W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fizjologiczne pola elektryczne (EF) odgrywają istotną rolę w migracji, różnicowaniu, podziale i śmierci komórek. W artykule opisano mikroprzepływowy system hodowli komórek, który został wykorzystany do długoterminowego badania różnicowania komórek przy użyciu mikroskopii. System mikroprzepływowy składa się z następujących głównych elementów: optycznie przezroczystego układu elektrotaktycznego, przezroczystej grzałki tlenku indu i cyny (ITO), pompy do napełniania pożywki hodowlanej, zasilacza elektrycznego, wzmacniacza mocy wysokiej częstotliwości, multipleksera EF, programowalnego stopnia z napędem silnikowym X-Y-Z oraz mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonego w kamerę cyfrową. System mikroprzepływowy jest korzystny w upraszczaniu ogólnej konfiguracji eksperymentalnej, a co za tym idzie, zużycia odczynnika i próbki. Praca ta polega na różnicowaniu nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych stymulacją impulsami prądu stałego (DC). W pożywce podtrzymującej komórki macierzyste mysie NPC (mNPC) różnicowały się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty po stymulacji impulsem DC. Wyniki sugerują, że proste leczenie impulsem prądu stałego może kontrolować los mNPC i może być wykorzystane do opracowania strategii terapeutycznych w zaburzeniach układu nerwowego. System może być używany do hodowli komórkowych w wielu kanałach, do długotrwałej stymulacji EF, do obserwacji morfologicznej komórek oraz do automatycznej akwizycji obrazów poklatkowych. Ten układ mikroprzepływowy nie tylko skraca wymagany czas eksperymentu, ale także zwiększa dokładność kontroli nad mikrośrodowiskiem.
Wprowadzenie
Neuronalne komórki prekursorowe (NPC, znane również jako nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe) mogą być obiecującym kandydatem do neurodegeneracyjnej strategii terapeutycznej1. Niezróżnicowane NPC mają zdolność do samoodnawiania, wielomoc i zdolność proliferacji2,3. Poprzednie badanie wykazało, że macierz zewnątrzkomórkowa i mediatory molekularne regulują różnicowanie NPC. Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) promują proliferację NPC, utrzymując w ten sposób stan niezróżnicowany4.
Poprzednie badania wykazały, że stymulacja elektryczna może regulować czynności fizjologiczne komórki, takie jak podział5, migration6,7,8, differentiation1,9,10, oraz śmierć komórki11. Pola elektryczne (EF) odgrywają istotną rolę w rozwoju i regeneracji ośrodkowego układu nerwowego12,13,14. Od 2009 do 2019 roku laboratorium to badało odpowiedzi komórkowe na zastosowanie EF w systemie mikroprzepływowym1,6,7,8,15,16,17. Wielokanałowy, optycznie przezroczysty chip elektrotaktyczny (MOE) został zaprojektowany tak, aby nadawał się do barwienia immunofluorescencyjnego w mikroskopii konfokalnej. Chip charakteryzował się wysoką przezroczystością optyczną i dobrą trwałością oraz pozwalał na jednoczesne przeprowadzenie trzech niezależnych eksperymentów stymulacyjnych i kilku warunków barwienia immunologicznego w jednym badaniu. System mikroprzepływowy jest korzystny w upraszczaniu ogólnej konfiguracji eksperymentalnej, a co za tym idzie, zużycia odczynnika i próbki. W artykule opisano rozwój mikroprzepływowego systemu hodowli komórek, który został wykorzystany do długoterminowego badania różnicowania komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie i wykonanie chipa MOE
- Zaprojektuj wzory dla poszczególnych warstw polimetakrylanu metylu (PMMA) oraz taśmy dwustronnej przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (Rycina 1A, Tabela materiałów). Wytnij arkusze PMMA oraz taśmę dwustronną za pomocą grawerki laserowej CO2 (Rycina 1B).
- Włącz grawerkę laserową CO2 i podłącz ją do komputera osobistego. Otwórz plik z zaprojektowanym wzorem w oprogramowaniu.
- Umieść arkusze PMMA (275 mm x 400 mm) lub taśmę dwustronną (210 mm x 297 mm) na platformie grawerki laserowej (Rycina 2A). Skup wiązkę laserową na powierzchni arkuszy PMMA lub taśmy dwustronnej, korzystając z funkcji autofokusu.
- Wybierz grawerkę laserową jako drukarkę, a następnie „wydrukuj” wzór, aby rozpocząć bezpośrednią ablację na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej i uzyskać poszczególne wzory na arkuszu PMMA lub taśmie (Rycina 2B).
- Usuń folię ochronną z arkuszy PMMA i oczyść powierzchnię za pomocą gazu azotowego.
UWAGA: Projektowanie wzoru PMMA i bezpośrednia obróbka arkusza PMMA zostały przeprowadzone zgodnie z poprzednim raportem17. - Aby połączyć ze sobą wiele warstw arkuszy PMMA, ułóż trzy sztuki arkuszy PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1, 2 i 3) i złącz je pod ciśnieniem 5 kg/cm2 w spawalniczce termicznej przez 30 min w temperaturze 110 °C, aby utworzyć zespół kanałów przepływowych/stymulacji elektrycznej (Rycina 2C).
UWAGA: Różne partie komercyjnie pozyskanych arkuszy PMMA mają nieco różną temperaturę przejścia szklistego (Tg). Optymalną temperaturę łączenia należy sprawdzić w krokach co 5 °C w pobliżu Tg. - Przyklej 12 sztuk adapterów do poszczególnych otworów w warstwie 1 zespołu chipa MOE za pomocą szybkoschnącego kleju cyjanoakrylowego.
UWAGA: Adaptery są wykonane z PMMA metodą wtryskową. Płaskie powierzchnie na spodzie służą do połączenia z chipem MOE. Adaptery z żebewym gwintem 1/4W-28 służą do podłączania białych korków dokręcanych palcami, złączników o płaskim spodzie lub adapterów Luer. Zachowaj ostrożność podczas używania szybkoschnącego kleju cyjanoakrylowego. Unikaj zachlapania oczu. - Zdezynfekuj podłoża z PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3), taśmę dwustronną (warstwa 4) oraz PMMA klasy optycznej o grubości 3 mm (warstwa 5) poprzez naświetlanie promieniami ultrafioletowymi (UV) przez 30 min przed montażem chipa (Rycina 1A).
- Przyklej podłoża z PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3) do PMMA klasy optycznej o grubości 3 mm (warstwa 5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 4), aby ukończyć montaż PMMA (warstwy 1-5) (Rycina 1A).
- Przygotuj czyste szkiełko nakrywkę do montażu na chipie.
- Napełnij naczynie do barwienia dziesięciokrotnym rozcieńczeniem detergentu (patrz Tabela materiałów) i oczyść szkiełko nakrywkę w tym detergencie za pomocą myjki ultradźwiękowej przez 15 min.
- Dokładnie wypłucz naczynie do barwienia pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć wszystkie ślady detergentu.
- Kontynuuj płukanie wodą destylowaną, aby usunąć wszystkie ślady wody z kranu; powtórz krok 1.7.2 dwukrotnie.
- Osusz oczyszczone szkiełko nakrywkę, przedmuchując je gazem azotowym.
- Zdezynfekuj zespół PMMA (warstwy 1-5), taśmę dwustronną (warstwa 6) i szkiełko nakrywkę (warstwa 7) za pomocą naświetlania UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 30 min przed montażem chipa (Rycina 1A).
- Przyklej oczyszczone szkiełko nakrywkę (warstwa 7) do zespołu PMMA (warstwy 1-5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 6) (Rycina 1A).
- Inkubuj chip MOE w komorze próżniowej przez noc; użyj zestawionego chipa MOE do kolejnych procedur (Rycina 3).
2. Powlekanie poli-L-lizyną (PLL) podłoża w obszarach hodowli komórkowej
- Przygotuj rurkę z politetrafluoroetylenu, konektor z płaskim dnem, konektor stożkowy, adapter stożek-Luer, biały korek dokręcany palcami (zwany również stoprem), adapter Luer, strzykawkę z zamkiem Luer oraz czarną gumową zaślepkę (Rysunek 4A, Tabela Materiałów). Wszystkie powyższe elementy wysterylizuj w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min.
- Zamknij otwory adapterów mostka agarowego (Rysunek 1A) za pomocą białych korków dokręcanych palcami. Połącz konektor z płaskim dnem z zestawem chipa MOE poprzez adaptery wlotowe i wylotowe medium (Rysunek 4B). Połącz adapter stożek-Luer z kurkami trójdrożnymi.
- Dodaj 2 mL 0,01% roztworu PLL za pomocą strzykawki 3 mL podłączonej do kurki trójdrożnej wlotu medium (Rysunek 4B-
). - Podłącz pustą strzykawkę 3 mL do kurki trójdrożnej wylotu medium (Rysunek 4B-
). - Wypełnij obszary hodowli komórkowej roztworem PLL. Ręcznie i powoli przepompowuj roztwór powlekający w przód i w tył. Zamknij obie kurki trójdrożne, aby uszczelnić roztwór wewnątrz obszarów hodowli.
- Inkubuj chip MOE w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze z atmosferą 5% CO2.
3. Przygotowanie sieci mostków solnych
- Po wykonaniu kroku 2.6 otworzyć dwa kurki trójdrożne i usunąć pęcherzyki powietrza z kanałów, ręcznie przepompowując roztwór powlekający w przód i w tył w kanale za pomocą dwóch strzykawek.
- Nabrać 3 mL pożywki kompletnej (pożywka do utrzymania komórek macierzystych składająca się z DMEM/F12, 2% suplementu B-27, 20 ng/mL EGF oraz 20 ng/mL bFGF) do strzykawki o pojemności 3 mL podłączonej do kurka trójdrożnego wlotu pożywki (Rysunek 4B- i Rysunek 4B-
). - Dodać 3 mL pożywki kompletnej, aby zastąpić roztwór powlekający w obszarach hodowli komórkowej. Podłączyć pustą strzykawkę 5 mL do kurka trójdrożnego wylotu pożywki (Rysunek 4B-
). - Przygotować sieć mostków solnych (Rysunek 5).
- Wyciąć szczelinę w czarnym gumowym korku i włożyć elektrody srebrne (Ag)/chlorku srebra (AgCl) przez gumowy korek do strzykawki z zakrętką Luer lock (Rysunek 4A).
- Zastąpić biały korek dokręcany palcami adapterem Luer i wstrzyknąć 3% gorącą agarozę, aby wypełnić adapter Luer.
UWAGA: W celu przygotowania gorącej agarozy rozpuścić 3 g proszku agarozy w 100 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min. - Podłączyć strzykawkę Luer lock do adaptera Luer. Za pomocą strzykawki z igłą wstrzyknąć 3% gorącą agarozę przez czarny gumowy korek, aby wypełnić strzykawkę Luer lock. Odczekać od 10 do 20 min, aż agaroza ostygnie i stężeje.
UWAGA: Aby zwiększyć pojemność agarozy, strzykawka Luer lock jest zamontowana na adapterze Luer (Rysunek 4 i Rysunek 5). Następnie do strzykawki Luer lock wstawia się duże elektrody. Elektroda ta umożliwia stabilną stymulację elektryczną podczas długoterminowego eksperymentu.
4. Przygotowanie mNPC
- Kultury mNPCs1 w pożywce kompletnej w kolbie do hodowli komórkowej T25 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z zawartością 5% CO22 atmosferze. Przeprowadzać pasażowanie komórek co 3-4 dni, a wszystkie eksperymenty wykonywać na komórkach po 3-8 pasażach od pierwotnego źródła.
- Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować neurosfery przy 100 × g przez 5 min. Odessać supernatant i przemyć neurosfery 1x buforem PBS Dulbecco (DPBS). Odwirować neurosfery przy 100 × g przez 5 min.
- Odssać 1x DPBS, a następnie resuspendować neurosfery w medium kompletnym. Wymieszać dokładnie i delikatnie.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podać 1 ml zawiesiny neurosfer do trójdrożnego kurka odpływowego (Rycina 4B-).
5. Konfiguracja systemu mikroprzepływowego do stymulacji impulsami DC (Rysunek 6)
- Zainstaluj chip MOE zasiany komórkami na przezroczystym grzałce ITO, która jest zamocowana na programowalnym zmotoryzowanym stole X-Y-Z.
UWAGA: Temperatura powierzchni ITO jest kontrolowana przez regulator proporcjonalno-całkująco-różniczkowy (PID) i utrzymywana na poziomie 37 °C. Termopara typu K jest zaciskana pomiędzy chipem a grzałką ITO w celu monitorowania temperatury obszarów hodowli komórkowej wewnątrz chipa. Chip MOE jest zainstalowany na programowalnym zmotoryzowanym stole X-Y-Z i nadaje się do automatycznego obrazowania time-lapse w poszczególnych sekcjach kanałów. Wykonanie grzałki ITO oraz konfiguracja systemu ogrzewania hodowli komórkowej zostały opisane wcześniej18,19. - Wprowadź mNPC poprzez ręczne pompowanie do chipa MOE przez wylot medium. Inkubuj zasiany komórkami chip MOE na grzałce ITO o temperaturze 37 °C przez 4 h.
- Po 4 h pompuj kompletne medium przez chip MOE przez wlot medium z przepływem 20 µL/h przy użyciu pompy strzykawkowej.
UWAGA: mNPC są hodowane i utrzymywane w chipie przez dodatkowe 24 h przed stymulacją EF, aby umożliwić adhezję i wzrost komórek. Ciecz odpadowa jest zbierana w pustej strzykawce 5 mL połączonej z trójdrożnym kranikiem wylotowym, oznaczonej jako „waste” na Rysunku 6A. Konfiguracja mikrofluidycznego systemu MOE przedstawiona jest na Rysunku 6. Ten system mikrofluidyczny zapewnia ciągłe dostarczanie składników odżywczych do komórek. Świeże kompletne medium jest stale pompowane do chipa MOE w celu utrzymania stałej wartości pH. Dzięki temu komórki mogą być hodowane poza inkubatorem CO2. - Użyj przewodów elektrycznych, aby połączyć multiplekser EF z chipem MOE poprzez elektrody Ag/AgCl znajdujące się na chipie. Połącz multiplekser EF i generator funkcji z wzmacniaczem, aby generować prostokątne impulsy DC o amplitudzie 300 mV/mm przy częstotliwości 100 Hz i cyklu pracy 50% (50% czasu włączenia i 50% czasu wyłączenia) (Rysunek 6B).
- Podłącz przewody elektryczne do multipleksera EF. Podłącz przewody elektryczne do chipa MOE poprzez elektrody Ag/AgCl.
- Połącz multiplekser EF ze wzmacniaczem za pomocą przewodów elektrycznych. Podłącz generator funkcji do wzmacniacza i cyfrowego oscyloskopu.
UWAGA: Multiplekser EF to obwód, który uwzględnia impedancję komory hodowlanej w obwodzie i łączy wszystkie poszczególne komory w równoległej sieci elektronicznej. Każda z trzech komór hodowlanych jest połączona elektrycznie szeregowo z rezystorem zmiennym (Vr) i ampermetrem (oznaczonym jako µA na Rysunku 6A) w multiplekserze. Natężenie prądu elektrycznego przez każdą komorę hodowlaną jest regulowane poprzez zmianę Vr, a wartość prądu jest wyświetlana na odpowiadającym mu ampermetrze. Natężenie pola elektrycznego w każdym obszarze hodowli komórkowej obliczono zgodnie z prawem Ohma, I= σEA, gdzie I to natężenie prądu, σ (przyjęte jako 1,38 S·m-1 dla DMEM/F1220) to przewodność elektryczna medium hodowlanego, E to pole elektryczne, a A to powierzchnia przekroju poprzecznego komory elektrotaktycznej. Dla wymiarów obszaru hodowli komórkowej przedstawionych na Rysunku 1, natężenie prądu wynosi odpowiednio ~87 mA dla DC i ~44 mA dla impulsów DC przy 50% cyklu pracy.
- Poddaj mNPC działaniu prostokątnych impulsów DC o amplitudzie 300 mV/mm przy częstotliwości 100 Hz przez 48 h. Stale pompuj kompletne medium z prędkością 10 µL/h, aby zapewnić komórkom odpowiednią ilość składników odżywczych i utrzymać stałą wartość pH medium.
6. Analizy immunofluorescencyjne mNPC po stymulacji impulsowym prądem stałym
UWAGA: Na tym etapie cały odczynnik jest pompowany przez wlot medium przy użyciu pompy strzykawkowej.
- Po 3, 7 lub 14 dniach hodowli in vitro (DIV) od momentu zasiewu1, przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 25 µL/min przez 20 min.
- Utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA). Pompować 4% PFA do chipa przy przepływie 25 µL/min przez 20 min, aby zastąpić 1x PBS. Aby usunąć 4% PFA, przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 25 µL/min przez 20 min.
- Pompować 0,1% Triton X-100 do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min w celu permeabilizacji komórek. Zmniejszyć przepływ do 50 µL/h na dodatkowe 30 min, aby umożliwić reakcję z komórkami. Aby usunąć 0,1% Triton X-100, przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 6 min.
- Zablokować komórki za pomocą PBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zredukować nieswoiste wiązanie przeciwciał. Pompować 1% BSA do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min. Zmniejszyć przepływ do 100 µL/h i pompować przez 1 h.
- Pompować przeciwciała do podwójnego immunostainingu do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min, a następnie inkubować chip przez 18 h w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 15 min.
- Pompować przeciwciała wtórne koniugowane z Alexa Fluor do chipa przy przepływie 50 µL/min przez 6 min. Zmniejszyć przepływ do 50 µL/h i pompować przeciwciała przez 1 h w temperaturze pokojowej, w ciemności. Przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 15 min.
- W celu barwienia jąder komórkowych pompować Hoechst 33342 do chipa przy przepływie 20 µL/min przez 10 min w temperaturze pokojowej, w ciemności. Przemyć komórki 1x PBS przy przepływie 50 µL/min przez 15 min.
- Po immunostainingu obserwować komórki przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
7. Analiza obrazów i przetwarzanie danych
- Przeanalizuj obrazy fluorescencyjne przy użyciu oprogramowania z wbudowanymi narzędziami pomiarowymi (patrz Tabela materiałów).
- Porównaj jądra barwione Hoechstem (całkowita liczba komórek) w grupach kontrolnej i badawczej, a następnie oblicz odsetek komórek wykazujących ekspresję każdego z markerów fenotypowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Szczegółowa konfiguracja chipa MOE została przedstawiona na Ryc. 1. Chip mikrofluidyczny zapewnia korzystne rozwiązanie w celu zmniejszenia rozmiaru zestawu doświadczalnego, objętości próbek oraz objętości odczynników. Chip MOE został zaprojektowany tak, aby umożliwić jednoczesne przeprowadzenie trzech niezależnych eksperymentów stymulacji EF oraz kilku warunków immunobarwienia w ramach jednego badania (Ryc. 3). Ponadto chip MOE,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas wytwarzania chipa MOE adaptery są mocowane do warstwy 1 chipa MOE za pomocą szybko działającego kleju cyjanoakrylowego. Klej nakłada się na 4 rogi adapterów, a następnie równomiernie dociska się do adapterów. Należy unikać nadmiaru kleju, aby zapewnić całkowitą polimeryzację kleju. Ponadto gotowy zespół chipów MOE jest inkubowany w komorze próżniowej. Ten krok pomaga usunąć pęcherzyki między warstwą PMMA, taśmą dwustronną i szkłem nakrywkowym.
Wybór materiału elektrody opiera się na fa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują profesorowi Tang K. Tang, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, za pomoc w dostarczeniu mysich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (mNPC). Autorzy dziękują również profesorowi Tang K. Tangowi i pani Ying-Shan Lee za ich cenną dyskusję na temat różnicowania mNPC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podłoża PMMA 1 mm (warstwy 1-3) | BHT | K2R20 | Polimetakrylan metylu (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 ml plastikowa tuba | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Stożkowa rurka z dnem z nakrętką, zmontowana, wstępnie sterylizowana |
| strzykawka 3 ml | TERUMO | DVR-3413 | Strzykawki doustne 3 ml, bez igły |
| mm klasy optycznej PMMA (warstwa 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Arkusz | Klasa optyczna PMMA |
| 3-drożny kran | NIPRO | NCN-3L | Sterylna jednorazowa strzykawka 3-drożna |
| 5 ml | TERUMO | DVR-3410 | ml strzykawka doustna, bez igły |
| Adapter | Dong Zhong Co., Ltd. | Dostosowany | adapter PMMA |
| Agaroza | Sigma-Aldrich | A9414 | Agaroza, niska temperatura żelowania |
| Wzmacniacz | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | Wzmacniacz wysokiego napięcia |
| Oprogramowanie AutoCAD | Autodesk | Wersja edukacyjna | Szkic |
| suplementu B-27 | Gibco | 12587-010 | B-27 suplement (50x), bez witaminy A |
| Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Nazywany również rekombinowanym ludzkim FGF-basic |
| Czarna gumowa zatyczka | TERUMO | DVR-3413 | Ze strzykawek doustnych 3 ml, bez igły |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Odczynnik blokujący |
| Wirówka | HSIANGTAI | CV2060 | Wirówka |
| CO2 traser laserowy | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II Zakupiony | od http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Łącznik stożkowy | IDEX Health & Science | F-120X | Jednoczęściowy stożek 10-32 dokręcany palcem, do adaptera 1/16" OD naturalnego |
| stożka-Luer | IDEX Zdrowie & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 żeński na żeński Luer, |
| konfokalny mikroskop fluorescencyjny | Leica Microsystems | TCS SP5 | Instrukcja obsługi Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Aparat cyfrowy | OLYMPUS | E-330 | Automatyczna akwizycja zdjęć poklatkowych |
| Oscyloskop cyfrowy | Tektronix | TDS2024 | Mierz sygnały napięcia lub prądu w czasie w obwodzie elektronicznym lub komponencie, aby wyświetlić amplitudę i częstotliwość. |
| Taśma dwustronna | 3M | PET 8018 | Zakupiony od http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s podłoże / mieszanka składników odżywczych szynki F-12 (DMEM / F12) | Gibco | 12400024 | DMEM / F-12, proszek, HEPES |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu |
| Multiplekser | EF Asiatic Sky Co., Ltd. | Dostosowane | Monitoruj i kontroluj prąd elektryczny w poszczególnych kanałach |
| Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Zwany również rekombinowanym ludzkim EGF |
| Szybko działający klej cyjanoakrylowy | 3M | 7004T | Wytrzymałość kleju błyskawicznego (płyn) |
| Łącznik z płaskim dnem | IDEX Zdrowie & Science | P-206 | Nakrętka męska bezkołnierzowa Delrin, 1/4-28 płaska denna, do 1/16" OD niebieski |
| Generator funkcyjny | Agilent Technologies | 33120A Wysokowydajny | 15 MHz syntetyzowany Generator funkcji z wbudowaną funkcją arbitralnego kształtu fali |
| Kozioł anty-mysi IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Kozia anty-mysia IgG H& L (Alexa Fluor 488) wstępnie zaadsorbowany |
| kozioł anty-króliczy IgG H& L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Kozie przeciwciało poliklonalne drugorzędowe przeciwko króliczej IgG - H& L (Alexa Fluor 555), wstępnie zaadsorbowany |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Barwienie jądrowe |
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health | 1.48v | Analizuj obrazy fluorescencyjne |
| Ind– Puszka– szkło tlenkowe (ITO) | Merck | 300739 | Do grzejnika ITO |
| Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami | OLYMPUS | CKX41 | Do obserwacji morfologii komórek |
| Termopara typu K | Tecpel | TPK-02A | Temperatura termopary |
| Adapter Luer | IDEX Zdrowie & Science | P618-01 | Adapter Luer żeński Luer na 1/4-28 męski polipropylenowy |
| strzykawka Luer lock | TERUMO | DVR-3413 | Do mostków solnych agarowych |
| Mysz anty-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Marker astrocytów |
| Oligodendrocyty znacznik O4 przeciwciało | R& Systemy D | MAB1326 | Marker oligodendrocytów |
| Paraformaldehyd (PFA) | Mocowanie Sigma-Aldrich | P6148 | agent |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Basic Life | BL2651 | Roztwór myjący |
| Poli-L-Lizyna (PLL) | SIGMA | P4707 | Roztwór powlekający |
| Precyzyjne szkła nakrywkowe grubość Nr 1,5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programowalny zmotoryzowany stolik X-Y-Z | Tanlian Inc | Dostosowane | Zakupione od http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proporcjonalne– całka– regulator pochodny (PID) | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Regulator temperatury |
| Rurka PTFE | Professional Plastics Inc. Oddział na Tajwanie | Średnica zewnętrzna 1/16 cala | Biała półprzezroczysta rurka PTFE |
| Królik anty-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Marker neuron |
| Pompa strzykawkowa | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programowalna pojedyncza pompa strzykawkowa |
| Detergent TFD4 | FRANKLAB | TFD4 | Środek do czyszczenia szkła nakrywkowego |
| Klej termiczny | Kuan-MIN Tech Co. | Dostosowane | Zakupione od http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Roztwór przepuszczalny |
| Myjka ultradźwiękowa | LEO | LEO-300S | Ultradźwiękowa myjka sterykalna |
| Komora próżniowa | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Suszarka próżniowa |
| Biała wtyczka doszczelna | IDEX Zdrowie & Science | P-316 | 1/4-28 Płasko-Dno, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
Bibliografia
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928(2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738(2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Stymulacja impulsami pr du sta egomikrofluidyczny system hodowli kom rekmonta chipa do elektrotaksjiobserwacje za pomoc mikroskopii konfokalnejmysie kom rki progenitorowe neuron wpo ywka do utrzymania kom rek macierzystychmultiplekser pola elektrycznegoprogramowalny zmotoryzowany st XYZgrza ka z tlenku indu i cyny
