Artykuł metodologiczny

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

DOI:

10.3791/61917

⸱

14 kwietnia 2021

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizjologiczne pola elektryczne (EF) odgrywają istotną rolę w migracji, różnicowaniu, podziale i śmierci komórek. W artykule opisano mikroprzepływowy system hodowli komórek, który został wykorzystany do długoterminowego badania różnicowania komórek przy użyciu mikroskopii. System mikroprzepływowy składa się z następujących głównych elementów: optycznie przezroczystego układu elektrotaktycznego, przezroczystej grzałki tlenku indu i cyny (ITO), pompy do napełniania pożywki hodowlanej, zasilacza elektrycznego, wzmacniacza mocy wysokiej częstotliwości, multipleksera EF, programowalnego stopnia z napędem silnikowym X-Y-Z oraz mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonego w kamerę cyfrową. System mikroprzepływowy jest korzystny w upraszczaniu ogólnej konfiguracji eksperymentalnej, a co za tym idzie, zużycia odczynnika i próbki. Praca ta polega na różnicowaniu nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych stymulacją impulsami prądu stałego (DC). W pożywce podtrzymującej komórki macierzyste mysie NPC (mNPC) różnicowały się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty po stymulacji impulsem DC. Wyniki sugerują, że proste leczenie impulsem prądu stałego może kontrolować los mNPC i może być wykorzystane do opracowania strategii terapeutycznych w zaburzeniach układu nerwowego. System może być używany do hodowli komórkowych w wielu kanałach, do długotrwałej stymulacji EF, do obserwacji morfologicznej komórek oraz do automatycznej akwizycji obrazów poklatkowych. Ten układ mikroprzepływowy nie tylko skraca wymagany czas eksperymentu, ale także zwiększa dokładność kontroli nad mikrośrodowiskiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronalne komórki prekursorowe (NPC, znane również jako nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe) mogą być obiecującym kandydatem do neurodegeneracyjnej strategii terapeutycznej1. Niezróżnicowane NPC mają zdolność do samoodnawiania, wielomoc i zdolność proliferacji2,3. Poprzednie badanie wykazało, że macierz zewnątrzkomórkowa i mediatory molekularne regulują różnicowanie NPC. Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) promują proliferację NPC, utrzymując w ten sposób stan niezróżnicowany4.

Poprzednie badania wykazały, że stymulacja elektryczna może regulować czynności fizjologiczne komórki, takie jak podział5, migration6,7,8, differentiation1,9,10, oraz śmierć komórki11. Pola elektryczne (EF) odgrywają istotną rolę w rozwoju i regeneracji ośrodkowego układu nerwowego12,13,14. Od 2009 do 2019 roku laboratorium to badało odpowiedzi komórkowe na zastosowanie EF w systemie mikroprzepływowym1,6,7,8,15,16,17. Wielokanałowy, optycznie przezroczysty chip elektrotaktyczny (MOE) został zaprojektowany tak, aby nadawał się do barwienia immunofluorescencyjnego w mikroskopii konfokalnej. Chip charakteryzował się wysoką przezroczystością optyczną i dobrą trwałością oraz pozwalał na jednoczesne przeprowadzenie trzech niezależnych eksperymentów stymulacyjnych i kilku warunków barwienia immunologicznego w jednym badaniu. System mikroprzepływowy jest korzystny w upraszczaniu ogólnej konfiguracji eksperymentalnej, a co za tym idzie, zużycia odczynnika i próbki. W artykule opisano rozwój mikroprzepływowego systemu hodowli komórek, który został wykorzystany do długoterminowego badania różnicowania komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i produkcja układu MOE

  1. Narysuj wzory dla poszczególnych warstw polimetakrylanu metylu (PMMA) i taśmy dwustronnej za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Rysunek 1A, Tabela materiałów). Wytnij zarówno arkusze PMMA, jak i taśmę dwustronną za pomocą rysika laserowego CO2 (Rysunek 1B).
    1. Włącz rysik laserowy CO2 i podłącz go do komputera osobistego. Otwórz plik zaprojektowanego wzorca za pomocą oprogramowania.
    2. Umieść arkusze PMMA (275 mm x 400 mm) lub taśmę dwustronną (210 mm x 297 mm) na platformie rysika laserowego (Rysunek 2A). Ustaw ostrość laser na powierzchni arkuszy PMMA lub taśmie dwustronnej za pomocą narzędzia do automatycznego ustawiania ostrości.
    3. Wybierz rysik laserowy jako drukarkę, a następnie "wydrukuj" wzór za pomocą rysika laserowego, aby rozpocząć bezpośrednią ablację na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej i uzyskać indywidualne wzory na arkuszu lub taśmie PMMA (Rysunek 2B).
  2. Usuń folię ochronną z arkuszy PMMA i oczyść powierzchnię za pomocą gazowego azotu.
    UWAGA: Rysunek wzoru PMMA i bezpośrednia obróbka arkusza PMMA zostały wykonane zgodnie z poprzednim raportem17.
  3. Aby połączyć ze sobą wiele warstw arkuszy PMMA, ułóż trzy kawałki arkuszy PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1, 2 i 3) i połącz je pod ciśnieniem 5 kg/cm2 w spajarce termicznej przez 30 minut w temperaturze 110 °C, aby utworzyć zespół kanału przepływu/stymulacji elektrycznej (Rysunek 2C).
    UWAGA: Różne partie komercyjnie otrzymywanych arkuszy PMMA mają nieco inną temperaturę zeszklenia (Tg). Optymalna temperatura wiązania musi być testowana w krokach co 5 °C zbliżonych do Tg.
  4. Przyklej 12 sztuk adapterów do poszczególnych otworów w warstwie 1 zespołu chipów MOE za pomocą szybko działającego kleju cyjanoakrylowego.
    UWAGA: Adaptery wykonane są z PMMA metodą wtrysku. Płaskie powierzchnie na dole służą do podłączenia do układu MOE. Adaptery z gwintem wewnętrznym 1/4W-28 służą do podłączania białych wtyczek dokręcanych palcami, złączy z płaskim dnem lub adapterów Luer. Zachowaj ostrożność podczas używania szybko działającego kleju cyjanoakrylowego. Unikaj rozpryskiwania się do oczu.
  5. Zdezynfekuj podłoża PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3), taśmę dwustronną (warstwa 4) i PMMA o grubości 3 mm (warstwa 5) za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV) przez 30 minut przed montażem chipa (Rysunek 1A).
  6. Przyklej podłoża PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3) do 3 mm warstwy optycznej PMMA (warstwa 5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 4), aby zakończyć montaż PMMA (warstwy 1-5) (Rysunek 1A).
  7. Przygotuj czystą szklankę nakrywkową do montażu na chipie.
    1. Napełnij dziesięciokrotnym rozcieńczeniem detergentu do słoika do barwienia (patrz Tabela materiałów) i wyczyść szkło nakrywkowe w tym detergencie za pomocą myjki ultradźwiękowej przez 15 minut.
    2. Dokładnie opłucz słoik do barwienia pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć wszelkie ślady detergentu.
    3. Kontynuuj płukanie wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady wody z kranu i powtórz krok 1.7.2 dwa razy.
    4. Osusz oczyszczoną szklankę nakrywkową, przedmuchując ją gazowym azotem.
  8. Zdezynfekuj zespół PMMA (warstwy 1-5), taśmę dwustronną (warstwa 6) i szkło nakrywkowe (warstwa 7) za pomocą promieniowania UV wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut przed montażem chipa (Rysunek 1A).
  9. Przyklej oczyszczoną szklaną pokrywę (warstwa 7) do zespołu PMMA (warstwy 1-5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 6) (Rysunek 1A).
  10. Inkubuj chip MOE w komorze próżniowej przez noc; użyj zestawu chipa MOE do kolejnych procedur (Rysunek 3).

2. Powlekanie poli-L-lizyny (PLL) na substracie w regionach hodowli komórkowej

  1. Przygotuj rurkę z politetrafluoroetylenu, złącze z płaskim dnem, złącze stożkowe, adapter stożkowy-Luer, białą zatyczkę dociskową na palce (zwaną również korkiem), adapter Luer, strzykawkę Luer lock i czarną gumową zatyczkę (Rysunek 4A, tabela materiałów). Sterylizuj wszystkie powyższe składniki w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min.
  2. Uszczelnij otwory adapterów mostka agarowego (Rysunek 1A) białymi zatyczkami dokręcanymi palcami. Podłącz złącze z płaskim dnem do zespołu chipa MOE za pomocą adapterów wlotowych i wylotowych medium (Rysunek 4B). Podłącz adapter stożkowy Luer do 3-drogowych zaworów odcinających.
  3. Dodaj 2 ml 0,01% roztworu PLL za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml, która łączy się z 3-kierunkowym kranem wlotu medium (Rysunek 4B-figure-protocol-1).
  4. Podłącz pustą strzykawkę o pojemności 3 ml do 3-kierunkowego kurka wylotu medium (Rysunek 4B-figure-protocol-2).
  5. Wypełnij regiony kultur komórkowych roztworem PLL. Ręcznie powoli pompuj roztwór powlekający tam iz powrotem. Zamknij dwa 3-drogowe zawory odcinające, aby uszczelnić roztwór wewnątrz obszarów hodowli.
  6. Inkubować chip MOE w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze wypełnionym 5% atmosferąCO2
    7. .

3. Przygotowanie sieci mostów solnych

  1. Postępując zgodnie z krokiem 2.6, otwórz dwa 3-drogowe zawory odcinające i wypłucz pęcherzyki w kanałach, ręcznie pompując roztwór powlekający tam iz powrotem w kanale za pomocą dwóch strzykawek.
  2. Pobrać 3 ml kompletnego podłoża (pożywki podtrzymującej komórki macierzyste składającej się ze zmodyfikowanej mieszanki składników odżywczych Eagle's Medium firmy Dulbecco/Ham's F-12 (DMEM/F12), 2% suplementu B-27, 20 ng/ml EGF i 20 ng/ml bFGF) do strzykawki o pojemności 3 ml, która łączy się z 3-kierunkowym kranem wlotu pożywki (Rysunek 4B-figure-protocol-3 i Rysunek 4B- figure-protocol-4).
  3. Dodać 3 ml kompletnej pożywki, aby zastąpić roztwór powlekający w obszarach hodowli komórkowych. Podłącz pustą strzykawkę o pojemności 5 ml do 3-kierunkowego kranu wylotu medium (Rysunek 4B-figure-protocol-5).
  4. Przygotuj sieć mostków solnych (Rysunek 5).
    1. Przetnij czarną gumową zatyczkę, aby utworzyć szczelinę, i włóż elektrody srebra (Ag)/chlorku srebra (AgCl) przez czarną gumową zatyczkę do strzykawki Luer lock (Rysunek 4A).
    2. Zastąp białą zatyczkę dociskową adapterem Luer i wstrzyknij 3% gorącej agarozy, aby napełnić adapter Luer.
      UWAGA: W celu przygotowania gorącej agarozy rozpuścić 3 g proszku agarozy w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
    3. Podłączyć strzykawkę Luer lock do adaptera Luer. Wstrzyknąć 3% gorącej agarozy przez czarną gumową zatyczkę, aby napełnić strzykawkę Luer lock za pomocą strzykawki z igłą. Odczekaj od 10 do 20 minut, aż agaroza ostygnie i stężeje.
      UWAGA: W celu zwiększenia objętości agarozy, strzykawka Luer lock jest montowana na adapterze Luer (Rysunek 4 i Rysunek 5). Następnie duże elektrody są wprowadzane do strzykawki Luer lock. Elektroda jest w stanie zapewnić stabilną stymulację elektryczną dla długotrwałego eksperymentu.

4. Przygotowanie mNPC

  1. Hodowla mNPCs1 w kompletnym podłożu w kolbie do hodowli komórkowych 25T w temperaturze 37 °C w inkubatorze wypełnionym 5% atmosferą CO2 . Subkulturuj komórki co 3-4 dni i wykonuj wszystkie eksperymenty na komórkach, które przeszły 3-8 pasaży od pierwotnego źródła.
  2. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj neurosfery w temperaturze 100 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i przemyć neurosfery 1x PBS Dulbecco (DPBS). Obracaj neurosfery pod ciśnieniem 100 × g przez 5 minut.
  3. Odessać 1x DPBS, a następnie ponownie zawiesić neurosfery w kompletnym pożywce. Dokładnie i delikatnie wymieszaj.
  4. Dodaj 1 ml zawiesiny neurosfery za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, która łączy się z 3-kierunkowym zaworem odcinającym wylotu (Rysunek 4B-figure-protocol-6).

5. Konfiguracja systemu mikroprzepływowego do stymulacji impulsami prądu stałego (Rysunek 6)

  1. Zainstaluj układ MOE z komórkami na przezroczystej grzałce ITO, która jest przymocowana do programowalnego zmotoryzowanego stolika XYZ.
    UWAGA: Temperatura powierzchni ITO jest kontrolowana przez regulator proporcjonalno-całkująco-pochodny i utrzymywana na poziomie 37 °C. Termopara typu K jest zaciśnięta między chipem a grzałką ITO w celu monitorowania temperatury obszarów hodowli komórkowych w chipie. Układ MOE jest zainstalowany na programowalnym zmotoryzowanym stoliku X-Y-Z i nadaje się do automatycznej akwizycji obrazu poklatkowego w poszczególnych sekcjach kanału. Produkcja grzałki ITO i konfiguracja systemu ogrzewania kultur komórkowych zostały opisane wcześniej18,19.
  2. Wlej mNPC poprzez ręczne pompowanie do chipa MOE przez wylot pożywki. Inkubować rozsiany komórkami chip MOE na grzałce ITO o temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
  3. Po 4 godzinach przepompować całe medium przez chip MOE przez wlot medium z natężeniem przepływu 20 μL/h za pomocą pompy strzykawkowej.
    UWAGA: MNPC są hodowane i utrzymywane w chipie przez dodatkowe 24 godziny przed stymulacją EF, aby umożliwić przyczepienie się komórek i wzrost. Odpady płynne są zbierane w pustej strzykawce o pojemności 5 ml podłączonej do 3-drogowego kranu wylotu, pokazanego jako "odpad" w Rysunek 6A. Konfiguracja systemu mikroprzepływowego MOE jest pokazana na rysunku Rysunek 6. Ten system mikroprzepływowy zapewnia ciągłe dostarczanie składników odżywczych do komórek. Kompletna świeża pożywka jest w sposób ciągły pompowana do chipa MOE w celu utrzymania stałej wartości pH. W związku z tym komórki mogą być hodowane poza inkubatorem emisjiCO2
    4. .
  4. Użyj przewodów elektrycznych, aby podłączyć multiplekser EF do układu MOE za pomocą elektrod Ag/AgCl na chipie. Podłącz multiplekser EF i generator funkcyjny do wzmacniacza, aby wyprowadzać impulsy prądu stałego o fali prostokątnej o wielkości 300 mV/mm z częstotliwością 100 Hz przy 50% cyklach pracy (50% czasu włączenia i 50% czasu wyłączenia) (Rysunek 6B).
    1. Podłącz przewody elektryczne do multipleksera EF. Podłącz przewody elektryczne do układu MOE za pomocą elektrod Ag/AgCl.
    2. Podłącz multiplekser EF do amplifier za pomocą przewodów elektrycznych. Podłączyć generator funkcyjny do amplifier i oscyloskop cyfrowy.
      UWAGA: Multiplekser EF to obwód, który obejmuje impedancję komory hodowlanej w obwodzie i łączy wszystkie poszczególne komory w równoległą sieć elektroniczną. Każda z trzech komór hodowlanych jest elektrycznie podłączona szeregowo do rezystora zmiennego (Vr) i amperomierza (pokazanego jako μA w Rysunek 6A) w multiplekserze. Prąd elektryczny przepływający przez każdą komorę hodowlaną jest zmieniany przez sterowanie Vr, a prąd jest pokazany na odpowiednim amperomierzu. Natężenie pola elektrycznego w każdym regionie hodowli komórkowej obliczono za pomocą prawa Ohma, I = σEA, gdzie I to prąd elektryczny, σ (ustawione na 1,38 S·m-1 dla DMEM/F1220) to przewodność elektryczna pożywki hodowlanej, E to pole elektryczne, a A to pole przekroju poprzecznego komory elektrotaktycznej. Dla wymiaru obszaru hodowli komórkowej pokazanego na Rysunek 1, prąd elektryczny wynosi ~87 mA i ~44 mA dla impulsu DC i DC odpowiednio przy 50% cyklu pracy.
  5. Poddaj mNPC kwadratowym impulsom prądu stałego o wielkości 300 mV/mm z częstotliwością 100 Hz przez 48 godzin. Pompuj w sposób ciągły całe podłoże z szybkością 10 μl/h, aby zapewnić odpowiednie odżywienie komórkom i utrzymać stałą wartość pH w pożywce.

6. Testy immunofluorescencyjne mNPC po pulsacyjnej stymulacji DC

UWAGA: W tym kroku cały odczynnik jest pompowany przez wlot medium za pomocą pompy strzykawkowej.

  1. Po 3, 7 lub 14 dniach hodowli in vitro (DIV) po wysiewie1, przemyj komórki 1x PBS przy natężeniu przepływu 25 μL/min przez 20 min.
  2. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA). Pompuj 4% PFA do chipa z natężeniem przepływu 25 μL/min przez 20 minut, aby zastąpić 1x PBS. Aby zastąpić 4% PFA, należy przemyć komórki 1x PBS przy natężeniu przepływu 25 μL/min przez 20 minut.
  3. Pompować 0,1% Triton X-100 do chipa z natężeniem przepływu 50 μl/min przez 6 minut, aby przepuszczalność komórek. Zmniejsz natężenie przepływu do 50 μl/h na dodatkowe 30 minut, aby zareagować z komórkami. Aby zastąpić 0,1% Triton X-100, należy przemyć ogniwa 1x PBS przy natężeniu przepływu 50 μL/min przez 6 minut.
  4. Zablokuj komórki za pomocą PBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Pompować 1% BSA do chipa z natężeniem przepływu 50 μl/min przez 6 minut. Zmniejsz natężenie przepływu do 100 μl/h i pompuj przez 1 godzinę.
  5. Pompować przeciwciała do podwójnego barwienia immunologicznego do chipa z szybkością przepływu 50 μl/min przez 6 minut i inkubować chip przez 18 godzin w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 1x PBS przy natężeniu przepływu 50 μL/min przez 15 min.
  6. Pompuj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorem Alexa do chipa z szybkością przepływu 50 μl/min przez 6 minut. Zmniejsz natężenie przepływu do 50 μL/h i pompuj przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyć komórki 1x PBS przy natężeniu przepływu 50 μL/min przez 15 min.
  7. W przypadku barwienia jądrowego należy pompować Hoechst 33342 do chipa z natężeniem przepływu 20 μl/min przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyć komórki 1x PBS przy natężeniu przepływu 50 μL/min przez 15 min.
  8. Po barwieniu immunologicznym obserwuj komórki za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

7. Analiza obrazu i przetwarzanie danych

  1. Analizuj obrazy fluorescencyjne za pomocą oprogramowania z wbudowanymi narzędziami pomiarowymi (patrz tabela materiałów).
  2. Porównaj jądra barwione przeciwwagą Hoechsta (całkowita liczba komórek) w grupie kontrolnej i badanej i oblicz procent komórek wykazujących ekspresję każdego markera fenotypowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowa konfiguracja układu MOE jest pokazana w Rysunek 1. Chip mikroprzepływowy zapewnia korzystne podejście do zmniejszania rozmiaru zestawu eksperymentalnego, objętości próbki i objętości odczynnika. Chip MOE został zaprojektowany do przeprowadzenia trzech niezależnych eksperymentów stymulacji EF i kilku warunków barwienia immunologicznego jednocześnie w jednym badaniu (Rysunek 3). Ponadto chip MOE, który ma wysoką przezroczystość o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas wytwarzania chipa MOE adaptery są mocowane do warstwy 1 chipa MOE za pomocą szybko działającego kleju cyjanoakrylowego. Klej nakłada się na 4 rogi adapterów, a następnie równomiernie dociska się do adapterów. Należy unikać nadmiaru kleju, aby zapewnić całkowitą polimeryzację kleju. Ponadto gotowy zespół chipów MOE jest inkubowany w komorze próżniowej. Ten krok pomaga usunąć pęcherzyki między warstwą PMMA, taśmą dwustronną i szkłem nakrywkowym.

Wybór materiału elektrody opiera się na fa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują profesorowi Tang K. Tang, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, za pomoc w dostarczeniu mysich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (mNPC). Autorzy dziękują również profesorowi Tang K. Tangowi i pani Ying-Shan Lee za ich cenną dyskusję na temat różnicowania mNPC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podłoża PMMA 1 mm (warstwy 1-3)BHTK2R20Polimetakrylan metylu (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 ml plastikowa tubaProtech Technology Enterprise Co., LtdCT-15-PL-TWStożkowa rurka z dnem z nakrętką, zmontowana, wstępnie sterylizowana
strzykawka 3 mlTERUMODVR-3413Strzykawki doustne 3 ml, bez igły
mm klasy optycznej PMMA (warstwa 5)CHI MEI CorporationACRYPOLY PMMA ArkuszKlasa optyczna PMMA
3-drożny kranNIPRONCN-3LSterylna jednorazowa strzykawka 3-drożna
5 mlTERUMODVR-3410ml strzykawka doustna, bez igły
AdapterDong Zhong Co., Ltd.Dostosowanyadapter PMMA
AgarozaSigma-AldrichA9414Agaroza, niska temperatura żelowania
WzmacniaczA.A. Lab Systems LtdA-304Wzmacniacz wysokiego napięcia
Oprogramowanie AutoCADAutodeskWersja edukacyjnaSzkic
suplementu B-27Gibco12587-010B-27 suplement (50x), bez witaminy A
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) PeprotechAF-100-18BNazywany również rekombinowanym ludzkim FGF-basic
Czarna gumowa zatyczkaTERUMODVR-3413Ze strzykawek doustnych 3 ml, bez igły
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichB4287Odczynnik blokujący 
WirówkaHSIANGTAICV2060Wirówka
CO2 traser laserowyLaser Tools and Technics Corp. ILS-II Zakupionyod http://www.lttcorp.com/index.htm
Łącznik stożkowyIDEX Health & ScienceF-120XJednoczęściowy stożek 10-32 dokręcany palcem, do adaptera 1/16" OD naturalnego
stożka-LuerIDEX Zdrowie & ScienceP-659Luer Adapter 10-32 żeński na żeński Luer,
konfokalny mikroskop fluorescencyjnyLeica MicrosystemsTCS SP5Instrukcja obsługi Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Aparat cyfrowyOLYMPUSE-330Automatyczna akwizycja zdjęć poklatkowych
Oscyloskop cyfrowyTektronixTDS2024Mierz sygnały napięcia lub prądu w czasie w obwodzie elektronicznym lub komponencie, aby wyświetlić amplitudę i częstotliwość.
Taśma dwustronna3M PET 8018Zakupiony od http://en.thd.com.tw/
Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s podłoże / mieszanka składników odżywczych szynki F-12 (DMEM / F12)Gibco12400024DMEM / F-12, proszek, HEPES
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)Gibco21600010DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu
MultiplekserEF Asiatic Sky Co., Ltd.DostosowaneMonitoruj i kontroluj prąd elektryczny w poszczególnych kanałach
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)PeprotechAF-100-15Zwany również rekombinowanym ludzkim EGF
Szybko działający klej cyjanoakrylowy3M 7004TWytrzymałość kleju błyskawicznego (płyn)
Łącznik z płaskim dnemIDEX Zdrowie & ScienceP-206Nakrętka męska bezkołnierzowa Delrin, 1/4-28 płaska denna, do 1/16" OD niebieski
Generator funkcyjnyAgilent Technologies33120A Wysokowydajny15 MHz syntetyzowany  Generator funkcji  z wbudowaną funkcją arbitralnego kształtu fali
Kozioł anty-mysi IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150117Kozia anty-mysia IgG H& L (Alexa Fluor 488) wstępnie zaadsorbowany
kozioł anty-króliczy IgG H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150086Kozie przeciwciało poliklonalne drugorzędowe przeciwko króliczej IgG - H& L (Alexa Fluor 555), wstępnie zaadsorbowany
Hoechst 33342InvitrogenH3570Barwienie jądrowe
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of Health1.48vAnalizuj obrazy fluorescencyjne 
Ind– Puszka– szkło tlenkowe (ITO)Merck300739Do grzejnika ITO
Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazamiOLYMPUSCKX41Do obserwacji morfologii komórek
Termopara typu KTecpelTPK-02ATemperatura  termopary
Adapter LuerIDEX Zdrowie & ScienceP618-01Adapter Luer żeński Luer na 1/4-28 męski polipropylenowy
strzykawka Luer lockTERUMODVR-3413Do mostków solnych agarowych
Mysz anty-GFAPeBioscience14-9892Marker astrocytów
Oligodendrocyty   znacznik  O4  przeciwciałoR& Systemy DMAB1326Marker oligodendrocytów
Paraformaldehyd (PFA)Mocowanie Sigma-AldrichP6148  agent
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Basic LifeBL2651Roztwór myjący
Poli-L-Lizyna (PLL)SIGMAP4707Roztwór powlekający
Precyzyjne szkła nakrywkowe grubość Nr 1,5HMARIENFELD107242https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programowalny zmotoryzowany stolik X-Y-ZTanlian IncDostosowaneZakupione od http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proporcjonalne– całka– regulator pochodny (PID)Toho ElectronicsTTM-J4-R-ABRegulator temperatury 
Rurka PTFEProfessional Plastics Inc. Oddział na TajwanieŚrednica zewnętrzna 1/16 calaBiała półprzezroczysta rurka PTFE
Królik anty-Tuj1Abcamab18207Marker neuron
Pompa strzykawkowaNew Era Systems IncNE-1000NE-1000 programowalna pojedyncza pompa strzykawkowa
Detergent TFD4FRANKLABTFD4Środek do czyszczenia szkła nakrywkowego
Klej termicznyKuan-MIN Tech Co.DostosowaneZakupione od http://kmtco.com.tw/
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Roztwór przepuszczalny
Myjka ultradźwiękowaLEOLEO-300SUltradźwiękowa myjka sterykalna
Komora próżniowaDENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.DOV-30Suszarka próżniowa
Biała wtyczka doszczelnaIDEX Zdrowie & ScienceP-3161/4-28 Płasko-Dno, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html
3 5 PEEK

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928(2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738(2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stymulacja impulsami pr du sta egomikrofluidyczny system hodowli kom rekmonta chipa do elektrotaksjiobserwacje za pomoc mikroskopii konfokalnejmysie kom rki progenitorowe neuron wpo ywka do utrzymania kom rek macierzystychmultiplekser pola elektrycznegoprogramowalny zmotoryzowany st XYZgrza ka z tlenku indu i cyny

Powiązane artykuły