Artykuł metodologiczny

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

DOI:

10.3791/61914

⸱

12 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrolowanie procesów biologicznych za pomocą światła zwiększyło dokładność i szybkość, z jaką badacze mogą manipulować wieloma procesami biologicznymi. Kontrola optyczna pozwala na bezprecedensową zdolność do analizowania funkcji i ma potencjał do umożliwienia nowatorskich terapii genetycznych. Jednak eksperymenty optogenetyczne wymagają odpowiednich źródeł światła z kontrolą przestrzenną, czasową lub intensywnością, co często stanowi wąskie gardło dla badaczy. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zbudować tani i wszechstronny system oświetlenia LED, który można łatwo dostosować do różnych dostępnych narzędzi optogenetycznych. System ten można skonfigurować do sterowania ręcznego lub komputerowego z regulowaną intensywnością diod LED. Udostępniamy ilustrowany przewodnik krok po kroku dotyczący budowy obwodu, sterowania nim za pomocą komputera i konstruowania diod LED. Aby ułatwić montaż tego urządzenia, omawiamy również kilka podstawowych technik i wyjaśniamy obwody używane do sterowania diodami LED. Korzystając z naszego interfejsu użytkownika o otwartym kodzie źródłowym, użytkownicy mogą zautomatyzować precyzyjne odmierzanie czasu i pulsowanie światła na komputerze osobistym (PC) lub niedrogim tablecie. Ta automatyzacja sprawia, że system jest przydatny w eksperymentach, które wykorzystują diody LED do kontrolowania genów, szlaków sygnałowych i innych działań komórkowych, które obejmują duże skale czasowe. W przypadku tego protokołu nie jest wymagana wcześniejsza wiedza z zakresu elektroniki, aby zbudować wszystkie potrzebne części lub wykorzystać system oświetlenia do przeprowadzania eksperymentów optogenetycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia optogenetyczne stają się wszechobecne, a nowe technologie są stale rozwijane do optycznej kontroli procesów biologicznych, takich jak ekspresja genów, sygnalizacja komórkowa i wiele innych1,2,3. Zdolność do kontrolowania procesów komórkowych za pomocą światła pozwala na szybką kinetykę, ścisłą kontrolę przestrzenną i regulację zależną od dawki, którą można kontrolować za pomocą natężenia światła i czasu ekspozycji. Aby korzystać z tych narzędzi, niezbędne jest urządzenie do kontrolowania tych parametrów. Niedawno opracowaliśmy genetycznie kodowany przełącznik genów ssaków PhyB-PIF3, który odwracalnie aktywuje i dezaktywuje geny za pomocą odpowiednio światła czerwonego/dalekiej czerwieni4. System ten został przetestowany na kilku liniach komórkowych ssaków i umożliwił niezrównaną indukcję ekspresji genów nawet przy bardzo małych ilościach światła, w tym impulsach światła. Naukowcy, którzy chcą korzystać z przełącznika PhyB i podobnych narzędzi5,6 często proszą o informacje na temat metod kontrolowania intensywności i czasu trwania oświetlenia. Dlatego opracowaliśmy ten protokół z instrukcjami krok po kroku, aby umożliwić szersze zastosowanie tych narzędzi w optogenetyce.

Przed powszechnym zastosowaniem diod LED, szerokopasmowe źródła światła z filtrami były używane do badania białek reagujących na światło, takich jak fitochromy7. Ostatnio opublikowano niektóre systemy oświetlenia LED wraz z narzędziami optogenetycznymi8,9,10,11,12, ale te protokoły mogą wymagać znacznej wiedzy specjalistycznej w zakresie elektroniki/oprogramowania, wymagają specjalistycznego sprzętu (np. drukarek 3D, maszyn do cięcia laserowego lub fotomasek) lub nie zawierają instrukcji krok po kroku Naukowcy musieliby rozmieścić swoje potrzeby badawcze. Chociaż niezależna kontrola poszczególnych studzienek w płytce wielodołkowej może być przydatna, często nie jest konieczna, gdy badacze muszą porównać tylko kilka różnych próbek w świetle jasnym i ciemnym lub czerwonym lub w świetle dalekiej czerwieni. Ponadto wiele istniejących systemów komercyjnych jest drogich, z ograniczonymi możliwościami dostosowywania. Jednak diody LED opisane w tym protokole są ekonomiczne, jasne i można je montować na wiele sposobów; Dzięki temu mogą być używane do oświetlania kilku różnych rodzajów próbek. Dzięki dostarczonemu protokołowi i oprogramowaniu, diody LED od ultrafioletu (UV) do NIR mogą być używane i kontrolowane za pomocą oprogramowania do przeprowadzania eksperymentów optogenetycznych przy użyciu UVR813,14, Dronpa15,16, domeny LOV17,18, funkcja krokowa Opsins19,20, CRY221,22, PhyB4,23,24,25, fitochromy bakteryjne26,27,28,29 i inne systemy reagujące na światło30,31,32.

Ten protokół stanowi samouczek do montażu obwodów i innego sprzętu potrzebnego do kontrolowania różnych parametrów stymulacji światłem, a także narzędzi molekularnych/komórkowych do przeprowadzenia eksperymentu optogenetycznego. Ponadto zgłaszamy plazmidy zoptymalizowane przez Kyriakakis et al.4, które są mniejsze i bardziej stabilne do klonowania. Dzięki temu protokołowi biolodzy bez doświadczenia w elektronice i optyce mogą budować systemy oświetleniowe, które są elastyczne i wytrzymałe. Krok po kroku pokazujemy, jak budować systemy LED, usuwając techniczne wąskie gardło dla szerszego zastosowania narzędzi optogenetycznych. System ten może być z łatwością stosowany w większości inkubatorów do hodowli komórkowych, nawet jeśli nie zawierają one portów przewodowych. Na przykład przez ponad 6 miesięcy trzymaliśmy system LED w nawilżonym inkubatorze CO2 bez spadku wydajności. Wyjaśniamy również, jak podłączyć system LED do komputera i połączyć go z oprogramowaniem typu open source, które udostępniamy na GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Budowanie systemu przy użyciu tego protokołu zapewnia badaczom podstawową wiedzę do debugowania potencjalnych problemów, wymiany części oraz ulepszania/rozszerzania funkcjonalności.

Przegląd systemu

Budowa systemu oświetlenia obejmuje (1) zbudowanie obwodu elektronicznego, (2) zbudowanie urządzeń peryferyjnych (przewód zasilający, wyłącznik zasilania, itp.), (3) zbudowanie diod LED, (4) montaż wszystkich tych komponentów i (5) zainstalowanie oprogramowania do sterowania diodami LED za pomocą interfejsu użytkownika (Rysunek 1A). Po zakończeniu system oświetlenia może sterować maksymalnie czterema diodami LED niezależnie za pomocą interfejsu użytkownika (Rysunek 1B). Interfejs użytkownika umożliwia każdej diodzie LED pulsowanie w określonych odstępach czasu i wyłączanie po określonym czasie. Istnieje również opóźnienie startu, aby rozpocząć programy oświetlenia o określonej godzinie. Potencjometry (POT) regulują intensywność każdej diody LED niezależnie lub mogą być używane do ręcznego sterowania diodami LED bez komputera. Przewody do diod LED mogą mieć dowolną niestandardową długość, co pozwala na łatwe umieszczenie ich w inkubatorze lub laboratorium. Ze względu na dużą moc tych diod LED można je wykorzystać do oświetlenia dużego obszaru za pomocą pojedynczej diody LED z dużej odległości.

Opis sterownika LED

Aby zasilić i kontrolować intensywność diod LED, ten protokół przejdzie przez kolejne kroki w celu zbudowania "sterownika LED". Każda dioda LED ma zakres napięć, w których pracuje (Rysunek 1C). Podczas pracy napięcie wyjściowe regulatora, które steruje natężeniem światła, można dostroić za pomocą potencjometru. POT zmienia rezystancję, dostosowując napięcie wyjściowe / jasność. Strojenie za pomocą POT 1kΩ (1 kiloom) daje to, co nazywamy "obwodem wysokiego napięcia" i ma zakres od 1,35 V do 2,9 V. Ponieważ 2,9 V jest zbyt wysokie do obsługi diod LED o niższym napięciu (Rysunek 1C), pokazujemy pojedynczą modyfikację (Rezystor 3 lub "R3" Rysunek uzupełniający 1A), która ogranicza zakres do dopasowania do niskonapięciowych diod LED. R3 służy do obniżenia maksymalnego napięcia przyłożonego do diod LED do 1,85 V (montaż szczegółowo opisany na rysunku uzupełniającym 8), gdy są one równoległe do potencjometru. Wykorzystując napięcie do sterowania jasnością zamiast prądu, system jest bardziej elastyczny w przypadku diod LED o różnych napięciach roboczych. Rysunek 1C zawiera listę diod LED wysokiego i niskiego napięcia, które pomogą w wyborze optymalnego obwodu. Taka konstrukcja utrzymuje minimalne napięcie na tyle niskie, że dioda LED jest całkowicie wyłączona, gdy potencjometr jest wyłączony i nie pozwala, aby napięcie przekroczyło typowe napięcie robocze diody LED. Do optogenetyki PhyB używamy diod LED w kolorze głębokiej czerwieni i dalekiej czerwieni, które wykorzystują obwód niskiego napięcia.

Opis systemu sterowania komputerowego LED

System oświetlenia LED może być używany do stałego oświetlenia bez komputera czy mikrokontrolera. Jednak do programów pulsacyjnych i do sterowania indywidualnym czasem diody LED musi być zainstalowany mikrokontroler. Aby użyć mikrokontrolera do sterowania diodami LED, wymagany jest tranzystor do podłączenia mikrokontrolera do obwodu. Tranzystor ten wyczuwa napięcie z mikrokontrolera i przełącza się z przewodzącego lub izolującego. Do sterowania włączaniem i wyłączaniem używamy tak zwanego "tranzystora przełączającego NPN" (2N22222) jako sterowanego bocznika w poprzek R2 (rysunek uzupełniający 1A). Gdy napięcie z mikrokontrolera zostanie przyłożone do bazy tranzystora, tranzystor staje się przewodzący i sprawia, że napięcie LED jest niskie, wyłączając diodę LED. W ten sposób stany włączenia i wyłączenia diody LED i tranzystora są bezpośrednio kontrolowane przez mikrokontroler, który jest sterowany przez oprogramowanie zainstalowane na komputerze.

Do stworzenia systemu oświetlenia wymagane są następujące kroki: Zbuduj obwód elektryczny; zbuduj zasilanie, ręczny wyłącznik zasilania, POTy i połączenie mikrokontrolera; zbuduj diody LED; pomieścisz czarną skrzynkę, aby pasowała do systemu oświetlenia; podłącz wszystkie okablowanie i urządzenia; zainstaluj oprogramowanie sterujące LED, stymuluj komórki światłem; zmierz ekspresję genów za pomocą podwójnego testu lucyferazy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbuduj obwód elektryczny

UWAGA: Protokół budowy pojedynczego obwodu dla dostępnej diody LED jest opisany tutaj. Instrukcje, jak rozszerzyć to do czterech diod LED, znajdują się w informacjach dodatkowych.

  1. Włącz pochłaniacz dymu i lutownicę. Dodaj wodę do gąbki do wycierania, miej pod ręką lut.
    UWAGA: Upewnij się, że podjąłeś środki ostrożności, aby usunąć dym i zapobiec poparzeniom.
  2. Rozpocznij elementów obwodu do płytki drukowanej (płytki PCB) w kolejności pokazanej w panelach dodatkowych.
    UWAGA: Użyj niewielkiej ilości lutu na końcówce lutownicy, aby najpierw podgrzać metal elementu i płytkę PCB, a następnie stopić dodatkowy lut bezpośrednio na komponentach; Flux może bardzo pomóc.
  3. przewody i elementy połączeniowe (rysunek uzupełniający 2 i rysunek uzupełniający 3).
    1. W przypadku przewodów połączeniowych (izolowane okablowanie, które łączy dwa punkty na płytce drukowanej), użyj dwóch kawałków pomarańczowych [7.6 mm (0.3 cala)] i żółtych [12 mm (0.4 cala)] przewodów z zestawu zworek.
    2. Przypnij płytkę PCB do "pomocnych dłoni" i włóż przewody połączeniowe w następujące otwory, zegnij zaciski pod kątem 45 stopni i dodaj strumień (Rysunek 2, Rysunek uzupełniający 2 i Rysunek uzupełniający 3): a1 i a3 → uziemienie (-) (pomarańczowy), a7 → zasilacz (+) #7 (żółty), d2 → d6 (żółty).
    3. , a następnie przytnij tył przewodów.
    4. Włóż regulator napięcia LM317T w następujące otwory, zegnij kołki i dodaj strumień (Rysunek 2 i Rysunek Uzupełniający 4): Adj → e5, Vout → e6, Vin → e7.
    5. Najpierw lewy i prawy zacisk, przytnij je, a następnie i przytnij środkowy zacisk.
    6. Aby ustawić zakres niskiego napięcia obwodu, włóż rezystor 820 Ω do końca w otwory, i przytnij c2 → c5 (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 5).
    7. Aby umożliwić sterowanie diodami LED przez mikrokontroler, włóż tranzystor do b3–b5 (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 6): Kolektor → b3, Podstawa → b4, Emiter → b5.
      UWAGA: Należy zwrócić uwagę na orientację tranzystora, aby prawidłowo go włożyć; sprawdź specyfikacje, aby znaleźć oznaczenie kolektora, podstawy i emitera.
  4. złącza przewód-przewód dla POT, diody LED, mikrokontrolera i źródła zasilania.
    UWAGA: Zwróć uwagę na kolor przewodów złączy przewód-przewód oraz na to, czy używasz żeńskiego czy męskiego złącza przewód-przewód.
    1. Określ, czy dla żądanej diody LED wymagany jest obwód "niskiego napięcia" czy obwód "wysokiego napięcia" (Rysunek 1C).
      UWAGA: Jeśli dioda LED znajduje się na liście "low voltage", wymagany jest rezystor równoległy do POT.
    2. W przypadku obwodu "niskonapięciowego" lub "wysokiego napięcia" należy umieścić przewód z żeńskiego złącza przewód-przewód przez otwór a5 (rysunek uzupełniający 7). Nie jeszcze na miejscu, jeśli wykonujesz obwód niskiego napięcia.
      UWAGA: Skręć gołe końce drutu, aby małe druciane włoski nie łuszczyły się. Jeśli drut wydaje się zbyt gruby, aby przepchnąć go przez otwór bez strzępienia, odetnij 2–6 pasm, a następnie skręć je z powrotem (rysunek uzupełniający 7B–D).
    3. Jeśli wykonujesz obwód "wysokiego napięcia", przejdź do kroku 1.4.5. W przypadku tworzenia obwodu "niskiego napięcia" przepchnij rezystor 560 Ω przez ten sam otwór (a5) i go za pomocą przewodu złącza przewód-przewód.
    4. Podłącz drugi koniec rezystora do masy (rysunek uzupełniający 7G).
    5. Włóż drugi koniec żeńskiego złącza przewód-przewód przylutowanego do otworu a5 łączącego go z uziemieniem i (rysunek uzupełniający 8A,B).
    6. W przypadku podłączenia mikrokontrolera włóż jeden koniec męskiego złącza przewód-przewód do otworu a4, a drugi do otworu podłączonego do uziemienia (rysunek uzupełniający 9A–C).
    7. W przypadku połączenia LED włóż jeden koniec żeńskiego złącza przewód-przewód do otworu a2, a drugi koniec do otworu podłączonego do uziemienia (rysunek uzupełniający 9D,E).

2. Zbuduj zasilacz, ręczny wyłącznik zasilania, POTy i podłączenie mikrokontrolera

  1. Zbuduj zasilacz.
    1. pomarańczową zworkę [7.6 mm (0.3 cala)] od a29 do masy (rysunek uzupełniający 10).
    2. żeńskie złącze przewód-przewód od a30 do zasilacza (+) (rysunek uzupełniający 11A–C).
    3. męskie złącze przewód-przewód od c29 do c30 (rysunek uzupełniający 11D–F).
    4. Odetnij złącze od przewodu zasilającego, odsłoń przewody i zdejmij je (Rysunek uzupełniający 12A–C).
    5. Dodaj topnik do przewodów przed za pomocą pisaka do topnika (rysunek uzupełniający 3G).
    6. Umieść rurkę termokurczliwą 3.18 mm (1/8 cala) wokół męskiego złącza przewód-przewód, a grubszy element 4.76 mm (3/16 cala) nad przewodem zasilającym (Rysunek uzupełniający 12D).
    7. Skręć przewody z zasilacza i męskiego złącza przewód-przewód i (Rysunek uzupełniający 12E, 13A,B).
    8. Umieść rurkę termokurczliwą o mniejszej średnicy 3.18 mm (1/8 cala) nad połączeniami i obkurcz je opalarką (rysunek uzupełniający 13C,D).
    9. Umieść rurkę termokurczliwą o większej średnicy 4.76 mm (3/16 cala) na mniejszej rurce termokurczliwej 3.18 mm (1/8 cala) i ponownie podgrzej (Rysunek uzupełniający 13E,F).
  2. Zbuduj ręczny wyłącznik zasilania.
    1. Umieść rurkę termokurczliwą 3.18 mm (1/8 cala) na przewodach przełącznika (Rysunek uzupełniający 14A).
    2. Skręć i przewody męskiego złącza przewód-przewód (rysunek uzupełniający 14B,C).
    3. Umieść rurkę termokurczliwą 3.18 mm (1/8 cala) na lutowanych sekcjach i obkurcz za pomocą opalarki (rysunek uzupełniający 14D,E).
  3. Podłącz męskie złącze przewód-przewód do POT.
    1. Zapętlić przewód złącza przewód-przewód wokół środkowego zacisku POT (Rysunek uzupełniający 15B).
    2. Skręć przewód, który jest ciasno owinięty wokół zacisku i go (Rysunek uzupełniający 15C).
      UWAGA: Małe szczypce precyzyjne mogą pomóc w wykonaniu ciasnego skrętu.
    3. Powtórz z czerwonym przewodem podłączonym do zacisku, jak na rysunku uzupełniającym 15D.
    4. Użyj szczypiec, aby złamać metalową wypustkę w pobliżu czerwonej strzałki (Rysunek uzupełniający 15E,F).
  4. Zbuduj połączenie z mikrokontrolerem (wymagane tylko w przypadku diod LED sterowanych komputerowo).
    1. W przypadku tworzenia sterownika LED dla więcej niż jednej diody LED, odetnij czarne przewody ze wszystkich oprócz jednego żeńskiego złącza przewód-przewód (Rysunek uzupełniający 16A).
    2. Zaciśnij końce złączy przewód-przewód, jak pokazano (rysunek uzupełniający 16B–D).
    3. Przepchnij zaciśnięte końce przez prostokątne złącze (rysunek uzupełniający 16E).

3. Zbuduj diody LED

  1. Zdjąć izolację z końcówek drutu (~5 mm) i nałożyć topnik za pomocą pisaka do topnika, jak na rysunku uzupełniającym 3G.
    UWAGA: Aby skutecznie przewody do podstawy LED, należy dodać topnik do styków podstawy LED i przewodów.
  2. Ocynuj drut, podgrzewając drut od dołu i dodając lut od góry (rysunek uzupełniający 17B).
  3. Użyj pisaka z topnikiem, aby umieścić topnik na powierzchni styku podstawy LED (rysunek uzupełniający 17C).
  4. Umieść dużą ilość lutu na dużym grocie lutowniczym (~4–5 mm) (Rysunek uzupełniający 17D), użyj go do podgrzania podstawy LED na styku (Rysunek uzupełniający 17E). Po kilku sekundach przeciągnij lut w poprzek styku (rysunek uzupełniający 17F). Powtórz kroki 3.3–3.4 na drugim styku (rysunek uzupełniający 17G).
    UWAGA: Podstawa LED może się bardzo nagrzać podczas. Umieść podstawę LED na powierzchni, która nie stopi się ani nie spali.
  5. Przypnij przewód do styku "C+" (katoda) za pomocą spinek do włosów (rysunek uzupełniający 18A).
  6. Umieść dużą ilość lutu na dużej końcówce lutowniczej (rysunek uzupełniający 18B) i dociśnij ją do drutu, aż lut na podstawie LED stopi się (rysunek uzupełniający 18C). Przytrzymaj drut (Rysunek uzupełniający 18D) i wyjmij lutownicę, trzymając drut na miejscu (Rysunek uzupełniający 18E).
  7. Umieść niewielką ilość pasty lutowniczej na padach do połączeń LED (Rysunek uzupełniający 19A,B) i umieść diodę LED na padach za pomocą kleszczyków (Rysunek uzupełniający 19C).
    UWAGA: Jeśli umieszczenie jest trochę nieprawidłowe, jest w porządku; Trafi na miejsce, gdy pasta lutownicza się stopi.
  8. Przytrzymaj czerwony przewód na "A+" (anodzie) i przypnij go spinką do włosów (rysunek uzupełniający 20A–C).
  9. Umieść dużą ilość lutu na dużym grocie lutowniczym (rysunek uzupełniający 20D) i dociśnij go do drutu, aż lut na podstawie LED i pasta lutownicza pod diodą LED stopią się (rysunek uzupełniający 20E).
    UWAGA: Po stopieniu pasty lutowniczej kolor staje się srebrny (rysunek uzupełniający 20H,I).
  10. Wybierz długość przewodu potrzebną do żądanej konfiguracji. Zdejmij izolację z przewodów LED i męskiego złącza przewód-przewód (rysunek uzupełniający 21A), a następnie dodaj topnik, jak na rysunku uzupełniającym 3G.
  11. Umieść rurkę termokurczliwą na drutach. Użyj rurki termokurczliwej 3.18 mm (1/8 cala) na złączach przewód-przewód i rurki termokurczliwej 4.76 mm (3/16 cala) na przewodzie (Rysunek uzupełniający 21B).
  12. Przypnij złącze przewód-przewód za pomocą "pomocnych rąk" i przekręć koniec złącza z przewodem (Rysunek uzupełniający 21C) i je. Powtórz z drugim przewodem (rysunek uzupełniający 21D,E).
  13. Umieść rurki termokurczliwe 3.18 mm (1/8 cala) na lutowiu i obkurcz (rysunek uzupełniający 21F–G).
  14. Umieść rurkę termokurczliwą 4.76 mm (3/16 cala) na rurce termokurczliwej 3.18 mm (1/8 cala) i obkurcz (rysunek uzupełniający 21H–I).
  15. Przypnij przewody LED do "pomocnych dłoni" taśmą pod nimi (Rysunek uzupełniający 22A).
  16. Wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z instrukcjami producenta i rozprowadź na wierzchu przylutowanej diody LED (rysunek uzupełniający 22B). Pozostaw na noc do utwardzenia.
  17. W przypadku montażu za pomocą łącznika dotykowego odetnij mały kawałek łącznika dotykowego (Rysunek uzupełniający 23A) i dociśnij go do tylnej części diody LED przez 30 sekund.
  18. Użyj szybkoobrotowego narzędzia obrotowego, aby wykonać nacięcie na pokrywie czarnego pudełka (rysunek uzupełniający 23C–E).
  19. Zbuduj mocowanie dla pojedynczej diody LED za pomocą folii zapewniającej prywatność.
    1. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć otwór o średnicy 1.75 cm (11/16 cala) w górnej części czarnej skrzynki, w której zostanie umieszczona dioda LED (rysunek uzupełniający 24A).
    2. Za pomocą szybkoobrotowego narzędzia obrotowego wykonaj nacięcie po jednej stronie otworu, aby zrobić miejsce na przewód LED, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 24A.
    3. Wytnij kawałek folii zapewniającej prywatność (25–30 mm) i przyklej taśmę do wewnętrznej strony czarnego pudełka, zakrywając otwór, przez który będzie oświetlać się dioda LED (rysunek uzupełniający 24A).
    4. Umieść diodę LED na zewnątrz czarnego pudełka na górze otworu z folią zapewniającą prywatność i przyklej taśmą izolacyjną (rysunek uzupełniający 24B–E).

4. Umieść czarną skrzynkę, aby pasowała do systemu oświetlenia

  1. W przypadku systemu z czterema diodami LED wywierć cztery otwory o średnicy 0.83 cm (21/64 cala) w pokrywie w odległości 3.81 cm (1.5 cala) od siebie, w których zostaną przymocowane potencjometry (rysunek uzupełniający 25).
  2. Za pomocą szybkoobrotowego narzędzia obrotowego wytnij prostokątny otwór o wymiarach 1.19 cm x 1.90 cm (0.47 cala x 0.75 cala) w lewym górnym rogu (Rysunek uzupełniający 25).
  3. Za pomocą wiertła łopatkowego wywierć otwór o średnicy 1.75 cm (11/16 cala) w czarnej skrzynce (rysunek uzupełniający 26).
  4. Spiłuj otwory i włóż przelotkę do wywierconego otworu (Rysunek uzupełniający 26).
  5. W przypadku diod LED sterowanych komputerowo należy przeszlifować papierem ściernym obszar, w którym mikrokontroler zostanie przyklejony w czarnym pudełku, a także dolną stronę uchwytu mikrokontrolera.
  6. Zatrzaśnij mikrokontroler na uchwycie przed zamocowaniem uchwytu w czarnej skrzynce, a następnie załóż je epoksydowo na miejsce (rysunek uzupełniający 27A).
  7. Użyj papieru ściernego, aby przeszlifować spód dwóch klipsów i obszar w czarnej skrzynce, w którym zostanie umieszczony obwód, a następnie zabezpiecz klipsy wewnątrz czarnej skrzynki za pomocą żywicy epoksydowej (rysunek uzupełniający 27A).
  8. Przymocuj płytkę PCB do zacisków (rysunek uzupełniający 27B).
  9. Przepchnij wyłącznik zasilania przez kwadratowy otwór w pokrywie wykonany na rysunku uzupełniającym 25 i zatrzaśnij go na miejscu (rysunek uzupełniający 28A).
  10. Przepchnij garnki przez otwory w pokrywie, przykręć na miejsce (rysunek uzupełniający 28A) i umieść pokrętło na garnku (rysunek uzupełniający 28B).

5. Podłącz wszystkie okablowanie i urządzenia

  1. Oznacz złącza przewód-przewód (np. LED, POT, COM) (rysunek uzupełniający 29A).
  2. Podłącz zaciskane złącza wykonane w kroku 2.4 (Rysunek uzupełniający 16) do męskiego złącza przewód-przewód między dwoma złączami żeńskimi (POT i LED) (Rysunki uzupełniające 7A i S37).
  3. Podłącz zaciśnięte końce do mikrokontrolera (rysunek uzupełniający 30).
  4. Przeciągnij USB przez przelotkę i podłącz go do mikrokontrolera.
  5. Przeciągnij przewody diod LED przez przepust i podłącz do żeńskiego złącza przewód-przewód po lewej stronie połączenia mikrokontrolera (rysunki uzupełniające 9D i 38).
  6. Przeciągnij przewód zasilający przez przepustę i podłącz go do męskiego złącza przewód-przewód po prawej stronie płytki PCB (rysunek uzupełniający 11D).
  7. Podłącz męskie złącze przewód-przewód z wyłącznika zasilania do żeńskiego złącza przewód-przewód po prawej stronie płytki PCB (rysunek uzupełniający 11A).
  8. Podłącz męskie złącza przewód-przewód z potencjometrów na pokrywie do żeńskich złączy przewód-przewód na płytce PCB (rysunki uzupełniające 8 i 36).
    UWAGA: Nie włączaj obwodu bez podłączonych potencjometrów.

6. Zainstaluj oprogramowanie sterujące diodami LED

UWAGA: Zobacz szczegółowe instrukcje instalacji oprogramowania w pliku uzupełniającym na Githubie. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do programowania mikrokontrolera
  2. Pobierz i zainstaluj menedżera pakietów.
  3. Zaprogramuj mikrokontroler.
  4. Pobierz i zainstaluj aparat środowiska uruchomieniowego.
  5. Pobierz interfejs użytkownika.

7. Stymuluj komórki światłem

  1. Transfekcyjne komórki HEK293.
    1. Płytka komórek HEK293 po 100 tys. komórek na dołek w płytce 24-dołkowej.
    2. Skorzystaj z przykładowej tabeli, aby obliczyć objętości pożywki wolnej od surowicy, polietylenininy (PEI) i DNA (rysunek uzupełniający 39) oraz transfekcję przy użyciu protokołu producenta.
  2. Stymulacja komórek światłem.
    UWAGA: Komórki muszą być trzymane w ciemności po transfekcji lub obsługiwane przy użyciu źródła światła, które nie pobudza układu optogenetycznego.
    1. Zdecyduj, jaki rodzaj stymulacji zostanie zastosowany na komórkach (światło ciągłe, intensywność pulsacji itp.).
    2. Gdy potencjometry są wyłączone (w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara), włącz zasilanie LED.
    3. Umieść światłomierz w czarnej skrzynce, w której zostaną umieszczone komórki, i umieść pokrywę z diodą LED nad miernikiem. Dostosuj natężenie światła zgodnie z potrzebami.
    4. Jeśli używasz komputera do sterowania diodami LED, otwórz oprogramowanie interfejsu użytkownika.
    5. Zaprogramuj interfejs użytkownika (Rysunek 5A,B).
      1. W lewym górnym panelu wybierz port COM dla mikrokontrolera i kliknij Połącz.
      2. Użyj paneli po prawej stronie, aby zaprogramować każdą diodę LED. W przypadku światła ciągłego wybierz dowolny czas z wyjątkiem zera w "Czas włączenia" i ustaw "Czas wyłączenia" na zero.
      3. W prawym dolnym panelu zaprogramuj główny regulator czasu.
        1. Aby opóźnić podświetlenie, wybierz opóźnienie startu (GG:MM).
        2. Aby wyłączyć wszystkie diody LED po wyznaczonym czasie, wybierz czas pracy (GG:MM).
        3. Uruchom program oświetlenia, klikając przycisk Uruchom (Rysunek 5A).

8. Pomiar ekspresji genów za pomocą testu podwójnej lucyferazy

  1. Przygotować odczynnik lucyferazy, mieszając 10 ml buforu lucyferazy z odczynnikiem lucyferazy i podwielokrotnością w probówkach o pojemności 1 ml, które mają być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
  2. Przygotować bufor do lizy 5x na 1x na 100 μL dla N + 2 dołki. np. dla 30 próbek, 30 x 20 μL 5X buforu do lizy i 30 x 80 μL MQ H2O.
  3. Przygotować roztwór substratu Renilla: 20 μl substratu Renilla na 1 ml buforu Renilla (ta ilość jest odpowiednia dla 10 testów).
  4. Usunąć komórki z inkubatora, odessać pożywkę, dodać 100 μl 1x buforu do lizy na studzienkę i umieścić go na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min na 15 minut.
  5. Umieścić w temperaturze -20 °C na co najmniej 1 godzinę.
  6. Dodać 100 μl odczynnika lucyferazy na próbkę do dołka na białej 96-dołkowej płytce.
  7. Skonfiguruj czytnik płytek pod kątem luminescencji. Korzystając z modułu luminometru czytnika płytek, ustaw całkowanie na 1 s.
  8. Dodaj rozmrożone lizaty w studzienkach poniżej odczynnika lucyferazy. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj 20 μl próbki z odczynnikiem lucyferazy i natychmiast zmierz luminescencję.
  9. Po ustabilizowaniu się odczytów dodaj 100 μl roztworu substratu Renilla i zeskanuj ponownie.
  10. Podziel sygnał lucyferazy przez sygnał Renilla, aby uwzględnić wydajność transfekcji.
  11. Porównaj sygnały lucyferazy znormalizowane pod kątem wydajności transfekcji (np. porównaj sygnał z próbek oświetlonych czerwonym światłem i dalekiego światła czerwonego oświetlonych).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zamontowaniu obwodu zasilania, zasilacza, wyłącznika zasilania, POTów i diody LED (do Rysunku Uzupełniającego 21), można przetestować obwód. Po umieszczeniu wszystkich potencjometrów na miejscu, POT będzie kontrolował intensywność diody LED. Po zakończeniu montażu do rysunku uzupełniającego 29 system może być używany ręcznie do optogenetyki lub innych zastosowań. Zasilanie całego systemu można sterować ręcznie za pomocą wyłącznika zasilania. Natężenie każdej diody LED można kontrolować niezależnie za pomocą POT podłączonego do każdego obwodu.

Po zainstalowaniu oprogramowania i zaprogramowaniu mikrokontrolera, interfejs użytkownika może komunikować się z mikrokontrolerem. Za pomocą interfejsu użytkownika diody LED mogą być sterowane czasowo na kilka sposobów: (1) każdą diodę LED można zaprogramować tak, aby pozostawała włączona przez określony czas, (2) każdą diodę LED można zaprogramować tak, aby pulsowała, (3) można zaprogramować globalne opóźnienie startu (np. podczas transfekcji i świecenia światłem 24 godziny później) (Rysunek 6B), (4) całkowity czas działania programu po opóźnieniu. Istnieją dwa interfejsy użytkownika, jeden z większymi przyciskami, które mogą sterować dwiema diodami LED jednocześnie, a drugi, który może sterować czterema diodami LED (Rysunek 5A,B). Interfejs użytkownika z dwiema diodami LED jest zoptymalizowany pod kątem tabletów i wystarcza do sterowania czerwonymi i dalekimi czerwonymi diodami LED w wielu eksperymentach.

W przypadku większych eksperymentów, drugi interfejs użytkownika może być używany do sterowania maksymalnie czterema diodami LED. Podczas indukowania ekspresji genów oczekiwany wynik zależy od kilku parametrów. Należą do nich czas indukcji, poziomy indukcji (np. ilość światła lub leku) oraz liczba kopii indukowalnego konstruktu w komórce. Aby to pokazać, transfekowaliśmy przełącznik genu PhyB wraz z różnymi ilościami reporterowego DNA (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% i 8% transfekowanego DNA) (Figura 6A) i oświetliliśmy, jak pokazano na Rysunek 6B. W próbkach zawierających PhyB, ale bez plazmidu wytwarzającego fikocyjanolinę (chromofor PCB) (tj. niereagujący na światło), ekspresja/nieszczelność genu lucyferazy wzrasta wraz z ilością reporterowego DNA (Figura 6C) (dalekoczerwony P < 0,0001, regresja liniowa, po której następuje test Walda), (czerwony P < 0,0001, regresja liniowa, po której następuje test Walda). Ponadto, gdy cały przełącznik genu PhyB, w tym plazmid wytwarzający chromofor PCB (komórki wrażliwe na światło), jest oświetlony światłem dalekiej czerwieni, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze wzrostem ilości konstruktu reporterowego w mieszance transfekcyjnej (Rysunek 6C,D) (światło dalekie czerwone P < 0,0001, regresja liniowa, po której następuje test Walda). Podobnie, gdy komórki wrażliwe na światło są oświetlone czerwonym światłem, ekspresja lucyferazy również wzrasta wraz ze zwiększoną ilością reportera (P < 0,0001, regresja liniowa, po której następuje test Walda). Porównując poziomy indukcji komórek traktowanych światłem czerwonym z komórkami traktowanymi światłem dalekiej czerwieni, stwierdziliśmy niewielki spadek aktywacji fałdowania wraz ze wzrostem ilości reportera (Rysunek 6E) (P = 0,0141, regresja liniowa, po której następuje test Walda).

figure-results-1
Ilustracja 1: podstawowy obwód dla pojedynczej diody LED. (A) Schemat blokowy przedstawiający przegląd kroków potrzebnych do zbudowania systemu oświetlenia LED. (B) System sterowania oświetleniem LED. (po lewej) Skrzynka sterownicza do regulacji intensywności i czasu diody LED. (środek) Tablet PC z interfejsem użytkownika do sterowania diodami LED. (po prawej) skrzynka do montażu diod LED i umieszczania komórek do stymulacji optycznej. (C) Tabela do określania, czy dioda LED wymaga obwodu wysokiego czy niskiego napięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Instrukcje dotyczące elementów na miejscu. (A) Przykład kreskówkowych instrukcji krok po kroku dotyczących budowy obwodu. (B,C) Przykładowa instrukcja ze zdjęciami montowanego urządzenia. (D) Przykładowe instrukcje dotyczące montażu wielu obwodów jednocześnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Widoki zmontowanego systemu sterowania LED. (A) Widok z góry na zewnątrz zmontowanego systemu. (B) Widok od wewnątrz zmontowanego systemu oświetlenia czterodiodowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: instrukcje dotyczące rozpływowego diody LED na radiatorze. (A) Podstawa diody LED i zbliżenie ciemnoczerwonej diody LED. (B) Umieszczenie pasty lutowniczej na podstawie diody LED. (C) Obraz wlutowanej diody LED. Czerwone strzałki wskazują pola lutownicze. W porównaniu do szarości przed (A), po lut wydaje się metaliczny/błyszczący. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Oprogramowanie do sterowania eksperymentami optogenetycznymi. (A) Interfejs użytkownika z dwiema diodami LED z dużymi przyciskami do łatwej obsługi z niedrogim tabletem. (B) Interfejs użytkownika z czterema diodami LED. Oba interfejsy umożliwiają niezależne sterowanie diodami LED. W przypadku pulsacji diody LED można zaprogramować tak, aby włączały się i wyłączały dla określonych szerokości impulsów i określonych czasów trwania. Pulsowanie może mieć również opóźnienie startu i z góry określony całkowity czas trwania. (C) Tabletka kontrolna LED zamontowana na inkubatorze do hodowli komórkowych. (D) Ilustracja systemu genów PhyB oświetlonego światłem dalekiej czerwieni. Światło dalekiej czerwieni utrzymuje gen w stanie "wyłączonym" lub "ciemnym". (E) Ilustracja systemu genów PhyB oświetlonego światłem czerwonym. Czerwone światło indukuje ekspresję genów, promując interakcję między PhyB i PIF3. Ta interakcja lokalizuje domenę aktywacji genu (AD) sprzężoną z PIF3 do promotora UAS, aktywując gen reporterowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Przewidywane wyniki z wykorzystaniem systemu LED do kontroli PhyB. (A) plazmid kodujący dwuhybrydowych partnerów PhyB + PIF3 (pPK-351), plazmid kodujący enzymy syntezy fikocyjanoliny (chromofor PCB) (pPK-352) i plazmid reporterowy lucyferazy (pPK-202). (B) Kalendarium eksperymentów z indukcją światła dla C-E. (C) Podstawowe poziomy transkrypcji (AKA nieszczelność) ze zwiększającymi się ilościami reporterowego DNA. Próbki "nieszczelne" nie są transfekowane pPK-352 (tj. nie reagują na światło), ale są oświetlane światłem czerwonym lub dalekiej czerwieni. Próbki przełącznika światła (LS) obejmują wszystkie plazmidy przełącznika genów światła i są oświetlone światłem czerwonym lub dalekiej czerwieni. (D) Poziomy indukcji światła w odpowiedzi na światło czerwone i dalekiej czerwieni. (LS-Dalekie światło czerwone to te same dane w C i D.) (E) Indukcja fałdowania lucyferazy w komórkach oświetlonych światłem czerwonym/światłem dalekiej czerwieni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kliknij tutaj, aby pobrać Rysunki Uzupełniające 1-39.

Rysunek uzupełniający 1: Elektroniczny obwód sterownika dla wielu diod LED. (A) Schemat obwodu dla pojedynczego systemu LED. (B) Schemat obwodu dla systemu z czterema diodami LED.

Rysunek uzupełniający 2: Umieszczanie połączeń obwodów. (A) Przypnij płytkę PCB do swoich pomocnych dłoni. (B) Położenie zworek obwodu głównego w otworach przelotowych na rysunku. (C) Schemat złączy przewodów odwzorowujący współrzędne. W przypadku czterech systemów LED narysuj linie dzielące każdy obwód, jak pokazano (czarne pionowe linie). Rysunek uzupełniający 31–38 opisuje montaż czterech obwodów jednocześnie.

Rysunek uzupełniający 3: przewodów na płytce drukowanej. (A) Zegnij zworki tak, aby miały bezpośredni kontakt z płytką drukowaną i pozostały na swoim miejscu podczas. (B) Inny widok na wygięte druty. (C) Przewody po. (D) Przycięte przewody na płytce drukowanej. (E) Skurczona izolacja po podgrzaniu lutem. (F) Przesunięcie izolacji na miejsce, aby zakryć otwór przelotowy w ziemi (niebieska strzałka) (G) Dodanie topnika do końca przewodu lub końcówki.

Rysunek uzupełniający 4: regulatora napięcia na miejsce. (A) Mapa współrzędnych regulatora napięcia. (B) Umiejscowienie regulatora napięcia. (C) Wygięte przewody regulatora napięcia. (D) Zaciski regulatora napięcia po.

Rysunek uzupełniający 5: rezystora R1 na miejsce. (A) Mapa współrzędnych rezystora R1 (820Ω). (B) Przeciągnięcie rezystora za pomocą przewodów za pomocą szczypiec (C) Ciągnięty rezystor blisko płytki drukowanej. (D) Przylutowany rezystor w pobliżu płytki drukowanej.

Rysunek uzupełniający 6: tranzystora na miejsce. (A) Mapa współrzędnych i orientacji tranzystora. (B) Zwróć uwagę na orientację tranzystora; etykieta w tym modelu jest skierowana w stronę regulatora napięcia (LM317T). Dokładnie sprawdź specyfikację tranzystora, aby upewnić się, że "Emiter", "Baza" i "Kolektor" znajdują się we właściwych otworach. (C) Tranzystor z wygiętymi zaciskami przed.

Rysunek uzupełniający 7: złącza przewód-przewód potencjometru na miejsce (plus rezystor 560Ω dla obwodu niskiego napięcia). (A) Mapa współrzędnych złącza przewód-przewód (plus R3-560Ω w przypadku budowy obwodu niskiego napięcia, złącze przewód-przewód jest umieszczone w otworze przed rezystorem). (B) Żeńskie złącze przewód-przewód. (C) Aby ułatwić montaż rezystora i złącza przewód-przewód w otworze przelotowym, wygina się 3–5 pasm plecionego drutu. (D) Pasma są odcinane nożycami do drutu jak najbliżej izolacji. (E) Wprowadzony czerwony przewód żeńskiego złącza przewód-przewód przez otwór przelotowy a5 (dla obwodu niskiego napięcia włożyć R3 przez ten sam otwór przelotowy). (F) Widok od spodu rezystora i złącza przewód-przewód przed. (G) Obraz wlutowanego rezystora R3 podłączonego do masy (F = Żeński).

Rysunek uzupełniający 8: złącza przewód-przewód potencjometru do masy. (A) Mapa współrzędnych połączenia uziemiającego dla złącza przewód-przewód potencjometru. (B) Widok z góry na złącze przewód-przewód potencjometru równolegle z R3 (F = Żeńskie).

Rysunek uzupełniający 9: mikrokontrolera i złączy przewód-przewód LED. (A) Mapa współrzędnych złącza przewód-przewód do podłączenia 2N222A i masy do mikrokontrolera. (B) Lutowane męskie złącze przewód-przewód. (C) Widok z góry (B). (D) Mapa współrzędnych żeńskiego złącza przewód-przewód do podłączenia wejścia obwodu i masy do diody LED. (E) Lutowane żeńskie złącze przewód-przewód (F = żeńskie, M = męskie).

Rysunek uzupełniający 10: zworki obwodu zasilania. (A) Mapa współrzędnych pomarańczowej zworki do podłączenia zasilacza do ziemi. (B) Pomarańczowa zworka przylutowana na miejscu. (C) Widok od spodu zworki wlutowanej na miejscu.

Rysunek uzupełniający 11: przełącznika zasilania i złączy przewód-przewód źródła zasilania. (A) Mapa współrzędnych żeńskiego złącza przewód-przewód do podłączenia wyłącznika zasilania. (B) Żeńskie złącze przewód-przewód przylutowane na miejscu. (C) Inny pogląd (B). (D) Mapa współrzędnych męskiego złącza przewód-przewód do podłączenia źródła zasilania. (E) Lutowane męskie złącze przewód-przewód. (F) Inny pogląd na (E) (F = Kobieta, M = Mężczyzna).

Rysunek uzupełniający 12: Podłączanie zasilacza do męskiego złącza przewód-przewód. (A) Niezmodyfikowany zasilacz. (B) Odcięcie przewodów zasilających. (C) Przewody zasilające zdjęte z nadmiaru izolacji i odcięte nadmiarem izolacji. (D) Umieszczenie rurki termokurczliwej wokół przewodów zasilających. Rurka oddzielająca dwa połączenia (czerwone strzałki) i rurka do przytrzymywania oddzielonych przewodów (żółta strzałka). (E) Skręcone przewody łączące zasilacz z żeńskim złączem przewód-przewód.

Rysunek uzupełniający 13: i izolacja połączenia zasilania z męskim złączem przewód-przewód. (A) Lutowane połączenie między uziemieniem zasilania a żeńskim złączem przewód-przewód. (B) Lutowane połączenie między dodatnim zaciskiem zasilacza a żeńskim złączem przewód-przewód. (C) Rurka termokurczliwa naciągnięta na przylutowane poszczególne połączenia (czerwona strzałka). (D) Oba połączenia zasilania lutowane i z rurką termokurczliwą poddaną obróbce cieplnej. (E) Umieszczenie rurki termokurczliwej nad poszczególnymi przyłączami (żółta strzałka). (F) Zakończone zasilanie.

Rysunek uzupełniający 14: przełącznika zasilania do męskiego złącza przewód-przewód. (A) Wyłącznik zasilania z odizolowanymi przewodami i rurką termokurczliwą umieszczoną nad przewodami (czerwone strzałki). (B) Przewody łączące przełącznik i męskie złącze przewód-przewód skręcone ze sobą przed. (C) Umieszczenie rurki termokurczliwej na lutowanych połączeniach. (D) Połączenia pokryte rurką termokurczliwą poddaną obróbce cieplnej. (E) Wyłącznik zasilania zmontowany z męskim złączem przewód-przewód.

Rysunek uzupełniający 15: Podłączanie potencjometru do męskiego złącza przewód-przewód. (A) Części potencjometru. (B) Męskie złącze przewód-przewód skręcone i wygięte w celu zaczepienia wokół środkowego zacisku potencjometru. (C) Męskie złącze przewód-przewód skręcone wokół środkowego zacisku potencjometru. (D) Lutowane połączenia przewód-przewód. (E) Czerwona strzałka wskazująca metalową zakładkę przed usunięciem. (F) Potencjometr po zdjęciu metalowej wypustki.

Rysunek uzupełniający 16: Okablowanie połączenia mikrokontrolera. (A) Przewody do żeńskich złączy przewód-przewód zdjęte i przecięte w ramach przygotowań do zaciskania. (B) Umieszczenie zacisku na złączu przewód-przewód. (C) Zaciskanie złącza przewód-przewód. (D) Zaciskane złącze przewód-przewód. (E) W pełni zmontowane połączenie mikrokontrolera.

Rysunek uzupełniający 17: przewodów i diody LED na podstawie LED Część 1. (A) Materiały potrzebne do przylutowania diody LED do podstawy LED. (B) Cynowanie końcówki odizolowanego drutu. (C) Nakładanie topnika na styk podstawy LED. (D) Dodanie lutu do dużej końcówki lutowniczej w celu ocynowania podstawy LED. (E) Umieszczenie lutu na styku w celu podgrzania podstawy LED. (F) Podstawa LED po przeciągnięciu grotu lutowniczego w poprzek styku. (G) Ta sama procedura na drugim styku.

Rysunek uzupełniający 18: przewodów i diody LED na podstawie LED Część 2. (A) Ocynowany drut przypięty do styku za pomocą spinki do włosów. Zwróć uwagę, że przewód jest przylutowany do katody "C-". (B) Dodanie dużej ilości lutu do grotu lutowniczego. (C) Grot lutowniczy naciska na drut, topiąc lut na podstawie LED i drucie. (D) Przytrzymanie drutu tak, aby pozostał na swoim miejscu po wyjęciu lutownicy. (E) Trzymanie drutu na miejscu, aż lut stwardnieje.

Rysunek uzupełniający 19: przewodów i diody LED na podstawie LED Część 3. (A) Za pomocą ostrej końcówki umieść pastę lutowniczą na podstawie LED w celu zamontowania diody LED. (B) Podstawa LED z założoną pastą lutowniczą. (C) Umieszczenie diody LED na podstawie LED w taki sposób, aby styki diody LED i podstawy LED pasowały do siebie.

Rysunek uzupełniający 20: przewodów i diody LED na podstawie LED Część 4. (A) drut nadal przypięty do styku przez spinkę do włosów. (B,C) Za pomocą drugiej spinki do włosów czerwony drut jest przytrzymywany na miejscu. Zwróć uwagę, że czerwony przewód jest przylutowany do anody "A+". (D) Dodanie dużej ilości lutu do grotu lutowniczego. (E) Grot lutowniczy dociska drut, topiąc lut na podstawie LED i drucie, a także pastę lutowniczą pod diodą LED. (F) Chłodzenie gorącej podstawy LED po. (G) Podstawa LED z przylutowanymi przewodami i diodą LED. (H,I) Czerwone strzałki wskazują pola lutownicze. Po lut wydaje się metaliczny/błyszczący (w porównaniu do szarego przed (rysunek uzupełniający 16D)).

Rysunek uzupełniający 21: Podłączanie przewodu LED do męskiego złącza przewód-przewód. (A) Odizolowane przewody i męskie złącze przewód-przewód obok rurki termokurczliwej przecięte na pół (1/8 cala i 3/16 cala). (B) Umieść rurkę termokurczliwą na drutach przed. (C) Przewody skręcone ze sobą przed. (D) Lutowane połączenie od przewodu do złącza przewód-przewód. (E) Zarówno czerwony jak i przewód są ze sobą zlutowane. (F) Umieszczenie rurki termokurczliwej 1/8 cala nad lutowanym połączeniem. (G) Rurka termokurczliwa po obkurczeniu opalarką. (H) Umieszczenie rurki termokurczliwej 3/16 cala nad mniejszą rurką termokurczliwą. (I) Połączenie przylutowane i uszczelnione rurką termokurczliwą.

Rysunek uzupełniający 22: Mocowanie przewodów i diod LED do podstawy LED za pomocą żywicy epoksydowej. (A) Za pomocą drewnianego aplikatora umieścić żywicę epoksydową w podstawie LED. Poniżej umieszczona jest taśma, która wyłapuje kapiącą żywicę epoksydową. (B) Żywica epoksydowa jest rozprowadzana równomiernie na całej powierzchni. (C) Diodę LED pozostawia się na noc do utwardzenia.

Rysunek uzupełniający 23: Montaż diod LED wewnątrz pokrywy skrzynki. (A) Dioda LED z dołączonym łącznikiem dotykowym dla łatwego montażu. (B) Różnokolorowe diody LED zamontowane po wewnętrznej stronie czarnej skrzynki za pomocą zapięcia dotykowego. (C) Nacięcie na pokrywie czarnej skrzynki wykonane za pomocą szybkoobrotowego narzędzia obrotowego, aby zrobić miejsce na przewód LED. (D) skrzynka do stymulacji ogniw z zapięciami dotykowymi do montażu diody LED. (E) Umieszczenie naczynia wielodołkowego w wersji skrzynki LED z łącznikiem dotykowym.

Rysunek uzupełniający 24: Montaż diod LED na zewnątrz pokrywy skrzynki. (A) Otwór wywiercony w pokrywie czarnej skrzynki z wycięciem z szybkoobrotowego narzędzia, aby zrobić miejsce na drut (czerwona strzałka). (B) Dioda LED umieszczona w otworze z przewodem we wcięciu, przytrzymywana taśmą izolacyjną. (C) Do zabezpieczenia diody LED służą jeszcze dwa kawałki taśmy. Tylna strona radiatora jest odsłonięta, aby zmaksymalizować wymianę ciepła. (D) Folia prywatności przyklejona taśmą do otworu, w którym zostanie umieszczona dioda LED. Czerwona strzałka wskazuje na folię chroniącą prywatność. (E) skrzynka do stymulacji komórek z diodą LED zamontowaną na zewnątrz pudełka oraz z folią prywatności do rozpraszania światła. (F) Umieszczenie naczynia wielodołkowego wewnątrz zewnętrznej wersji LED LED + folii prywatności.

Rysunek uzupełniający 25: Wiercenie otworów w pokrywie skrzynki dla wyłącznika zasilania i potencjometrów. (A) Rysunek CAD z adnotacjami wymiarami pokrywy pudełka. (B) Pokrywa pudełka z otworami potencjometru i wyłącznika zasilania.

Rysunek uzupełniający 26: Przygotowanie otworu wylotowego przewodu. (A) Rysunek CAD z opisanymi wymiarami. (B) Obraz wywierconego otworu za pomocą wiertła. (C) Wygładzanie otworu wylotowego za pomocą szybkoobrotowego narzędzia obrotowego lub narzędzia do pilnikowania. (D) Umieszczenie przelotki w otworze wylotowym.

Rysunek uzupełniający 27: Umieszczenie mikrokontrolera i płytki drukowanej w pudełku. (A) Uchwyt mikrokontrolera (pomarańczowy) i uchwyty PCB wewnątrz pudełka. (B) Mikrokontroler i płytka drukowana zamocowane w pudełku.

Rysunek uzupełniający 28: Rozmieszczenie potencjometrów i przełącznika zasilania. (A) Widok z przodu pokrywy skrzynki z wyłącznikiem zasilania i czterema POT. (B) Widok z przodu pokrywy pudełka z dodanymi pokrętłami potencjometru. (C) Widok z tyłu pokrywy pudełka z dołączonymi elementami.

Rysunek uzupełniający 29: Zmontowany system sterowania LED. (A) Otwarta skrzynka kontrolna z przewodami oznaczonymi drukarką etykiet i zawiązanym zamkiem błyskawicznym dla organizacji. (B) Pudełko po całkowitym zmontowaniu z każdym DONIKIEM oznaczonym wraz z kodem PIN.

Rysunek uzupełniający 30: Umiejscowienie zaciskanego złącza przewód-przewód. (A) Zdjęcie zaciskanych złączy przewód-przewód dla systemu mikrokontrolerów z czterema diodami LED. (B) Umieszczenie zaciskanego złącza w portach mikrokontrolera.

Rysunek uzupełniający 31: Umieszczanie przewodów połączeniowych. (A) Płytka drukowana z oznaczonymi współrzędnymi czerwonych przewodów połączeniowych. (B) Płytka drukowana z oznaczonymi współrzędnymi żółtych przewodów połączeniowych.

Rysunek uzupełniający 32: Układanie przewodów połączeniowych. Płytka drukowana wyświetlająca współrzędne żółtych przewodów połączeniowych.

Rysunek uzupełniający 33: Dodawanie regulatorów napięcia. Regulatory napięcia LM317T są dodawane do obwodu z ich współrzędnymi oznaczonymi na schematach.

Rysunek uzupełniający 34: Wkładanie rezystorów 820Ω. Rezystory R1 są dodawane do obwodu z ich współrzędnymi oznaczonymi na schematach.

Rysunek uzupełniający 35: Wstawianie tranzystorów. Tranzystory 2N2222A są dodawane do obwodu z ich współrzędnymi oznaczonymi na schematach.

Rysunek uzupełniający 36: Wkładanie żeńskich złączy przewód-przewód i rezystorów (opcjonalnie) do połączenia POT. Przewody i rezystory są dodawane do obwodu z ich współrzędnymi oznaczonymi na schematach. (A) Włóż czerwony przewód, a następnie rezystor R2 (560 Ω) (tylko dla obwodu niskiego napięcia). (B) Włóż drugi koniec rezystora do wskazanego otworu uziemiającego. (C) Włóż czarne przewody do zaznaczonych otworów, aby podłączyć je do uziemienia. Uwaga: R2 (560Ω) jest równoległy do potencjometru.

Rysunek uzupełniający 37: Wprowadzanie męskich złączy przewód-przewód do podłączenia mikrokontrolera i zasilania. Przewody są dodawane do obwodu z ich współrzędnymi oznaczonymi na schematach. (A) Włóż czerwone przewody do wskazanych otworów. (B) Włóż czarne przewody do zaznaczonych otworów.

Rysunek uzupełniający 38: Dodawanie złączy przewód-przewód LED. (A) Złącza żeńskie przewód-przewód z zaznaczonymi czerwonymi współrzędnymi przewodów. (B) Żeńskie złącze przewód-przewód z podświetlonymi czarnymi współrzędnymi przewodu.

Rysunek uzupełniający 39: Przygotowanie eksperymentu z przełącznikiem genu PhyB-PIF3. (A) Przykładowa tabela mieszanki wzorcowej zawierającej Renilla do kontroli wewnętrznej. (B) Przykładowa tabela do ustawiania mieszaniny DNA do testu reporterowego podwójnej lucyferazy w eksperymencie optogenetycznym PhyB-PIF3. (C) Przykładowa tabela do ustawiania odczynnika do transfekcji PEI i porcjowania mieszaniny na komórki (kroplami). (D) Umiejscowienie światłomierza do ustawiania jasności diody LED.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj system LED został wykorzystany w naszym laboratorium do optymalizacji, scharakteryzowania i pracy z kilkoma narzędziami optogenetycznymi. W Kyriakakis et al.4 przetestowaliśmy wiele kombinacji przełączników genów PhyB-PIF równolegle. Następnie wykorzystaliśmy ten system do przetestowania impulsów światła o różnych częstotliwościach, aby zmierzyć kinetykę przełącznika genowego i efektywne natężenie światła. System ten został również wykorzystany do optymalizacji i scharakteryzowania dwóch systemów optogenetycznych, które wykorzystują światło niebieskie do stymulacji 5,6. Ponieważ tylko jedna dioda LED musiała być wystarczająco jasna, aby aktywować większość narzędzi optogenetycznych, zakup systemu z dużą liczbą diod LED nad każdą studzienką nie zawsze jest konieczny. Ta konfiguracja jest niedroga, niezawodna, łatwa do rekonfiguracji i nie wymaga wcześniejszej wiedzy elektrycznej, aby postępować zgodnie z protokołem montażu.

Na dodatkowych rysunkach uzupełniających 31–38 opisano, w jaki sposób można włączyć do systemu maksymalnie cztery diody LED. Chociaż może to ograniczyć niektóre eksperymenty wymagające dużej liczby warunków równoległych, można dodać więcej diod LED, zastępując zasilacz 9 V używany w tym protokole zasilaczem o wyższej mocy. Podobnie, kilka diod LED o mniejszej mocy można podłączyć równolegle do każdego obwodu. W tym ostatnim układzie niektóre diody LED nie będą sterowane indywidualnie, ale może to być przydatne, gdy wiele diod LED jest wymaganych do pokrycia większego obszaru. Po zapoznaniu się z elektroniką tego systemu istnieje wiele sposobów na jego dostosowanie. Dodatkowe strategie dostosowywania systemu obejmują umieszczenie diody LED dalej lub bliżej próbki i oświetlenie przez filtry/dyfuzory w celu uzyskania jednorodnych warunków oświetlenia lub zapobieżenia nagrzewaniu, jak w (rysunek uzupełniający 23) i Allen i wsp.5. Inną godną uwagi cechą naszej konstrukcji LED jest to, że jest ona pokryta żywicą epoksydową i ma zapięcie dotykowe z tyłu; pozwala to na bezpieczne umieszczenie diody LED praktycznie wszędzie: w inkubatorach, akwariach, klatkach dla zwierząt, ścianach itp.

Wiele eksperymentów, które wykorzystują optogenetykę do kontrolowania genów, szlaków sygnałowych i innej aktywności komórkowej, często wymaga pulsowania, obejmuje duże skale czasowe lub musi być przeprowadzanych w inkubatorze, co wymaga automatyzacji lub zdalnej manipulacji bez mikroskopu. Ten system LED był testowany nieprzerwanie przez kilka miesięcy w nawilżanym inkubatorze CO2 bez żadnych problemów. Dodatkowo, w przypadku systemów odwracalnych, takich jak systemy optogenetyczne PhyB, eksperymentator może być zmuszony do zaprogramowania specyficznych harmonogramów oświetlenia pulsacyjnego. W naszej poprzedniej pracy4 użyliśmy programów pulsujących do przetestowania dynamiki odwracalności przełącznika PhyB-PIF3 w komórkach ssaków za pośrednictwem interfejsu użytkownika. Korzystając z metodologii opisanej w tym manuskrypcie, programowanie protokołu pulsacyjnego jest łatwe, zapewniając elastyczność i autonomię potrzebną do wielu rodzajów eksperymentów optogenetycznych w sposób przyjazny dla użytkownika.

Najbardziej krytycznymi krokami w budowie tego systemu jest złożenie obwodu elektrycznego na płytce PCB i podłączenie komponentów, które są szczegółowo opisane w sekcji 1 i sekcji 2. Konieczne jest uważne wykonanie każdego kroku w tych sekcjach i dwukrotne sprawdzenie numerów otworków linia po linii przed każdego elementu. W sekcji 2 wyjaśniono, jak skonfigurować komponenty, które zostaną podłączone do obwodu. Aby komponenty łączyły się we właściwej orientacji, szczególnie ważne jest, aby upewnić się, że kolory czarnego i czerwonego przewodu na złączach przewód-przewód są zgodne. Drobne niedopatrzenia w tych dwóch sekcjach z dużym prawdopodobieństwem wpłyną na funkcjonalność systemu. Rzeczywiście, pierwszym krokiem w rozwiązywaniu problemów z tą metodą będzie sprawdzenie, czy obwód został zbudowany poprawnie i czy wszystkie połączenia są na swoim miejscu. Po drugie, szczególnie ważne jest sprawdzenie jakości pod kątem luźnych połączeń oraz przewodów pod kątem rozszerzających się drutów, które mogą powodować zwarcie w obwodzie. Trzecim krokiem byłoby upewnienie się, że diody LED działają poprawnie, co można zrobić za pomocą zasilacza lub akumulatora 1,5 V, przypinając dwa zaciski diody LED za pomocą zacisków krokodylkowych. Inną potencjalnie krytyczną kwestią jest zapobieganie nagrzewaniu się (w przypadku korzystania z diod LED o dużej mocy) lub rozpraszaniu światła w celu uzyskania szerszego oświetlenia. Aby rozwiązać te problemy, diody LED można zamontować na zewnątrz czarnej skrzynki z "folią prywatności" wewnątrz, jak opisano na rysunku uzupełniającym 23 i Allen et al.5. Ze względu na prostotę tego systemu, rozebranie go na części w celu weryfikacji, modyfikacji, modernizacji lub naprawy komponentów modułowych nie jest trudne.

Innym krytycznym czynnikiem dla indukowalnych systemów genowych jest rozważenie, ile aktywacji jest wymagane lub jak duża nieszczelność jest akceptowalna dla kontrolowanego systemu biologicznego. Jak pokazano na rycinie 6, mogą się one różnić w zależności od ilości reporterowego DNA. Ponadto wydajność transfekcji, a tym samym liczba kopii konstruktów reporterowych w każdej komórce, będzie się różnić. W przypadku niektórych eksperymentów korzystne może być stworzenie linii komórkowej ze stałą ilością składników reporterowych lub przełączników genów PhyB i badanie przesiewowe klonów o pożądanym zakresie indukowanej ekspresji, jak to jest powszechnie robione w przypadku systemów indukowanych przez leki. Ze względu na wielkość i niestabilność plazmidu lentiwirusowego pPK-2304, wykonaliśmy również nielentiwirusowe wersje plazmidu przełącznika PhyB w szkielecie pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) i pPK-352 (Addgene #157922).

Budując ten system oświetlenia LED zgodnie z tym protokołem, użytkownicy mają wszystkie komponenty niezbędne do przeprowadzenia szerokiej gamy eksperymentów optogenetycznych in vitro i in vivo. W połączeniu z instrukcjami dotyczącymi stosowania PhyB-PIF3 w komórkach ssaków, protokół ten pozwoli osobom niebędącym inżynierami i biologom na elastyczne i skuteczne wykorzystanie optogenetyki opartej na PhyB w różnych kontekstach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang i Molly Allen za testowanie różnych wersji systemu LED w trakcie jego rozwoju. Praca ta była wspierana przez Kavli Institute for Brain and Mind na UC San Diego i Salk Institute, National Science Foundation za pośrednictwem NSF Center for Science of Information w ramach grantu CCF-0939370, NIH Grant NS060847 i NIH Grant R21DC018237.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18AWG 2pin CZERWONY przewódAmazon15M-28AWG-2468Niedrogi przewód do podłączenia diod LED do obwodu zasilania.
https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1
Potencjometr 1K OhmAmazon52161500potencjometr potencjometru 2 x 1K Ohm + 2 x czarne pokrętło sterujące.
https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
Silikonowe złącze JST o grubości 20SIM & NAT 5,9 cala 2-pinowe męskie żeńskie złącza wtykowe JST RCYSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
22 AWG solidne przewody połączenioweAmazonWJW-60B-RJameco Valuepro WJW-60B-R Zestaw zworek przewodów 350 każdy 22 AWG, 14 długości 10 kolorów 25 każdej długości.
https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
560 omów 1/2 wata 1% tolerancji Amazona14051600ux0301Uxcell a14051600ux0301 60-częściowy przewód osiowy 1% tolerancji Kolorowy pierścień Rezystor z folii metalowej Rezystancja, 560 Ohm 1 / 2W.
https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN
820 ohm 1/2watt 1% tolerancjiAmazonTTL-A-8035-50EaZestaw rezystora metalowego 50Ea 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W).
https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor
męski na B męski (10 stóp)AmazonCzęść # 30-001-10Bdołączony do Arduino nie mieści się dobrze w pudełku.
https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Ardiuino UNO odpowiednikAmazonElegoo EL-CB-001UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 z USB do Arduino.
https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1
Uchwyt ArduinoDigikeyX000018Pasuje bardzo ciasno.
https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632
Czarne skrzynki do obwodów i komór świetlnychAmazon1591ESBKHammond 1591ESBK ABS Project Box.
https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Niebieska dioda LEDDigikeyLXML-PB01-0040LED LUXEON REBEL NIEBIESKI SMD. Używa "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134
Opaski kabloweAmazonsd027Tarvol Nylonowe opaski zaciskowe (zestaw 100 sztuk) 8 cali z samoblokującymi się opaskami kablowymi (biały).
Klipsy do lodówki https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch CommandAmazon17210CLRKlipsy do przytrzymywania płytki drukowanej wewnątrz czarnej skrzynki. Można również użyć listew sterujących.
https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
Cyan LEDDigikeyLXML-PE01-0070LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Wykorzystuje taśmę izolacyjną "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd
- 3M Scotch #35 Taśma izolacyjna Value PackAmazon03429NATaśma izolacyjna Scotch 700, 03429NA, 3/4 cala x 66 ft.
https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK
Dalred LED 720nmLuxeon Star LEDLXML-PF01Daleka czerwień (720nm) LUXEON Rebel LED. Wykorzystuje "Saber 20 mm Star base"
https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW
Farred LED 740nmUshioEDC740D-1100-S5Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa
https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf
Farred LED 780nmUshioEDC780D-1100Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nmUshioEDC810D-1100Wykorzystuje "STAR XP 3535" podstawa
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nmUshioEDC850D-1100Wykorzystuje przelotki "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf
AmazonPico 6120DSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G
Klipsy do włosów/aligatoraAmazon1-3/4 cala (45 mm) - spinki do włosów Jednobolcowe metalowe klipsy krokodylkowe Akcesoria do łuków do włosów -Srebrne, 50 szt.
https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
Podstawa LEDLuxeon Star Diody LEDLXB-RS20ASaber 20 mm Star Blank Aluminiowa podstawa MCPCB do diod LED Rebel
https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds
LED PCB dla diod LEDUshioRozwiązania Adura LEDPakiet LED STAR XP 3535Pasuje do wielu innych diod LED firmy Ushio
http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led
Loctite Epoxy Clear Wielofunkcyjna, 0,85-uncjowa strzykawkaAmazon1943587Loctite Epoxy Clear Wielofunkcyjna, 0,85 uncji płynu.
https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C
NTE Heat Shrink 2: 1 Różne kolory i rozmiary 160 sztukAmazonB000FIDTYGSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Wiszące paski na rzepyAmazonPH204-16NADzięki nim możesz zawiesić diody LED w wielu miejscach.
https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H
ZasilaczAmazontb013Każda inna przetwornica AC/DC 9V 1.5Z wystarczy, ponieważ i tak odcinamy koniec.
https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1
Przełącznik zasilania Przełącznik kołyskowyAmazonSIXQJZMLSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011
Łączniki prostokątne - do przewodów zaciskanychDigikey2183-1905-ND6 Łączniki prostokątne - Obudowy Czarne 0,100" (2,54mm)
https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB
Czerwona dioda LEDDigikeyLXM3-PD01LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Wykorzystuje papier ścierny "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd
ściernyAmazonB002NEV6GS3M Wetordry, 03022, ziarnistość 800, 3 2/3 cala x 9 cali.
https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1
Lut do drutów i elementów obwodówAmazonMudder Bezołowiowy drut lutowniczy Sn99 Ag0,3 Cu0,7 z rdzeniem kalafoniowym do elektrycznego 0,22 funta (0,6 mm)Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY
Płytka stykowa do do budowy obwoduAmazonGK1007Gikfun Płytka prototypowa do Pozłacane wykończenie Proto Board PCB DIY Kit dla Arduino (zestaw 5 sztuk) GK1007.
https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1
Wiertło łopatkoweAmazonIrwin 88811Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit
TranzystorNewark2N2222AMożna kupić w wielu miejscach.
http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197
Regulator napięciaNewarkLM317TOdpowiednik NTE956.
https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|dopasowanie|p|slid||produkt||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|& s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!! g!! LM317T& CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC
Tablet z systemem Windows 10AmazonB08BYTT79YKażdy komputer z systemem Windows 10 zrobi.
> https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1Cell Culture Reodczynniki
Ludzka nerka embrionalna 293 komórki HEK293ATCCATCC CRL-1573Common Cell line.
https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher26140079Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco" s Zmodyfikowany Eagle Średnio-Wysoki Poziom GlukozyThermoFisher11965− 092Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycynyThermoFisher15140122Są one bardzo powszechne i istnieje wiele ich odpowiedników.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122
White Corning 96-dołkowe stałe czarne lub białe mikropłytki polistyrenoweThermoFisher07-200-589Preferowane są białe talerze. Nie używaj przezroczystych płytek.
https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852
PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40 000)PolySciences24765-1Można zastąpić innym odczynnikiem do transfekcji.
https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Nazwa sprzętu
Szczypce do cięcia bocznego (110mm)AmazonProskit 1PK-037SSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11
Dremil 3000 z narzędziem tnącym i szlifierkąAmazonDremel 3000Zestaw narzędzi obrotowych Dremel 3000-2/28 o zmiennej prędkości - 1 Nasadki i 28 Akcesoria - szlifierka, szlifierka, polerka, frezarka i grawer.
https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Narzędzie do cięcia i szlifowania DremilAmazonDremel 200-1/15Każdy podobny Dremil będzie działać.
https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Końcówka szlifierska DremilAmazonDremel 84922Kamień szlifierski z węglika krzemu.
https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN Oryginalny Deluxe SOLDAPULLTAmazonDS017Do usuwania lutu/błędów.
https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Pomocna dłoń ze szkłem powiększającymAmazonSE MZ101BSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Szczypce mikro ze spiczastym noskiemAmazonHakko CHP PN-20-MStalowe mikroszczypce Super Specialty ze szpiczastym noskiem i gładkimi szczękami, 1,0 mm Nose.
https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Mała śruba sterownikiAmazonWiha 26197Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set
LutownicacyfrowaAmazon Yihua 939D+Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR
TraceTech No-Clean Flux PenAmazon2507-NTech Spray 2507-N No-Clean Topnik Dozujący długopis, 11,5 mL.
https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1
Weller WSA350 120v Stołowy pochłaniacz dymuAmazonWSA350Do bezpiecznego.
https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK
Szczypce do ściągania izolacjiAmazonCSP-30-7Są one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG
IWISS IWS-3220M Narzędzie do zaciskania pinów mikrozłączy 0,03-0,52 mm i sup2; 32-20AWGAmazonIWS-3220MSą one bardzo powszechne i istnieje wiele odpowiedników.
https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Amazon Papier

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
  2. Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
  3. Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952(2019).
  4. Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), electronic resource 706-717 (2018).
  5. Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).
  6. Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
  7. Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production. Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).
  8. Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
  9. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  10. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737(2020).
  11. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
  12. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  13. Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779(2013).
  14. Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. A light-triggered protein secretion system. The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).
  15. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  16. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
  17. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  18. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256(2015).
  19. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).
  20. Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
  21. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  22. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  23. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  24. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77(2013).
  25. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
  26. Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
  27. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  28. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
  29. Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), electronic resource 240-248 (2018).
  30. Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
  31. Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
  32. Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Optogenetic ExperimentsLED Illumination SystemCircuit AssemblySoldering TechniquesComputer ControlLED ConstructionWavelength ControlTiming AutomationBiological StimulationLow Cost Device

Powiązane artykuły