bazą danych MEGARes 2.0 w celu ustalenia, które geny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (w formie „MEG_#”) są aktywnie ekspresowane. Geny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe ekspresowane przez przedstawicieli Burkholderiales zostały następnie wyekstrahowane, aby sprawdzić, które z nich były najpowszechniejsze w tym taksonie. Metatranskryptomika, choć jest bardziej kosztowna i czasochłonna, pozwala na analizy funkcjonalne, takie jak niniejsza, których nie można przeprowadzić w oparciu o dane 16S. Warto zauważyć, że w tej przykładowej analizie zamiast HUMAnN2 wykorzystano Kraken2. Kraken2 jest szybszy niż HUMAnN2, jednak generuje jedynie informacje o składzie, a nie o składzie, wkładzie, funkcjach (genach) i szlakach, jak robi to HUMAnN2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający: Przykład potoku analizy metatranskryptomicznej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Metody opisane w tym artykule zostały rozwinięte i udoskonalone w trakcie kilku badań opublikowanych przez naszą grupę w latach 2014-2018 7,8,10 i zostały z powodzeniem zastosowane we wspólnym projekcie mającym na celu zbadanie wpływu szczelinowania hydraulicznego na społeczności wodne w trzyletnim projekcie, który wkrótce zostanie przedłożony do publikacji. Metody te będą nadal wykorzystywane przez pozostałą część projektu. Ponadto inna aktualna literatura badająca wpływ szczelinowania hydraulicznego na strumienie i ekosystemy opisuje podobne metody pobierania, przetwarzania i analizy próbek 7,8,10,11. Jednak w żadnym z tych artykułów nie wykorzystano analizy metatranskryptomicznej, co czyni ten artykuł pierwszym, który opisuje, w jaki sposób te analizy mogą być wykorzystane do wyjaśnienia wpływu szczelinowania hydraulicznego na pobliskie strumienie. Ponadto przedstawione tutaj metody pobierania próbek są bardziej szczegółowe, podobnie jak kroki podjęte w celu uniknięcia zanieczyszczenia.

Jednym z najważniejszych etapów naszego protokołu jest wstępne pobranie i zabezpieczenie próbki. Pobieranie próbek i pobieranie próbek w terenie wiąże się z pewnymi wyzwaniami, ponieważ utrzymanie aseptycznego lub sterylnego środowiska podczas pobierania próbek może być trudne. Na tym etapie ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek. W tym celu należy nosić rękawiczki i dopuszczać do kontaktu z próbkami tylko sterylne pojemniki i narzędzia. Próbki należy również natychmiast umieścić na lodzie po pobraniu, aby złagodzić degradację kwasów nukleinowych. Dodanie komercyjnego środka konserwującego kwasy nukleinowe po pobraniu może również zwiększyć wydajność kwasów nukleinowych i umożliwić przechowywanie próbek przez dłuższy czas po pobraniu. Za każdym razem, gdy przeprowadzana jest ekstrakcja kwasów nukleinowych, ważne jest, aby użyć odpowiedniej ilości próbki, zbyt duża ilość może zatkać filtry wirowe używane do ekstrakcji (w przypadku tych protokołów, które z nich korzystają), ale zbyt mała może skutkować niską wydajnością. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z instrukcjami dla każdego używanego zestawu.

Podobnie jak w przypadku zbierania w terenie, unikanie lub minimalizowanie zanieczyszczeń jest również ważne podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych i przygotowywania próbek, zwłaszcza podczas pracy z próbkami o niskiej wydajności kwasów nukleinowych, takimi jak nieoptymalne próbki osadów (próbki zawierające dużą ilość żwiru lub skał) lub próbki wody. Dlatego, podobnie jak w przypadku pobierania próbek, podczas wszystkich tych czynności należy nosić rękawiczki, aby zmniejszyć zanieczyszczenie. Dodatkowo wszystkie powierzchnie robocze używane podczas zabiegów laboratoryjnych należy wcześniej wysterylizować poprzez przetarcie 10% roztworem wybielacza, a następnie 70% roztworem etanolu. Na etapach pipetowania (3-6) należy używać końcówek filtrujących, aby uniknąć zanieczyszczenia przez samą pipetę, a końcówki należy wymieniać za każdym razem, gdy dotykają niesterylnej powierzchni. Wszystkie narzędzia używane do pracy laboratoryjnej, w tym pipety, należy przetrzeć przed i po roztworze wybielacza i etanolu. Aby ocenić zanieczyszczenie, ślepe próby ekstrakcyjne i negatywy (sterylna ciecz) powinny być dołączone do każdego zestawu ekstrakcji kwasów nukleinowych i reakcji PCR. Jeśli kwantyfikacja po ekstrakcji wykaże wykrywalną ilość DNA/RNA w negatywach, ekstrakcje można powtórzyć, jeśli pozostała wystarczająca ilość próbki. Jeśli ujemne próbki do PCR wykazują amplifikację, należy rozwiązać problem w celu określenia źródła, a następnie próbki należy ponownie uruchomić. Aby uwzględnić niski poziom zanieczyszczenia, zaleca się sekwencjonowanie ślepych prób ekstrakcyjnych i ujemnych wyników PCR, tak aby można było zidentyfikować i usunąć, jeśli to konieczne, zanieczyszczenia podczas analizy obliczeniowej. I odwrotnie, amplifikacja PCR może również zakończyć się niepowodzeniem z różnych przyczyn. W przypadku próbek środowiskowych często winowajcą jest zahamowanie reakcji PCR, co może być spowodowane różnymi substancjami zakłócającymi polimerazę Taq23. W przypadku podejrzenia zahamowania, do rozcieńczenia ekstraktów DNA można użyć wody klasy PCR (patrz Tabela Materiałów).

Ten protokół ma kilka znaczących ograniczeń i potencjalnych trudności. Pobieranie próbek może być wyzwaniem zarówno w przypadku próbek wody, jak i osadów. Aby uzyskać wystarczającą ilość biomasy, najlepiej przepchnąć 1 litr wody ze strumienia przez filtr. Pory filtra muszą być małe, aby wychwytywać drobnoustroje, ale mogą również zatrzymywać osad. Jeśli w wodzie znajduje się dużo osadu z powodu niedawnych opadów deszczu, filtr może się zatkać, utrudniając przepchnięcie całej objętości przez filtr. W przypadku zbierania osadów oszacowanie głębokości osadu podczas zbierania może być trudne. Ponadto ważne jest, aby upewnić się, że zebrany osad składa się głównie z gleby, ponieważ kamyki i skały doprowadzą do obniżenia wydajności kwasów nukleinowych i mogą nie być dokładnym odzwierciedleniem społeczności drobnoustrojów. Wreszcie, ważne jest również, aby próbki były przechowywane na lodzie po pobraniu, zwłaszcza jeśli nie stosuje się środka konserwującego.

Chociaż protokół ten obejmuje zarówno metatranskryptomikę, jak i protokoły laboratoryjne 16S, należy podkreślić, że te dwie metody bardzo różnią się zarówno pod względem procesu, jak i rodzaju dostarczanych danych. Gen 16S rRNA jest powszechnie atakowanym regionem, wysoce konserwatywnym u bakterii i archeonów oraz przydatnym do scharakteryzowania społeczności bakteryjnej w próbce. Chociaż jest to podejście ukierunkowane i specyficzne, rozdzielczość na poziomie gatunku jest często nieosiągalna, a scharakteryzowanie nowo rozdzielonych gatunków lub szczepów jest trudne. W przeciwieństwie do tego, metatranskryptomika jest szerszym podejściem, które obejmuje wszystkie aktywne geny i drobnoustroje obecne w próbce. Podczas gdy 16S dostarcza tylko danych do identyfikacji, metatranskryptomika może dostarczyć danych funkcjonalnych, takich jak ekspresja genów i szlaków metabolicznych. Oba są cenne, a po połączeniu mogą ujawnić, które bakterie są obecne i jakie geny wyrażają.

W artykule opisano metody zbierania i przetwarzania próbek zarówno dla 16S rRNA, jak i analiz metatranskryptomicznych w kontekście badania szczelinowania. Ponadto szczegółowo opisano metody pobierania wysokiej jakości DNA/RNA z próbek o niskiej biomasie oraz do długotrwałego przechowywania. Opisane tutaj metody są kulminacją naszych doświadczeń z gromadzeniem i przetwarzaniem próbek w naszych wysiłkach, aby dowiedzieć się, jak szczelinowanie wpływa na pobliskie strumienie poprzez badanie struktury i funkcji ich społeczności mikrobiologicznych. Mikroorganizmy szybko reagują na zakłócenia, a co za tym idzie, które drobnoustroje są obecne i jakie geny wyrażają, mogą dostarczyć informacji o skutkach szczelinowania hydraulicznego dla ekosystemów. Ogólnie rzecz biorąc, metody te mogą być nieocenione w naszym zrozumieniu, w jaki sposób szczelinowanie wpływa na te ważne ekosystemy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować źródłom finansowania projektów, które doprowadziły do rozwoju tych metod, przy czym tymi źródłami są: Instytut Medyczny Howarda Hughesa (http://www.hhmi.org) poprzez Program Edukacji Naukowej Precollege and Undergraduate oraz National Science Foundation (http://www.nsf.gov) poprzez nagrody NSF DBI-1248096 i CBET-1805549.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
200 Proof EthanolThermo Fisher ScientificA4094400 ml należy dodać do Buffer PE (patrz protokół zestawu do ekstrakcji żelu Qiagen QIAQuck), a 96 ml należy dodać do buforu do płukania DNA/RNA (patrz protokół zestawu ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep).
Do ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep i NEBNext® potrzebny jest dodatkowy etanol; Ultra&handel; II Przygotowanie biblioteki RNA z zestawami kulek do oczyszczania próbki.
AgarozaThermo Fisher ScientificBP1356-100100 g na butelkę. 0,6 g agarozy byłoby potrzebne do wytworzenia jednego żelu 2% 30 ml.
Wybielacz dezynfekującyWalmart (Clorox)Brak numeru katalogowegoUżyj 10% roztworu wybielacza do czyszczenia obszaru roboczego przed i po zabiegach laboratoryjnych
Barwnik ładujący żel DNAThermo Fisher ScientificR0611Każdy produkt wykonany przez użytkownika (tj. nie-e-żel) powinien zawierać barwnik ładujący ze wszystkimi próbkami w stosunku 1 i mikro; L barwnik do 5 i mikro; L próbka
DNA drabinkaMilliporeSigmaD3937-1VLDrabinka powinna być prowadzona na każdym żelu/e-żelu
DNA/RNA Shield (2x)Zymo ResearchR1200-1253 ml na próbkę osadu (50 ml stożkowa) i 2 ml na próbkę wody (filtr)
Bromek etydynyThermo Fisher ScientificBP1302-10Służy do barwienia e-żeli tworzonych przez użytkownika
Forward PrimerIntegrated DNA Technologies ( IDT)51-01-19-060,5 &mikro; L na reakcję PCR
IzopropanolMilliporeSigma563935-1LGeneralnie mniej niż 2 ml na bibliotekę. Potrzebna objętość różni się w zależności od masy wyciętego fragmentu żelu (patrz protokół zestawu do ekstrakcji żelu Qiagen QIAQuick). 
Woda klasy PCRMilliporeSigma331593200113 & mikro; L na reakcję PCR (przy założeniu 1 &mikro; Stosuje się L matrycy DNA próbki)
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific1300001210 µ L na reakcję PCR
Reverse PrimerIntegrated DNA Technologies (IDT)51-01-19-070,5 &mikro; L na reakcję PCR
Bufor TBE (Tris-boran-EDTA)Thermo Fisher ScientificB521 l 10x buforu TBE (30 ml 1x buforu TBE byłoby potrzebne do wytworzenia jednego 30 ml żelu)
Butelka 1 LThermo Fisher Scientific02-893-4EJedna potrzebna na strumień (ta sama butelka może być używana do wielu strumieni, jeśli jest sterylizowana między użyciami)
1,5 ml Probówki do mikrowirówekMilliporeSigmaBR780400-450EANa ekstrakcję DNA potrzeba 5 probówek do mikrowirówek, a dodatkowe 3 są potrzebne do oczyszczenia RNA (patrz protokół zestawu ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep)
2% e-żel agarozowyThermo Fisher ScientificG401002Każdy żel może zawierać 10 próbek (więc 9 z ujemnym wynikiem PCR i 8, jeśli ujemny wynik ekstrakcji jest przeprowadzany na tym samym żelu)
50 ml ConicalsCellTreat2294211 50 ml stożkowy na próbki osadu
500 ml ZlewkaMilliporeSigmaZ740580Potrzebny tylko 1 (do sterylizacji płomieniowej)
Folia aluminiowaWalmart (Reynolds KITCHEN)Brak numeruFolię aluminiową można składać i sterylizować w autoklawie. Część niewystawiona na działanie środowiska może być następnie wykorzystana jako sterylna, wolna od DNA i RNA powierzchnia do przetwarzania filtrów
(jeden złożony kawałek na filtr, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego)
AutoklawGettingeLSS 130Tylko jedna potrzebna
wirówkaMilliporeSigmaEP5404000138-1EATylko 1 potrzebna
chłodnicaULINES-22567Można użyć prawie każdej chłodnicy. Ten jest wymieniony ze względu na to, że jest wykonany z pianki, dzięki czemu jest lżejszy, a tym samym łatwiejszy do zabrania ze sobą do pobierania próbek w terenie.
Disruptor GenieBio-Rad3591456Tylko jeden potrzebny
Komora do elektroforezyBio-Rad1664000EDUTylko 1 potrzebna
Zasilacz do elektroforezyBio-Rad1645050Tylko 1 potrzebny
Zamrażarka (-20 C)K2 SCIENTIFICK204SDFJedna potrzebna do przechowywania ekstraktów DNA
Zamrażarka (-80 C)K2 SCIENTIFICK205ULTJedna potrzebna do przechowywania ekstraktów RNA
RękawiceThermo Fisher Scientific19-020-352Numer katalogowy dotyczy rękawic Medium.
Blok grzewczyMilliporeSigmaZ741333-1EAPotrzebny tylko jeden
Palnik laboratoryjnySterlitech177200-00Potrzebny tylko jeden
Okap z przepływem laminarnymSystemy AirCleanAC624LFUVPotrzebny tylko 1
Zestaw do oczyszczania bibliotekiQiagen28704Jeden zestaw wystarcza na 50 reakcji
Płyta magnetycznaAlpaquaA001219Tylko jeden potrzebna
MikrowirówkaThermo Fisher Scientific75004061Potrzebna tylko jedna
Mikropipeta (1000 &mikro; Objętość L)Pipette.comL-1000Tylko 1 potrzebna
mikropipeta (2 i mikro; L objętość)Pipette.comL-2Potrzebna jest tylko 1
mikropipeta (20 &mikro; L objętość)Pipette.comL-20Potrzebna tylko 1
mikropipeta (200 &mikro; L) objętość)Pipette.comL-200RPotrzebny tylko 1
NEBNext Ultra II Przygotowanie biblioteki RNA z koralikami do oczyszczania próbekNew England BioLabs Inc.E7775SJeden zestaw zawiera wystarczającą ilość odczynników na 24 próbki.
ParafilmMilliporeSigmaP7793-1EANa filtr potrzebne są kwadraty 1 "x 1"
probówki PCRThermo Fisher ScientificAM12230Jedna probówka potrzebna na reakcję
Końcówki do pipet (dla 1000 i mikro; Objętość L)Pipette.comLF-1000Zestaw 576 końcówek
Końcówki do pipet (do 20 i mikro; Objętość L)Pipette.comLF-20Zestaw 960 końcówek
Końcówki do pipet (do 200 i mikro; Objętość L)Pipette.comLF-250Zestaw 960 końcówek
Klaster komputerowy PowerWulf ZXR1+PSSC LabsBrak liczbyTo tylko przykład superkomputera wystarczająco potężnego, aby przeprowadzić analizę metatranskryptomiczną w odpowiednim czasie. Potrzebny jest tylko jeden.
Zestaw startowy fluorometru QubitThermo Fisher ScientificQ33239W zestawie fluorometr Qubit 4, odczynnik wystarczający na 100 testów DNA i 500 probówek kubitowych
ScoopulaThermo Fisher Scientific14-357QPotrzebny tylko jeden
Sterylne ostrzaAD SurgicalA600-P10-0Jeden potrzebny na filtr
Filtr ciśnieniowy Sterivex-GPMilliporeSigmaSVGP01050Potrzebny jest 1 filtr na próbkę wody
TermocyklerBio-Rad1861096Potrzebny tylko jeden
ImadłoIrwin2078500Potrzebny tylko jeden (do otwarcia filtrów)
Vortex-Genie 2MilliporeSigmaZ258415-1EAPotrzebny tylko 1
Worki WHIRL-PAKULINES-227291 potrzebny na filtr
ZymoBIOMICS DNA/RNA Zestaw do miniprepuZymo ResearchR2002Jeden zestaw zawiera odczynniki wystarczające na 50 próbek.
na potrzebny

Bibliografia

  1. The process of unconventional natural gas production. US EPA. , Available from: https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production (2013).
  2. Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats. Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).
  3. McBroom, M., Thomas, T., Zhang, Y. Soil erosion and surface water quality impacts of natural gas development in East Texas, USA. Water. 4 (4), 944-958 (2012).
  4. Maloney, K. O., Weller, D. E. Anthropogenic disturbance, and streams: land use and land-use change affect stream ecosystems via multiple pathways. Freshwater Biology. 56 (3), 611-626 (2011).
  5. Meyer, J. L., et al. The contribution of headwater streams to biodiversity in river networks1. JAWRA Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 86-103 (2007).
  6. Alexander, R. B., Boyer, E. W., Smith, R. A., Schwarz, G. E., Moore, R. B. The role of headwater streams in downstream water quality. Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 41-59 (2007).
  7. Ulrich, N., et al. Response of aquatic bacterial communities to hydraulic fracturing in Northwestern Pennsylvania: A five-year study. Scientific Reports. 8 (1), 5683(2018).
  8. Chen See, J. R., et al. Bacterial biomarkers of Marcellus shale activity in Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 9, 1697(2018).
  9. Rausch, P., et al. Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms. Microbiome. 7 (1), 133(2019).
  10. Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem. Microbiome. 6 (1), 41(2018).
  11. Trexler, R., et al. Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 5, 522(2014).
  12. Mumford, A. C., et al. Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).
  13. JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/cn/science-education/10814/dna-isolation (2020).
  14. Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT. , Available from: https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality (2011).
  15. ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html (2020).
  16. QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation (2020).
  17. ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research. , Available from: https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit (2020).
  18. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  19. 16S Illumina amplicon protocol: Earth microbiome project. Earth microbiome project. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2018).
  20. Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/5063/gel-purification (2020).
  21. New England Biolabs protocol for the use with NEBNext Poly(A) mRNA magnetic isolation module (E7490) and NEBNext Ultra II RNA library prep kit for Illumina (E7770, E7775). New England Biolabs. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki (2020).
  22. Anderson, M. J. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA). Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).
  23. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

społeczność drobnoustrojówosad strumieniowypobieranie próbek wodyekstrakcja kwasów nukleinowychsekwencjonowanie 16S rRNAanaliza metatranskryptomicznaanaliza PERMANOVAmodel Random Forestoporność na środki przeciwdrobnoustrojowe
Ocena wpływu szczelinowania hydraulicznego na strumienie przy użyciu mikrobiologicznych sygnatur molekularnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.