Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Naprzemienne zanurzanie w glukozie w celu wytworzenia przedłużonej hiperglikemii u danio pręgowanego

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61935

⸱

5 maja 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University, 3Department of Chemistry, American University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół nieinwazyjnie wywołuje hiperglikemię u danio pręgowanego przez okres do 8 tygodni. Korzystając z tego protokołu, można przeprowadzić dogłębne badanie niekorzystnych skutków hiperglikemii.

Streszczenie

Danio pręgowany (Danio rerio) jest doskonałym modelem do badania skutków przewlekłej hiperglikemii, cechy charakterystycznej cukrzycy typu II (T2DM). Ten alternatywny protokół zanurzenia jest nieinwazyjną, krokową metodą wywoływania hiperglikemii przez okres do ośmiu tygodni. Dorosłe danio pręgowane są na przemian wystawione na działanie cukru (glukozy) i wody przez 24 godziny. Danio pręgowany rozpoczyna leczenie w 1% roztworze glukozy przez 2 tygodnie, następnie w 2% roztworze przez 2 tygodnie, a na końcu w 3% roztworze przez pozostałe 4 tygodnie. W porównaniu z kontrolami poddanymi działaniu wody (stres) i mannitolem (osmotycznymi), danio pręgowany traktowany glukozą ma znacznie wyższy poziom cukru we krwi. Danio pręgowany, któremu podawano glukozę, wykazuje poziom cukru we krwi 3-krotnie wyższy niż w grupie kontrolnej, co sugeruje, że zarówno po czterech, jak i ośmiu tygodniach można osiągnąć hiperglikemię. Utrzymująca się hiperglikemia wiązała się ze zwiększonym poziomem kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i zwiększonym poziomem czynnika jądrowego Kappa B (NF-kB) w siatkówce oraz zmniejszonymi reakcjami fizjologicznymi, a także deficytami poznawczymi, co sugeruje, że protokół ten można wykorzystać do modelowania powikłań choroby.

Wprowadzenie

Danio rerio) danio pręgowany (Danio rerio) szybko staje się powszechnie używanym modelem zwierzęcym do badania zarówno chorób, jak i funkcji poznawczych1. Łatwość manipulacji genetycznej i przezroczystość embrionalna we wczesnych stadiach rozwojowych sprawiają, że są one głównym kandydatem do badania chorób ludzkich o znanej podstawie genetycznej. Na przykład danio pręgowany był używany do badania zespołu Holta-Oram, kardiomiopatii, kłębuszkowej choroby nerek, dystrofii mięśniowej i cukrzycy (DM) wśród innych chorób1. Ponadto model danio pręgowanego jest idealny ze względu na niewielkie rozmiary gatunku, łatwość konserwacji i wysoką płodność2,3.

Trzustka danio pręgowanego jest anatomicznie i funkcjonalnie podobna do trzustki ssaków4. Tak więc unikalne cechy wielkości, wysokiej płodności i podobnych struktur endokrynnych sprawiają, że danio pręgowany jest odpowiednim kandydatem do badania powikłań związanych z DM. U danio pręgowanego istnieją dwie metody eksperymentalne stosowane w celu wywołania przedłużonej hiperglikemii, która jest charakterystyczna dla DM: napływ glukozy (modelowanie typu 2) i zaprzestanie wydzielania insuliny (modelowanie typu 1)5,6. Eksperymentalnie, aby zatrzymać wydzielanie insuliny, komórki β trzustki mogą zostać chemicznie zniszczone za pomocą zastrzyków Streptozotocyny (STZ) lub Alloxanu. STZ jest z powodzeniem stosowany u gryzoni i danio pręgowanego, powodując powikłania związane z retinopatią7,8,9, upośledzenia poznawcze10 i regeneracja kończyn11. Jednak u danio pręgowanego β-komórki regenerują się po leczeniu, co powoduje, że "zastrzyki przypominające" STZ są konieczne do utrzymania stanu cukrzycowego12. Alternatywnie trzustka danio pręgowanego może zostać usunięta6. Są to zarówno zabiegi wysoce inwazyjne, ze względu na wielokrotne wstrzyknięcia, jak i długi czas rekonwalescencji.

Na odwrót, hiperglikemia może być wywołana nieinwazyjnie poprzez ekspozycję na egzogenną glukozę. W tym protokole ryby są zanurzane w roztworze glukozy o wysokim stężeniu przez 24 godziny5,13 lub nieprzerwanie przez 2 tygodnie14,15,16. Egzogenna glukoza jest pobierana przezskórnie, po spożyciu i/lub przez skrzela, co powoduje zwiększenie poziomu cukru we krwi. Ponieważ ta nieinwazyjna technika nie manipuluje bezpośrednio poziomem insuliny, nie może twierdzić, że indukuje cukrzycę typu 2. Może być jednak stosowany do badania powikłań wywołanych hiperglikemią, która jest jednym z głównych objawów cukrzycy typu 2.

Niedawno, mutant danio pręgowanego pdx1-/- został opracowany poprzez manipulowanie genem homeobox 1 trzustki i dwunastnicy, genem powiązanym z genetyczną przyczyną DM typu 2 u ludzi. Korzystając z tego mutanta, naukowcy byli w stanie odtworzyć zaburzenia rozwoju trzustki, wysoki poziom cukru we krwi i zbadać retinopatię cukrzycową wywołaną hiperglikemią17,18.

W tym artykule opisujemy nieinwazyjną metodę indukcji hiperglikemii, która wykorzystuje protokół naprzemiennego zanurzenia. Protokół ten utrzymuje stany hiperglikemiczne przez okres do 8 tygodni, z obserwowanymi późniejszymi powikłaniami. Krótko mówiąc, dorosłe danio pręgowany umieszcza się w roztworze cukru na 24 godziny, a następnie w roztworze wodnym na 24 godziny. W przeciwieństwie do ciągłego zanurzania w zewnętrznych roztworach glukozy, naprzemienne dni między cukrem a wodą naśladują wzrost i spadek poziomu cukru we krwi w cukrzycy. Protokół naprzemiennego pomiaru glukozy dodatkowo pozwala na wywołanie hiperglikemii przez dłuższy czas, ponieważ danio pręgowany nie jest w stanie zrekompensować wysokich warunków zewnętrznych glukozy. Jako dowód zasady podajemy dane pokazujące, że hiperglikemia wywołana za pomocą tego protokołu zmienia chemię i fizjologię siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Amerykańskim.

1. Przygotowanie zbiorników roztworu

  1. Zdobądź sześć zbiorników, po dwa dla każdej grupy eksperymentalnej (glukoza, mannitol i woda). Oznacz jeden z dwóch zbiorników jako "zbiornik mieszczący" (pomieści ryby), a drugi "zbiornik roztworu" (pomieści roztwór).
    UWAGA: Grupa leczenia mannitolem to kontrola osmotyczna, a grupa uzdatniania wody to kontrola obsługi/stresu. Ważne jest, aby zbiorniki, linie lotnicze/kamienie napowietrzające, pokrywy i środki czyszczące były przechowywane oddzielnie dla każdej grupy leczonej
  2. Użyj zbiornika o pojemności 2 litrów, jeśli całkowita liczba użytych ryb jest mniejsza niż 20. Użyj zbiornika o pojemności 4 litrów, jeśli całkowita liczba użytych ryb jest większa niż 20,
    UWAGA: Użyj N 5-10 na grupę badaną na punkt czasowy pobierania próbek.
  3. Przechowywać zbiorniki w łaźni wodnej w temperaturze 28-29 °C, aby utrzymać temperaturę wody.
  4. W dniu 1 umieść ryby w odpowiednich roztworach uzdatniania (glukoza, mannitol, woda) na 24 godziny ("Woda do uzdatniania"). W dniu 2 przenieść ryby z roztworów uzdatniających do wody na 24 godziny ("Leczenie do wody"). W dniu 3 należy przenieść ryby z wody do roztworów uzdatniających ("Woda do uzdatniania"). Ta naprzemienna ekspozycja jest kontynuowana przez pozostałą część eksperymentu (Rysunek 1). Codziennie przenoś uzdatnione wodą ryby kontrolne z wody do wody.
  5. Upewnij się, że ryby są karmione i przenoszone w tym samym 2-godzinnym oknie każdego dnia przez cały czas trwania eksperymentu.

2. Przygotowanie ryby

  1. Użyj dorosłego danio pręgowanego (4 miesiące – 1 rok)5.
  2. Podawaj rybom zmielone płatki Tetramin codziennie po przybyciu do laboratorium.
  3. Zapisz pH i temperaturę wszystkich zbiorników oraz zapisz ogólny stan ryb.

3. Przenoszenie ryb

  1. Przenieść ryby z każdej grupy poddanej działaniu substancji ze zbiornika w obudowie do odpowiedniego zbiornika roztworu za pomocą standardowej sieci rybackiej.
  2. Umieść zbiornik z rybami z powrotem w łaźni wodnej, załóż kamień napowietrzający i pokrywę zbiornika. Ten zbiornik jest teraz "zbiornikiem mieszkalnym", a zbiornik, w którym wcześniej znajdowały się ryby, jest teraz "zbiornikiem roztworu".
  3. Wyrzuć stary roztwór i wyczyść zbiornik wraz z pokrywami zbiornika, liniami lotniczymi, kamieniami napowietrzającymi i siatkami, aby zapobiec gromadzeniu się glukozy i mannitolu.
    UWAGA: Nie myj rzeczy mydłem. Użyj wody i dedykowanej szczotki/gąbki do szorowania dla każdego stanu zabiegu, aby prawidłowo wyczyścić zbiorniki.
  4. Osusz nowo oczyszczone "zbiorniki roztworu" ręcznikiem papierowym. Przygotuj roztwory na następny dzień za pomocą tego zbiornika. Upewnij się, że pozostałe przedmioty są wysuszone i oddzielone odpowiednimi grupami uzdatniania.
    UWAGA: Prowadź dziennik tego, z jakich roztworów ryby są przenoszone każdego dnia, a także roztworów, które są przygotowywane na następny dzień. Na przykład: Ryba przeniesiona z glukozy doH2O, nowy 1% roztwór glukozy przygotowany na jutro.

4. Przygotowanie roztworu po transferze

  1. Przygotowanie roztworów cukru
    1. Napełnij każdy zbiornik roztworu 2 litrami (lub 4 lami) wody systemowej (woda systemowa jest definiowana jako woda, która została uzdatniona roztworem soli w odpowiednim stosunku i ma tę samą temperaturę, co zbiorniki podstawowe i uzdatniające).
    2. Zmierz prawidłową ilość glukozy i mannitolu (patrz krok 5 poniżej) za pomocą wagi ładowanej od góry i oddzielnych łódeczek wagowych dla każdej substancji chemicznej.
    3. Dodać zważoną porcję glukozy lub mannitolu do odpowiedniego, oczyszczonego zbiornika roztworu, który zawiera tylko wodę systemową.
    4. Mieszaj roztwory glukozy i mannitolu za pomocą oddzielnych szklanych prętów mieszających, aż cukry całkowicie się rozpuszczą.
    5. Zwróć zbiorniki z roztworem do łaźni wodnej i przykryj odpowiednimi pokrywkami.
  2. Przygotowanie roztworów wodnych
    1. Napełnij zbiorniki doświadczalne (2 l lub 4 l) wodą systemową.
    2. Umieścić te "zbiorniki z roztworem" z powrotem w łaźni wodnej i przykryć odpowiednimi pokrywkami.

5. Zmiana wartości procentowych

  1. Utrzymuj ryby w 1% roztworze przez pierwsze 2 tygodnie leczenia: 40 g glukozy lub mannitolu w 4-litrowym zbiorniku.
  2. Utrzymuj ryby w 2% roztworze w 3 i 4 tygodniu leczenia: 80 g glukozy lub mannitolu w 4-litrowym zbiorniku.
  3. Utrzymuj ryby w 3% roztworze przez ostatnie 4 tygodnie leczenia: 120 g glukozy lub mannitolu w 4-litrowym zbiorniku.

6. Pomiar poziomu glukozy we krwi i pobieranie tkanek

  1. Znieczulaj ryby 2 na raz w 0,02% roztworze trikainy.
  2. Odetnij głowę ryby bezpośrednio za skrzelami za pomocą żyletki.
  3. Zmierz wartość cukru we krwi.
    UWAGA: Używamy glukometru (np. Freestyle Lite) do pomiaru stężenia glukozy we krwi i umieszczamy pasek testowy bezpośrednio na odsłoniętym sercu (próbce krwi serca).
  4. Wypreparuj poszukiwaną tkankę z ryby (mózg, mięśnie itp.).
  5. Pobraną tkankę należy przechowywać przez błyskawiczne zamrażanie na suchym lodzie i przechowywanie w zamrażarce o temperaturze -80 °C, utrwalanie w 4% paraformaldehydzie lub umieszczanie w roztworze buforowym do natychmiastowego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując ten protokół (Rycina 1), wartości poziomu cukru we krwi ulegają znacznemu podwyższeniu zarówno po 4, jak i po 8 tygodniach leczenia (Rycina 2A), przy czym hiperglikemię zdefiniowano jako trzykrotność średnich z grup kontrolnych poddanych działaniu wody oraz mannitolu. Kontrole traktowane wodą są codziennie przenoszone do wody i z niej wyjmowane, co stanowi kontrolę stresu i manipulacji. Mannitol służy jako kontrola osmotyczna w badaniach glukozy in vitr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Cukrzyca to problem ogólnokrajowy. Badania pokazują, że do 2030 roku około 400 milionów ludzi będzie miało jakąś formę cukrzycy. W modelach gryzoni cukrzyca typu 2 jest badana za pomocą manipulacji genetycznej. U szczurów, szczury tłuszczowe z cukrzycą Zuckera (ZDF) i szczury tłuszczowe Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF) dostarczają więcej informacji na temat wpływu DM10 typu 2. Ponadto diety wysokotłuszczowe były stosowane u gryzoni w celu wywołania hiperglikemii. Odzwierciedla to nieinwazyjną p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować VPC, CJR i MCP za rozwój tego protokołu. EMM otrzymało wsparcie finansowe od American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support na przeprowadzenie tych badań. Prace te były również wspierane przez American University Faculty Mellon Award oraz finansowanie przez American University College of Arts and Sciences (oba dla VPC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurki powietrznepetsmart5291863Może być używany w zbiorniku do cyrkulacji powietrza
Pompa powietrzapetsmart5094984Może być używany w zbiorniku do cyrkulacji powietrza
Kamienie powietrznepetsmart5149683Może być używany w zbiorniku do cyrkulacji powietrza
D-glukozaSigmaG8270-5KG
D-mannitolAcros Organics
Miernik Freestyle Lite AmazonB01LMOMLTU
Paski Freestyle LiteAmazonB074ZN3H2Z
NetPetsmart5175115
ZbiornikiAmazonB0002APZO4
AC125340050

Bibliografia

  1. Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
  2. Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
  4. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  5. Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
  6. Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
  7. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
  8. Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
  9. Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
  10. Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
  11. Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232(2013).
  12. Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , iConcept Press Ltd. Hong Kong. (2013).
  13. Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
  14. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
  15. Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
  16. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
  17. Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43(2020).
  18. Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
  19. Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
  20. Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
  21. Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
  22. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
  23. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
  24. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
  25. Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
  26. Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
  27. Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
  28. Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
  29. Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
  30. Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  31. Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
  32. Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
  33. Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
  34. Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
  35. Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hiperglikemia u danio pr kowanegoimersja w glukozieekspozycja naprzemiennapomiar poziomu cukru we krwianaliza siatk wkiekspresja GFAPaktywacja NF kBzapisy ERGocena poznawczamodel cukrzycy
Naprzemienne zanurzanie w glukozie w celu wytworzenia przedłużonej hiperglikemii u danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.