Zadanie behawioralne trójkomorowego wyboru z wykorzystaniem danio pręgowanego jako systemu modelowego

Summary

Prezentujemy komorę behawioralną przeznaczoną do oceny zdolności poznawczych. Przedstawiamy dane pokazujące, że raz zdobyty danio pręgowany pamięta zadanie 8 tygodni później. Pokazujemy również, że zegmunowany z hiperglikemią ma zmienioną wydajność poznawczą, co wskazuje, że ten paradygmat ma zastosowanie w badaniach oceniających funkcje poznawcze i pamięć.

Abstract

Choroby neurodegeneracyjne są zależne od wieku, wyniszczające i nieuleczalne. Ostatnie doniesienia korelowały również hiperglikemię ze zmianami w pamięci i/lub zaburzeniami poznawczymi. Zmodyfikowaliśmy i opracowaliśmy trzykomorowe zadanie poznawcze podobne do tego, które stosuje się u gryzoni w przypadku danio pręgowanego z hiperglikemią. Komora testowa składa się z centralnie umieszczonej komory startowej i dwóch komór wyboru po obu stronach, z ławicą współplemieńców używanych jako nagroda. Przedstawiamy dane pokazujące, że raz pozyskany danio pręgowany pamięta zadanie co najmniej 8 tygodni później. Nasze dane wskazują, że danio pręgowany silnie reaguje na tę nagrodę, a po 4 tygodniach leczenia zidentyfikowaliśmy deficyty poznawcze u ryb hiperglikemicznych. Ten test behawioralny może być również stosowany w innych badaniach związanych z poznaniem i pamięcią.

Introduction

Choroby neurodegeneracyjne są zależne od wieku, wyniszczające i nieuleczalne. Choroby te stają się coraz częstsze, co powoduje pilną potrzebę poprawy i opracowania nowych strategii terapeutycznych. Początek i prezentacja każdej choroby jest wyjątkowa, ponieważ niektóre wpływają na język, motorykę i autonomiczne obszary mózgu, podczas gdy inne powodują deficyty w uczeniu się i utratę pamięci¹. Przede wszystkim deficyty poznawcze i/lub upośledzenie są najczęstszymi powikłaniami we wszystkich chorobach neurodegeneracyjnych². W nadziei na rzucenie światła na mechanizmy leżące u podstaw tych chorób neurodegeneracyjnych, wykorzystano wiele różnych systemów modelowych (w tym organizmy jednokomórkowe, Drosophila, kręgowce wyższego rzędu, takie jak gryzonie i ludzie); Jednak większość chorób neurodegeneracyjnych pozostaje nieuleczalna.

Uczenie się i pamięć są wysoce konserwatywnymi procesami wśród organizmów, ponieważ ciągłe zmiany w środowisku wymagają adaptacji³. Upośledzenie zarówno funkcji poznawczych, jak i plastyczności synaptycznej wykazano w kilku modelach gryzoni. W szczególności dobrze ugruntowane testy behawioralne wykorzystują uczenie się asocjacyjne do oceny zmian poznawczych po różnych chorobach i zaburzeniach wywołanych upośledzeniem⁴. Dodatkowo, odwrócenie dyskryminacji kontrastowej ocenia deficyty poznawcze, ponieważ obejmuje funkcje uczenia się i pamięci wyższego rzędu, a odwrócenie zależy od zahamowania wcześniej wyuczonego skojarzenia. Szeroko stosowane zadanie wyboru w trzech komorach wyjaśnia możliwe deficyty w szlakach uczenia się i pamięci ośrodkowego układu nerwowego^5,6. Ostatnio dziedzina ta rozszerzyła się o modele niessaków, takie jak danio pręgowany (Danio rerio), ponieważ opracowano kilka paradygmatów dla różnych grup wiekowych, od larw do dorosłych^7,8.

Danio pręgowany zapewnia równowagę złożoności i prostoty, co jest korzystne dla oceny zaburzeń poznawczych za pomocą technik behawioralnych. Po pierwsze, danio pręgowany jest podatny na wysokoprzepustowe badania behawioralne ze względu na ich niewielkie rozmiary i płodną naturę reprodukcyjną. Po drugie, danio pręgowany posiada strukturę, paliusz boczny, który jest analogiczny do hipokampa ssaków, ponieważ ma podobne markery neuronalne i typy komórek⁷. Danio pręgowany jest również w stanie pozyskiwać i zapamiętywać informacje przestrzenne⁹ i, podobnie jak ludzie, są dzienne¹⁰. Nic więc dziwnego, że danio pręgowany jest coraz częściej wykorzystywany jako model chorób neurodegeneracyjnych. Jednak brak odpowiednich testów behawioralnych utrudnił zastosowanie modelu danio pręgowanego do ocen poznawczych. Opublikowane prace wykorzystujące testy behawioralne specyficzne dla danio pręgowanego obejmują zadania związane z uczeniem się asocjacyjnym¹¹, zachowanie lękowe¹², memory¹³, rozpoznawanie obiektów¹⁴ i conditioned-place-preference^{15,16,17,18,19}. Chociaż dokonano wielu postępów w odniesieniu do testów behawioralnych danio pręgowanego, odpowiedniki dla niektórych testów funkcji poznawczych u gryzoni nie zostały jeszcze opracowane do użytku z danio pręgowanym¹⁸.

Opierając się na poprzednich badaniach z naszego laboratorium, modelowaliśmy/rozwijaliśmy zadanie kognitywne u danio pręgowanego w oparciu o trzykomorowe zadanie wyboru stosowane u gryzoni, wykorzystując interakcję społeczną jako nagrodę. Ponadto rozszerzyliśmy aspekt uczenia się asocjacyjnego w zadaniu behawioralnym i włączyliśmy odwrócenie dyskryminacji kontrastowej w nadziei na dalszy rozwój tego zadania behawioralnego w celu oceny upośledzenia poznawczego. Umożliwiło nam to zbadanie zarówno początkowego nabywania uczenia się rozróżniania, jak i późniejszego zahamowania tego uczenia się w fazie odwrócenia. W obecnym badaniu wykazaliśmy, że procedura ta zapewniła wiarygodną metodę oceny funkcji poznawczych u danio pręgowanego po zanurzeniu w glukozie przez 4 lub 8 tygodni.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Amerykańskim (protokół # 1606, 19-02).

1. Zwierzęta

1. Hodowla i utrzymanie zwierząt
   1. Pozyskać dorosłe danio pręgowane (Danio rerio) w wieku 4–11 miesięcy jako zarodki i hodować je we własnym zakresie.
   2. Utrzymuj ryby w systemie stojaków wodnych w temperaturze 28–29 °C w 14-godzinnym światło: 10-godzinnym ciemnym fotoperiodze.
   3. Karm ryby dwa razy dziennie płatkami komercyjnymi i suplementuj żywą artemią.
   4. Wybierz losowo ryby z tych zbiorników do eksperymentów behawioralnych.
2. Po zakończeniu eksperymentu znieczulij zwierzęta przez zanurzenie w 0,02% tricainie na 2 minuty lub do momentu, gdy wystąpi brak koordynacji ruchowej i zmniejszone tempo oddychania do późniejszych analiz molekularnych i/lub neurochemicznych.

2. Trzykomorowa komora testowa

UWAGA: Ta technika behawioralna została zmodyfikowana przez Ruhl et al.²⁰.

1. Budowa studzienki
   1. Zmodyfikuj komorę behawioralną²⁶—akwarium o pojemności 40 litrów (50 x 30 x 30 cm³)— tak, aby miało komorę centralną lub początkową (10 x 30 x 30 cm³), oddzieloną od dwóch komór bocznych (każda o wymiarach 20 x 30 x 30 cm³, Rysunek 1A).
   2. Zbuduj trzy komory za pomocą aluminiowego kanału w kształcie litery "U" przymocowanego do wewnętrznych szklanych ścian za pomocą uszczelniacza akwariowego, aby podzielić zbiornik na trzy komory.
   3. Zbuduj nieprzezroczyste przegrody o wysokości 10 cm z szarej blachy PCV, pasującej do aluminiowych kanałów po obu stronach. Wykonaj każdą przegrodę z 2 części, z których każda ma równy rozmiar: nieruchoma dolna część zamontowana na stałe w zbiorniku i ruchoma górna część, która porusza się w górę iw dół na aluminiowych szynach.
   4. Przyklej bardzo duże klipsy do segregatorów do górnej części szarych arkuszy PVC, aby działały jak uchwyty.
   5. Za pomocą markera permanentnego narysuj małe poziome linie 10 cm nad przyklejoną szarą rurą PVC na zewnątrz zbiornika.
      UWAGA: Ten znak jest punktem, do którego zostanie otwarty górny szary arkusz PCV, aby umożliwić dostęp z obu stron.
   6. Dodaj wodę kontrolną (systemową) do zbiornika do poziomu 25 cm od dołu do góry zbiornika lub ~ 30 L. Umieść szklane grzałki akwariowe w każdej sekcji komory na 24 godziny przed badaniem, aby doprowadzić temperaturę do 28,5 °C.
      UWAGA: Wyjmij grzałki na początku sesji behawioralnej i wykonaj pełną wymianę wody po dwóch dniach użytkowania.
2. Konfiguracja dyskryminacji
   1. Dla każdego zadania dyskryminacyjnego indywidualnie umieść kolorowe kawałki filcu (beżowe, czarne lub białe) na zewnętrznej tylnej, bocznej i dolnej części komór wyboru za pomocą rzepów (Rysunek 1B–D).
      UWAGA: Centralna komora nie powinna mieć przypisanego koloru tła.
3. Jako nagrodę, utwórz grupę współplemieńców (ławica), umieszczając 4 dorosłe rybki danio pręgowane, które w przeciwnym razie nie zostałyby wykorzystane w badaniu, w małym, przezroczystym zbiorniku w odległym tylnym rogu każdej komory wyboru (Rysunek 1B–D).
   UWAGA: Każdego dnia wybieraj losowo ryby ławicowe ze zbiorników hodowlanych, z co najmniej jednym samcem i jedną samicą w tym samym wieku i wielkości co ryby doświadczalne w każdym zbiorniku ławicowym.

3. Zadania behawioralne

1. Aklimatyzacja
   UWAGA: Aklimatyzacja do komory behawioralnej składa się z trzech dni treningu; Dwa dni grupowej aklimatyzacji, a następnie jeden dzień treningu indywidualnego.
2. Aklimatyzacja grupowa
   1. Przymocuj beżowe (neutralne) filcowe tło na zewnątrz obu komór wyboru i zanurz zbiornik z żywym zbiornikiem na mieliznę w każdym z wybranych przegródek (Rysunek 1B).
   2. Dodaj pięć-sześć danio pręgowanego do środkowej komory startowej z otwartymi drzwiami przesuwnymi i pozwól rybie swobodnie wędrować przez 30 minut.
      UWAGA: Eksperymentalny danio pręgowany powinien być w stanie wchodzić w interakcje i nawiązywać kontakty towarzyskie z tymi rybami ławicowymi przez zbiornik jako nagroda po przejściu do dowolnego przedziału wyboru podczas aklimatyzacji. Uważa się, że ryba weszła do jednej z bocznych komór, gdy całe jej ciało wejdzie do komory.
   3. Powtórz tę procedurę z tymi samymi rybami doświadczalnymi przez drugi dzień (2 dni aklimatyzacji grupowej).
      UWAGA: Nie trzymaj tych samych grup ryb.
3. Indywidualna aklimatyzacja
   1. Konfiguracja komory: Przymocuj beżowe (neutralne) filcowe tło na zewnątrz obu komór wyboru i zanurz żywy zbiornik z ławicą w obu komorach wyboru, tak jak w aklimatyzacji grupowej (Rysunek 1B,E).
      1. Umieść pojedynczego danio pręgowanego w centralnej komorze startowej na 2 minuty przy zamkniętych drzwiach przesuwnych, a po upływie 2 minut otwórz oba drzwi jednocześnie.
      2. Upewnij się, że każda ryba przepływa z centralnej komory przez drzwi w sumie 10 razy, niezależnie od tego, po której stronie. Nagradzaj rybę za każdym razem, gdy wejdzie do jednej z bocznych komór (1 dzień indywidualnej aklimatyzacji).
         UWAGA: Jeśli ryba nie jest w stanie wykonać tego zadania 10 razy w ciągu 30 minut lub w ogóle odmawia opuszczenia komory startowej, należy ją wykluczyć z badania.
   2. Akwizycja danych: Zapisz, ile razy ryba przepłynęła na dowolną stronę i całkowity czas potrzebny na wykonanie zadania.
4. Akwizycja
   UWAGA: Po aklimatyzacji danio pręgowany rozpoczął 3-dniowe zadanie akwizycji.
   1. Konfiguracja komory: Przymocuj biały filc na zewnątrz jednej komory wyboru i kawałek filcu na zewnątrz drugiej komory wyboru (Rysunek 1C,F).
      UWAGA: Codziennie zmieniaj kolor tła każdej strony, korzystając z pseudolosowego harmonogramu³⁷.
      1. Na czas trwania tej fazy treningu umieść ławicę-nagrodę umieszczoną tylko w jednym z wybranych przegródek; staje się to stroną nagrodzoną.
      2. Aby rozpocząć akwizycję, umieść pojedynczą rybę doświadczalną w komorze startowej na okres 2 minut z zamkniętymi przegródkami wyboru.
      3. Po 2-minutowej aklimatyzacji otwórz jednocześnie obie drzwi, uzyskując dostęp do obu przegródek wyboru, i uruchom stoper, aby ocenić opóźnienie wyboru.
      4. Korzystając z tendencyjnego projektu, losowo przypisz rybie preferencję czarną lub białą (tj. W+/B- lub B+/W-), co oznacza, że ławica jest umieszczana w czarnym (B+) lub białym (W+) przedziale wyboru.
   2. Oznaczanie odpowiedzi wyboru
      1. Gdy ryba dokona wyboru, wchodząc do jednej z bocznych komór, zatrzymaj stoper.
      2. Jeśli ryba prawidłowo wybierze preferowaną stronę, natychmiast zamknij drzwi między centralną komorą a tą stroną, aby ograniczyć rybę do preferowanej strony na 1 minutę i pozwól jej zostać nagrodzoną poprzez interakcję z ławicą (Rysunek 1C,F). Oceń tę próbę jako "C" dla "Prawidłowej" (nagrodzonej).
      3. Jeśli ryba przepłynie przez niewłaściwe drzwi, przenieś ją z powrotem do centralnej komory, zamknij obie drzwi i oceń próbę jako "I" dla "nieprawidłowego" (nienagrodzonego).
      4. Jeśli ryba nie podejmie decyzji w ciągu 2 minut po otwarciu drzwi, przesuń rybę na właściwą stronę na 1 minutę i oceń próbę jako "M" dla "oznaczone" (nagrodzone siłą).
      5. Podczas przenoszenia/przenoszenia ryb z powrotem do komory startowej, delikatnie prowadź rybę do komory środkowej, używając siatki na ryby jako narzędzia pasterskiego.
         UWAGA: Nie wyjmuj ryby z wody i nie wkładaj jej do komory startowej, ponieważ może to wpłynąć na test behawioralny.
      6. Gdy ryba wróci do centralnej komory, odczekaj 1 minutę przed ponownym wykonaniem zadania. Upewnij się, że każda ryba wykona zadanie 8 razy.
   3. Akwizycja danych
      1. Dla każdej ryby doświadczalnej należy zapisać czas do podjęcia pierwszej decyzji (lub opóźnienie wyboru) oraz indywidualne wyniki (C, I lub M) dla każdej z 8 prób nabycia (sekcja 3.4.2) w kolejności.
      2. Wyniki tych eksperymentów zostały przedstawione jako średnie grupowe dla każdego badania w każdym dniu przejęcia.
      3. Gdy ryba zakończy próbę, skategoryzuj ją jako rybę "o wysokiej wydajności" lub "rybę o niskiej wydajności".
         UWAGA: Ryba została uznana za "wysokowydajną", jeśli udało jej się wybrać właściwą stronę zbiornika w co najmniej 6 z 8 wszystkich prób tego dnia. Każda ryba, która nie spełnia tego kryterium, jest "słabą rybą".
      4. Po zidentyfikowaniu należy oddzielnie trzymać ryby o wysokiej i niskiej wydajności.
      5. Kategoryzuj ryby jako "wysokie" lub "słabe" w każdym z trzech dni po pozyskaniu, po tym jak ryba ukończyła próby.
         UWAGA: Pod koniec trzeciego dnia od pozyskania ryby pozostają "wysokie" lub "niskie" wyniki przez cały czas trwania badania.
         UWAGA: Niektóre ryby, które początkowo znajdowały się w grupie "o niskiej wydajności", uczą się tego zadania w 2 lub 3 dniu akwizycji. W takim przypadku początkowe ryby "o niskiej wydajności" mogą zostać przeniesione do grupy "wysokowydajnej". Nie przenoś ryb w ten sposób między grupami po 3 dniu (koniec pozyskiwania).

4. Leczenie eksperymentalne

1. Po okresie akwizycji, gdy ryby wykażą zdolność do rozwiązania prostego zadania rozróżniania między czarnym i białym tłem, rozpocznij schemat leczenia dla eksperymentalnego danio pręgowanego.
   UWAGA: Aby pokazać możliwość zastosowania tej metody, w niniejszym badaniu przedstawiono dwa projekty eksperymentalne:
   1. Badanie podłużne
      1. Zwróć ryby doświadczalne do ich zbiorników na 8 tygodni. Utrzymuj ryby w standardowych zbiornikach z codziennymi podmianami wody i karm je dwa razy dziennie.
         UWAGA: Nie przeprowadzaj żadnego treningu behawioralnego przez te 8 tygodni w zbiornikach retencyjnych.
      2. Po tym okresie należy przeprowadzić ocenę odwrócenia, aby ocenić, czy danio pręgowany może rozwiązać zadanie odwrócenia po 8 tygodniach bez treningu.
   2. Hiperglikemia: Wystaw grupy eksperymentalne na działanie wody (radzenie sobie ze stresem), mannitolu (1%-3%, kontrola osmotyczna) lub glukozy (1%-3%) przez 4 lub 8 tygodni^22,23.
      UWAGA: Nie przeprowadzaj żadnego treningu behawioralnego przez te 4 lub 8 tygodni.

5. Odwrócenie

UWAGA: Po eksperymentalnej manipulacji (jak w sekcji 4.2), ryby są testowane w końcowej części paradygmatu wyboru 3-komorowego - odwróceniu. Aby to zrobić, nagradzana strona jest odwracana (w porównaniu z nabyciem) w taki sposób, że ryby, które wcześniej były nagradzane ławicą po białej stronie, są teraz nagradzane ławicą po czarnej stronie i odwrotnie. W ten sposób odwrócenie ocenia, czy ryby nauczyły się, gdzie znajduje się nagroda (ławica), niezależnie od koloru tła.

1. Ustawienie studzienki
   1. Przymocuj filc na zewnątrz jednej z komór wyboru, a biały filc na zewnątrz drugiej, upewniając się, że czarne i białe boki są tymi samymi bokami, co w próbach akwizycji (sekcja 3.4).
   2. Zanurz zbiornik z mielizną w odległym tylnym rogu boku, który jest przeciwieństwem poprzednio nagradzanej komory wyboru (Rysunek 1D,G).
      UWAGA: Innymi słowy, ryby, które wcześniej były nagradzane po białej stronie, teraz są nagradzane po czarnej stronie i na odwrót.
   3. Badać ryby indywidualnie, jak w sekcji 3.5. Zacznij od umieszczenia pojedynczej ryby doświadczalnej w komorze startowej na okres 2 minut i zamknij dostęp do przegródek wyboru.
   4. Jednocześnie otworzyć obie strony komory.
      UWAGA: Wykonaj łącznie 8 badań klinicznych każdego dnia przez trzy kolejne dni leczenia.
2. Oznaczanie odpowiedzi wyboru
   1. Jeśli ryba prawidłowo wybierze preferowany kolor, natychmiast zamknij drzwi do centralnej komory na 1 minutę, pozwalając rybie na interakcję z nagrodą w postaci ławicy. Oceń tę próbę jako "C" dla "Prawidłowej" (nagrodzonej).
   2. Jeśli ryba przepłynie przez niewłaściwe drzwi, przenieś ją z powrotem do centralnej komory, zamknij obie drzwiczki i zapunktuj tę próbę jako "I" dla "nieprawidłowej" (nienagrodzonej).
   3. Jeśli ryba nie podejmie decyzji w ciągu 2 minut po otwarciu drzwi, przesuń rybę na właściwą stronę i oceń próbę jako "M" od "marked" (force-rewarded).
3. Akwizycja danych
   1. Dla każdego doświadczalnego danio pręgowanego zapisz opóźnienie wyboru i indywidualne wyniki (C, I, M), w kolejności, dla każdej próby.
   2. Przedstaw wyniki tych eksperymentów jako średnie grupowe dla każdego bloku dwóch prób w każdym z 3 dni odwrócenia.
   3. Zachowaj oddzielnie dane dla ryb o wysokiej i niskiej wydajności, aby określić, czy wykazują one taki sam poziom wydajności podczas odwrócenia, jak podczas pozyskiwania.

Results

Aklimatyzacja do komory behawioralnej obejmuje trzy dni treningu: 2 dni grupowej aklimatyzacji, a następnie 1 dzień indywidualnej aklimatyzacji. Ponieważ jednak nie byliśmy w stanie odróżnić poszczególnych danio pręgowanego od siebie, byliśmy w stanie zebrać dane tylko podczas indywidualnej aklimatyzacji. W tym czasie zwierzęta doświadczalne (n = 30), kondycjonowane za pomocą nagrody opartej na ławicy, potrzebowały średnio 125,11 s, aby podjąć pierwszą decyzję (Ryc. 2A) i średnio 725,34 s (12 min), ab...

Discussion

Chociaż w ciągu ostatnich 15 lat nastąpił ogromny wzrost liczby i różnorodności badań neurobiologicznych przeprowadzonych na danio pręgowanym24, brakuje testów behawioralnych u tego gatunku w porównaniu z systemami modelowymi ssaków 11,25,26. Tutaj pokazujemy, że trzykomorowe zadanie wyboru opracowane do użytku z gryzoniami może być dostosowane do oceny nabycia i odwrócenia uczenia się dyskryminacji wizua...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw stopera sportowego Champion: wodoodporny, ręczny zegar cyfrowy Stopery sportowe z dużym wyświetlaczem dla dzieci lub trenera - Jasne kolory 6 sztuk	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Polecam dwa w różnych kolorach; jeden dla opóźnienia wyboru i jeden dla czasu do ukończenia
Coofficer Extra Large Spiner Clips 2-calowe (24 sztuki), duże zaciski do papieru na artykuły biurowe,	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silikonowy uszczelniacz akwariowy	Petsmart	Pozycja #2431002
Arkusz PVC (polichlorek winylu), nieprzezroczysty szary, standardowa tolerancja, UL 94 / ASTM D1784, grubość 0,125 cala, szerokość 12 cali, długość 24 "Amazon		nie dotyczy	https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Huta  1/4 cala szer. x 8 stóp dł. Wykończone aluminiowe spawane wykończenie w kształcie litery U	Kanał Lowes	Pozycja #55979Model #11377	https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 galonów Akwarium	Petsmart	Pozycja #5271256
Siatka na ryby o drobnych oczkach Top Fin (3 cale)	Petsmart	Przedmiot #5175115