Artykuł metodologiczny

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61914

⸱

12 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.

Streszczenie

Kontrolowanie procesów biologicznych za pomocą światła zwiększyło dokładność i szybkość, z jaką badacze mogą manipulować wieloma procesami biologicznymi. Kontrola optyczna pozwala na bezprecedensową zdolność do analizowania funkcji i ma potencjał do umożliwienia nowatorskich terapii genetycznych. Jednak eksperymenty optogenetyczne wymagają odpowiednich źródeł światła z kontrolą przestrzenną, czasową lub intensywnością, co często stanowi wąskie gardło dla badaczy. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zbudować tani i wszechstronny system oświetlenia LED, który można łatwo dostosować do różnych dostępnych narzędzi optogenetycznych. System ten można skonfigurować do sterowania ręcznego lub komputerowego z regulowaną intensywnością diod LED. Udostępniamy ilustrowany przewodnik krok po kroku dotyczący budowy obwodu, sterowania nim za pomocą komputera i konstruowania diod LED. Aby ułatwić montaż tego urządzenia, omawiamy również kilka podstawowych technik i wyjaśniamy obwody używane do sterowania diodami LED. Korzystając z naszego interfejsu użytkownika o otwartym kodzie źródłowym, użytkownicy mogą zautomatyzować precyzyjne odmierzanie czasu i pulsowanie światła na komputerze osobistym (PC) lub niedrogim tablecie. Ta automatyzacja sprawia, że system jest przydatny w eksperymentach, które wykorzystują diody LED do kontrolowania genów, szlaków sygnałowych i innych działań komórkowych, które obejmują duże skale czasowe. W przypadku tego protokołu nie jest wymagana wcześniejsza wiedza z zakresu elektroniki, aby zbudować wszystkie potrzebne części lub wykorzystać system oświetlenia do przeprowadzania eksperymentów optogenetycznych.

Wprowadzenie

Narzędzia optogenetyczne stają się wszechobecne, a nowe technologie są stale rozwijane do optycznej kontroli procesów biologicznych, takich jak ekspresja genów, sygnalizacja komórkowa i wiele innych1,2,3. Zdolność do kontrolowania procesów komórkowych za pomocą światła pozwala na szybką kinetykę, ścisłą kontrolę przestrzenną i regulację zależną od dawki, którą można kontrolować za pomocą natężenia światła i czasu ekspozycji. Aby korzystać z tych narzędzi, niezbędne jest urządzenie do kontrolowania tych parametrów. Niedawno opracowaliśmy genetycznie kodowany przełącznik genów ssaków PhyB-PIF3, który odwracalnie aktywuje i dezaktywuje geny za pomocą odpowiednio światła czerwonego/dalekiej czerwieni4. System ten został przetestowany na kilku liniach komórkowych ssaków i umożliwił niezrównaną indukcję ekspresji genów nawet przy bardzo małych ilościach światła, w tym impulsach światła. Naukowcy, którzy chcą korzystać z przełącznika PhyB i podobnych narzędzi5,6 często proszą o informacje na temat metod kontrolowania intensywności i czasu trwania oświetlenia. Dlatego opracowaliśmy ten protokół z instrukcjami krok po kroku, aby umożliwić szersze zastosowanie tych narzędzi w optogenetyce.

Przed powszechnym zastosowaniem diod LED, szerokopasmowe źródła światła z filtrami były używane do badania białek reagujących na światło, takich jak fitochromy7. Ostatnio opublikowano niektóre systemy oświetlenia LED wraz z narzędziami optogenetycznymi8,9,10,11,12, ale te protokoły mogą wymagać znacznej wiedzy specjalistycznej w zakresie elektroniki/oprogramowania, wymagają specjalistycznego sprzętu (np. drukarek 3D, maszyn do cięcia laserowego lub fotomasek) lub nie zawierają instrukcji krok po kroku Naukowcy musieliby rozmieścić swoje potrzeby badawcze. Chociaż niezależna kontrola poszczególnych studzienek w płytce wielodołkowej może być przydatna, często nie jest konieczna, gdy badacze muszą porównać tylko kilka różnych próbek w świetle jasnym i ciemnym lub czerwonym lub w świetle dalekiej czerwieni. Ponadto wiele istniejących systemów komercyjnych jest drogich, z ograniczonymi możliwościami dostosowywania. Jednak diody LED opisane w tym protokole są ekonomiczne, jasne i można je montować na wiele sposobów; Dzięki temu mogą być używane do oświetlania kilku różnych rodzajów próbek. Dzięki dostarczonemu protokołowi i oprogramowaniu, diody LED od ultrafioletu (UV) do NIR mogą być używane i kontrolowane za pomocą oprogramowania do przeprowadzania eksperymentów optogenetycznych przy użyciu UVR813,14, Dronpa15,16, domeny LOV17,18, funkcja krokowa Opsins19,20, CRY221,22, PhyB4,23,24,25, fitochromy bakteryjne26,27,28,29 i inne systemy reagujące na światło30,31,32.

Ten protokół stanowi samouczek do montażu obwodów i innego sprzętu potrzebnego do kontrolowania różnych parametrów stymulacji światłem, a także narzędzi molekularnych/komórkowych do przeprowadzenia eksperymentu optogenetycznego. Ponadto zgłaszamy plazmidy zoptymalizowane przez Kyriakakis et al.4, które są mniejsze i bardziej stabilne do klonowania. Dzięki temu protokołowi biolodzy bez doświadczenia w elektronice i optyce mogą budować systemy oświetleniowe, które są elastyczne i wytrzymałe. Krok po kroku pokazujemy, jak budować systemy LED, usuwając techniczne wąskie gardło dla szerszego zastosowania narzędzi optogenetycznych. System ten może być z łatwością stosowany w większości inkubatorów do hodowli komórkowych, nawet jeśli nie zawierają one portów przewodowych. Na przykład przez ponad 6 miesięcy trzymaliśmy system LED w nawilżonym inkubatorze CO2 bez spadku wydajności. Wyjaśniamy również, jak podłączyć system LED do komputera i połączyć go z oprogramowaniem typu open source, które udostępniamy na GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Budowanie systemu przy użyciu tego protokołu zapewnia badaczom podstawową wiedzę do debugowania potencjalnych problemów, wymiany części oraz ulepszania/rozszerzania funkcjonalności.

Przegląd systemu

Budowa systemu oświetlenia obejmuje (1) zbudowanie obwodu elektronicznego, (2) zbudowanie urządzeń peryferyjnych (przewód zasilający, wyłącznik zasilania, itp.), (3) zbudowanie diod LED, (4) montaż wszystkich tych komponentów i (5) zainstalowanie oprogramowania do sterowania diodami LED za pomocą interfejsu użytkownika (Rysunek 1A). Po zakończeniu system oświetlenia może sterować maksymalnie czterema diodami LED niezależnie za pomocą interfejsu użytkownika (Rysunek 1B). Interfejs użytkownika umożliwia każdej diodzie LED pulsowanie w określonych odstępach czasu i wyłączanie po określonym czasie. Istnieje również opóźnienie startu, aby rozpocząć programy oświetlenia o określonej godzinie. Potencjometry (POT) regulują intensywność każdej diody LED niezależnie lub mogą być używane do ręcznego sterowania diodami LED bez komputera. Przewody do diod LED mogą mieć dowolną niestandardową długość, co pozwala na łatwe umieszczenie ich w inkubatorze lub laboratorium. Ze względu na dużą moc tych diod LED można je wykorzystać do oświetlenia dużego obszaru za pomocą pojedynczej diody LED z dużej odległości.

Opis sterownika LED

Aby zasilić i kontrolować intensywność diod LED, ten protokół przejdzie przez kolejne kroki w celu zbudowania "sterownika LED". Każda dioda LED ma zakres napięć, w których pracuje (Rysunek 1C). Podczas pracy napięcie wyjściowe regulatora, które steruje natężeniem światła, można dostroić za pomocą potencjometru. POT zmienia rezystancję, dostosowując napięcie wyjściowe / jasność. Strojenie za pomocą POT 1kΩ (1 kiloom) daje to, co nazywamy "obwodem wysokiego napięcia" i ma zakres od 1,35 V do 2,9 V. Ponieważ 2,9 V jest zbyt wysokie do obsługi diod LED o niższym napięciu (Rysunek 1C), pokazujemy pojedynczą modyfikację (Rezystor 3 lub "R3" Rysunek uzupełniający 1A), która ogranicza zakres do dopasowania do niskonapięciowych diod LED. R3 służy do obniżenia maksymalnego napięcia przyłożonego do diod LED do 1,85 V (montaż szczegółowo opisany na rysunku uzupełniającym 8), gdy są one równoległe do potencjometru. Wykorzystując napięcie do sterowania jasnością zamiast prądu, system jest bardziej elastyczny w przypadku diod LED o różnych napięciach roboczych. Rysunek 1C zawiera listę diod LED wysokiego i niskiego napięcia, które pomogą w wyborze optymalnego obwodu. Taka konstrukcja utrzymuje minimalne napięcie na tyle niskie, że dioda LED jest całkowicie wyłączona, gdy potencjometr jest wyłączony i nie pozwala, aby napięcie przekroczyło typowe napięcie robocze diody LED. Do optogenetyki PhyB używamy diod LED w kolorze głębokiej czerwieni i dalekiej czerwieni, które wykorzystują obwód niskiego napięcia.

Opis systemu sterowania komputerowego LED

System oświetlenia LED może być używany do stałego oświetlenia bez komputera czy mikrokontrolera. Jednak do programów pulsacyjnych i do sterowania indywidualnym czasem diody LED musi być zainstalowany mikrokontroler. Aby użyć mikrokontrolera do sterowania diodami LED, wymagany jest tranzystor do podłączenia mikrokontrolera do obwodu. Tranzystor ten wyczuwa napięcie z mikrokontrolera i przełącza się z przewodzącego lub izolującego. Do sterowania włączaniem i wyłączaniem używamy tak zwanego "tranzystora przełączającego NPN" (2N22222) jako sterowanego bocznika w poprzek R2 (rysunek uzupełniający 1A). Gdy napięcie z mikrokontrolera zostanie przyłożone do bazy tranzystora, tranzystor staje się przewodzący i sprawia, że napięcie LED jest niskie, wyłączając diodę LED. W ten sposób stany włączenia i wyłączenia diody LED i tranzystora są bezpośrednio kontrolowane przez mikrokontroler, który jest sterowany przez oprogramowanie zainstalowane na komputerze.

Do stworzenia systemu oświetlenia wymagane są następujące kroki: Zbuduj obwód elektryczny; zbuduj zasilanie, ręczny wyłącznik zasilania, POTy i połączenie mikrokontrolera; zbuduj diody LED; pomieścisz czarną skrzynkę, aby pasowała do systemu oświetlenia; podłącz wszystkie okablowanie i urządzenia; zainstaluj oprogramowanie sterujące LED, stymuluj komórki światłem; zmierz ekspresję genów za pomocą podwójnego testu lucyferazy.

Protokół

1. Zbuduj obwód elektryczny

UWAGA: Protokół budowy pojedynczego obwodu dla dostępnej diody LED jest opisany tutaj. Instrukcje, jak rozszerzyć to do czterech diod LED, znajdują się w informacjach dodatkowych.

  1. Włącz pochłaniacz dymu i lutownicę. Dodaj wodę do gąbki do wycierania, miej pod ręką lut.
    UWAGA: Upewnij się, że podjąłeś środki ostrożności, aby usunąć dym i zapobiec poparzeniom.
  2. Rozpocznij elementów obwodu do płytki drukowanej (płytki PCB) w kolejności pokazanej w panelach dodatkowych.
    UWAGA: Użyj niewielkiej ilości lutu na końcówce lutownicy, aby najpierw podgrzać metal elementu i płytkę PCB, a następnie stopić dodatkowy lut bezpośrednio na komponentach; Flux może bardzo pomóc.
  3. przewody i elementy połączeniowe (rysunek uzupełniający 2 i rysunek uzupełniający 3).
    1. W przypadku przewodów połączeniowych (izolowane okablowanie, które łączy dwa punkty na płytce drukowanej), użyj dwóch kawałków pomarańczowych [7.6 mm (0.3 cala)] i żółtych [12 mm (0.4 cala)] przewodów z zestawu zworek.
    2. Przypnij płytkę PCB do "pomocnych dłoni" i włóż przewody połączeniowe w następujące otwory, zegnij zaciski pod kątem 45 stopni i dodaj strumień (Rysunek 2, Rysunek uzupełniający 2 i Rysunek uzupełniający 3): a1 i a3 → uziemienie (-) (pomarańczowy), a7 → zasilacz (+) #7 (żółty), d2 → d6 (żółty).
    3. , a następnie przytnij tył przewodów.
    4. Włóż regulator napięcia LM317T w następujące otwory, zegnij kołki i dodaj strumień (Rysunek 2 i Rysunek Uzupełniający 4): Adj → e5, Vout → e6, Vin → e7.
    5. Najpierw lewy i prawy zacisk, przytnij je, a następnie i przytnij środkowy zacisk.
    6. Aby ustawić zakres niskiego napięcia obwodu, włóż rezystor 820 Ω do końca w otwory, i przytnij c2 → c5 (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 5).
    7. Aby umożliwić sterowanie diodami LED przez mikrokontroler, włóż tranzystor do b3–b5 (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 6): Kolektor → b3, Podstawa → b4, Emiter → b5.
      UWAGA: Należy zwrócić uwagę na orientację tranzystora, aby prawidłowo go włożyć; sprawdź specyfikacje, aby znaleźć oznaczenie kolektora, podstawy i emitera.
  4. złącza przewód-przewód dla POT, diody LED, mikrokontrolera i źródła zasilania.
    UWAGA: Zwróć uwagę na kolor przewodów złączy przewód-przewód oraz na to, czy używasz żeńskiego czy męskiego złącza przewód-przewód.
    1. Określ, czy dla żądanej diody LED wymagany jest obwód "niskiego napięcia" czy obwód "wysokiego napięcia" (Rysunek 1C).
      UWAGA: Jeśli dioda LED znajduje się na liście "low voltage", wymagany jest rezystor równoległy do POT.
    2. W przypadku obwodu "niskonapięciowego" lub "wysokiego napięcia" należy umieścić przewód z żeńskiego złącza przewód-przewód przez otwór a5 (rysunek uzupełniający 7). Nie jeszcze na miejscu, jeśli wykonujesz obwód niskiego napięcia.
      UWAGA: Skręć gołe końce drutu, aby małe druciane włoski nie łuszczyły się. Jeśli drut wydaje się zbyt gruby, aby przepchnąć go przez otwór bez strzępienia, odetnij 2–6 pasm, a następnie skręć je z powrotem (rysunek uzupełniający 7B–D).
    3. Jeśli wykonujesz obwód "wysokiego napięcia", przejdź do kroku 1.4.5. W przypadku tworzenia obwodu "niskiego napięcia" przepchnij rezystor 560 Ω przez ten sam otwór (a5) i go za pomocą przewodu złącza przewód-przewód.
    4. Podłącz drugi koniec rezystora do masy (rysunek uzupełniający 7G).
    5. Włóż drugi koniec żeńskiego złącza przewód-przewód przylutowanego do otworu a5 łączącego go z uziemieniem i (rysunek uzupełniający 8A,B).
    6. W przypadku podłączenia mikrokontrolera włóż jeden koniec męskiego złącza przewód-przewód do otworu a4, a drugi do otworu podłączonego do uziemienia (rysunek uzupełniający 9A–C).
    7. W przypadku połączenia LED włóż jeden koniec żeńskiego złącza przewód-przewód do otworu a2, a drugi koniec do otworu podłączonego do uziemienia (rysunek uzupełniający 9D,E).

2. Zbuduj zasilacz, ręczny wyłącznik zasilania, POTy i podłączenie mikrokontrolera

  1. Zbuduj zasilacz.
    1. pomarańczową zworkę [7.6 mm (0.3 cala)] od a29 do masy (rysunek uzupełniający 10).
    2. żeńskie złącze przewód-przewód od a30 do zasilacza (+) (rysunek uzupełniający 11A–C).
    3. męskie złącze przewód-przewód od c29 do c30 (rysunek uzupełniający 11D–F).
    4. Odetnij złącze od przewodu zasilającego, odsłoń przewody i zdejmij je (Rysunek uzupełniający 12A–C).
    5. Dodaj topnik do przewodów przed za pomocą pisaka do topnika (rysunek uzupełniający 3G).
    6. Umieść rurkę termokurczliwą 3.18 mm (1/8 cala) wokół męskiego złącza przewód-przewód, a grubszy element 4.76 mm (3/16 cala) nad przewodem zasilającym (Rysunek uzupełniający 12D).
    7. Skręć przewody z zasilacza i męskiego złącza przewód-przewód i (Rysunek uzupełniający 12E, 13A,B).
    8. Umieść rurkę termokurczliwą o mniejszej średnicy 3.18 mm (1/8 cala) nad połączeniami i obkurcz je opalarką (rysunek uzupełniający 13C,D).
    9. Umieść rurkę termokurczliwą o większej średnicy 4.76 mm (3/16 cala) na mniejszej rurce termokurczliwej 3.18 mm (1/8 cala) i ponownie podgrzej (Rysunek uzupełniający 13E,F).
  2. Zbuduj ręczny wyłącznik zasilania.
    1. Umieść rurkę termokurczliwą 3.18 mm (1/8 cala) na przewodach przełącznika (Rysunek uzupełniający 14A).
    2. Skręć i przewody męskiego złącza przewód-przewód (rysunek uzupełniający 14B,C).
    3. Umieść rurkę termokurczliwą 3.18 mm (1/8 cala) na lutowanych sekcjach i obkurcz za pomocą opalarki (rysunek uzupełniający 14D,E).
  3. Podłącz męskie złącze przewód-przewód do POT.
    1. Zapętlić przewód złącza przewód-przewód wokół środkowego zacisku POT (Rysunek uzupełniający 15B).
    2. Skręć przewód, który jest ciasno owinięty wokół zacisku i go (Rysunek uzupełniający 15C).
      UWAGA: Małe szczypce precyzyjne mogą pomóc w wykonaniu ciasnego skrętu.
    3. Powtórz z czerwonym przewodem podłączonym do zacisku, jak na rysunku uzupełniającym 15D.
    4. Użyj szczypiec, aby złamać metalową wypustkę w pobliżu czerwonej strzałki (Rysunek uzupełniający 15E,F).
  4. Zbuduj połączenie z mikrokontrolerem (wymagane tylko w przypadku diod LED sterowanych komputerowo).
    1. W przypadku tworzenia sterownika LED dla więcej niż jednej diody LED, odetnij czarne przewody ze wszystkich oprócz jednego żeńskiego złącza przewód-przewód (Rysunek uzupełniający 16A).
    2. Zaciśnij końce złączy przewód-przewód, jak pokazano (rysunek uzupełniający 16B–D).
    3. Przepchnij zaciśnięte końce przez prostokątne złącze (rysunek uzupełniający 16E).

3. Zbuduj diody LED

  1. Zdjąć izolację z końcówek drutu (~5 mm) i nałożyć topnik za pomocą pisaka do topnika, jak na rysunku uzupełniającym 3G.
    UWAGA: Aby skutecznie przewody do podstawy LED, należy dodać topnik do styków podstawy LED i przewodów.
  2. Ocynuj drut, podgrzewając drut od dołu i dodając lut od góry (rysunek uzupełniający 17B).
  3. Użyj pisaka z topnikiem, aby umieścić topnik na powierzchni styku podstawy LED (rysunek uzupełniający 17C).
  4. Umieść dużą ilość lutu na dużym grocie lutowniczym (~4–5 mm) (Rysunek uzupełniający 17D), użyj go do podgrzania podstawy LED na styku (Rysunek uzupełniający 17E). Po kilku sekundach przeciągnij lut w poprzek styku (rysunek uzupełniający 17F). Powtórz kroki 3.3–3.4 na drugim styku (rysunek uzupełniający 17G).
    UWAGA: Podstawa LED może się bardzo nagrzać podczas. Umieść podstawę LED na powierzchni, która nie stopi się ani nie spali.
  5. Przypnij przewód do styku "C+" (katoda) za pomocą spinek do włosów (rysunek uzupełniający 18A).
  6. Umieść dużą ilość lutu na dużej końcówce lutowniczej (rysunek uzupełniający 18B) i dociśnij ją do drutu, aż lut na podstawie LED stopi się (rysunek uzupełniający 18C). Przytrzymaj drut (Rysunek uzupełniający 18D) i wyjmij lutownicę, trzymając drut na miejscu (Rysunek uzupełniający 18E).
  7. Umieść niewielką ilość pasty lutowniczej na padach do połączeń LED (Rysunek uzupełniający 19A,B) i umieść diodę LED na padach za pomocą kleszczyków (Rysunek uzupełniający 19C).
    UWAGA: Jeśli umieszczenie jest trochę nieprawidłowe, jest w porządku; Trafi na miejsce, gdy pasta lutownicza się stopi.
  8. Przytrzymaj czerwony przewód na "A+" (anodzie) i przypnij go spinką do włosów (rysunek uzupełniający 20A–C).
  9. Umieść dużą ilość lutu na dużym grocie lutowniczym (rysunek uzupełniający 20D) i dociśnij go do drutu, aż lut na podstawie LED i pasta lutownicza pod diodą LED stopią się (rysunek uzupełniający 20E).
    UWAGA: Po stopieniu pasty lutowniczej kolor staje się srebrny (rysunek uzupełniający 20H,I).
  10. Wybierz długość przewodu potrzebną do żądanej konfiguracji. Zdejmij izolację z przewodów LED i męskiego złącza przewód-przewód (rysunek uzupełniający 21A), a następnie dodaj topnik, jak na rysunku uzupełniającym 3G.
  11. Umieść rurkę termokurczliwą na drutach. Użyj rurki termokurczliwej 3.18 mm (1/8 cala) na złączach przewód-przewód i rurki termokurczliwej 4.76 mm (3/16 cala) na przewodzie (Rysunek uzupełniający 21B).
  12. Przypnij złącze przewód-przewód za pomocą "pomocnych rąk" i przekręć koniec złącza z przewodem (Rysunek uzupełniający 21C) i je. Powtórz z drugim przewodem (rysunek uzupełniający 21D,E).
  13. Umieść rurki termokurczliwe 3.18 mm (1/8 cala) na lutowiu i obkurcz (rysunek uzupełniający 21F–G).
  14. Umieść rurkę termokurczliwą 4.76 mm (3/16 cala) na rurce termokurczliwej 3.18 mm (1/8 cala) i obkurcz (rysunek uzupełniający 21H–I).
  15. Przypnij przewody LED do "pomocnych dłoni" taśmą pod nimi (Rysunek uzupełniający 22A).
  16. Wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z instrukcjami producenta i rozprowadź na wierzchu przylutowanej diody LED (rysunek uzupełniający 22B). Pozostaw na noc do utwardzenia.
  17. W przypadku montażu za pomocą łącznika dotykowego odetnij mały kawałek łącznika dotykowego (Rysunek uzupełniający 23A) i dociśnij go do tylnej części diody LED przez 30 sekund.
  18. Użyj szybkoobrotowego narzędzia obrotowego, aby wykonać nacięcie na pokrywie czarnego pudełka (rysunek uzupełniający 23C–E).
  19. Zbuduj mocowanie dla pojedynczej diody LED za pomocą folii zapewniającej prywatność.
    1. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć otwór o średnicy 1.75 cm (11/16 cala) w górnej części czarnej skrzynki, w której zostanie umieszczona dioda LED (rysunek uzupełniający 24A).
    2. Za pomocą szybkoobrotowego narzędzia obrotowego wykonaj nacięcie po jednej stronie otworu, aby zrobić miejsce na przewód LED, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 24A.
    3. Wytnij kawałek folii zapewniającej prywatność (25–30 mm) i przyklej taśmę do wewnętrznej strony czarnego pudełka, zakrywając otwór, przez który będzie oświetlać się dioda LED (rysunek uzupełniający 24A).
    4. Umieść diodę LED na zewnątrz czarnego pudełka na górze otworu z folią zapewniającą prywatność i przyklej taśmą izolacyjną (rysunek uzupełniający 24B–E).

4. Umieść czarną skrzynkę, aby pasowała do systemu oświetlenia

  1. W przypadku systemu z czterema diodami LED wywierć cztery otwory o średnicy 0.83 cm (21/64 cala) w pokrywie w odległości 3.81 cm (1.5 cala) od siebie, w których zostaną przymocowane potencjometry (rysunek uzupełniający 25).
  2. Za pomocą szybkoobrotowego narzędzia obrotowego wytnij prostokątny otwór o wymiarach 1.19 cm x 1.90 cm (0.47 cala x 0.75 cala) w lewym górnym rogu (Rysunek uzupełniający 25).
  3. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć otwór o średnicy 1.75 cm (11/16 cala) w czarnej skrzynce (rysunek uzupełniający 26).
  4. Spiłuj otwory i włóż przelotkę do wywierconego otworu (Rysunek uzupełniający 26).
  5. W przypadku diod LED sterowanych komputerowo należy przeszlifować papierem ściernym obszar, w którym mikrokontroler zostanie przyklejony w czarnym pudełku, a także dolną stronę uchwytu mikrokontrolera.
  6. Zatrzaśnij mikrokontroler na uchwycie przed zamocowaniem uchwytu w czarnej skrzynce, a następnie załóż je epoksydowo na miejsce (rysunek uzupełniający 27A).
  7. Użyj papieru ściernego, aby przeszlifować spód dwóch klipsów i obszar w czarnej skrzynce, w którym zostanie umieszczony obwód, a następnie zabezpiecz klipsy wewnątrz czarnej skrzynki za pomocą żywicy epoksydowej (rysunek uzupełniający 27A).
  8. Przymocuj płytkę PCB do zacisków (rysunek uzupełniający 27B).
  9. Przepchnij wyłącznik zasilania przez kwadratowy otwór w pokrywie wykonany na rysunku uzupełniającym 25 i zatrzaśnij go na miejscu (rysunek uzupełniający 28A).
  10. Przepchnij garnki przez otwory w pokrywie, przykręć na miejsce (rysunek uzupełniający 28A) i umieść pokrętło na garnku (rysunek uzupełniający 28B).

5. Podłącz wszystkie okablowanie i urządzenia

  1. Oznacz złącza przewód-przewód (np. LED, POT, COM) (rysunek uzupełniający 29A).
  2. Podłącz zaciskane złącza wykonane w kroku 2.4 (Rysunek uzupełniający 16) do męskiego złącza przewód-przewód między dwoma złączami żeńskimi (POT i LED) (Rysunki uzupełniające 7A i S37).
  3. Podłącz zaciśnięte końce do mikrokontrolera (rysunek uzupełniający 30).
  4. Przeciągnij USB przez przelotkę i podłącz go do mikrokontrolera.
  5. Przeciągnij przewody diod LED przez przepust i podłącz do żeńskiego złącza przewód-przewód po lewej stronie połączenia mikrokontrolera (rysunki uzupełniające 9D i 38).
  6. Przeciągnij przewód zasilający przez przepustę i podłącz go do męskiego złącza przewód-przewód po prawej stronie płytki PCB (rysunek uzupełniający 11D).
  7. Podłącz męskie złącze przewód-przewód z wyłącznika zasilania do żeńskiego złącza przewód-przewód po prawej stronie płytki PCB (rysunek uzupełniający 11A).
  8. Podłącz męskie złącza przewód-przewód z potencjometrów na pokrywie do żeńskich złączy przewód-przewód na płytce PCB (rysunki uzupełniające 8 i 36).
    UWAGA: Nie włączaj obwodu bez podłączonych potencjometrów.

6. Zainstaluj oprogramowanie sterujące diodami LED

UWAGA: Zobacz szczegółowe instrukcje instalacji oprogramowania w pliku uzupełniającym na Githubie. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do programowania mikrokontrolera
  2. Pobierz i zainstaluj menedżera pakietów.
  3. Zaprogramuj mikrokontroler.
  4. Pobierz i zainstaluj aparat środowiska uruchomieniowego.
  5. Pobierz interfejs użytkownika.

7. Stymuluj komórki światłem

  1. Transfekcyjne komórki HEK293.
    1. Płytka komórek HEK293 po 100 tys. komórek na dołek w płytce 24-dołkowej.
    2. Skorzystaj z przykładowej tabeli, aby obliczyć objętości pożywki wolnej od surowicy, polietylenininy (PEI) i DNA (rysunek uzupełniający 39) oraz transfekcję przy użyciu protokołu producenta.
  2. Stymulacja komórek światłem.
    UWAGA: Komórki muszą być trzymane w ciemności po transfekcji lub obsługiwane przy użyciu źródła światła, które nie pobudza układu optogenetycznego.
    1. Zdecyduj, jaki rodzaj stymulacji zostanie zastosowany na komórkach (światło ciągłe, intensywność pulsacji itp.).
    2. Gdy potencjometry są wyłączone (w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara), włącz zasilanie LED.
    3. Umieść światłomierz w czarnej skrzynce, w której zostaną umieszczone komórki, i umieść pokrywę z diodą LED nad miernikiem. Dostosuj natężenie światła zgodnie z potrzebami.
    4. Jeśli używasz komputera do sterowania diodami LED, otwórz oprogramowanie interfejsu użytkownika.
    5. Zaprogramuj interfejs użytkownika (Rysunek 5A,B).
      1. W lewym górnym panelu wybierz port COM dla mikrokontrolera i kliknij Połącz.
      2. Użyj paneli po prawej stronie, aby zaprogramować każdą diodę LED. W przypadku światła ciągłego wybierz dowolny czas z wyjątkiem zera w "Czas włączenia" i ustaw "Czas wyłączenia" na zero.
      3. W prawym dolnym panelu zaprogramuj główny regulator czasu.
        1. Aby opóźnić podświetlenie, wybierz opóźnienie startu (GG:MM).
        2. Aby wyłączyć wszystkie diody LED po wyznaczonym czasie, wybierz czas pracy (GG:MM).
        3. Uruchom program oświetlenia, klikając przycisk Uruchom (Rysunek 5A).

8. Pomiar ekspresji genów za pomocą testu podwójnej lucyferazy

  1. Przygotować odczynnik lucyferazy, mieszając 10 ml buforu lucyferazy z odczynnikiem lucyferazy i podwielokrotnością w probówkach o pojemności 1 ml, które mają być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
  2. Przygotować bufor do lizy 5x na 1x na 100 μL dla N + 2 dołki. np. dla 30 próbek, 30 x 20 μL 5X buforu do lizy i 30 x 80 μL MQ H2O.
  3. Przygotować roztwór substratu Renilla: 20 μl substratu Renilla na 1 ml buforu Renilla (ta ilość jest odpowiednia dla 10 testów).
  4. Usunąć komórki z inkubatora, odessać pożywkę, dodać 100 μl 1x buforu do lizy na studzienkę i umieścić go na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min na 15 minut.
  5. Umieścić w temperaturze -20 °C na co najmniej 1 godzinę.
  6. Dodać 100 μl odczynnika lucyferazy na próbkę do dołka na białej 96-dołkowej płytce.
  7. Skonfiguruj czytnik płytek pod kątem luminescencji. Korzystając z modułu luminometru czytnika płytek, ustaw całkowanie na 1 s.
  8. Dodaj rozmrożone lizaty w studzienkach poniżej odczynnika lucyferazy. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj 20 μl próbki z odczynnikiem lucyferazy i natychmiast zmierz luminescencję.
  9. Po ustabilizowaniu się odczytów dodaj 100 μl roztworu substratu Renilla i zeskanuj ponownie.
  10. Podziel sygnał lucyferazy przez sygnał Renilla, aby uwzględnić wydajność transfekcji.
  11. Porównaj sygnały lucyferazy znormalizowane pod kątem wydajności transfekcji (np. porównaj sygnał z próbek oświetlonych czerwonym światłem i dalekiego światła czerwonego oświetlonych).

Wyniki

Po złożeniu obwodu zasilania, zasilacza, przełącznika zasilania, potencjometrów (POT) i diody LED (do Supplementary Figure 21), można przetestować układ. Przy zamontowanych wszystkich potencjometrach, POT będzie kontrolować intensywność świecenia diody LED. Po zakończeniu montażu do etapu przedstawionego na Supplementary Figure 29, system może być używany ręcznie do optogenetyki lub innych zastosowań. Zasilanie całego systemu można kontrolować ręcznie za pomocą przełącznika zasilania. Intensywność każdej diody LED może być regulowana niezależnie za pomocą potencjometru podłączonego do każdego obwodu.

Po zainstalowaniu oprogramowania i zaprogramowaniu mikrokontrolera interfejs użytkownika może komunikować się z mikrokontrolerem. Za pomocą interfejsu użytkownika można sterować diodami LED w czasie na kilka sposobów: (1) każdą diodą LED można zaprogramować tak, aby świeciła przez określony czas, (2) każdą diodą LED można zaprogramować do pulsowania, (3) można zaprogramować globalne opóźnienie startu (np. podczas transfekcji i naświetlania 24 h później) (Rysunek 6B), (4) całkowity czas działania programu po opóźnieniu. Dostępne są dwa interfejsy użytkownika: jeden z większymi przyciskami, który umożliwia sterowanie dwiema diodami LED jednocześnie, oraz drugi, który pozwala sterować czterema diodami LED (Rysunek 5A,B). Interfejs dla dwóch diod LED jest zoptymalizowany pod kątem tabletów i jest wystarczający do sterowania diodami LED czerwonymi i dalekoczerwonymi w wielu eksperymentach.

W przypadku większych eksperymentów drugi interfejs użytkownika może służyć do sterowania czterema diodami LED. Podczas indukowania ekspresji genu oczekiwany wynik zależy od kilku parametrów. Należą do nich czas indukcji, poziomy indukcji (np. ilość światła lub leku) oraz liczba kopii indukowalnego konstruktu w komórce. Aby to wykazać, przeprowadziliśmy transfekcję przełącznika genowego PhyB wraz z różnymi ilościami DNA reporterowego (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% i 8% transfekowanego DNA) (Rysunek 6A) i oświetlone zgodnie z przedstawionym na Rycina 6BW próbkach zawierających PhyB, ale pozbawionych plazmidu do produkcji fikocyjanobiliny (chromoforu PCB) (tj. nie reagujących na światło), ekspresja/przeciek genu lucyferazy wzrasta wraz z ilością DNA raportowego (Rysunek 6C) (daleka czerwień P < 0,0001, regresja liniowa, po której zastosowano test Walda), (Czerwony P < 0,0001, regresja liniowa, po której wykonano test Walda). Dodatkowo, gdy cały przełącznik genu PhyB, w tym plazmid produkujący chromofor PCB (komórki światłoczułe), jest naświetlany światłem dalekiej czerwieni, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze zwiększaniem ilości konstruktu reporterowego w mieszaninie do transfekcji (Rysunek 6C,D) (Światło dalekiej czerwieni P < 0,0001, regresja liniowa z następującym testem Walda). Podobnie, gdy komórki światłoczułe są naświetlane światłem czerwonym, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze zwiększoną ilością reportera (P < 0,0001, regresja liniowa, a następnie test Walda). Porównując poziomy indukcji w komórkach traktowanych światłem czerwonym z komórkami traktowanymi światłem dalekim czerwonym, stwierdzono niewielki spadek krotności aktywacji wraz ze wzrostem ilości reportera (Rysunek 6E) (P = 0,0141, regresja liniowa, a następnie test Walda).

Proces montażu obwodu LED; instrukcja budowy krok po kroku, komponenty i tabela kompatybilności; konfiguracja eksperymentu.
Rycina 1: Podstawowy obwód dla pojedynczej diody LED. (A) Schemat blokowy przedstawiający przegląd kroków niezbędnych do zbudowania systemu oświetlenia LED. (B) System sterowania oświetleniem LED. (lewo) Pudełko sterujące do regulacji intensywności i czasu świecenia diod LED. (środek) Tablet PC z uruchomionym interfejsem użytkownika do sterowania diodami LED. (prawo) Czarna skrzynka do montażu diod LED i umieszczania komórek do stymulacji optycznej. (C) Tabela służąca do określenia, czy dioda LED wymaga obwodu wysokiego czy niskiego napięcia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Przewodnik po montażu układu tranzystorowego; schemat; rozmieszczenie 2N2222A, LM317T na płytce stykowej, uwagi instruktażowe.
Rysunek 2: Instrukcje lutowania komponentów na miejscu. (A) Przykład krok po kroku w formie rysunkowej instrukcji budowy układu. (B,C) Przykładowe instrukcje ze zdjęciami montowanego urządzenia. (D) Przykładowe instrukcje jednoczesnego montażu wielu układów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja obudowy potencjometru z opisanymi pinami i okablowaniem do sterowania elektronicznego, widoczne połączenia wewnętrzne.
Rycina 3: Widoki zmontowanego systemu sterowania diodami LED. (A) Widok zewnętrzny z góry zmontowanego systemu. (B) Widok wewnętrzny zmontowanego systemu oświetlenia z czterema diodami LED. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Montaż urządzenia półprzewodnikowego; zbliżenia z obrazowania mikroskopowego; inspekcja komponentów elektronicznych.
Rysunek 4: Instrukcje lutowania reflow diody LED na radiatorze.(A) Podstawa diody LED i zbliżenie ciemnoczerwonej diody LED. (B) Nakładanie pasty lutowniczej na podstawę diody LED. (C) Zdjęcie przylutowanej diody LED. Czerwone strzałki wskazują wypady lutownicze. W porównaniu do koloru szarego przed lutowaniem (A), po lutowaniu spoiwo ma wygląd metaliczny/błyszczący. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interfejs czasowy LED sterowany przez Arduino (A,B), inkubator laboratoryjny (C), schemat sygnalizacji fotoreceptorów (D,E).
Rysunek 5: Oprogramowanie do kontrolowania eksperymentów optogenetycznych. (A) Interfejs użytkownika dla dwóch diod LED z dużymi przyciskami w celu ułatwienia obsługi za pomocą niedrogiego tabletu. (B) Interfejs użytkownika dla czterech diod LED. Oba interfejsy umożliwiają niezależne sterowanie diodami LED. W przypadku impulsowania diody LED mogą być programowane tak, aby włączały się i wyłączały dla określonej szerokości impulsu i określonego czasu trwania. Impulsowanie może mieć również opóźnienie startu oraz z góry określony całkowity czas pracy. (C) Tablet sterujący diodami LED zamontowany na inkubatorze do hodowli komórkowych. (D) Ilustracja systemu genu PhyB podczas naświetlania światłem dalekoczerwonym. Światło dalekoczerwone utrzymuje gen w stanie „wyłączonym” lub „ciemnym”. (E) Ilustracja systemu genu PhyB podczas naświetlania światłem czerwonym. Światło czerwone indukuje ekspresję genu poprzez promowanie interakcji między PhyB a PIF3. Interakcja ta lokalizuje domenę aktywacyjną (AD) genu połączoną z PIF3 w promotorze UAS, aktywując gen reporterowy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment z genem reporterowym lucyferazy; schemat plazmidu, oś czasu transfekcji, wykresy ekspresji.
Rysunek 6: Przewidywane wyniki z zastosowaniem systemu LED do sterowania PhyB. (A) Plazmid kodujący partnerów dwuhybrydowych PhyB+PIF3 (pPK-351), plazmid kodujący enzymy syntezy fikocyjanobiliny (chromofor PCB) (pPK-352) oraz plazmid reporterowy lucyferazy (pPK-202). (B) Harmonogram eksperymentów z indukcją światłem dla punktów C–E. (C) Bazowe poziomy transkrypcji (tzw. przeciekanie) przy zwiększających się ilościach DNA reporterowego. Próbki „Leak” nie są transfekowane pPK-352 (tj. nie reagują na światło), ale są naświetlane światłem czerwonym lub dalekim czerwonym. Próbki Light Switch (LS) zawierają wszystkie plazmidy przełącznika świetlnego i są naświetlane światłem czerwonym lub dalekim czerwonym. (D) Poziomy indukcji światłem w odpowiedzi na światło czerwone i dalekie czerwone. (LS-Far-red light to te same dane w C i D). (E) Krotność indukcji lucyferazy w komórkach naświetlanych światłem czerwonym/dalekim czerwonym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

 Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać Ryciny uzupełniające 1-39.

Rysunek uzupełniający 1: Elektroniczny układ sterujący dla wielu diod LED. (A) Schemat obwodu dla systemu z jedną diodą LED. (B) Schemat obwodu dla systemu z czterema diodami LED).

Rycina dodatkowa 2: Rozmieszczenie połączeń obwodu. (A) Przymocuj płytkę PCB do trzeciej ręki. (B) Pozycje głównych zworek obwodu w otworach przelotowych przedstawione na zdjęciu. (C) Schemat złączy przewodów z mapowaniem współrzędnych. W przypadku czterech układów LED narysuj linie dzielące każdy obwód zgodnie z rysunkiem (czarne linie pionowe). Ryciny dodatkowe 31–38 opisują montaż czterech obwodów jednocześnie.

Rycina uzupełniająca 3: Lutowanie przewodów do płytki PCB. (A) Zgiąć zworki tak, aby stykały się bezpośrednio z płytką PCB i pozostały na miejscu podczas lutowania. (B) Inny widok zgiętych przewodów. (C) Przewody po lutowaniu. (D) Przycięte przewody na płytce PCB. (E) Skurczona izolacja po podgrzaniu lutownicą. (F) Przesuwanie izolacji do pozycji pokrywającej otwór przelotowy masy (niebieska strzałka) (G) Nakładanie topnika na koniec przewodu lub zacisk.

Rysunek uzupełniający 4: Lutowanie regulatora napięcia na miejscu. (A) Mapa współrzędnych regulatora napięcia. (B) Umiejscowienie regulatora napięcia. (C) Zgięte wyprowadzenia regulatora napięcia. (D) Zaciski regulatora napięcia po lutowaniu. 

Rycina uzupełniająca 5: Lutowanie rezystora R1 w odpowiednim miejscu. (A) Mapa współrzędnych rezystora R1 (820Ω). (B) Przeciąganie rezystora za wyprowadzenie za pomocą szczypiec. (C) Przeciągnięty rezystor w pobliżu PCB. (D) Przylutowany rezystor w pobliżu PCB. 

Rycina uzupełniająca 6: Lutowanie tranzystora na miejscu. (A) Mapa współrzędnych i orientacji tranzystora. (B) Zwróć uwagę na orientację tranzystora; etykieta w tym modelu jest skierowana w stronę regulatora napięcia (LM317T). Ponownie sprawdź specyfikację tranzystora, aby upewnić się, że „Emiiter”, „Baza” i „Kolektor” znajdują się w odpowiednich otworach. (C) Tranzystor z wygiętymi wyprowadzeniami przed lutowaniem.

Rysunek uzupełniający 7: Lutowanie złącza przewód-przewód potencjometru (oraz rezystora 560Ω dla obwodu niskonapięciowego). (A) Mapa współrzędnych złącza przewód-przewód (oraz R3-560Ω w przypadku budowy obwodu niskonapięciowego; złącze przewód-przewód umieszcza się w otworze przed rezystorem). (B) Żeńskie złącze przewód-przewód. (C) Aby ułatwić dopasowanie rezystora i złącza przewód-przewód do otworu przelotowego, zgina się 3–5 splotów drutu. (D) Sploty są odcinane obcinaczkami do drutów jak najbliżej izolacji. (E) Wprowadzenie czerwonego przewodu żeńskiego złącza przewód-przewód przez otwór przelotowy a5 (dla obwodu niskonapięciowego wprowadza się R3 przez ten sam otwór przelotowy). (F) Widok od spodu rezystora i złącza przewód-przewód przed lutowaniem. (G) Obraz wlutowanego rezystora R3 podłączonego do masy (F = żeńskie).

Rycina uzupełniająca 8: Lutowanie złącza przewodowego potencjometru do masy. (A) Mapa współrzędnych przyłącza masy dla złącza przewodowego potencjometru. (B) Widok z góry złącza przewodowego potencjometru podłączonego równolegle do R3 (F = Female – gniazdo). 

Rycina uzupełniająca 9: Lutowanie złączy przewodowych mikrokontrolera i diody LED. (A) Mapa współrzędnych złącza przewodowego do połączenia tranzystora 2N222A oraz masy z mikrokontrolerem. (B) Przylutowane męskie złącze przewodowe. (C) Widok z góry elementu (B). (D) Mapa współrzędnych żeńskiego złącza przewodowego do połączenia wejścia obwodu i masy z diodą LED. (E) Przylutowane żeńskie złącze przewodowe (F = żeńskie, M = męskie). 

Rycina uzupełniająca 10: Lutowanie przelotki dla obwodu zasilania. (A) Mapa współrzędnych pomarańczowej przelotki służącej do połączenia zasilania z masą. (B) Pomarańczowa przelotka przylutowana na miejscu. (C) Widok od spodu przylutowanej przelotki. 

Rysunek uzupełniający 11: Lutowanie przełącznika zasilania i złączy przewodowych źródła zasilania. (A) Mapa współrzędnych żeńskiego złącza przewodowego do podłączenia przełącznika zasilania. (B) Żeńskie złącze przewodowe przylutowane na miejscu. (C) Inny widok (B). (D) Mapa współrzędnych męskiego złącza przewodowego do podłączenia źródła zasilania. (E) Przylutowane męskie złącze przewodowe. (F) Inny widok (E) (F = żeńskie, M = męskie). 

Rysunek uzupełniający 12: Podłączenie zasilacza do męskiego konektora przewód-przewód. (A) Niekorygowany zasilacz. (B) Odcinanie przewodów zasilacza. (C) Przewody zasilacza po zdjęciu izolacji i odcięciu jej nadmiaru. (D) Umieszczenie rurki termokurczliwej wokół przewodów zasilacza. Rurki oddzielające dwa połączenia (czerwone strzałki) oraz rurka do utrzymania oddzielnych przewodów (żółta strzałka). (E) Skręcone przewody łączące zasilacz z żeńskim konektorem przewód-przewód. 

Rysunek uzupełniający 13: Lutowanie i izolowanie połączenia zasilania z męskim konektorem przewód-przewód. (A) Lutowane połączenie między masą zasilacza a żeńskim konektorem przewód-przewód. (B) Lutowane połączenie między zaciskiem dodatnim zasilacza a żeńskim konektorem przewód-przewód. (C) Koszulka termokurczliwa nasunięta na lutowane poszczególne połączenia (czerwona strzałka). (D) Oba połączenia zasilania polutowane i zabezpieczone obrobioną termicznie koszulką termokurczliwą. (E) Umieszczenie koszulki termokurczliwej na poszczególnych połączeniach (żółta strzałka). (F) Gotowy zasilacz. 

Rycina uzupełniająca 14: Lutowanie przełącznika zasilania do męskiego konektora przewód-przewód. (A) Przełącznik zasilania z odizolowanymi przewodami i rurką termokurczliwą nałożoną na przewody (czerwone strzałki). (B) Przewody łączące przełącznik i męski konektor przewód-przewód skręcone przed lutowaniem. (C) Nakładanie rurki termokurczliwej na lutowane połączenia. (D) Połączenia pokryte obkurczoną termicznie rurką. (E) Przełącznik zasilania zmontowany z męskim konektorem przewód-przewód. 

Rysunek uzupełniający 15: Podłączenie potencjometru do męskiego konektora przewód-przewód. (A) Elementy potencjometru. (B) Męski konektor przewód-przewód skręcony i zgięty, aby zahaczyć o środkowy terminal potencjometru. (C) Męski konektor przewód-przewód skręcony wokół środkowego terminala potencjometru. (D) Przylutowane połączenia przewód-przewód. (E) Czerwona strzałka wskazująca metalowy zaczep przed jego usunięciem. (F) Potencjometr po usunięciu metalowego zaczepu.)

Rysunek uzupełniający 16: Okablowanie połączenia mikrokontrolera. (A) Przewody dla żeńskich złączy przewód-przewód odizolowane i przycięte w przygotowaniu do zaciskania. (B) Umieszczenie zacisku na złączu przewód-przewód. (C) Zaciskanie złącza przewód-przewód. (D) Zacisnięte złącze przewód-przewód. (E) Całkowicie zmontowane połączenie mikrokontrolera. 

Rycina uzupełniająca 17: Lutowanie przewodów i diody LED do podstawy LED Część 1. (A) Materiały niezbędne do przylutowania diody LED do podstawy LED. (B) Cynowanie końcówki odizolowanego przewodu. (C) Nakładanie topnika na styk podstawy LED. (D) Dodawanie spoiwa do dużej końcówki lutownicy w celu ocynowania podstawy LED. (E) Nakładanie spoiwa na styk w celu rozgrzania podstawy LED. (F) Podstawa LED po przesunięciu końcówki lutownicy przez styk. (G) Ta sama procedura na drugim styku.

Rysunek uzupełniający 18: Lutowanie przewodów i diody LED do podstawy LED, część 2. (A) Cyna-powlekany przewód przymocowany do styku za pomocą żabki. Należy zwrócić uwagę, że czarny przewód jest przylutowany do katody „C-”. (B) Nałożenie znacznej ilości spoiwa na grot lutownicy. (C) Dociskanie przewodu grotem lutownicy, co powoduje stopienie spoiwa na podstawie LED i przewodzie. (D) Przytrzymywanie przewodu, aby pozostał na miejscu po odsunięciu lutownicy. (E) Trzymanie przewodu w miejscu aż do stwardnienia spoiwa.)

Rysunek uzupełniający 19: Lutowanie przewodów i diody LED do podstawy diody LED, część 3. (A) Użycie ostrej końcówki do nałożenia pasty lutowniczej na podstawę diody LED w celu montażu diody LED. (B) Podstawa diody LED z naniesioną pastą lutowniczą. (C) Umieszczenie diody LED na podstawie diody LED w taki sposób, aby styki diody LED i podstawy diody LED były dopasowane.

Rycina uzupełniająca 20: Lutowanie przewodów i diody LED do podstawy LED, część 4. (A) Czarny przewód wciąż przymocowany do styku za pomocą spinki do włosów. (B,C) Użycie drugiej spinki do włosów w celu przytrzymania czerwonego przewodu na miejscu. Należy zauważyć, że czerwony przewód jest przylutowany do anody „A+”. (D) Nałożenie znacznej ilości spoiwa na grot lutownicy. (E) Grot lutownicy dociskający przewód, co powoduje stopienie spoiwa na podstawie LED i przewodzie, a także pasty lutowniczej pod diodą LED. (F) Gorąca podstawa LED chłodząca się po lutowaniu. (G) Podstawa LED z przylutowanymi przewodami i diodą LED. (H,I) Czerwone strzałki wskazują pady lutownicze. Po lutowaniu spoiwo ma wygląd metaliczny/błyszczący (w porównaniu do szarego koloru przed lutowaniem (Rycina uzupełniająca 16D)).

Rysunek uzupełniający 21: Podłączenie przewodu LED do męskiego konektora przewód-przewód. (A) Odizolowane przewody i męski konektor przewód-przewód obok rurek termokurczliwych przeciętych na pół (1/8 inch i 3/16 inch). (B) Umieszczenie rurki termokurczliwej na przewodach przed lutowaniem. (C) Przewody skręcone przed lutowaniem. (D) Lutowane połączenie przewodu z konektorem przewód-przewód. (E) Lutowanie czerwonego i czarnego przewodu. (F) Nałożenie rurki termokurczliwej 1/8 inch na lutowane połączenie. (G) Rurka termokurczliwa po obkurczeniu za pomocą opalarki. (H) Nałożenie rurki termokurczliwej 3/16 inch na mniejszą rurkę termokurczliwą. (I) Połączenie polutowane i uszczelnione rurką termokurczliwą). 

Rysunek uzupełniający 22: Mocowanie przewodów i diod LED do podstawy LED za pomocą żywicy epoksydowej. (A) Użycie drewnianego aplikatora do nałożenia żywicy epoksydowej do podstawy LED. Poniżej umieszczono taśmę, aby zebrać ewentualne wycieki żywicy. (B) Żywica epoksydowa jest rozprowadzona równomiernie na całej powierzchni. (C) Dioda LED pozostaje przez noc w celu utwardzenia.

Rysunek uzupełniający 23: Montaż diod LED w pokrywie pudełka. (A) Dioda LED z przytwierdzonym elementem rzepa w celu łatwego montażu. (B) Diody LED o różnych kolorach zamontowane wewnątrz czarnego pudełka za pomocą rzepa. (C) Wycięcie w pokrywie czarnego pudełka wykonane narzędziem obrotowym o wysokich obrotach, aby stworzyć miejsce na przewód diody LED. (D) Czarne pudełko do stymulacji komórek z rzepami do montażu diod LED. (E) Umieszczenie płytki wielodołkowej wewnątrz wersji pudełka do diod LED z rzepami. 

Rycina uzupełniająca 24: Montaż diod LED na zewnętrznej stronie pokrywy pudełka. (A) Otwór wywiercony w pokrywie czarnego pudełka z nacięciem wykonanym narzędziem obrotowym o wysokiej prędkości, aby zrobić miejsce na przewód (czerwona strzałka). (B) Dioda LED umieszczona w otworze z przewodem w nacięciu, utrwalona taśmą izolacyjną. (C) Do zabezpieczenia diody LED użyto dwóch kolejnych kawałków taśmy. Tylna strona radiatora pozostaje odsłonięta w celu maksymalizacji wymiany ciepła. (D) Folia matująca przyklejona taśmą nad otworem, w którym zostanie umieszczona dioda LED. Czerwona strzałka wskazuje folię matującą. (E) Czarne pudełko do stymulacji komórek diodą LED zamontowaną na zewnątrz pudełka i z folią matującą służącą do rozproszenia oświetlenia. (F) Umieszczenie płytki wielodotykowej wewnątrz wersji pudełka LED z zewnętrzną diodą LED i folią matującą.

Rycina uzupełniająca 25: Wywiercanie otworów w pokrywie obudowy na przełącznik zasilania i potencjometry. (A) Rysunek CAD z naniesionymi wymiarami pokrywy obudowy. (B) Pokrywa obudowy z otworami na potencjometry i przełącznik zasilania.)

Rysunek uzupełniający 26: Przygotowanie otworu wylotowego dla przewodu. (A) Rysunek CAD z naniesionymi wymiarami. (B) Zdjęcie wywierconego otworu z wiertłem. (C) Wygładzanie otworu wylotowego za pomocą obrotowego narzędzia wysokobiegowego lub pilnika. (D) Umieszczanie przelotki w otworze wylotowym.

Rycina uzupełniająca 27: Umiejscowienie mikrokontrolera i płytki PCB w obudowie. (A) Uchwyt mikrokontrolera (pomarańczowy) oraz uchwyty PCB wewnątrz obudowy. (B) Mikrokontroler i płytka PCB zamocowane w obudowie.

Rysunek uzupełniający 28: Rozmieszczenie potencjometrów i przełącznika zasilania. (A) Widok z przodu pokrywy pudełka z przełącznikiem zasilania i czterema potencjometrami. (B) Widok z przodu pokrywy pudełka z dodanymi pokrętłami potencjometrów. (C) Widok z tyłu pokrywy pudełka z zamontowanymi komponentami. 

Rysunek uzupełniający 29: Zmontowany system sterowania LED. (A) Otwarta skrzynka sterownicza z przewodami opisanymi za pomocą drukarki etykiet i spiętymi opaskami zaciskowymi w celu organizacji. (B) Skrzynka po pełnym montażu, z opisanymi potencjometrami POT oraz przypisanymi im pinami PIN.

Rysunek uzupełniający 30: Umieszczenie zaciskanego złącza przewód-przewód. (A) Zdjęcie zaciskanych złączy przewód-przewód dla systemu składającego się z czterech diod LED i mikrokontrolera. (B) Umieszczenie zaciskanego złącza w portach mikrokontrolera).

Rysunek uzupełniający 31: Umieszczanie przewodów zastępczych. (A) Płyta obwodowa z oznaczonymi współrzędnymi czerwonych przewodów zastępczych. (B) Płyta obwodowa z oznaczonymi współrzędnymi żółtych przewodów zastępczych). 

Rycina uzupełniająca 32: Umieszczanie przewodów połączeniowych. Płyta obwodowa przedstawiająca współrzędne żółtych przewodów połączeniowych.

Rysunek uzupełniający 33: Dodawanie stabilizatorów napięcia. Stabilizatory napięcia LM317T zostają dodane do obwodu, a ich współrzędne zostały oznaczone na schematach.

Rycina uzupełniająca 34: Montaż rezystorów 820Ω. Rezystory R1 zostają dodane do obwodu zgodnie z ich współrzędnymi naniesionymi na schematach.

Rysunek uzupełniający 35: Montaż tranzystorów. Tranzystory 2N2222A zostają dodane do obwodu, a ich współrzędne zostały oznaczone na schematach.

Rycina uzupełniająca 36: Wkładanie żeńskich złączy przewodowych i rezystorów (opcjonalnie) dla połączenia potencjometru (POT). Przewody i rezystory są dodawane do obwodu zgodnie z ich współrzędnymi wskazanymi na schematach. (A) Włóż czerwony przewód, a następnie rezystor R2 (560Ω) (wyłącznie dla obwodu niskiego napięcia). (B) Włóż drugi koniec rezystora do wskazanego otworu masy. (C) Włóż czarne przewody do zaznaczonych otworów, aby połączyć je z masą. Uwaga: R2 (560Ω) jest połączony równolegle do potencjometru.

Rysunek uzupełniający 37: Montaż męskich złączy przewodowych dla połączenia z mikrokontrolerem i zasilaczem. Przewody są dodawane do obwodu zgodnie z ich współrzędnymi oznaczonymi na schematach. (A) Włóż czerwone przewody do wskazanych otworów. (B) Włóż czarne przewody do zaznaczonych otworów).

Rycina uzupełniająca 38: Montaż złączy przewodowych LED. (A) Żeńskie złącza przewodowe z zaznaczonymi współrzędnymi czerwonego przewodu. (B) Żeńskie złącze przewodowe z zaznaczonymi współrzędnymi czarnego przewodu).

Rysunek uzupełniający 39: Przygotowanie eksperymentu z przełącznikiem genowym PhyB-PIF3. (A) Przykładowa tabela master mixu zawierającego Renilla jako kontrolę wewnętrzną. (B) Przykładowa tabela przygotowania mieszaniny DNA do testu Dual-Luciferase Reporter Assay w eksperymencie optogenetycznym PhyB-PIF3. (C) Przykładowa tabela przygotowania odczynnika do transfekcji PEI i aplikowania mieszaniny na komórki (kroplami). (D) Rozmieszczenie luksometru w celu ustawienia jasności diod LED.

Dyskusja

Opisany tutaj system LED został wykorzystany w naszym laboratorium do optymalizacji, scharakteryzowania i pracy z kilkoma narzędziami optogenetycznymi. W Kyriakakis et al.4 przetestowaliśmy wiele kombinacji przełączników genów PhyB-PIF równolegle. Następnie wykorzystaliśmy ten system do przetestowania impulsów światła o różnych częstotliwościach, aby zmierzyć kinetykę przełącznika genowego i efektywne natężenie światła. System ten został również wykorzystany do optymalizacji i scharakteryzowania dwóch systemów optogenetycznych, które wykorzystują światło niebieskie do stymulacji 5,6. Ponieważ tylko jedna dioda LED musiała być wystarczająco jasna, aby aktywować większość narzędzi optogenetycznych, zakup systemu z dużą liczbą diod LED nad każdą studzienką nie zawsze jest konieczny. Ta konfiguracja jest niedroga, niezawodna, łatwa do rekonfiguracji i nie wymaga wcześniejszej wiedzy elektrycznej, aby postępować zgodnie z protokołem montażu.

Na dodatkowych rysunkach uzupełniających 31–38 opisano, w jaki sposób można włączyć do systemu maksymalnie cztery diody LED. Chociaż może to ograniczyć niektóre eksperymenty wymagające dużej liczby warunków równoległych, można dodać więcej diod LED, zastępując zasilacz 9 V używany w tym protokole zasilaczem o wyższej mocy. Podobnie, kilka diod LED o mniejszej mocy można podłączyć równolegle do każdego obwodu. W tym ostatnim układzie niektóre diody LED nie będą sterowane indywidualnie, ale może to być przydatne, gdy wiele diod LED jest wymaganych do pokrycia większego obszaru. Po zapoznaniu się z elektroniką tego systemu istnieje wiele sposobów na jego dostosowanie. Dodatkowe strategie dostosowywania systemu obejmują umieszczenie diody LED dalej lub bliżej próbki i oświetlenie przez filtry/dyfuzory w celu uzyskania jednorodnych warunków oświetlenia lub zapobieżenia nagrzewaniu, jak w (rysunek uzupełniający 23) i Allen i wsp.5. Inną godną uwagi cechą naszej konstrukcji LED jest to, że jest ona pokryta żywicą epoksydową i ma zapięcie dotykowe z tyłu; pozwala to na bezpieczne umieszczenie diody LED praktycznie wszędzie: w inkubatorach, akwariach, klatkach dla zwierząt, ścianach itp.

Wiele eksperymentów, które wykorzystują optogenetykę do kontrolowania genów, szlaków sygnałowych i innej aktywności komórkowej, często wymaga pulsowania, obejmuje duże skale czasowe lub musi być przeprowadzanych w inkubatorze, co wymaga automatyzacji lub zdalnej manipulacji bez mikroskopu. Ten system LED był testowany nieprzerwanie przez kilka miesięcy w nawilżanym inkubatorze CO2 bez żadnych problemów. Dodatkowo, w przypadku systemów odwracalnych, takich jak systemy optogenetyczne PhyB, eksperymentator może być zmuszony do zaprogramowania specyficznych harmonogramów oświetlenia pulsacyjnego. W naszej poprzedniej pracy4 użyliśmy programów pulsujących do przetestowania dynamiki odwracalności przełącznika PhyB-PIF3 w komórkach ssaków za pośrednictwem interfejsu użytkownika. Korzystając z metodologii opisanej w tym manuskrypcie, programowanie protokołu pulsacyjnego jest łatwe, zapewniając elastyczność i autonomię potrzebną do wielu rodzajów eksperymentów optogenetycznych w sposób przyjazny dla użytkownika.

Najbardziej krytycznymi krokami w budowie tego systemu jest złożenie obwodu elektrycznego na płytce PCB i podłączenie komponentów, które są szczegółowo opisane w sekcji 1 i sekcji 2. Konieczne jest uważne wykonanie każdego kroku w tych sekcjach i dwukrotne sprawdzenie numerów otworków linia po linii przed każdego elementu. W sekcji 2 wyjaśniono, jak skonfigurować komponenty, które zostaną podłączone do obwodu. Aby komponenty łączyły się we właściwej orientacji, szczególnie ważne jest, aby upewnić się, że kolory czarnego i czerwonego przewodu na złączach przewód-przewód są zgodne. Drobne niedopatrzenia w tych dwóch sekcjach z dużym prawdopodobieństwem wpłyną na funkcjonalność systemu. Rzeczywiście, pierwszym krokiem w rozwiązywaniu problemów z tą metodą będzie sprawdzenie, czy obwód został zbudowany poprawnie i czy wszystkie połączenia są na swoim miejscu. Po drugie, szczególnie ważne jest sprawdzenie jakości pod kątem luźnych połączeń oraz przewodów pod kątem rozszerzających się drutów, które mogą powodować zwarcie w obwodzie. Trzecim krokiem byłoby upewnienie się, że diody LED działają poprawnie, co można zrobić za pomocą zasilacza lub akumulatora 1,5 V, przypinając dwa zaciski diody LED za pomocą zacisków krokodylkowych. Inną potencjalnie krytyczną kwestią jest zapobieganie nagrzewaniu się (w przypadku korzystania z diod LED o dużej mocy) lub rozpraszaniu światła w celu uzyskania szerszego oświetlenia. Aby rozwiązać te problemy, diody LED można zamontować na zewnątrz czarnej skrzynki z "folią prywatności" wewnątrz, jak opisano na rysunku uzupełniającym 23 i Allen et al.5. Ze względu na prostotę tego systemu, rozebranie go na części w celu weryfikacji, modyfikacji, modernizacji lub naprawy komponentów modułowych nie jest trudne.

Innym krytycznym czynnikiem dla indukowalnych systemów genowych jest rozważenie, ile aktywacji jest wymagane lub jak duża nieszczelność jest akceptowalna dla kontrolowanego systemu biologicznego. Jak pokazano na rycinie 6, mogą się one różnić w zależności od ilości reporterowego DNA. Ponadto wydajność transfekcji, a tym samym liczba kopii konstruktów reporterowych w każdej komórce, będzie się różnić. W przypadku niektórych eksperymentów korzystne może być stworzenie linii komórkowej ze stałą ilością składników reporterowych lub przełączników genów PhyB i badanie przesiewowe klonów o pożądanym zakresie indukowanej ekspresji, jak to jest powszechnie robione w przypadku systemów indukowanych przez leki. Ze względu na wielkość i niestabilność plazmidu lentiwirusowego pPK-2304, wykonaliśmy również nielentiwirusowe wersje plazmidu przełącznika PhyB w szkielecie pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) i pPK-352 (Addgene #157922).

Budując ten system oświetlenia LED zgodnie z tym protokołem, użytkownicy mają wszystkie komponenty niezbędne do przeprowadzenia szerokiej gamy eksperymentów optogenetycznych in vitro i in vivo. W połączeniu z instrukcjami dotyczącymi stosowania PhyB-PIF3 w komórkach ssaków, protokół ten pozwoli osobom niebędącym inżynierami i biologom na elastyczne i skuteczne wykorzystanie optogenetyki opartej na PhyB w różnych kontekstach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang i Molly Allen za testowanie różnych wersji systemu LED w trakcie jego rozwoju. Praca ta była wspierana przez Kavli Institute for Brain and Mind na UC San Diego i Salk Institute, National Science Foundation za pośrednictwem NSF Center for Science of Information w ramach grantu CCF-0939370, NIH Grant NS060847 i NIH Grant R21DC018237.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18AWG 2pin CZERWONY przewódAmazon15M-28AWG-2468Niedrogi przewód do podłączenia diod LED do obwodu zasilania.
https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1
Potencjometr 1K OhmAmazon52161500potencjometr potencjometru 2 x 1K Ohm + 2 x czarne pokrętło sterujące.
https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
Silikonowe złącze JST o grubości 20SIM & NAT 5,9 cala 2-pinowe męskie żeńskie złącza wtykowe JST RCYSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
22 AWG solidne przewody połączenioweAmazonWJW-60B-RJameco Valuepro WJW-60B-R Zestaw zworek przewodów 350 każdy 22 AWG, 14 długości 10 kolorów 25 każdej długości.
https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
560 omów 1/2 wata 1% tolerancji Amazona14051600ux0301Uxcell a14051600ux0301 60-częściowy przewód osiowy 1% tolerancji Kolorowy pierścień Rezystor z folii metalowej Rezystancja, 560 Ohm 1 / 2W.
https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN
820 ohm 1/2watt 1% tolerancjiAmazonTTL-A-8035-50EaZestaw rezystora metalowego 50Ea 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W).
https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor
męski na B męski (10 stóp)AmazonCzęść # 30-001-10Bdołączony do Arduino nie mieści się dobrze w pudełku.
https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Ardiuino UNO odpowiednikAmazonElegoo EL-CB-001UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 z USB do Arduino.
https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1
Uchwyt ArduinoDigikeyX000018Pasuje bardzo ciasno.
https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632
Czarne skrzynki do obwodów i komór świetlnychAmazon1591ESBKHammond 1591ESBK ABS Project Box.
https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Niebieska dioda LEDDigikeyLXML-PB01-0040LED LUXEON REBEL NIEBIESKI SMD. Używa "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134
Opaski kabloweAmazonsd027Tarvol Nylonowe opaski zaciskowe (zestaw 100 sztuk) 8 cali z samoblokującymi się opaskami kablowymi (biały).
Klipsy do lodówki https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch CommandAmazon17210CLRKlipsy do przytrzymywania płytki drukowanej wewnątrz czarnej skrzynki. Można również użyć listew sterujących.
https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
Cyan LEDDigikeyLXML-PE01-0070LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Wykorzystuje taśmę izolacyjną "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd
- 3M Scotch #35 Taśma izolacyjna Value PackAmazon03429NATaśma izolacyjna Scotch 700, 03429NA, 3/4 cala x 66 ft.
https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK
Dalred LED 720nmLuxeon Star LEDLXML-PF01Daleka czerwień (720nm) LUXEON Rebel LED. Wykorzystuje "Saber 20 mm Star base"
https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW
Farred LED 740nmUshioEDC740D-1100-S5Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa
https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf
Farred LED 780nmUshioEDC780D-1100Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nmUshioEDC810D-1100Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nmUshioEDC850D-1100Wykorzystuje przelotki "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf
AmazonPico 6120DSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G
Klipsy do włosów/aligatoraAmazon1-3/4 cala (45 mm) - spinki do włosów Jednobolcowe metalowe klipsy krokodylkowe Akcesoria do łuków do włosów -Srebrne, 50 szt.
https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
Podstawa LEDLuxeon Star Diody LEDLXB-RS20ASaber 20 mm Star Blank Aluminiowa podstawa MCPCB do diod LED Rebel
https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds
LED PCB dla diod LEDUshioRozwiązania Adura LEDPakiet LED STAR XP 3535Pasuje do wielu innych diod LED firmy Ushio
http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led
Loctite Epoxy Clear Wielofunkcyjna, 0,85-uncjowa strzykawkaAmazon1943587Loctite Epoxy Clear Wielofunkcyjna, 0,85 uncji płynu.
https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C
NTE Heat Shrink 2: 1 Różne kolory i rozmiary 160 sztukAmazonB000FIDTYGSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Wiszące paski na rzepyAmazonPH204-16NADzięki nim możesz zawiesić diody LED w wielu miejscach.
https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H
ZasilaczAmazontb013Każda inna przetwornica AC/DC 9V 1.5Z wystarczy, ponieważ i tak odcinamy koniec.
https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1
Przełącznik zasilania Przełącznik kołyskowyAmazonSIXQJZMLSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011
Łączniki prostokątne - do przewodów zaciskanychDigikey2183-1905-ND6 Łączniki prostokątne - Obudowy Czarne 0,100" (2,54mm)
https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB
Czerwona dioda LEDDigikeyLXM3-PD01LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Wykorzystuje papier ścierny "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd
ściernyAmazonB002NEV6GS3M Wetordry, 03022, ziarnistość 800, 3 2/3 cala x 9 cali.
https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1
Lut do drutów i elementów obwodówAmazonMudder Bezołowiowy drut lutowniczy Sn99 Ag0,3 Cu0,7 z rdzeniem kalafoniowym do elektrycznego 0,22 funta (0,6 mm)Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY
Płytka stykowa do do budowy obwoduAmazonGK1007Gikfun Płytka prototypowa do Pozłacane wykończenie Proto Board PCB DIY Kit dla Arduino (zestaw 5 sztuk) GK1007.
https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1
Wiertło łopatkoweAmazonIrwin 88811Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit
TranzystorNewark2N2222AMożna kupić w wielu miejscach.
http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197
Regulator napięciaNewarkLM317TOdpowiednik NTE956.
https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|dopasowanie|p|slid||produkt||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|& s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!! g!! LM317T& CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC
Tablet z systemem Windows 10AmazonB08BYTT79YKażdy komputer z systemem Windows 10 zrobi.
> https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1Cell Culture Reodczynniki
Ludzka nerka embrionalna 293 komórki HEK293ATCCATCC CRL-1573Common Cell line.
https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher26140079Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco" s Zmodyfikowany Eagle Średnio-Wysoki Poziom GlukozyThermoFisher11965− 092Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycynyThermoFisher15140122Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122
White Corning 96-dołkowe stałe czarne lub białe mikropłytki polistyrenoweThermoFisher07-200-589Preferowane są białe talerze. Nie używaj przezroczystych płytek.
https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852
PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40 000)PolySciences24765-1Można zastąpić innym odczynnikiem do transfekcji.
https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Nazwa sprzętu
Szczypce do cięcia bocznego (110mm)AmazonProskit 1PK-037SSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11
Dremil 3000 z narzędziem tnącym i szlifierkąAmazonDremel 3000Zestaw narzędzi obrotowych Dremel 3000-2/28 o zmiennej prędkości - 1 Nasadki i 28 Akcesoria - szlifierka, szlifierka, polerka, frezarka i grawer.
https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Narzędzie do cięcia i szlifowania DremilAmazonDremel 200-1/15Każdy podobny Dremil będzie działać.
https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Końcówka szlifierska DremilAmazonDremel 84922Kamień szlifierski z węglika krzemu.
https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN Oryginalny Deluxe SOLDAPULLTAmazonDS017Do usuwania lutu/błędów.
https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Pomocna dłoń ze szkłem powiększającymAmazonSE MZ101BSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Szczypce mikro ze spiczastym noskiemAmazonHakko CHP PN-20-MStalowe mikroszczypce Super Specialty ze szpiczastym noskiem i gładkimi szczękami, 1,0 mm Nose.
https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Mała śruba sterownikiAmazonWiha 26197Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set
LutownicacyfrowaAmazon Yihua 939D+Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR
TraceTech No-Clean Flux PenAmazon2507-NTech Spray 2507-N No-Clean Topnik Dozujący długopis, 11,5 mL.
https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1
Weller WSA350 120v Stołowy pochłaniacz dymuAmazonWSA350Do bezpiecznego.
https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK
Szczypce do ściągania izolacjiAmazonCSP-30-7Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG
IWISS IWS-3220M Narzędzie do zaciskania pinów mikrozłączy 0,03-0,52 mm i sup2; 32-20AWGAmazonIWS-3220MSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Amazon Papier

Bibliografia

  1. Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
  2. Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
  3. Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952(2019).
  4. Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), electronic resource 706-717 (2018).
  5. Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).
  6. Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
  7. Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production. Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).
  8. Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
  9. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  10. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737(2020).
  11. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
  12. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  13. Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779(2013).
  14. Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. A light-triggered protein secretion system. The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).
  15. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  16. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
  17. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  18. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256(2015).
  19. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).
  20. Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
  21. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  22. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  23. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  24. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77(2013).
  25. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
  26. Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
  27. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  28. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
  29. Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), electronic resource 240-248 (2018).
  30. Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
  31. Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
  32. Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System oświetlenia LEDmontaż obwodówtechniki lutowaniasterowanie komputerowekonstrukcja diod LEDkontrola długości faliautomatyzacja czasowastymulacja biologicznaurządzenie niskokosztowe
Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.