Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Muchy piaskowe są naturalnymi wektorami dla gatunków Leishmania, pasożytniczych pierwotniaków wywołujących szerokie spektrum objawów, od zmian skórnych po patologię trzewną. Rozszyfrowanie natury interakcji wektor/pasożyt ma zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia przenoszenia Leishmania na ich gospodarzy. Wśród parametrów kontrolujących kompetencję wektorów muchy piaskowej (tj. ich zdolność do przenoszenia i przenoszenia patogenów) wykazano, że kluczową rolę odgrywają parametry właściwe tym owadom. Na przykład odpowiedź immunologiczna owadów wpływa na kompetencję wektora muchy piaskowej do Leishmania. Badania nad tymi parametrami były ograniczone ze względu na brak metod modyfikacji ekspresji genów przystosowanych do stosowania w tych organizmach niemodelowych. Regulacja w dół genów przez małe interferujące RNA (siRNA) jest możliwa, ale oprócz tego, że jest to wyzwanie techniczne, prowadzi tylko do częściowej utraty funkcji, która nie może być przekazywana z pokolenia na pokolenie. Ukierunkowana mutageneza za pomocą technologii CRISPR/Cas9 została niedawno zaadaptowana do muchy piaskowej Phlebotomus papatasi. Technika ta prowadzi do wygenerowania zakaźnych mutacji w specjalnie wybranym locus, co pozwala na badanie genów będących przedmiotem zainteresowania. System CRISPR/Cas9 opiera się na indukcji ukierunkowanych pęknięć dwuniciowego DNA, które są następnie naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę sterowaną homologią (HDR). NHEJ składa się z prostego zamknięcia przerwy i często prowadzi do małych zdarzeń wstawiania/usuwania. W przeciwieństwie do tego, HDR wykorzystuje obecność cząsteczki DNA dawcy dzielącej homologię z docelowym DNA jako matrycę do naprawy. W tym miejscu przedstawiamy metodę mikroiniekcji zarodków muchy piaskowej do celowanej mutagenezy za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu NHEJ, która jest jedyną jak dotąd techniką modyfikacji genomu dostosowaną do wektorów muchy piaskowej.
Wprowadzenie
Choroby przenoszone przez wektory są głównym zagrożeniem dla zdrowia publicznego w ciągłej ewolucji. Według Światowej Organizacji Zdrowia setki gatunków wektorów rozprzestrzenionych w bardzo różnych rodzinach filogenetycznych (np. komary, kleszcze, pchły) są odpowiedzialne za przenoszenie ogromnej liczby patogenów drobnoustrojowych, co powoduje ponad 700 000 zgonów ludzi rocznie. Wśród owadów wektorów dużą grupę stanowią muchy piaskowe flebotominowe (Diptera, Psychodidae), w których znajduje się 80 sprawdzonych gatunków wektorów wykazujących wyraźne cechy fenotypowe i zdolności wektorowe występujące w różnych regionach geograficznych. Są one wektorami pasożytów pierwo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wykorzystanie myszy jako źródła krwi do karmienia muchy piaskowej zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health (NIH). Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania NIAID, NIH (numer protokołu LPD 68E). Bezkręgowce nie są objęte wytycznymi NIH.
1. Przygotowanie igieł (Rysunek 1)
- Pociągnij igły i skoś zgodnie z opisem w Meuti i Harrell19. Krótko mówiąc, pociągnij igły za dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych, używając kapilar ze sz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół mikroiniekcji CRISPR/Cas9 opisany tutaj w celu generowania mutantów muszki piaskowej został opracowany w poprzedniej publikacji4. Podejście to zapewniło wysoką wydajność mutagenezy, gdyż 11 z 540 osobników przeżyło procedurę, z czego 9 było mutantami. Podczas projektowania przewodników do mutacji CRISPR/Cas9 krytycznym pierwszym krokiem jest sekwencjonowanie regionu wokół obszaru docelowego. Matryca do sekwencjonowania powinna pochodzić z linii, która zostanie wykorzystana jako źródło emb.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy tutaj niedawno opracowaną metodę mikroiniekcji zarodka do celowanej mutagenezy za pomocą CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych Phlebotomus papatasi. Mikroiniekcja zarodków do modyfikacji genetycznej owadów została opracowana u Drosophila w połowie lat 80. XX wiekui jest obecnie rutynowo stosowana u wielu różnych owadów. Inne metody dostarczania materiałów do modyfikacji genetycznej zostały opracowane do stosowania u owadów, takie jak ReMOT 20,21,22.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy dziękują Vanessie Meldener-Harrell za krytyczną lekturę rękopisu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bibuła filtracyjna 4,25 CM PK100 | VWR | 28342-012 | Pokrój na prostokąty o wymiarach około 46 x 22 mm. Umieszcza się je między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym i działają jako wilgotna warstwa podstawowa dla zarodków podczas wstrzyknięcia. |
| Szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Mikroskop preparacyjny | Dowolna marka | Do wyrównywania zarodków | |
| Szkiełka | szklane Fisher Scientific | 12-550-A3 | Warstwa podstawowa zestawu do mikroiniekcji Rysunek 2A |
| Klatka na owady | wykonana na zamówienie lub kilka opcji | komercyjnychklatka z poliwęglanu dla dorosłych trzymających i kryjących Lawyera, Phillipa, Mireille Killick-Kendrick, Tobina Rowlanda, Edgara Rowtona i Petra Volfa. “ Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. Dostęp 6 sierpnia 2020 r. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Pokarm dla larw | wykonany | na zamówienie z mieszanki karmy dla królików i odchodów królika Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton i Petr Volf. " Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Mikrokapsułki 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Służy do napełniania igieł do mikroiniekcji |
| Aspirator do jamy ustnej | John W. Hock Company | Model 612 | z filtrem HEPA |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences Mikroskop | mikroiniekcyjny | |
| Firma Ovipots | Nalge | Doniczki wykonane są ze słoików po plolypropylenie o pojemności 125 ml lub 500 ml o prostych ściankach, zmodyfikowanych poprzez wywiercenie 2,5 cm otworów w dnie i wypełnionych 1 cm gipsu paryskiego. Prawnik, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton i Petr Volf. “ Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. Dostęp 6 sierpnia 2020 r. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Pędzel 6-0 | Dowolna firma zajmująca się zaopatrzeniem sztuki | n/a | Służy do wyrównywania zarodków |
| Kwas propionowy | Sigma-Aldrich | 402907 | środek przeciwgrzybiczy |
| Standardowe szklane kapilary | World Precision Instruments | 1B100-3 | Służy do wytwarzania igieł do mikroiniekcji |
| Kontroler Trio-MPC100 i manipulator MP845 | Sutter Instruments Kontroler | mikroiniekcji i Mikromanipulator |
Bibliografia
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42(2017).
- Pelletier, I., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
