Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Streszczenie

Muchy piaskowe są naturalnymi wektorami dla gatunków Leishmania, pasożytniczych pierwotniaków wywołujących szerokie spektrum objawów, od zmian skórnych po patologię trzewną. Rozszyfrowanie natury interakcji wektor/pasożyt ma zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia przenoszenia Leishmania na ich gospodarzy. Wśród parametrów kontrolujących kompetencję wektorów muchy piaskowej (tj. ich zdolność do przenoszenia i przenoszenia patogenów) wykazano, że kluczową rolę odgrywają parametry właściwe tym owadom. Na przykład odpowiedź immunologiczna owadów wpływa na kompetencję wektora muchy piaskowej do Leishmania. Badania nad tymi parametrami były ograniczone ze względu na brak metod modyfikacji ekspresji genów przystosowanych do stosowania w tych organizmach niemodelowych. Regulacja w dół genów przez małe interferujące RNA (siRNA) jest możliwa, ale oprócz tego, że jest to wyzwanie techniczne, prowadzi tylko do częściowej utraty funkcji, która nie może być przekazywana z pokolenia na pokolenie. Ukierunkowana mutageneza za pomocą technologii CRISPR/Cas9 została niedawno zaadaptowana do muchy piaskowej Phlebotomus papatasi. Technika ta prowadzi do wygenerowania zakaźnych mutacji w specjalnie wybranym locus, co pozwala na badanie genów będących przedmiotem zainteresowania. System CRISPR/Cas9 opiera się na indukcji ukierunkowanych pęknięć dwuniciowego DNA, które są następnie naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę sterowaną homologią (HDR). NHEJ składa się z prostego zamknięcia przerwy i często prowadzi do małych zdarzeń wstawiania/usuwania. W przeciwieństwie do tego, HDR wykorzystuje obecność cząsteczki DNA dawcy dzielącej homologię z docelowym DNA jako matrycę do naprawy. W tym miejscu przedstawiamy metodę mikroiniekcji zarodków muchy piaskowej do celowanej mutagenezy za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu NHEJ, która jest jedyną jak dotąd techniką modyfikacji genomu dostosowaną do wektorów muchy piaskowej.

Wprowadzenie

Choroby przenoszone przez wektory są głównym zagrożeniem dla zdrowia publicznego w ciągłej ewolucji. Według Światowej Organizacji Zdrowia setki gatunków wektorów rozprzestrzenionych w bardzo różnych rodzinach filogenetycznych (np. komary, kleszcze, pchły) są odpowiedzialne za przenoszenie ogromnej liczby patogenów drobnoustrojowych, co powoduje ponad 700 000 zgonów ludzi rocznie. Wśród owadów wektorów dużą grupę stanowią muchy piaskowe flebotominowe (Diptera, Psychodidae), w których znajduje się 80 sprawdzonych gatunków wektorów wykazujących wyraźne cechy fenotypowe i zdolności wektorowe występujące w różnych regionach geograficznych. Są one wektorami pasożytów pierwotniaków z rodzaju Leishmania, powodując około 1,3 miliona nowych przypadków leiszmaniozy i od 20 000 do 30 000 zgonów rocznie. Wyniki kliniczne leiszmaniozy są zróżnicowane, a objawy wahają się od samoograniczających się zmian skórnych po rozsiew trzewnych, które są śmiertelne w przypadku braku leczenia.

Muchy piaskowe to wyłącznie owady lądowe. Ich cykl życiowy, stosunkowo długi w porównaniu z innymi muchówkami, trwa do trzech miesięcy, w zależności od różnych parametrów, takich jak temperatura, wilgotność i odżywianie. Składa się z jednego stadium embrionalnego (od 6 do 11 dni), czterech stadiów larwalnych (trwających łącznie od 23 do 25 dni) i jednego stadium poczwarki (od 9 do 10 dni), po którym następuje metamorfoza, a następnie dorosłość. Muchy piaskowe wymagają wilgotnego i ciepłego środowiska do hodowli. Zarówno samce, jak i samice żywią się cukrami, pozyskiwanymi w naturze z nektarów kwiatowych. Tylko samice żywią się krwią, ponieważ do produkcji jaj potrzebują białka uzyskanego z mączki z krwi¹.

Ważnym celem badań jest określenie charakteru interakcji wektor/pasożyt, które prowadzą do rozwoju zakaźnych infekcji. Podobnie jak w przypadku innych owadów-wektorów, wykazano, że parametry nieodłącznie związane z muchami piaskowymi wpływają na ich kompetencję wektorową, którą definiuje się jako zdolność do przenoszenia i przenoszenia patogenów na swoich gospodarzy. Na przykład ekspresja galektyn przez komórki jelita środkowego muchy piaskowej Phlebotomus papatasi, działające jako receptory rozpoznające składniki powierzchniowe pasożyta, może bezpośrednio wpływać na ich kompetencję wektorową dla Leishmania major^2,3. Szlak odpowiedzi immunologicznej owadów, niedobór odporności (IMD), ma również kluczowe znaczenie dla kompetencji wektora muchy piaskowej Phlebotomus papatasi dla Leishmania major⁴. Krytyczna rola szlaków odpowiedzi immunologicznej owadów wektorów w kontrolowaniu przenoszenia zakaźnych patogenów została podobnie opisana u komarów Aedes aegypti^5,6,7, u muchy tse-tse Glossina morsitans⁸, oraz u komarów Anopheles gambiae^9,10.

Badania interakcji muchy piaskowej z Leishmania były ograniczone przez brak metod modyfikacji ekspresji genów dostosowanych do stosowania u tych owadów. Do niedawna przeprowadzano jedynie regulację w dół genów za pomocą małego interferującego RNA (siRNA)^11,12,13,14 do niedawna. Technika ta, ograniczona śmiertelnością związaną z mikroiniekcją dorosłych samic, prowadzi jedynie do częściowej utraty funkcji, która nie może być przekazywana z pokolenia na pokolenie.

Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała funkcjonalne badania genomiczne w organizmach niemodelowych, takich jak muszki piaskowe. Zmodyfikowany z adaptacyjnego układu odpornościowego u prokariontów do obrony przed bakteriofagami^15,16, system CRISPR Cas9 został szybko zaadaptowany jako narzędzie do edycji genomu dla lepszych organizmów eukariotycznych, w tym owadów. Zasada celowanej edycji genomu CRISPR/Cas9 opiera się na komplementarności pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) do określonego locus genomowego. Nukleaza Cas9 wiąże się z sgRNA i tworzy pęknięcie dwuniciowego DNA (dsDNA) w genomowym DNA, w którym sgRNA wiąże się ze swoją komplementarną sekwencją. Kompleks Cas9-sgRNA jest kierowany do sekwencji docelowej przez 17 do 20 komplementarnych zasad w sgRNA do wybranego locus, przerwanie dsDNA może być następnie naprawione przez dwie niezależne ścieżki: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) ¹⁷. Naprawa NHEJ polega na prostym zamknięciu przerwy, ale często prowadzi do małych zdarzeń wstawiania/usuwania. Naprawa DNA za pomocą HDR wykorzystuje cząsteczkę DNA dawcy dzielącą homologię z docelowym DNA jako matrycę do naprawy. Owady posiadają obie maszyny.

Technologia CRISPR/Cas9 może generować mutacje w wybranym locus, poprzez szlak naprawczy NHEJ; lub w przypadku bardziej złożonych strategii edycji genomu, takich jak knock-in lub reportery ekspresji, poprzez ścieżkę HDR z odpowiednim szablonem dawcy. U muszek piaskowych zerowe zmutowane allele czynnika odpowiedzi immunologicznej Relish zostały wygenerowane za pośrednictwem CRISPR za pośrednictwem NHEJ w Phlebotomus papatasi⁴. Zarodki muchy piaskowej zostały również wstrzyknięte w innym badaniu z mieszanką CRISPR/Cas9 ukierunkowaną na gen kodujący kolor żółty. Mimo to nie wyprodukowano żadnego dorosłego nosiciela mutacji¹⁸. Opisujemy tutaj szczegółową metodę ukierunkowanej mutagenezy muchy piaskowej za pomocą CRISPR/Cas9 za pośrednictwem NHEJ, ze szczególnym naciskiem na mikroiniekcję zarodka, która jest kluczowym etapem protokołu.

Protokół

Wykorzystanie myszy jako źródła krwi do karmienia muchy piaskowej zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health (NIH). Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania NIAID, NIH (numer protokołu LPD 68E). Bezkręgowce nie są objęte wytycznymi NIH.

1. Przygotowanie igieł (Rysunek 1)

1. Pociągnij igły i skoś zgodnie z opisem w Meuti i Harrell¹⁹. Krótko mówiąc, pociągnij igły za dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych, używając kapilar ze szkła borokrzemianowego.
2. Naostrz igły, ukosując na mokro na ukosie do mikropipet, używając bardzo drobnego kamienia.

2. Pobieranie zarodków i mikromanipulacja (Rysunek 2)

1. Pięć dni przed dniem wstrzyknięcia, krew karmi samice muchy piaskowej, tak jak jest to rutynowe w celu utrzymania kolonii. Szczegółowe informacje na temat procedur hodowli kolonii much piaskowych i wymaganego materiału można znaleźć w Lawyer et al.¹ Utrzymuj owady w inkubatorach w temperaturze 70% wilgotności i 26 °C podczas ich rozwoju.
   1. Pewnego dnia po karmieniu krwią złap karmione krwią samice w grupach po 100-150 sztuk w gipsowych doniczkach z bocznym portem. Utrzymuj samice, karmiąc je roztworem cukru (30% sacharozy – objętość wystarczająca do namoczenia małego wacika), co jest typowe dla utrzymania kolonii.
2. W 2-3 dniu po karmieniu krwią NIE zwilżaj doniczek gipsowych. Trzymanie samic na suchym podłożu zapobiegnie przedwczesnemu składaniu jaj, ponieważ samice wolą składać jaja w wilgotnym środowisku.
3. W 5 dniu po karmieniu krwią wykonaj pobranie zarodka, mikromanipulację i mikroiniekcję. Wprowadzić wilgotną bibułę filtracyjną do komory do składania jaj. Świeżo złożone zarodki nie mają w pełni rozwiniętej kosmówki i wydają się białe. Podczas zabiegu należy używać czarnej bibuły filtracyjnej, aby ułatwić wizualizację białych zarodków.
4. Przenieś małą grupę samic z gipsowego garnka do komory składania jaj przez boczne porty za pomocą aspiratora doustnego. Obecność wilgotnego podłoża (bibuły filtracyjnej) skłania samice do składania jaj.
5. Po 30-60 minutach ostrożnie wyjmij z komory bibułę filtracyjną z nowo złożonymi zarodkami. Przechowuj bibułę filtracyjną i zarodki na szalce Petriego do 3 godzin. W tym czasie należy regularnie oceniać poziom wilgotności bibuły filtracyjnej, aby upewnić się, że pozostaje ona wilgotna. W tym czasie powtórz kroki od 2.4 do 2.6 z nowymi grupami samic i zbierz jak najwięcej zarodków.
6. Przygotuj szkiełka mikroskopowe do wstrzyknięcia: ręcznie zbieraj jaja jedno po drugim bardzo cienkim pędzlem i ostrożnie przenieś je na inny kawałek wilgotnej czarnej bibuły filtracyjnej umieszczony na szkiełku mikroskopowym zwieńczonym szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
   1. Dodać wodę do bibuły filtracyjnej, wystarczająco dużo, aby zarodki były wilgotne, ale nie powodując ich odpływania od szkiełka nakrywkowego lub zasysania pod szkiełko nakrywkowe. Ułóż zarodki na szkiełku nakrywkowym. Szkiełko nakrywkowe działa jak zabezpieczenie, zapobiegając stoczeniu się jaj podczas wstrzykiwania.

3. Zastrzyki z zarodków (Rysunek 3)

1. Wstrzyknięcia należy rozpocząć od 2,5 do 3 godzin po rozpoczęciu pobierania komórek jajowych. Wstrzyknięcia należy wykonywać w temperaturze pokojowej i wilgotności otoczenia w laboratorium.
2. Upewnij się, że wyrównane zarodki mają wystarczającą ilość wody, aby były wilgotne.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zarodki były wilgotne podczas wstrzyknięć. Jeśli nie są wilgotne podczas procesu wstrzykiwania, wstrzyknięcia stają się trudne, ponieważ igła ma problemy z przebiciem zarodka. Prawidłowa ilość wody to punkt, w którym zarodki mają wokół siebie łąkotkę wody, ale szkiełko nakrywkowe nie unosi się na powierzchni wody, co powoduje, że zarodki przepychają się pod szkiełko nakrywkowe. Bardzo ważne jest monitorowanie ilości wody wokół zarodków podczas wstrzyknięć. W razie potrzeby dodaj wodę, aby zarodki były wilgotne.
3. Ostrożnie dodaj wodę, zwilżając szczotkę wodą i przenosząc wodę na tylny koniec bibuły filtracyjnej. Dodawanie wody w ten sposób pozwala na dodawanie wody w powolny i kontrolowany sposób, tak aby dodać tylko tyle, aby zarodki były wilgotne. Zbyt dużo wody może spowodować, że zarodki będą unosić się poza wyrównaniem, co utrudni wstrzyknięcie zarodków.
4. Mieszać do wstrzykiwań z powrotem do igły do mikroiniekcji. Dodać około 0,5 do 1 μl mieszanki iniekcyjnej do igły za pomocą ręcznie rysowanego wypełniacza igłowego borokrzemianowego, można również użyć końcówek do pipet z żelem. Mieszanina iniekcyjna składa się z jednego lub kilku przewodników RNA (80 ng/μL każdy) zaprojektowanych do celowania w określone locus zmieszane z dostępnym na rynku rekombinowanym białkiem Cas9 (300 ng/μL).
5. Zaczynając od ciśnienia iniekcji wynoszącego 30 psi, nacisnąć spust wtrysku, aby usunąć powietrze z końcówki igły. Spowoduje to wypchnięcie mieszanki iniekcyjnej do końcówki igły, umożliwiając przepływ mieszanki iniekcyjnej. W tym momencie powoli zwiększaj mocowanie/stałe ciśnienie, aż materiał do wstrzykiwania zacznie płynąć, a następnie wycofaj się z trzymania/stałego ciśnienia, tak aby znajdowało się tuż poniżej punktu mieszanki iniekcyjnej wypływającej z igły. Bramkowane ustawienie powinno dostarczyć tylko tyle materiału do iniekcji, aby można było zobaczyć, jak niewielka ilość materiału dostaje się do zarodka.
   UWAGA: Początkowo testowano wstrzykiwanie zarodków muchy piaskowej pod olej halowęglowy, podobnie jak w przypadku innych protokołów stosowanych w przypadku Drosophila i komarów, jednak procent przeżycia w przypadku tych zastrzyków był bardzo niski. Przeżywalność uległa poprawie, przechodząc na iniekcje na wilgotną bibułę filtracyjną, jak opisano powyżej.
6. Wbić igłę w bok zarodka. Użyj szkiełka nakrywkowego za zarodkiem jako zabezpieczenia, które pomoże igle przebić zarodek. Dostarczyć niewielką ilość mieszanki do wstrzykiwań do zarodka przed delikatnym wyjęciem igły.
7. Natychmiast po wyjęciu igły należy nacisnąć wstrzykiwacz, aby usunąć zasypany materiał z końcówki igły. Pomoże to zapobiec zatykaniu się igły.
8. Przejdź do następnego zarodka. Pomiędzy każdym wstrzyknięciem należy upewnić się, że bibuła filtracyjna jest wilgotna, a igła nie jest zatkana.
9. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków policz liczbę wstrzykniętych zarodków, aby prowadzić bieżącą liczbę.
10. Usuń szkiełko nakrywkowe, dodając wodę do bibuły filtracyjnej, aby szkiełko nakrywkowe unosiło się. W tym momencie użyj sondy (drewniany aplikator w sztyfcie z pinezką do owadów przyklejoną do końcówki), aby przytrzymać bibułę filtracyjną na miejscu, podczas gdy palec jest używany do odciągania szkiełka nakrywkowego od wstrzykniętych zarodków.
11. Zetrzyj nadmiar wody z bibuły filtracyjnej po usunięciu szkiełka nakrywkowego.

4. Hodowla po iniekcji (G₀) (Rysunek 4)

1. Przenieś bibułę filtracyjną z zarodkami na kilka warstw wilgotnej bibuły filtracyjnej umieszczonej na szalce Petriego w celu utrzymania wilgotności. Trzymaj zarodki w tym miejscu przez czas potrzebny do wstrzyknięcia innych zarodków. W ten sposób zarodki mogą być trzymane maksymalnie przez 3 godziny. Po wstrzyknięciu powoli brązowieją.
2. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy je ręcznie przenieść do wcześniej zwilżonych małych gipsowych doniczek. Nie umieszczaj zbyt wielu zarodków w każdej doniczce i zachowaj odległość między nimi, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia grzybiczego między osobnikami. Przykryj doniczki sitkiem i przechowuj je tak, jak zwykle robi się to w przypadku jaj kolonii much piaskowych, utrzymywanych w inkubatorach przy wilgotności 70% i temperaturze 26 °C, podczas ich rozwoju.
3. W 1. dniu po wstrzyknięciu należy usunąć wszystkie uszkodzone i martwe zarodki za pomocą pędzla. Dodaj 100 μl 0,5% kwasu propionowego, kropla po kropli, na gipsowe doniczki zawierające wstrzyknięte zarodki, aby ograniczyć zanieczyszczenie grzybicze. Uwalnianie cytoplazmy z zarodków uszkodzonych podczas procesu iniekcji jest szczególnie korzystne dla rozwoju grzybów.
4. Codziennie sprawdzaj doniczki gipsowe i usuwaj wszelkie złe lub martwe zarodki. Jeśli obecny jest grzyb, usuń wszystkie zainfekowane zarodki i dodaj kilka kropli 0,5% kwasu propionowego.
5. Larwy wylęgają się między 8 a 12 dniem po wstrzyknięciu. Dwa razy dziennie przenieś nowo powstałe larwy do nowych gipsowych doniczek, w grupach po maksymalnie 5-10 sztuk. Dodaj niewielką ilość jedzenia i sprawdzaj jedzenie 2-3 razy w tygodniu.
   1. Uważnie monitoruj ilość pokarmu dla larw, ponieważ zbyt duża ilość znacznie zwiększa ryzyko skażenia grzybami. Larwy much piaskowych przeżywają lepiej w grupach, jednak mogą być kanibalami, jeśli nie ma wystarczającej ilości pożywienia.
6. Kiedy larwy przepoczwarzają się, oddziel je według płci, aby samice pozostały dziewicami. Jeśli jest dużo ocalałych, odrzuć samce i zachowaj tylko samice.
   UWAGA: Zarówno mężczyźni, jak i samice mogą być nosicielami i przenosić mutacje. Ponieważ jednak samice muszą być utrzymywane w stanie dziewiczym przed ich skrzyżowaniem, łatwiej jest używać tylko samic, którym wstrzyknięto G₀, aby uniknąć konieczności rozdzielania owadów wt według płci. Samce G₀ mogą być trzymane jako zapasowe, jeśli liczba dorosłych osobników, które przeżyły, są niskie i w tym przypadku będą kojarzone z posortowanymi dziewiczymi samicami.

5. Selekcja i badanie przesiewowe zmutowanych alleli (Rysunek 5)

1. Masowo krzyżuj samice G₀ z samcami wt w klatce. Nakarm je krwią w całości, tak jak robiłoby się to w przypadku normalnego utrzymania kolonii.
2. Jednego dnia po karmieniu krwią przenieś każdą samicę G₀ z 2-3 samcami do indywidualnych rurek gipsowych za pomocą aspiratora doustnego. Nakarm muchy cukrem na małym waciku zmienianym codziennie i użyj strzykawki z wodą, aby upewnić się, że wilgotność gipsu jest odpowiednia do składania jaj.
3. Po złożeniu jaj przez samice G₀ (odpowiadających G₁), zbierz ich ciała w osobnych, opatrzonych adnotacjami probówkach Eppendorfa w celu późniejszego genotypowania. Utrzymuj zarodki, jak zwykle robi się to w przypadku kolonii wt.
4. Wyodrębnij DNA od samic G₀ wybraną metodą.
5. Badanie przesiewowe DNA pod kątem obecności mutacji, na przykład poprzez zaprojektowanie testu PCR przy użyciu starterów otaczających region oczekiwanych cięć CRISPR.
6. Przechowywać tylko zarodki G₁ złożone przez samice G₀ wykazujące oznaki transformacji. Kiedy te zarodki G₁ rozwiną się w poczwarki, oddziel je według płci i zachowaj tylko samice. Skrzyżuj samice G₁ z tej samej samicy G₀ do samców wt, nakarm je krwią, a następnie przenieś w małych grupach po 2-3 samice i 4-5 samców do małych pojemników.
   UWAGA: Wszystkie osobniki G₁ mają szansę być nosicielami unikalnej mutacji, więc jeśli liczba osobników, które przeżyły, nie jest zbyt duża, lepiej jest krzyżować samice G₁ indywidualnie z samcami WT. Przypadek kilku samic będących nosicielami innej mutacji obecnej w tej samej probówce jest rzadki, ale może wystąpić. Jeśli taki przypadek zostanie zaobserwowany po genotypowaniu, samice potomstwa G₂ powinny być następnie kryte indywidualnie z samcami wt. Ten schemat krycia pozwala uniknąć możliwości wielu mutacji u potomstwa.
7. Po złożeniu jaj zbierz ciała samic G₁ i przebadaj je pod kątem mutacji. Trzymaj tylko te rurki, w których co najmniej jedna samica wykazywała oznaki mutacji.
8. Dla późniejszych pokoleń wykonuj pojedyncze pary krzyżówek. Po złożeniu jaj przebadaj rodziców pod kątem obecności mutacji. Powtarzaj w każdym pokoleniu, aż oboje rodzice będą homozygotyczni pod względem tej samej mutacji. Po zidentyfikowaniu będą założycielami homozygotycznego stada mutantów.

Wyniki

Protokół mikroiniekcji CRISPR/Cas9 opisany tutaj w celu generowania mutantów muszki piaskowej został opracowany w poprzedniej publikacji⁴. Podejście to zapewniło wysoką wydajność mutagenezy, gdyż 11 z 540 osobników przeżyło procedurę, z czego 9 było mutantami. Podczas projektowania przewodników do mutacji CRISPR/Cas9 krytycznym pierwszym krokiem jest sekwencjonowanie regionu wokół obszaru docelowego. Matryca do sekwencjonowania powinna pochodzić z linii, która zostanie wykorzystana jako źródło emb...

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj niedawno opracowaną metodę mikroiniekcji zarodka do celowanej mutagenezy za pomocą CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych Phlebotomus papatasi. Mikroiniekcja zarodków do modyfikacji genetycznej owadów została opracowana u Drosophila w połowie lat 80. XX wiekuⁱ jest obecnie rutynowo stosowana u wielu różnych owadów. Inne metody dostarczania materiałów do modyfikacji genetycznej zostały opracowane do stosowania u owadów, takie jak ReMOT 20,21,22...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bibuła filtracyjna 4,25 CM PK100	VWR	28342-012	Pokrój na prostokąty o wymiarach około 46 x 22 mm. Umieszcza się je między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym i działają jako wilgotna warstwa podstawowa dla zarodków podczas wstrzyknięcia.
Szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12-543A
Mikroskop preparacyjny	Dowolna marka		Do wyrównywania zarodków
Szkiełka	szklane Fisher Scientific	12-550-A3	Warstwa podstawowa zestawu do mikroiniekcji Rysunek 2A
Klatka na owady	wykonana na zamówienie lub kilka opcji		komercyjnychklatka z poliwęglanu dla dorosłych trzymających i kryjących Lawyera, Phillipa, Mireille Killick-Kendrick, Tobina Rowlanda, Edgara Rowtona i Petra Volfa. “ Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. Dostęp 6 sierpnia 2020 r. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Pokarm dla larw	wykonany		na zamówienie z mieszanki karmy dla królików i odchodów królika Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton i Petr Volf. " Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Mikrokapsułki 100 ml	Drummond	1-000-1000	Służy do napełniania igieł do mikroiniekcji
Aspirator do jamy ustnej	John W. Hock Company	Model 612	z filtrem HEPA
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences Mikroskop		mikroiniekcyjny
Firma Ovipots	Nalge		Doniczki wykonane są ze słoików po plolypropylenie o pojemności 125 ml lub 500 ml o prostych ściankach, zmodyfikowanych poprzez wywiercenie 2,5 cm otworów w dnie i wypełnionych 1 cm gipsu paryskiego. Prawnik, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton i Petr Volf. “ Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. Dostęp 6 sierpnia 2020 r. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Pędzel 6-0	Dowolna firma zajmująca się zaopatrzeniem sztuki	n/a	Służy do wyrównywania zarodków
Kwas propionowy	Sigma-Aldrich	402907	środek przeciwgrzybiczy
Standardowe szklane kapilary	World Precision Instruments	1B100-3	Służy do wytwarzania igieł do mikroiniekcji
Kontroler Trio-MPC100 i manipulator MP845	Sutter Instruments Kontroler		mikroiniekcji i Mikromanipulator

Aspirator do jamy ustnej