Artykuł metodologiczny

Metoda hodowli w celu utrzymania w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61938

⸱

17 maja 2021

 , 
1Department of Stem Cell Biology, Research Institute, National Center for Global Health and Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół umożliwia utrzymanie w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro poprzez naśladowanie mikrośrodowiska szpiku kostnego przy użyciu obfitych kwasów tłuszczowych, cholesterolu, niższych stężeń cytokin i niedotlenienia.

Streszczenie

Ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), podobnie jak inne HSC ssaków, utrzymują hematopoezę w szpiku kostnym przez całe życie. HSC pozostają w stanie spoczynku in vivo, w przeciwieństwie do bardziej zróżnicowanych komórek progenitorowych, i szybko wchodzą do cyklu komórkowego po chemioterapii lub napromienianiu w celu leczenia uszkodzenia szpiku kostnego lub hodowli in vitro. Naśladując mikrośrodowisko szpiku kostnego w obecności obfitych kwasów tłuszczowych, cholesterolu, niskiego stężenia cytokin i niedotlenienia, ludzkie HSC utrzymują spokój in vitro. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół utrzymywania funkcjonalnych HSC w stanie spoczynku in vitro. Metoda ta umożliwi badania zachowania ludzkich HSC w warunkach fizjologicznych.

Wprowadzenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) i multipotencjalne komórki progenitorowe (MPP) koordynacyjnie tworzą rezerwuar do ciągłego uzupełniania zróżnicowanych komórek w celu utrzymania hematopoezy przez całe życie u ludzi1. Spoczynek cyklu komórkowego jest charakterystyczną cechą HSC, odróżniającą je od MPPs2. Konwencjonalnie uważa się, że HSC znajdują się na szczycie hierarchii układu krwiotwórczego, wytwarzając wszystkie zróżnicowane komórki krwi. Ten hierarchiczny model został w większości wydedukowany z eksperymentów transplantacyjnych3. Jednak ostatnie badania wykazały, że dynamika HSC różni się in vivo w porównaniu z tymi w eksperymentach transplantacyjnych4,5,6,7. Eksperymenty śledzenia linii przy użyciu kilku systemów kodów kreskowych wykazały, że fenotypowe mysie HSC nie są unikalnym typem komórek, który przyczynia się do hematopoezy w stanie ustalonym, a MPP, które wykazują ograniczoną aktywność samoodnawiania się po przeszczepie, stale dostarczają dojrzałe komórki krwi4,5,8. W przeciwieństwie do tego, udział HSC w dojrzałych komórkach jest zwiększony po uszkodzeniu szpiku kostnego4. Może to być spowodowane drastycznymi zmianami w mikrośrodowisku po ablacji szpiku kostnego, w tym przeszczepie szpiku kostnego. Chociaż zastosowanie śledzenia linii komórek mysich do komórek ludzkich jest trudne, analiza filogenetyczna łącząca izolację kolonii pochodzących z pojedynczej komórki i sekwencjonowanie całego genomu ujawniła podobną właściwość układu krwiotwórczego, w którym zarówno HSC, jak i MPP są odpowiedzialne za codzienną produkcję dojrzałych komórek7. Tak więc, chociaż przeszczep jest niezbędny do zbadania aktywności HSC u myszy lub człowieka, potrzebne są inne modele eksperymentalne, aby zrozumieć zachowanie HSC w warunkach fizjologicznych.

Metody hodowli HSC zostały szczegółowo przebadane, aby zrozumieć ich kliniczne zastosowania i cechy. Ludzkie HSC mogą być namnażane in vitro za pomocą kombinacji cytokin, odtwarzania macierzy zewnątrzkomórkowych, usuwania antagonistów samoodnawiania, kohodowli z komórkami mezenchymalnymi lub śródbłonka, dodawania albuminy lub jej zastępowania, transdukcji samoodnawiających się czynników transkrypcyjnych i dodawania związków małocząsteczkowych9,10. Niektóre z tych metod, w tym dodawanie małych związków SR111 i UM17112, zostały przetestowane w badaniach klinicznych z obiecującymi wynikami9. Biorąc pod uwagę spoczynkowy charakter HSC in vivo, utrzymanie HSC z minimalnym cyklem komórkowym ma kluczowe znaczenie dla podsumowania zachowania HSC in vitro. Spoczynkowe i proliferujące HSC wykazują zróżnicowany cykl komórkowy entry13, status metaboliczny14 i tolerancję na wiele stresów15 . Metody stosowane w celu utrzymania stanu spoczynku ludzkich HSC in vitro są ograniczone.

Naśladując mikrośrodowisko szpiku kostnego (niedotlenione i bogate w lipidy) i optymalizując stężenie cytokin, ludzkie HSC mogą być utrzymywane w kulturze w stanie niezróżnicowanym i spokojnym. Rekapitulacja spoczynkowej natury HSC in vitro poprawi zrozumienie właściwości HSC w stanie ustalonym i umożliwi eksperymentalną manipulację HSC.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi National Center for Global Health and Medicine. Wszystkie procedury eksperymentalne wykonywane na myszach są zatwierdzone przez komitet eksperymentów na zwierzętach National Center for Global Health and Medicine.
UWAGA: Przegląd protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1.

1. Preparat lipidowy

  1. Rozpuścić następujące lipidy w metanolu w szklanych probówkach o wskazanych stężeniach: palmitynian sodu 16 mg/ml, oleinian sodu 30 mg/ml i cholesterol 4 mg/ml. Przechowywać roztwór lipidów w temperaturze -30 °C i rozmrozić próbkę przed użyciem.
  2. Roztwory lipidów przygotowane w kroku 1.1 wymieszać w świeżej szklanej probówce w dawkach niezbędnych do uzyskania końcowego stężenia 100 μg/ml palmitynianu, 100 μg/ml oleinianu i 20 μg/ml cholesterolu. Na przykład, przygotowując 10 ml pożywki hodowlanej, wymieszaj 62,5 μl roztworu palmitynianu, 33 μl roztworu oleinianu i 50 μl roztworu cholesterolu w szklanej probówce.
  3. Odparować metanol, przepuszczając gazowy azot przez roztwór lipidów (Rysunek 2A i 2B). Jeśli gazowy azot nie jest dostępny, przepuść powietrze przez roztwór za pomocą pipety.
  4. Całkowicie odparować pozostały metanol poprzez podgrzanie szklanej rurki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C (Rysunek 2C).
    UWAGA: Stosowanie wysokiego stężenia gazuN2 w przestrzeni zamkniętej jest potencjalnie szkodliwe. Chociaż objętość użyta w protokole do odparowania metanolu jest ograniczona i dlatego jest uważana za bezpieczną, w przypadku wystąpienia nieoczekiwanego wycieku gazu ważne jest odpowiednie przewietrzenie pomieszczenia i oznakowanie obszarów o potencjalnie wysokich stężeniach gazuN2.

2. Przygotowanie podłoża

  1. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco (z HEPES i glutaminą). Dodać penicylinę i siarczan streptomycyny do pożywki do końcowego stężenia odpowiednio 50 jednostek i 50 μg/ml. Pożywka DMEM/F12 zawierająca antybiotyki może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 miesiące.
  2. Dodać 4% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco (z HEPES i glutaminą).
  3. Dostosuj pH pożywki do pH 7,4-7,8 za pomocą roztworu NaOH, zwykle do pH 7,6.
  4. Dodaj pożywkę do szklanej rurki przygotowanej w kroku 1. Aby uzyskać roztwór o maksymalnej rozpuszczalności, zaleca się dodanie 3-15 ml pożywki.
  5. Całkowicie rozpuść lipidy za pomocą sonikacji (optymalnie: ponad 20 minut sonikacji). Po rozpuszczeniu BSA i lipidów próbka powinna być przechowywana w temperaturze -80 °C i zużyta w ciągu 2 miesięcy. Rozmrozić bezpośrednio przed użyciem.
  6. Dodaj 1/1,000 mieszaniny insuliny, transferyny, seleninu sodu i aminy etanolowej (ITS-X) do DMEM/F12. Przefiltrować zmieszane podłoże za pomocą filtra 0,22 μm (oznaczonego jako "pożywka hodowlana"). Przed użyciem należy dodać ludzki czynnik komórek macierzystych (SCF) i ludzką trombopoetynę (TPO) do pożywki hodowlanej w końcowym stężeniu 3 ng/ml każdy. Po dodaniu cytokin i ITS-X pożywka nie może być przechowywana.
  7. Bufor barwiący: Dodaj 10% FCS do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez Ca i Mg. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
  8. Podłoża do rozmrażania: Dodaj 10% FCS do DMEM/F12. To rozwiązanie jest jednorazowego użytku.
  9. Roztwór podstawowy cytokin: Rozpuścić każdy ludzki SCF lub ludzki TPO w PBS (bez Ca- i Mg) w stężeniu 20 μg/ml. Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez co najmniej rok bez utraty aktywności. Po rozmrożeniu roztwór podstawowy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.
    UWAGA: Sprawdzaj partię po każdym zakupie, aby uniknąć zmian w zanieczyszczeniach w BSA. Hodować HSC w tym samym czasie z różnymi partiami BSA i badać fenotypowy numer HSC w dniu 7, jak opisano poniżej. Jeśli partia BSA wykazuje niską liczbę lub częstotliwość komórek CD34+ (np. mniej niż połowę liczby komórek wejściowych), należy unikać używania tej partii.

3. Przygotowanie komórek CD34+ ludzkiego szpiku kostnego

  1. Kup ludzkie komórki szpiku kostnego CD34+ i przechowuj je w ciekłym azocie do czasu użycia. Alternatywnie, komórki szpiku kostnego pochodzące od zdrowego ochotnika lub świeże komórki krwi pępowinowej mogą być wykorzystane po zatwierdzeniu przez komisję etyczną instytutu i uzyskaniu zgody dawcy.
  2. Ogrzać 10 ml pożywki do rozmrażania w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Rozmrozić zamrożone komórki w fiolkach w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w ciągu 2 minut. Po przetarciu fiolki 70% etanolem w celu usunięcia zanieczyszczeń, przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej wstępnie podgrzane podłoże z kroku 3.2.
  4. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml o stężeniu 200 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant, aby osad pozostał nienaruszony (pozostawiając < 50 μl podłoża). Ponownie zawiesić komórki z pozostałą pożywką i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    UWAGA: Narażenie na próbki pochodzące od ludzi bezpośrednio w błonie śluzowej, w tym w oku lub zranionej tkance, może spowodować zakażenie znanymi lub nieznanymi patogenami; Dlatego podczas pracy z komórkami ludzkimi zaleca się noszenie rękawiczek i okularów. Nawet jeśli zakupione komórki CD34+ dają wynik ujemny na obecność wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) i ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 (HIV1), w przypadku wystąpienia narażenia należy przeprowadzić staranne monitorowanie zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi podczas utylizacji materiałów narażonych na kontakt z komórkami ludzkimi.

4. Sortowanie HSC

  1. Oznacz komórki przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem. Wymieszaj 50 μl buforu barwiącego plus 10 μl anty-CD34-FITC, 2 μl anty-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μl anty-CD90-PE-Cy7 i 10 μl anty-CD45RA-PE. Zawiesić osad komórkowy w mieszaninie przeciwciał. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  2. Dodać 1 ml buforu barwiącego, aby przepłukać przeciwciała. Odwirować probówki o stężeniu 340 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml buforu barwiącego + 0,1% jodku propydyny. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 5 ml za pomocą filtra 40 μm.
  4. Bramkować fenotypowe HSC we frakcji PI-CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- za pomocą FACS Aria-IIIu i sortować komórki do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 500 μl pożywki hodowlanej (Rysunek 3). Korzystając ze strategii bramkowania pokazanej w Rysunek 3, oczekuje się, że ~10% komórek CD34+ będzie fenotypowymi HSC. Zapisz posortowaną liczbę komórek, aby obliczyć objętość pożywki do ponownego zawieszenia komórek w kroku 5.3.
    UWAGA: Strategia bramkowania jest wykonywana zgodnie z opisem wcześniej16 z pominięciem barwienia markera linii, biorąc pod uwagę niską ekspresję markerów linii we frakcji CD34+CD38- u osób zdrowych17 .
  5. Odwirować posortowane komórki w temperaturze 340 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Ostrożnie zassać supernatant, aby upewnić się, że osad pozostaje nienaruszony.
  6. Przechowuj posortowane komórki na lodzie do czasu hodowli.
    UWAGA: Kompensacja fluorescencji nakładania się widma powinna być przeprowadzona podczas pierwszego eksperymentu.

5. Hodowla komórkowa

  1. Przenieść 200 μl pożywki hodowlanej zawierającej cytokiny przygotowane w kroku 2 na płaskodenne płytki 96-dołkowe.
  2. Aby uniknąć odparowania pożywki, należy napełnić wszystkie nieużywane studzienki 100-200 μl PBS.
  3. Ponownie zawiesić posortowane HSC w pożywkach hodowlanych bez cytokin w stężeniu 60 komórek/μl.
  4. Podamy 600 HSC/basenik (10 μl zawiesiny komórek) do każdego dołka. Numer komórki można zmienić. Mniej niż 300 komórek doprowadzi do większej zmienności technicznej, a zatem do wykrycia różnic biologicznych potrzeba więcej studzienek na warunek. Należy unikać hodowli więcej niż 1000 komórek w jednym dołku ze względu na niedobór cytokin/składników odżywczych lub nagromadzenie niekorzystnych cytokin/chemokin.
  5. Hodować komórki w nawilżonym inkubatorze wielogazowym w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 i 1 %O2 atmosfery
    6. .
  6. W przypadku kultur powyżej 7 dni zaleca się wymianę połowy objętości pożywki co 3-4 dni. Ostrożnie odessać 100 μl pożywki przez pipetowanie i dodać 100 μl nowo przygotowanej pożywki hodowlanej zawierającej cytokiny do każdej studzienki. Pożywki hodowlane należy wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C.

6. Analiza fenotypów markerowych za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Chociaż komórki powinny być analizowane po 7 dniach hodowli, czas trwania hodowli może zostać zmieniony.

  1. Wyrzucić 170 μl pożywki za pomocą pipety 8-kanałowej.
  2. Oznacz komórki mieszaniną przeciwciał. Wymieszać 0,5 μl anty-CD34-FITC, 0,1 μl anty-CD38-PerCP-Cy5,5, 0,25 μl anty-CD90-PE-Cy7, 0,5 μl anty-CD45RA-PE i 9 μl buforu barwiącego na studzienkę. Dodać 10 μl mieszaniny do płytki 96-dołkowej i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. W celu przepłukania przeciwciał należy dodać 100 μl buforu barwiącego do studzienek i odwirować płytki przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, stosując niskie przyspieszenie i średnie opóźnienie.
  4. Ostrożnie zassać 100 μl supernatantu, aby utrzymać komórki na dnie studzienek, a następnie ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego + 0,1% v/v PI + 1% v/v mikrosfer fluorescencyjnych (np. fluorosfery Flow-Check).
  5. Skonfiguruj przyrząd do cytometrii przepływowej. Pozyskiwanie danych dla próbek w trybie szybkim z włączonym trybem mieszanym i objętościami wychwytu 100 μl.
  6. Eksportuj dane w formacie FCS i analizuj je za pomocą oprogramowania, takiego jak FlowJo. Liczbę komórek można określić za pomocą liczby kulek fluorescencyjnej mikrosfery. Na przykład, jeśli badacz doda 2000 koralików na studzienkę, a liczba kulek wynosi 700, pomnóż liczbę komórek każdej frakcji przez 2000/700, aby oszacować całkowitą liczbę komórek frakcji w studzience.
    UWAGA: Mikrosfery fluorescencyjne są toksyczne dla hodowanych komórek ze względu na obecność formaldehydu. Może to wywołać śmierć komórki podczas analizy. Zminimalizuj liczbę odwiertów (<50 dołków) analizowanych w sposób ciągły, aby uniknąć stronniczości.

7. Przeszczepianie ludzkich HSC

UWAGA: Aktywność repopulacji hodowanych komórek jest weryfikowana przez przeszczep myszom z niedoborem odporności. Wszystkie procedury muszą być zatwierdzone przez komitety doświadczalne na zwierzętach lub ich odpowiedniki.

  1. Jako dawcy przygotuj wystarczającą liczbę myszy z 8-12-tygodniowym niedoborem odporności NOD-SCID-Il2rg-null (NOG). Ponieważ myszy NOG są bardzo podatne na infekcje, utrzymuj klatki hodowlane tak czyste, jak to możliwe i karm myszy wysterylizowaną dietą i wodą.
  2. Hodowla odpowiedniej liczby HSC do przeszczepienia, zgodnie z opisem w kroku 5. Na przykład, gdy 5000 HSC (odpowiednik dnia 0) zostanie przeszczepionych 6 myszom biorcom, należy wyhodować 35 000-40 000 HSC w 40 dołkach 96-dołkowej płytki (200 μl pożywki hodowlanej na studzienkę) lub w 8 dołkach 24-dołkowej płytki (1 ml pożywki hodowlanej na studzienkę). Hodować komórki przez 2 tygodnie z połówkową wymianą pożywki co 3-4 dni w wilgotnym inkubatorze wielogazowym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 1%O2 . Czas trwania kultury można zmienić.
  3. Napromieniować myszy NOG w dawce 2,5 Gy na 6-24 godziny przed przeszczepem.
  4. Zebrać wyhodowane HSC w probówkach o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówki o sile 340 ×g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  5. Ostrożnie odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w sterylnym, lodowatym buforze do barwienia przy gęstości komórek 5000 HSC (odpowiednik dnia 0) na 200 μl. Przenieść tę zawiesinę do probówek polipropylenowych o pojemności 3 ml. Aby wysterylizować bufor barwiący, przefiltruj go za pomocą filtra 0,22 μm.
  6. Przed przeszczepem znieczulić myszy przez inhalację sewofluranu lub izofluranu.
  7. Aby przeszczepić 5000 hodowanych HSC (odpowiednik dnia 0), wstrzyknij 200 μl zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej lub zatoki zaoczodołowej myszy NAPROMIENIOWANYCH NOG w kroku 7.1 za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 27. Świeżo wyizolowane lub rozmrożone HSC szpiku kostnego mogą być przeszczepiane jako kontrola. Rękawice powinny być sterylizowane 70% v/v etanolem między każdym zabiegiem.

8. Analiza częstości występowania komórek pochodzenia ludzkiego we krwi obwodowej

  1. Aby zbadać ponowne zasiedlenie komórek ludzkich, należy pobrać krew obwodową po 1, 2 i 3 miesiącach od przeszczepu.
  2. Przed pobraniem krwi obwodowej należy znieczulić myszy przez inhalację sewofluranu.
  3. Zebrać 40-80 μl krwi obwodowej z zatoki zaoczodołowej za pomocą heparynizowanych szklanych kapilar i zawiesić tę próbkę w 1 ml PBS + heparyna (1 U/ml) w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  4. Odwirować zawiesinę krwi o stężeniu 340 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS + 1,2% w/v dekstranu (200 kDa) przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść supernatant do innej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 340 × g przez 3 minuty.
  6. W celu lizy krwinek czerwonych należy ponownie zawiesić komórki w 0,17 M NH4Cl na 5 minut.
  7. Odwirować zawiesinę komórek o masie 340 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu barwiącego zawierającego 0,3 μl antymysiego bloku Fc. Próbkę należy inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  8. Dodaj następujące przeciwciała do barwienia markerem powierzchniowym: 0,3 μl mysiego CD45-PE-Cy7, 0,3 μl mysiego Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μl ludzkiego CD45-BV421, 0,3 μl ludzkiego CD13-PE, 1,2 μl ludzkiego CD33-PE, 0,3 μL ludzkiego CD19-APC, 0,3 μL ludzkiego CD3-APC-Cy7. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  9. Przemyć raz 1 ml buforu barwiącego i odwirować w temperaturze 340 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego + 0,1% v/v PI.
  11. Przenieść zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę płaskodenną i uzyskać dane za pomocą cytometru przepływowego w trybie szybkim, z włączonym trybem mieszania próbek i objętością absorpcji 100 μl.
  12. Eksportuj dane w formacie FCS do analizy za pomocą oprogramowania, takiego jak FlowJo.
  13. Ustaw cytometr przepływowy. Pobieranie danych dla próbek w trybie szybkim z włączonym trybem mieszania próbek i objętością wychwytu 100 μl.
  14. Eksportuj dane w formacie FCS do analizy za pomocą oprogramowania, takiego jak FlowJo.

Wyniki

Po 7 dniach hodowli oczyszczonych HSC, do 80% komórek wykazywało fenotypy markerowe CD34+CD38- (Rycina 4A). Całkowita liczba komórek była zależna od stężenia cytokin (Rycina 4B). Wyższe stężenia SCF i TPO indukowały wejście w cykl komórkowy, proliferację oraz różnicowanie (Rycina 4B). Liczba fenotypowych HSC charakteryzujących się fenotypami markerowymi CD34+CD38-CD90+CD45RA- wzrastała proporcjonalnie do stężeń SCF lub TPO (Rycina 4B), podczas gdy ich częstotliwość wśród wszystkich komórek malała (Rycina 4C). Całkowita liczba komórek była taka sama w kombinacjach 1,5 ng/mL SCF i 4 ng/mL TPO oraz 3 ng/mL SCF i 2 ng/mL TPO, co sugeruje, że HSC pozostają w stanie spoczynku podczas minimalnej aktywacji cyklu komórkowego. Ze względu na różnice indywidualne, zaleca się miareczkowanie cytokin dla każdego dawcy szpiku kostnego.

Po 3 miesiącach od transplantacji hodowanych dorosłych HSC z szpiku kostnego, stopień rekonstytucji można ocenić na podstawie ich częstotliwości w krwi obwodowej jako komórki ludzkie CD45+ mysie CD45- Ter119-. Trzy linie, w tym limfocyty B CD19+, komórki mieloidalne CD13/CD33+ oraz limfocyty T CD3+, zostały zrekonstytuowane u myszy NOG poddanych transplantacji albo świeżo rozmrożonych HSC, albo hodowanych HSC (Rysunek 5).

Schemat procesu hodowli komórek krwiotwórczych: przygotowanie pożywki, przygotowanie komórek, sortowanie, hodowla, analiza przepływowa.
Rysunek 1. Przegląd procedury. Graficzne podsumowanie procedury obejmującej sortowanie, hodowlę i analizę ludzkich komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kontrola ciśnienia butli z gazem, zestaw do filtracji i szczegóły szklanego sprzętu dla etapów eksperymentu laboratoryjnego.
Rysunek 2.Procedura odparowywania metanolu z roztworu lipidów. A) Butla z azotem z regulatorem gazu. B) Procedura przepuszczania gazowego azotu przez roztwór lipidów rozpuszczonych w metanolu. C) Lipidy przylegające do dna szklanej rurki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające różnicowanie komórek z użyciem markerów CD34, CD38, CD45RA, analiza FACS.
Rycina 3. Strategia bramkowania dla sortowania HSC. Wykresy przedstawiają wyselekcjonowane komórki CD34+CD38-CD90+CD45RA-. Około 10% komórek CD34+ stanowiły fenotypowe HSC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej; markery CD34, CD38; wykresy; częstość występowania hematopoetycznych komórek macierzystych.
Rycina 4Reprezentatywna liczba komórek po 7 dniach hodowli. A) Reprezentatywny wykres sortowania komórek metodą FACS po hodowli HSC w SCF (3 ng/mL) i TPO (2 ng/mL). Frakcja 1 została wzbogacona o żywe komórki, frakcja 2 o martwe komórki, a frakcja 3 o debris. Liczby zaznaczone na różowo wskazują częstotliwość (%) wybranego obszaru (gate). B) Liczba wszystkich HSC, CD34+CD38- komórki oraz CD34+CD38-CD90+CD45RA- komórki po hodowli 600 HSC w określonych warunkach cytokinowych. Czerwone przerywane linie wskazują początkową liczbę komórek wejściowych. S: SCF, T: TPO. Średnia ± odchylenie standardowe, n = 4. Liczby następujące po S i T wskazują stężenie (ng/mL) poszczególnych cytokin. C) Częstość występowania CD34+CD38- oraz CD34+CD38-CD90+CD45RA- komórki w określonych warunkach cytokinowych. S: SCF, T: TPO. Średnia ± odchylenie standardowe, n = 4. Słupki błędów dla komórek hodowanych w SCF (1 ng/mL) i TPO (0 ng/mL) pominięto ze względu na ich wysokie wartości (odpowiednio 37,7 i 47,9). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykresy analizy cytometrii przepływowej; bramkowanie populacji komórek; markery mCD45, hCD19; świeżo rozmrożone vs hodowane.
Rysunek 5. Reprezentatywne wykresy FACS myszy biorców 3 miesiące po transplantacji. Łącznie 5000 świeżo rozmrożonych (panele górne) oraz hodowanych przez 2 tygodnie HSC (3 ng/mL SCF i 3 ng/mL TPO; panele dolne) przeszczepiono myszom NOG. hCD19 znakuje ludzkie limfocyty B, hCD13 i hCD33 znakują ludzkie komórki mieloidalne, a hCD3 znakuje ludzkie limfocyty T. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ostatnio opisano kilka metod rozszerzania HSC z minimalnym zróżnicowaniem 18,19,20,21. Chociaż metody te są doskonałe, HSC są zmuszone do aktywacji swoich cykli komórkowych w obecności wysokiego poziomu cytokin, co różni się od sytuacji in vivo, w której HSC wykazują minimalne cykle. Protokół ten jest przydatny do utrzymywania HSC w stanie spoczynku, jak obserwowano in vivo, poprzez rekapitulację mikrośrodowiska szpiku kostnego.

Hodując ludzkie HSC w warunkach o niskiej cytokinie, bogatej w lipidy i niedotlenionej, HSC wykazywały minimalne cykle przy zachowaniu swoich fenotypów markerowych. Krytycznym etapem w tym protokole jest przygotowanie pożywki zawierającej wysokie stężenie kwasów tłuszczowych i cholesterolu oraz niskie stężenie cytokin i hodowla w stanie niedotlenienia (Krok 1, Krok 2 i Krok 4). Bez cholesterolu i/lub kwasów tłuszczowych tempo utrzymywania się HSC przy niskich stężeniach cytokin zmniejsza się22. Hodowla komórek w warunkach niedotlenienia jest również ważna, o czym informowaliśmy wcześniej23.

Warunki hodowli były podobne do tych stosowanych w przypadku mysich HSC, z wyjątkiem stężeń cytokin. Mysie HSC przeżywają bez TPO, podczas gdy ludzkie HSC wymagają co najmniej 2 ng/ml TPO z 3 ng/ml SCF22. Ponieważ stężenie TPO jest znacznie wyższe niż w ludzkiej surowicy (~100 pg/ml), w warunkach stosowanych w tym protokole może brakować określonych czynników wspierających przeżycie ludzkich HSC. FLT3 ulega ekspresji w ludzkich HSCs24. Dodanie jego liganda FLT3LG nieznacznie zmniejsza zapotrzebowanie TPO na utrzymanie HSC22.

Ludzkie HSC wymagają wyższych stężeń cholesterolu w porównaniu z mysimi HSC, prawdopodobnie z powodu niezdolności do indukowania ekspresji enzymów syntetyzujących cholesterol i podatności na lipotoksyczność w wysokich stężeniach (>400 μg/ml) kwasów tłuszczowych22. Chociaż testowano tylko kombinację kwasów palmitynowego, oleinowego, linolowego i stearynowego, które są obficie występujące w surowicy ludzkiej, należy ocenić inne kombinacje lipidów w celu zmniejszenia lipotoksyczności i poprawy tempa utrzymania funkcjonalnych HSC.

Chociaż potwierdzono aktywność odnowy populacji ludzkich HSC u myszy z niedoborem odporności po dwóch tygodniach hodowli22, ten system hodowli nie podsumowuje w pełni niszowych funkcji HSC in vivo. Doniesiono, że ekspresja CD45RA wzrasta, a zdolność ponownego zasiedlania jest gorsza niż w przypadku świeżo posortowanych HSC22. Jednak stężenia składników odżywczych, takich jak glukoza, aminokwasy, pirogronian i insulina, które są dodawane do pożywki na poziomie suprafizjologicznym, można zoptymalizować. Zanieczyszczenia w BSA mogą również zagrozić utrzymaniu HSC18,25. Ponadto niektóre hodowane komórki ulegają śmierci komórkowej, podczas gdy inne ulegają podziałowi komórkowemu; W związku z tym utrzymanie całkowitej liczby komórek może nie wskazywać stanu spoczynku każdej komórki.

Pomimo tych ograniczeń, warunki hodowli opisane w protokole opracowanym w tym badaniu pomogą posunąć naprzód badania i inżynierię HSC, szczególnie w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Warunki hodowli, które utrzymują HSC przy minimalnym różnicowaniu i aktywności cyklicznej, byłyby odpowiednie do testowania związków biologicznych i chemicznych specyficznie działających na HSC, manipulowania HSC poprzez transdukcję lentiwirusa lub edycję genomu bez utraty macierzystej oraz wyjaśnienia początkowego etapu transformacji indukowanej przez geny związane z białaczką.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Podziękowania

Dziękujemy M. Haraguchi i S. Tamaki za wsparcie techniczne i zarządzanie laboratorium oraz K. Shiroshita za zrobienie zdjęć. Hongkong był częściowo wspierany przez grant KAKENHI z MEXT/JSPS (grant nr 19K17847) oraz National Center for Global Health and Medicine. KT był częściowo wspierany przez KAKENHI Granty z MEXT/JSPS (granty nr 18H02845 i 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (granty nr 26-001 i 19A2002), AMED (granty nr 1). JP18ck0106444, JP18ae0201014, JP20bm0704042 i JP20gm1210011), Fundacja Badań Medycznych Ono, Fundacja Badań Medycznych Kanzawa i Fundacja Naukowa Takeda.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzkie komórki progenitorowe szpiku kostnego CD34 +Lonza2M-101C
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO JicIn-Vivo Science Inc.
Anty-ludzki CD34-FITC (klon: 581)BD biosciencesCat# 560942; RRID: AB_10562559
Anty-ludzki CD38-PerCP-Cy5.5 BD nauki biologiczneKat# 551400; RRID: AB_394184
Anty-ludzkie nauki biologiczne CD45RA-PEBDKat# 555489; RRID: AB_395880
Anty-ludzki CD90-PE-Cy7 (klon: 5E10)BD biosciencesKat# 561558; RRID: AB_10714644
Anty-ludzki CD13-PE (klon: WM15)BioLegendCat# 301703; RRID: AB_314179
Anty-ludzki CD33-PE (klon: WM53)BD biosciencesCat# 561816; RRID: AB_10896480
Anty-ludzki CD19-APC (klon: SJ259)BioLegendCat# 363005; RRID: AB_2564127
Anty-ludzki CD3-APC-Cy7 (klon: SK7)BD biosciencesCat# 561800; RRID: AB_10895381
Anty-ludzki CD45-BV421 (klon: HI30)BD biosciencesCat# 563880; RRID:AB_2744402
Anty-mysz CD45-PE-Cy7 (klon: 30-F11)BioLegendCat# 103114; RRID: AB_312979
Anty-mysi Ter-119-PE-Cy7 (klon: TER-119)BD biosciencesCat# 557853; RRID: AB_396898
Blok FC (anty-mysz CD16/32) (klon: 2.4-G2)BD BiosciencesCat# 553142; RRID: AB_394657
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiNacalai TesqueCat# 14249-24
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher ScientificCat# 26140079
DMEM/F-12 mediumThermo Fisher ScientificCat# 11320-033
ITS-XThermo Fisher ScientificCat# 51500056
PenicylinaMeiji Seika
Siarczan streptomycynyMeiji SeikaSSDN1013
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichCat# A4503
Palmitynian soduTokyo Chemical Industry Co., Ltd.Kat# P0007
Oleinian soduTokyo Chemical Industry Co., Ltd.Kot# O0057
CholesterolTokyo Chemical Industry Co., Ltd.Nr kat. # C0318
Chlorek amonuFujifilmCat # 017-2995
Wodorowęglan soduFujifilmCat # 191-01305
EDTA 2NaFujifilmCat # 345-01865
Heparyna naMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO.,  LTD.Kot# 224122557
SevofluraneFujifilmCat# 193-17791
DextranNacalai Tesque Cat#  10927-54
Rekombinowany człowiek SCFPeproTechCat# 300-07
Rekombinowany ludzki TPOPeproTechCat# 300-18
Rekombinowany ludzki ligand Flt3PeproTechCat# 300-19
Jodek propidynyLife TechnologiesCat# P3566
Flow-Check FluorospheresBeckman CoulterCat# 7547053
FlowJo wersja 10BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
AutoMACS ProMiltenyi BiotecN/A
FACS Aria3uBD BiosciencesN/A
VELVO-CLEAR VS-25 (sonikator)VELVO-CLEARN/A
Butla z azotemKOIKE SANSHO CO., LTDN/A
Reduktor gazuAstecCat# IM-055
Inkubator wielogazowyAstecCat# SMA-30DR
Szklana rurka, 16 mlMaruemu corporationN-16
Szklana rurka, 50 mlMaruemu corporationNX-50
Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0.22  &mikro; M, polieterosulfon, 33  mm, sterylizowany promieniami gammaMerck MilliporeSLGPR33RS
https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.htmlPGLD755

Bibliografia

  1. Scala, S., Aiuti, A. In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions. Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).
  2. Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. Awakening dormant haematopoietic stem cells. Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).
  3. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  4. Sun, J., et al. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).
  5. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  6. Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).
  7. Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).
  8. Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis. Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).
  9. Pineault, N., Abu-Khader, A. Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation. Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).
  10. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
  11. Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  12. Cohen, S., et al. Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study. Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).
  13. Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
  14. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  15. Mendelson, A., Frenette, P. S. Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration. Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).
  16. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  17. Xie, W., et al. Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes. Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).
  18. Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
  19. Bai, T., et al. Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel. Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).
  20. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  21. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  22. Kobayashi, H., et al. Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
  23. Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).
  24. Kikushige, Y., et al. Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival. Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).
  25. Ieyasu, A., et al. An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spoczynkowe HSCspoczynek cyklu komórkowegomikrośrodowisko szpiku kostnegosuplementacja kwasami tłuszczowymihipoksyjne warunki hodowlifenotyp CD34 CD38czynnik stymulujący komórki macierzystetrombopoetynatransplantacja u myszy z niedoborem odporności
Metoda hodowli w celu utrzymania w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.