Drukowany w 3D hipoksyjny rak na chipie do rekapitulacji patologicznej progresji raka litego

Podsumowanie

Niedotlenienie jest cechą charakterystyczną mikrośrodowiska guza i odgrywa kluczową rolę w progresji raka. Ten artykuł opisuje proces wytwarzania niedotlenionego raka na chipie opartego na technologii drukowania komórek 3D w celu podsumowania patologii raka związanej z niedotlenieniem.

Streszczenie

Mikrośrodowisko raka ma znaczący wpływ na postęp choroby. W szczególności niedotlenienie jest kluczowym czynnikiem wpływającym na przeżycie raka, inwazję i chemooporność. Chociaż opracowano kilka modeli in vitro do badania patologii nowotworów związanych z hipoksją, złożone wzajemne oddziaływanie mikrośrodowiska nowotworu obserwowane in vivo nie zostało jeszcze odtworzone ze względu na brak precyzyjnej kontroli przestrzennej. Zamiast tego zaproponowano podejścia do biofabrykacji 3D w celu stworzenia systemów mikrofizjologicznych w celu lepszej emulacji ekologii raka i dokładnej oceny leczenia przeciwnowotworowego. W tym miejscu proponujemy podejście do drukowania komórek 3D w celu wytworzenia niedotlenionego raka na chipie. Składniki wywołujące niedotlenienie w chipie zostały określone na podstawie komputerowej symulacji rozkładu tlenu. Koncentryczne pierścienie rakowo-zrębowe zostały wydrukowane przy użyciu biotuszy zawierających komórki glejaka i komórki śródbłonka, aby podsumować rodzaj raka litego. Powstały w ten sposób chip doprowadził do centralnego niedotlenienia i zaostrzenia nowotworu złośliwego w nowotworze dzięki tworzeniu reprezentatywnych markerów patofizjologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że proponowane podejście do stworzenia systemu mikrofizjologicznego imitującego raka w ciele stałym wypełni lukę między modelami in vivo i in vitro do badań nad rakiem.

Wprowadzenie

Mikrośrodowisko raka jest krytycznym czynnikiem napędzającym postęp nowotworu. Wiele składników, w tym sygnały biochemiczne, biofizyczne i komórkowe, określa patologiczne cechy raka. Wśród nich niedotlenienie jest silnie związane z przeżywalnością, proliferacją i inwazją raka¹. Ze względu na nieograniczony wzrost i podział komórek rakowych, składniki odżywcze i tlen są stale wyczerpywane, co powoduje powstanie gradientu niedotlenienia. W warunkach niskiego poziomu tlenu komórki aktywują kaskadę molekularną związaną z czynnikiem transkrypcyjnym indukowanym hipoksją (HIF). Proces ten indukuje martwiczy rdzeń, wyzwala zmiany metaboliczne oraz inicjuje przerost naczyń krwionośnych i przerzuty^2,3. Następnie niedotlenienie w komórkach nowotworowych powoduje zniszczenie sąsiednich normalnych tkanek. Ponadto niedotlenienie jest silnie związane z opornością terapeutyczną guzów litych w sposób wieloczynnikowy. Niedotlenienie może poważnie utrudnić radioterapię, ponieważ wrażliwość na promieniowanie jest ograniczona ze względu na reaktywne formy tlenu^1,4. Ponadto obniża poziom pH w mikrośrodowiskach nowotworowych, co zmniejsza akumulację leków¹. Dlatego odtwarzanie cech patologicznych związanych z hipoksją in vitro jest obiecującą strategią dla wyników naukowych i przedklinicznych.

Modelowanie specyficznego mikrośrodowiska raka jest niezbędne do zrozumienia rozwoju raka i zbadania odpowiednich metod leczenia. Chociaż modele zwierzęce są szeroko stosowane ze względu na ich silne znaczenie fizjologiczne, istnieją problemy związane z różnicami gatunkowymi i problemami etycznymi⁵. Co więcej, chociaż konwencjonalne modele 2D i 3D pozwalają na manipulację i obrazowanie komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym w celu dogłębnej analizy, ich złożoności architektonicznej i komórkowej nie można w pełni podsumować. Na przykład modele sferoidalne raka są szeroko stosowane, ponieważ agregacja komórek rakowych w sferoidzie może naturalnie generować niedotlenienie w rdzeniu. Co więcej, duża liczba sferoid komórkowych o jednakowej wielkości została wyprodukowana przy użyciu systemów wielodołkowych na bazie tworzywa sztucznego lub silikonu^6,7. Jednak mniejsza elastyczność w odniesieniu do uchwycenia dokładnej heterogenicznej struktury tkanek nowotworowych za pomocą konwencjonalnych platform wymagała ustanowienia zaawansowanej technologii biofabrykacji w celu zbudowania wysoce biomimetycznej platformy w celu usprawnienia badań nad rakiem⁸.

3D mikrofizjologiczne systemy (MPS) są użytecznymi narzędziami do podsumowania złożonej geometrii i patologicznego postępu komórek nowotworowych⁹. Ponieważ komórki nowotworowe wyczuwają biochemiczny gradient czynników wzrostu i chemokin oraz mechaniczną heterogeniczność odtwarzaną w systemie, ważne cechy rozwoju raka mogą być badane in vitro. Na przykład żywotność raka, nowotwór złośliwy z przerzutami i oporność na leki w zależności od różnych stężeń tlenu badano za pomocą MPSs^10,11. Pomimo najnowszych osiągnięć, generowanie warunków hipoksyjnych modeli in vitro opiera się na złożonych procedurach produkcyjnych, w tym połączeniu z fizycznymi pompami gazowymi. Dlatego potrzebne są proste i elastyczne metody budowania mikrośrodowisk specyficznych dla raka.

Technologia druku 3D komórek zyskała znaczną uwagę ze względu na precyzyjną kontrolę przestrzennego rozmieszczenia biomateriałów w celu podsumowania rodzimych architektur biologicznych¹². W szczególności technologia ta przezwycięża istniejące ograniczenia modeli hipoksji 3D ze względu na jej wysoką sterowalność i wykonalność w budowaniu cech przestrzennych mikrośrodowiska nowotworu. Druk 3D ułatwia również produkcję wspomaganą komputerowo poprzez proces warstwa po warstwie, zapewniając w ten sposób szybką, dokładną i powtarzalną konstrukcję złożonych geometrii, które naśladują rzeczywiste architektury tkanek. Oprócz zalet istniejących strategii produkcji MPS 3D, patofizjologiczne cechy progresji raka można odtworzyć poprzez tworzenie wzorców komponentów biochemicznych, komórkowych i biofizycznych^13,14.

Tutaj prezentujemy strategię drukowania komórek 3D dla niedotlenionego raka na chipie w celu podsumowania heterogeniczności raka litego (Rysunek 1)¹⁵. Parametry wytwarzania określono za pomocą symulacji obliczeniowej powstawania centralnego niedotlenienia w systemie. Koncentryczne pierścienie rakowo-zrębowe wydrukowano przy użyciu biotuszy kolagenowych zawierających komórki glejaka i komórki śródbłonka, aby naśladować patofizjologię glejaka, rodzaju raka litego. Tworzenie promienistego gradientu tlenu pogorszyło złośliwość raka, wskazując na zwiększoną agresywność. Ponadto wskazujemy perspektywy na przyszłość dla zastosowań chipa w modelach przedklinicznych specyficznych dla pacjenta. Oczekuje się, że proponowane podejście do stworzenia systemu mikrofizjologicznego imitującego raka w stanie stałym wypełni lukę między modelami raka in vivo i in vitro.

Protokół

1. Komputerowa symulacja powstawania gradientu tlenu

1. Generowanie modelu geometrii 3D do drukowania niedotlenionego raka na chipie
   1. Uruchom oprogramowanie CAD 3D.
   2. Naszkicuj model geometryczny niedotlenionego raka na chipie. Kliknij Szkic i wybierz żądaną płaszczyznę, aby narysować geometrię. Zapoznaj się z rysunkiem (Rysunek 2A), aby zapoznać się ze skalą szczegółów każdej części.
   3. Ustaw grubość geometrii, klikając opcję Element-Występ Boss/Podstawa. Wprowadź żądaną grubość (patrz Rysunek 2A) w pustym polu i wybierz zieloną ikonę wyboru, aby utworzyć geometrię 3D.
      UWAGA: Wymiar cancer-on-a-chip jest definiowany na podstawie pożądanych objętości pożywki i hydrożelu. W niniejszym eksperymencie pożądane objętości pożywki i hydrożelu wynosiły odpowiednio około 1500 μl i 500 μl, w oparciu o wcześniejsze praktyczne doświadczenia w zakresie rozdzielczości biodrukarki opartej na wytłaczaniu.
   4. Zapisz plik geometrii w formacie pliku CAD 3D (.prt lub .stl).
2. Oznaczanie gęstości komórkowej do indukcji niedotlenionego rdzenia
   1. Uruchom program do symulacji dyfuzji fizycznej
   .
   2. Kliknij LiveLink i wybierz używany program CAD. Kliknij Synchronizuj, aby zaimportować geometrię niedotlenionego raka na chipie w programie symulacyjnym. Ponieważ wewnętrzna przestrzeń komory zostanie wypełniona pożywką hodowlaną w rzeczywistych warunkach eksperymentalnych, tlen będzie dyfundował przez wewnętrzną przestrzeń komory i konstrukt komórkowy, który będzie składał się z hydrożeli zawierających komórki.
      UWAGA: Zapoznaj się z poprzednim badaniem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat parametrów fizycznych¹⁵.
   3. Zdefiniuj zaimportowaną geometrię 3D jako objętość kontrolną przestrzeni, w której tlen dyfunduje, a komórki zużywają tlen (Rysunek 2B).
   4. Przeprowadź analizę komputerową do analizy dyfuzji gazów, postępując zgodnie z instrukcją obsługi i wcześniej ustalonymi metodami^16,17.
   5. Z wyników analizy komputerowej wyeksportuj szacunkowe dane dotyczące stężenia tlenu w przekroju A-A' w każdym punkcie czasowym, postępując zgodnie z instrukcją obsługi. Równanie rządzące opiera się na pierwszym prawie Ficka, wyrażonym w równaniu (1) (Rysunek 2C).
      
      gdzie c jest stężeniem, D jest współczynnikiem dyfuzji tlenu, N_komórka jest gęstością komórek, to maksymalna szybkość pobierania tlenu, a Km to stała Michaelisa-Mentena. Stałe zostały zastosowane zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji¹⁵.
      UWAGA: Każdy punkt czasowy oznacza punkt krokowy do obserwacji zmian dyfuzji tlenu w czasie.
   6. Oceń, czy minimalny poziom tlenu osiąga próg niedotlenienia i powtórz proces analizy komputerowej ze zwiększaniem lub zmniejszaniem gęstości komórek.
      UWAGA: Zdefiniuj, że gradient hipoksji powstaje w konstrukcji, jeśli poziom tlenu 80% w obszarze hydrożelu jest mniejszy niż 0,02 mM po 24 godzinach.
   7. Potwierdź liczbę komórek wymaganych do wygenerowania gradientu tlenu indukującego niedotlenienie w obszarze centralnym na podstawie pierwszego prawa Ficka w kroku 1.2.5 i wyników symulacji z kroku 1.2.6.
      UWAGA: W tym protokole numer komórki wynosił 2 × 10⁶ komórek/każdy konstrukt.

2. Hodowla komórkowa komórek nowotworowych i komórek zrębu

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych w celu uniknięcia stresu fizjologicznego
   1. W przypadku komórek U-87 MG (unieśmiertelniona ludzka linia komórkowa glejaka) umieść 12 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w kolbie do hodowli komórek T-75 w 37 °C, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze na 30 minut, aby zminimalizować termiczne i zasadowe działanie pożywki na komórki.
      UWAGA: Glejak został wybrany jako rodzaj raka litego, ponieważ ma agresywne cechy w niedotlenionym środowisku. Do tego modelu można zastosować inne różne rodzaje nowotworów.
   2. W przypadku ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) umieścić 12 ml pożywki do hodowli komórek śródbłonka w kolbie do hodowli komórek T-75 w inkubatorze z wilgotnością 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: HUVEC zostały wybrane, ponieważ jest to jedna z najbardziej reprezentatywnych linii komórkowych śródbłonka. W tym modelu można również zastosować różne typy komórek zrębowych.
2. Szybkie rozmrażanie kriokonserwowanych komórek rakowych i komórek zrębu oraz ich utrzymanie
   1. Przenieść kriowiale zawierające 5 x 10⁵ komórek U-87 MG i HUVEC z pojemnika na ciekły azot do komory o przepływie laminarnym. Natychmiast poluzuj i ponownie dokręć nakrętkę, aby uwolnić ciśnienie wewnętrzne.
   2. Delikatnie umieść kriokonserwowane komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty, trzymając nakrętkę z dala od wody. Przepłukać fiolki 70% etanolem pod wpływem przepływu laminarnego, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
   3. Przenieść rozmrożone komórki do kolb zawierających przygotowane pożywki do hodowli komórkowych opisane w kroku 2.1 i umieścić kolby zawierające komórki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO₂ w temperaturze 37 °C w celu odzyskania komórek.
   4. Odświeżaj pożywkę do hodowli komórkowych co 2 dni i utrzymuj wzrost komórek.
   5. Po 24 godzinach rozmrażania należy wymienić pożywkę do hodowli komórkowych, aby uniknąć cytotoksyczności dimetylosulfotlenku (DMSO), który był używany do zamrażania komórek. Użyj HUVEC, który przeszedł mniej niż 6 pasaży.

3. Przygotowanie roztworu żelu kolagenowego

1. Solubilizacja gąbki kolagenowej za pomocą 0,1 N kwasu solnego (HCl)
   1. Przygotować roztwór 0,1 N HCl i przefiltrować go za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
   2. Na 3 ml 1% (w/v) zneutralizowanego roztworu żelu kolagenowego przygotuj gąbki kolagenowe pokrojone na⁵ x 5 mm 2 kawałki i o wadze 30 mg.
   3. Przenieś pocięte kawałki kolagenu do sterylnej szklanej fiolki o pojemności 10 ml.
      UWAGA: Przygotuj 1,5-krotność wymaganej objętości hydrożelu kolagenowego, biorąc pod uwagę utratę hydrożelu z powodu lepkości roztworu kolagenu.
   4. Dodać 2,4 ml 0,1 N HCl do szklanej fiolki zawierającej kolagen i inkubować na kołysce z prędkością 15 obr./min i 4 °C przez 3 dni.
      UWAGA: Objętość roztworu 0,1 N HCl wynosiła cztery piąte końcowej objętości wymaganego hydrożelu kolagenowego. W tym przypadku przygotowano 3 ml kolagenu.
   5. Po strawieniu przesiej niestrawione cząsteczki kolagenu za pomocą sitka komórkowego o wielkości 40 μm. Kwaśny roztwór kolagenu należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 7 dni.
2. Dostosowanie pH dla 1% zneutralizowanego roztworu żelu kolagenowego
   1. Odwirować kwaśny roztwór kolagenu o sile 1224 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Dodać 30 μl roztworu czerwieni fenolowej jako wskaźnika pH do końcowego stężenia 1% (v/v) i 300 μl 10-krotnego buforu soli fizjologicznej (PBS) do końcowego stężenia 10% (v/v) w roztworze kolagenu do wstępnego żelu.
   3. Zneutralizować pH do 7 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH), sprawdzając zmianę koloru.
      UWAGA: Na podstawie wzoru mole ^H+ = molowość H⁺ x objętość H⁺ = mole OH^-= molowość OH^- x objętość OH^-, dodać 240 μL NaOH.
   4. Dodać wodę destylowaną, aby uzyskać całkowitą objętość 3 ml.
   5. Po dostosowaniu pH należy przechowywać 1% (w/v) zneutralizowany roztwór żelu kolagenowego w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
      UWAGA: Aby wstępnie sprawdzić żelowanie zneutralizowanego roztworu żelu wstępnego kolagenu, przygotuj 50 μl kropelek kolagenu na małym naczyniu za pomocą pipety wyporowej i inkubuj je w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zapoznaj się z poniższymi trzema metodami, aby zweryfikować usieciowanie kropelek kolagenu.
   6. Sprawdź, czy kolor kolagenu zmienił się z przezroczystego koloru na nieprzezroczysty biały.
   7. Przechyl pojemnik i sprawdź, czy kolagen przylega do dna pojemnika.
   8. Wlej 1x PBS na kropelki i sprawdź, czy konstrukt kolagenowy nie jest uszkodzony w roztworze.

4. 3D drukowanie bariery gazoprzepuszczalnej

1. Druk 3D protektorowej formy z poli(etylenu i octanu winylu) (PEVA)
   1. Wygeneruj geometrię 3D protektorowej formy PEVA zdefiniowanej w kroku 1 za pomocą oprogramowania CAD 3D (Rysunek 3A).
      UWAGA: Geometria 3D i szczegółowa skala modelu, w tym wymiary, jednostki i typy linii, zostały pokazane w Rysunek 2A.
   2. Konwertuj plik CAD 3D na format pliku STL, klikając Plik | Zapisz-Plik wpisz jako STL. Kliknij także Opcja | Formularz wyjściowy jako ASCII do generowania G-code.
   3. Kliknij Plik | Otwórz plik STL i wybierz zapisany plik STL, aby zaimportować wygenerowany plik STL. Kliknij na model Slice wymiennika STL-CAD, aby automatycznie wygenerować kod G protektorowej formy PEVA ( Rysunek 3B, C).
      UWAGA: Ścieżka drukowania jest generowana poprzez połączenie przeciętych punktów między figurą podstawową pliku STL a płaszczyzną cięcia (tj. warstwą). Zasadniczo podstawową figurą fragmentu w pliku STL jest trójkąt, który zawiera współrzędne 3D. Po uzyskaniu punktów przeciętych między trójkątem a warstwą, generowany jest kod G do drukowania, łącząc każdy punkt bez nakładającej się ścieżki na warstwie¹⁸. Każdy algorytm generowania G-code w oprogramowaniu pokładowym może być używany do generowania ścieżek drukowania do produkcji chipów.
   4. Przygotować sterylny klej i hydrofilowe szkiełko histologiczne.
      UWAGA: Hydrofilowe szkło szkiełkowe ma kluczowe znaczenie dla trwałego wiązania polidimetylosiloksanu (PDMS) ze szkłem i adhezji konstruktów kolagenowych otaczających komórki rakowe i komórki zrębu.
   5. Wydrukuj protektorową formę PEVA na szkiełku za pomocą precyzyjnej dyszy 50 G pod ciśnieniem pneumatycznym 500 kPa w temperaturze 110 °C.
      UWAGA: Na szerokość linii ma wpływ prędkość posuwu, manometr dyszy i temperatura materiału. Zastosowano dyszę 50 G i zastosowano prędkość posuwu 400, aby wygenerować linię o szerokości 500 μm dla ściany ofiarnej. Manometr dyszy, ciśnienie pneumatyczne i prędkość posuwu są definiowane na podstawie praktycznych wyników¹⁹. Ściana protektorowa musi być wystarczająco gruba, aby utrzymać roztwór PDMS, co jest kolejnym etapem wytwarzania.
2. Odlewanie bariery z polidimetylosiloksanu (PDMS)
   1. Wymieszaj 6 ml elastomeru bazowego PDMS i 0,6 ml utwardzacza jednorodnie przez 5 minut w plastikowym zbiorniku. Może to wytworzyć 6 niedotlenionych nowotworów na chipach, biorąc pod uwagę utratę z powodu lepkiej charakterystyki PDMS.
   2. Załaduj zmieszany roztwór PDMS do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml i wyposaż głowicę strzykawki w plastikową, stożkową końcówkę dozującą o pojemności 20 g.
   3. Napełnij ofiarną formę PEVA zmieszanym roztworem PDMS w strzykawce. Zmieszany PDMS wypełni protektorową formę PEVA wypukłą powierzchnią. Wysokość bariery PDMS będzie wyższa niż w przypadku formy PEVA.
   4. Utwardzać barierę PDMS w piecu w temperaturze 40 °C przez ponad 36 godzin, aby uniknąć stopienia PEVA. Nie zwiększaj temperatury do ponad 88 °C, która jest temperaturą topnienia PEVA.
   5. Odłącz protektorową formę PEVA za pomocą pęsety precyzyjnej i wysterylizuj barierę przepuszczającą gaz w temperaturze 120 °C w autoklawie.

5. Przygotowanie bio-tuszy kolagenowych w kapsułkach komórkowych

1. Odwarstwienie przygotowanych komórek nowotworowych i komórek zrębu
   UWAGA: Biorąc pod uwagę żywotność ogniw, cały proces drukowania powinien zostać zakończony jak najszybciej po odłączeniu ogniw.
   1. Przemyć komórki rakowe i zrębu 10 ml 1x PBS za pomocą pipety serologicznej; potraktować 2 ml 0,25% kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) za pomocą pipety i inkubować je przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
   2. Zneutralizować trypsynizowane komórki za pomocą 3 ml pożywki do hodowli komórkowych; zebrać zawiesiny komórek do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 516 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
   3. Odsysać supernatant powoli; zawiesić osadki komórkowe w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
   4. Przenieść 5 x 10⁶ komórek każdego typu komórek do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować je w temperaturze 516 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
   5. Odessać supernatant i umieścić go na mokrym lodzie.
2. Mieszanie każdego typu komórek z 1% zneutralizowanym roztworem żelu kolagenowego
   UWAGA: Aby uniknąć termicznego zestalenia 1% zneutralizowanego roztworu żelu wstępnego kolagenu, proces ten należy przeprowadzić na mokrym lodzie.
   1. Zawiesić każdy rodzaj osadu komórkowego zebranego w kroku 5.1.4 z 20 μl pożywki do hodowli komórkowych każdy.
   2. Dodać 1 ml 1% zneutralizowanego roztworu żelu kolagenowego do każdej z zawieszonych zawiesin komórkowych i wymieszać je jednorodnie za pomocą pipety wyporowej. Końcowe stężenie każdego typu komórek wyniesie 5 x 10⁶ komórek/ml.
   3. Przenieś kapsułkowane w komórkach biotusze kolagenowe do jednorazowych strzykawek o pojemności 3 ml za pomocą dodatniej jednorazowej pipety i przechowuj strzykawki w temperaturze 4 °C do momentu drukowania komórek 3D.

6. 3D drukowanie komórek koncentrycznych pierścieni rakowo-zrębowych

1. Druk 3D biotuszów kolagenowych kapsułkujących komórki rakowe i komórki zrębu
   1. Wygeneruj geometrię 3D koncentrycznych pierścieni rakowo-zrębowych zdefiniowanych w kroku 1.2 za pomocą oprogramowania CAD 3D.
      UWAGA: Wymiary koncentrycznych pierścieni zrębu nowotworowego są definiowane za pomocą symulowanych parametrów. Końcowe wymiary parametru wymiaru są pokazane w Rysunek 3A.
   2. Przekonwertuj plik CAD 3D na format pliku STL i wygeneruj kod G koncentrycznych pierścieni rak-zrąb za pomocą wymiennika STL-CAD.
      UWAGA: Zapoznaj się z uwagą w kroku 4.1.2, aby zapoznać się z algorytmem generowania G-code.
   3. Załaduj kapsułkowane w komórkach biotusze kolagenowe zawarte w jednorazowych strzykawkach o pojemności 3 ml do głowicy drukarki 3D i ustaw temperaturę głowicy i płytki na 15 °C.
      UWAGA: Jeśli temperatura głowicy i płyty drukarki przekroczy 37 °C, biotusz zostanie usieciowany i nie będzie już drukowany.
   4. Załaduj wygenerowaną ścieżkę drukowania do oprogramowania sterującego drukarki 3D.
   5. Klikając przycisk Start, wydrukuj biotusze kolagenowe kapsułkujące komórki rakowe i komórki zrębu na barierze przepuszczającej gaz zgodnie z załadowanym kodem G za pomocą igły z tworzywa sztucznego 18 G pod ciśnieniem pneumatycznym około 20 kPa w temperaturze 15 °C.
   6. Pod koniec każdej operacji drukowania ręcznie umieść wysterylizowaną szklaną pokrywę o wymiarach 22 mm x 50 mm na przepuszczającej gaz barierze, aby wygenerować gradient hipoksyjny.
      UWAGA: Porównaj dwie grupy w zależności od obecności szklanej pokrywy (GR+) i jej braku (GR-), aby zweryfikować generowanie gradientu hipoksyjnego.
   7. Po wygenerowaniu trzech niedotlenionych chipów z rakiem na chipach, przenieś je do inkubatora w temperaturze 37 °C na 1 godzinę w celu usieciowania biotuszów kolagenowych.
2. Zakończenie procesu wytwarzania i konserwacji niedotlenionego nowotworu na chipie
   1. Po zakończeniu wszystkich procesów drukowania komórek 3D niedotlenionego raka na chipie, delikatnie przetrzyj szkła nakrywkowe na wierzchu barier przepuszczalnych dla gazów za pomocą skrobaka komórkowego w celu ścisłego połączenia (Rysunek 4A,B).
      UWAGA: Szkło nakrywkowe i bariera przepuszczająca gaz są montowane za pomocą klejenia hydrofobowego bez klejów chemicznych, po prostu zeskrobując połączoną część między szkłem nakrywkowym a barierą PDMS.
   2. Wprowadź 1,5 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka do każdego chipa. Aby uniknąć oderwania się konstruktu nowotworowego, należy wprowadzić pożywkę do hodowli komórkowej z jednej strony chipa. Przechyl chip, aby umożliwić przepływ pożywki do hodowli komórkowych za pomocą pipety.
   3. Odświeżaj pożywkę do hodowli komórkowych codziennie przez tydzień. Użyj pipety, aby zassać pożywkę do hodowli komórkowych; Nie używaj pompy ciśnieniowej.

7. Ocena żywotności komórek po wydrukowaniu

1. Przygotowanie próbek i traktowanie roztworem kalceiny AM i EthD-1
   1. Ogrzewać 1x PBS w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
   2. Przygotować roztwór do oznaczania, dodając 0,75 μl acetoksymetylu kalceiny (kalceiny AM) i 3 μl homodimeru etydyny (EthD-1) do 1,5 ml wstępnie podgrzanego PBS.
   3. Ostrożnie odessać wszystkie media z chipa za pomocą pipety.
   4. Umyj konstrukt raka wstępnie podgrzanym PBS. Wlej 1,5 ml PBS do chipa za pomocą pipety i odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby uniknąć deformacji konstrukcji raka, wprowadź 1x PBS z jednej strony chipów i przechyl wióry, aby umożliwić przepływ 1x PBS.
   5. Odessać PBS z chipa; poddać działaniu 1,5 ml roztworu do oznaczania i inkubować chip w temperaturze 37 °C przez 20 minut, używając folii w celu ochrony przed światłem. Użyj pipety, aby zassać 1x PBS; Nie używaj pompy ssącej.
2. Obrazowanie żywotności komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
   1. Przeglądaj i rejestruj znakowane komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 4C).
      UWAGA: Calcein AM oznacza żywe komórki zieloną fluorescencją (długość fali ~488 nm). EthD-1 reprezentuje sygnał martwych komórek z czerwoną fluorescencją (długość fali ~594 nm).
   2. Policz liczbę żywych i martwych komórek za pomocą oprogramowania do obrazowania, programu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym, i oblicz żywotność za pomocą liczb.

8. Immunofluorescencja w celu sprawdzenia powstawania centralnego niedotlenienia i jego wpływu na nowotwór złośliwy

1. Fiksacja, przenikanie i blokowanie konstruktu nowotworowego
   1. Przygotuj 1x PBS, 4% paraformaldehydu (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 i 2% (w/v) albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze pokojowej.
   2. Ostrożnie odessać wszystkie media z chipa za pomocą pipety i trzykrotnie przepłukać chip 1x PBS. Aby uniknąć deformacji konstrukcji raka, wprowadź 1x PBS z jednej strony chipów i przechyl wióry, aby umożliwić przepływ 1x PBS. Pomiędzy każdym etapem mycia pozostaw frytek z 1x PBS na 5 minut, aby usunąć resztki roztworów.
      UWAGA: 1x PBS był odsysany za pomocą pipety, a nie pompy ciśnieniowej.
   3. Dodaj 500 μl 4% PFA do konstruktu raka na chipie za pomocą pipety; pozostaw na 15 minut i przemyj trzy razy 1x PBS, aby utrwalić komórki w konstrukcie raka.
   4. Leczyć konstrukt raka za pomocą 500 μl 0,1% Triton X-100 za pomocą pipety w temperaturze pokojowej przez 5 minut i przemyć trzykrotnie 1x PBS, aby rozpuścić i przeniknąć przez błonę komórkową.
   5. Leczyć konstrukt raka za pomocą 500 μl 2% BSA za pomocą pipety w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w celu zablokowania reaktywnych epitopów.
      UWAGA: Przykryj wiór folią parafinową, aby zapobiec parowaniu.
   6. Po 1 godzinie umyj frytki trzykrotnie 1x PBS.
2. Leczenie przeciwciałem pierwotnym, przeciwciałem drugorzędowym i DAPI oraz obrazowanie struktury za pomocą mikroskopu konfokalnego.
   1. Przygotować przeciwciała kontrolne izotypu i koktajl przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając przeciwciała w 1x PBS do każdego pożądanego stężenia roboczego.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przeciwciał znajdują się w Tabeli materiałów. Należy stosować te same stężenia robocze przeciwciał kontrolnych izotypu, co przeciwciała pierwszorzędowe.
   2. Ostrożnie odessać cały 1x PBS z chipa za pomocą pipety i potraktować chip 200 μl roztworem przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze 4 °C przez noc. Przykryj wióry folią parafinową, aby zapobiec parowaniu.
   3. Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i umyć chip trzykrotnie 1x PBS.
   4. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe i DAPI w 1x PBS do pożądanego stężenia roboczego.
      UWAGA: W tym przypadku stosuje się przeciwciało drugorzędowe sprzężone z zieloną fluorescencją w stosunku 1:200. DAPI zastosowano w stosunku 1:1000.
   5. Ostrożnie odessać cały 1x PBS z chipa za pomocą pipety i potraktować chip 200 μl wtórnego roztworu przeciwciała-DAPI w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Przykryj chip folią parafinową, aby zapobiec parowaniu, a następnie owiń go folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu.
   6. Odessać wtórny roztwór przeciwciała-DAPI i umyć chip trzy razy 1x PBS.
   7. Po zakończeniu etapu barwienia przenieś konstrukt raka do naczynia konfokalnego, delikatnie chwytając kleszczami.
   8. Wizualizuj i rejestruj oznaczone komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rysunek 5).
      UWAGA: Długość fali mikroskopu konfokalnego została dostosowana w zależności od rodzaju markerów fluorescencyjnych. Szczegółowe informacje na temat przeciwciał są wymienione w tabeli materiałów. Aby skutecznie wykryć pozycję komórki, lepiej byłoby najpierw obserwować jądra konstruktu barwione DAPI. Długości fal detekcji wzbudzenia/emisji sygnałów fluorescencyjnych wynosiły 358/461 nm (DAPI, niebieski), 494/517 nm (zielony) i 590/617 nm (czerwony). Powiększenia wynosiły 4x, 10x i 20x, regulowane od najniższego do najwyższego.

9. Analiza statystyczna

1. Zliczanie komórek za pomocą programu do przetwarzania obrazu
   1. Uruchom program do przetwarzania obrazu, aby policzyć liczbę żywych i martwych komórek.
   2. Otwórz pliki obrazów fluorescencyjnych. Kliknij Plik | Otwórz i zaimportuj obrazy TIFF.
   3. Przekonwertuj obrazy na 16-bitowe obrazy w skali szarości. Kliknij na Obrazek | Rodzaj | 16-bitowa skala szarości.
   4. Dostosuj próg, klikając Obraz | Dostosuj | Próg, a następnie wybierz kolor komórek, które mają być czarne.
   5. Wytnij scalone komórki, klikając Proces | Binarny | Zlewnia do precyzyjnego zliczania komórek.
   6. Policz liczbę komórek, klikając Analizuj, a następnie trzykrotnie Analizuj cząstki; oblicz średnią i przedstaw dane jako średnią ± błędu standardowego.
      UWAGA: Markery immunofluorescencji analizowano, porównując intensywność fluorescencji.

Wyniki

Niedotleniony rak na chipie został opracowany przy użyciu wspomaganej komputerowo technologii druku komórkowego 3D w celu podsumowania niedotlenienia i patologii związanej z rakiem (Rysunek 1). Transport i zużycie tlenu zostały zasymulowane przy użyciu modelu geometrii 3D. Chip został zaprojektowany w postaci koncentrycznych pierścieni, aby naśladować promieniową dyfuzję i zubożenie tlenu w tkankach nowotworowych (Rysunek 2A). Po zdefiniowaniu objęt...

Dyskusja

W tym badaniu opisujemy proces wytwarzania niedotlenionego nowotworu na chipie opartego na technologii drukowania komórek 3D. Powstawanie gradientu hipoksyjnego w zaprojektowanym chipie zostało przewidziane za pomocą symulacji komputerowych. Środowisko, które może wywołać niejednorodny gradient hipoksyjny, zostało odtworzone za pomocą prostej strategii łączącej wydrukowaną w 3D barierę przepuszczalną dla gazów i szklaną pokrywę. Związane z niedotlenieniem patologiczne cechy glejaka, w tym pseudopalisada i niewielka popul...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
komórki
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej	Promocell	C-12200
U-87 MG komórki	ATCC	ATCC HTB-14
Jednorazowe
0,2 μ m filtr strzykawkowy	Sartorius	16534-K
10 ml jednorazowa strzykawka	Jung Rim	10ml 21G32
10 ml szklana fiolka	Hubena	A0039
10 ml Serologiczna końcówka do pipety	SPL lifescience	91010
15 mL rurka stożkowa	SPL lifescience	50015
18G igła z tworzywa sztucznego inżynieria		MusashiPN-18G-B
20G plastikowa stożkowa końcówka dozująca	Musashi engineering	TPND-20G-U
22x50 szklana pokrywa	MARIENFIELD	0101142
25 mL Serologiczna końcówka do pipety	SPL lifescience	90125
mL jednorazowe strzykawki	HENKE-JET	4020-X00V0
40 µ m Sitko do komórek	Falcon	352360
5 ml Serologiczna końcówka do pipety	SPL lifescience	91005
50 ml rurka stożkowa	SPL lifescience	50050
50 mL Serologiczna końcówka do pipety	SPL lifescience	90150
50N dysza precyzyjna	Musashi engineering	HN-0.5ND
Folia aluminiowa	SINKWANG
Końcówki kapilarne	Gilson	CP1000
Skrobak do komórek	SPL lifescience	90030
Naczynie konfokalne	SPL lifescience	200350
Parafilm	Bemis	PM996
Wstępnie powlekane szkiełko histologiczne	MATSUNAMI	MAS-11
Zbiornik	SPL lifescience	23050
Kolba do hodowli komórkowych T-75	SPL lifescience	70075
Sprzęt
3DX drukarka	T& R Autoklaw Biofab
	Wirówka JEIOTECH	AC-12
	Cyrozen	1580MGR
Konfokalna mikroskopia laserowa	Olympus Life Science	FV 1000
Mikroskop fluorescencyjny	FISHER SCEINTIFIC	O221S366
Kleszcz	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Wskaźnik dłoni licznik	KTRIO
Hemocytometr	MARIENFIELD	0650030
Inkubator	Panasonic	MCO-170AIC
Komora laminarna	DAECHUNG SCIENCE	CB-BMMS C-001
Metalowa strzykawka	IWASHITA engineering	SUS BARREL 10CC
Nożyczki operacyjne	Hirose	HC.13-122
Piekarnik	JEIOTECH	OF-12, H070023
Pipeta wyporowa	GILSON	NJ05652
Lodówka	SAMSUNG	CRFD-1141
Mikser Voltex	DAIHAN scientific	VM-10
Łaźnia wodna	DAIHAN SCIENTIFIC	WB-11
Oczyszczacz wody	WASSER LAB	DI-GR
Materiały
0,25 % Trypsyna-EDTA	Gibco	25200-072
10x PBS	Intron	IBS-BP007a
4% Paraformaldehyd	Biosesang
70% Etanol	Daejung	4018-4410
Przeciwciało anty-CD31	Abcam	ab28364
Przeciwciało anty-HIF-1 alfa	Abcam	ab16066
Przeciwciało anty-SHMT2/SHMT	Abcam	ab88664
Przeciwciało anty-SOX2	Abcam	ab75485
Albumina surowicy bydlęcej	Thermo scientific	J10857-22
Kolagen ze skóry świni	Dalim tissen	PC-001-1g
DAPI (4',6- Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)	Thermofisher	D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2	Promocell	C22011
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	12483-020
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H + L), Alexa Fluor 488	Theromofisher	A-11001
Kozia anty-królicza IgG (H + L) Adsorbowana krzyżowo wtórna Przeciwciało, Alexa Fluor 594	Theromofisher	A-11012
Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy" s Zmodyfikowany hyklon Eagle Medium (DMEM)		SH30243-0
Kwas solny	Sigma-Aldrich	311413-100ML
Zestaw do oznaczania żywych/martwych	zwierząt Invitrogen	L3224
Mysz IgG1, kappa monoklonalny [15-6E10A7] - Kontrola izotypu	Abcam	ab170190
Penicylina/streptomycyna	Gibco	15140-122
Czerwień fenolowa roztwór	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Poli(etylen-octan winylu)	Poly science	06108-500
Polidimetylosiloksan	Dowhitech	sylgard 184
IgG królika, poliklonalny - Kontrola izotypu	Abcam	ab37415
Roztwór wodorotlenku sodu	Samchun	S0610
Triton X-100	Biosesang	TRI020-500-50
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a	COMSOL AB
IMS beamer			oprogramowanie wewnętrzne
Pakiet SolidWorks Dassault	Systems SolidWorks Corporation