Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Drukowany w 3D hipoksyjny rak na chipie do rekapitulacji patologicznej progresji raka litego

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61945

⸱

5 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niedotlenienie jest cechą charakterystyczną mikrośrodowiska guza i odgrywa kluczową rolę w progresji raka. Ten artykuł opisuje proces wytwarzania niedotlenionego raka na chipie opartego na technologii drukowania komórek 3D w celu podsumowania patologii raka związanej z niedotlenieniem.

Streszczenie

Mikrośrodowisko raka ma znaczący wpływ na postęp choroby. W szczególności niedotlenienie jest kluczowym czynnikiem wpływającym na przeżycie raka, inwazję i chemooporność. Chociaż opracowano kilka modeli in vitro do badania patologii nowotworów związanych z hipoksją, złożone wzajemne oddziaływanie mikrośrodowiska nowotworu obserwowane in vivo nie zostało jeszcze odtworzone ze względu na brak precyzyjnej kontroli przestrzennej. Zamiast tego zaproponowano podejścia do biofabrykacji 3D w celu stworzenia systemów mikrofizjologicznych w celu lepszej emulacji ekologii raka i dokładnej oceny leczenia przeciwnowotworowego. W tym miejscu proponujemy podejście do drukowania komórek 3D w celu wytworzenia niedotlenionego raka na chipie. Składniki wywołujące niedotlenienie w chipie zostały określone na podstawie komputerowej symulacji rozkładu tlenu. Koncentryczne pierścienie rakowo-zrębowe zostały wydrukowane przy użyciu biotuszy zawierających komórki glejaka i komórki śródbłonka, aby podsumować rodzaj raka litego. Powstały w ten sposób chip doprowadził do centralnego niedotlenienia i zaostrzenia nowotworu złośliwego w nowotworze dzięki tworzeniu reprezentatywnych markerów patofizjologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że proponowane podejście do stworzenia systemu mikrofizjologicznego imitującego raka w ciele stałym wypełni lukę między modelami in vivo i in vitro do badań nad rakiem.

Wprowadzenie

Mikrośrodowisko raka jest krytycznym czynnikiem napędzającym postęp nowotworu. Wiele składników, w tym sygnały biochemiczne, biofizyczne i komórkowe, określa patologiczne cechy raka. Wśród nich niedotlenienie jest silnie związane z przeżywalnością, proliferacją i inwazją raka1. Ze względu na nieograniczony wzrost i podział komórek rakowych, składniki odżywcze i tlen są stale wyczerpywane, co powoduje powstanie gradientu niedotlenienia. W warunkach niskiego poziomu tlenu komórki aktywują kaskadę molekularną związaną z czynnikiem transkrypcyjnym indukowanym hipoksją (HIF). Proces ten indukuje martwiczy rdzeń, wyzwala zmiany metaboliczne oraz inicjuje przerost naczyń krwionośnych i przerzuty2,3. Następnie niedotlenienie w komórkach nowotworowych powoduje zniszczenie sąsiednich normalnych tkanek. Ponadto niedotlenienie jest silnie związane z opornością terapeutyczną guzów litych w sposób wieloczynnikowy. Niedotlenienie może poważnie utrudnić radioterapię, ponieważ wrażliwość na promieniowanie jest ograniczona ze względu na reaktywne formy tlenu1,4. Ponadto obniża poziom pH w mikrośrodowiskach nowotworowych, co zmniejsza akumulację leków1. Dlatego odtwarzanie cech patologicznych związanych z hipoksją in vitro jest obiecującą strategią dla wyników naukowych i przedklinicznych.

Modelowanie specyficznego mikrośrodowiska raka jest niezbędne do zrozumienia rozwoju raka i zbadania odpowiednich metod leczenia. Chociaż modele zwierzęce są szeroko stosowane ze względu na ich silne znaczenie fizjologiczne, istnieją problemy związane z różnicami gatunkowymi i problemami etycznymi5. Co więcej, chociaż konwencjonalne modele 2D i 3D pozwalają na manipulację i obrazowanie komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym w celu dogłębnej analizy, ich złożoności architektonicznej i komórkowej nie można w pełni podsumować. Na przykład modele sferoidalne raka są szeroko stosowane, ponieważ agregacja komórek rakowych w sferoidzie może naturalnie generować niedotlenienie w rdzeniu. Co więcej, duża liczba sferoid komórkowych o jednakowej wielkości została wyprodukowana przy użyciu systemów wielodołkowych na bazie tworzywa sztucznego lub silikonu6,7. Jednak mniejsza elastyczność w odniesieniu do uchwycenia dokładnej heterogenicznej struktury tkanek nowotworowych za pomocą konwencjonalnych platform wymagała ustanowienia zaawansowanej technologii biofabrykacji w celu zbudowania wysoce biomimetycznej platformy w celu usprawnienia badań nad rakiem8.

3D mikrofizjologiczne systemy (MPS) są użytecznymi narzędziami do podsumowania złożonej geometrii i patologicznego postępu komórek nowotworowych9. Ponieważ komórki nowotworowe wyczuwają biochemiczny gradient czynników wzrostu i chemokin oraz mechaniczną heterogeniczność odtwarzaną w systemie, ważne cechy rozwoju raka mogą być badane in vitro. Na przykład żywotność raka, nowotwór złośliwy z przerzutami i oporność na leki w zależności od różnych stężeń tlenu badano za pomocą MPSs10,11. Pomimo najnowszych osiągnięć, generowanie warunków hipoksyjnych modeli in vitro opiera się na złożonych procedurach produkcyjnych, w tym połączeniu z fizycznymi pompami gazowymi. Dlatego potrzebne są proste i elastyczne metody budowania mikrośrodowisk specyficznych dla raka.

Technologia druku 3D komórek zyskała znaczną uwagę ze względu na precyzyjną kontrolę przestrzennego rozmieszczenia biomateriałów w celu podsumowania rodzimych architektur biologicznych12. W szczególności technologia ta przezwycięża istniejące ograniczenia modeli hipoksji 3D ze względu na jej wysoką sterowalność i wykonalność w budowaniu cech przestrzennych mikrośrodowiska nowotworu. Druk 3D ułatwia również produkcję wspomaganą komputerowo poprzez proces warstwa po warstwie, zapewniając w ten sposób szybką, dokładną i powtarzalną konstrukcję złożonych geometrii, które naśladują rzeczywiste architektury tkanek. Oprócz zalet istniejących strategii produkcji MPS 3D, patofizjologiczne cechy progresji raka można odtworzyć poprzez tworzenie wzorców komponentów biochemicznych, komórkowych i biofizycznych13,14.

Tutaj prezentujemy strategię drukowania komórek 3D dla niedotlenionego raka na chipie w celu podsumowania heterogeniczności raka litego (Rysunek 1)15. Parametry wytwarzania określono za pomocą symulacji obliczeniowej powstawania centralnego niedotlenienia w systemie. Koncentryczne pierścienie rakowo-zrębowe wydrukowano przy użyciu biotuszy kolagenowych zawierających komórki glejaka i komórki śródbłonka, aby naśladować patofizjologię glejaka, rodzaju raka litego. Tworzenie promienistego gradientu tlenu pogorszyło złośliwość raka, wskazując na zwiększoną agresywność. Ponadto wskazujemy perspektywy na przyszłość dla zastosowań chipa w modelach przedklinicznych specyficznych dla pacjenta. Oczekuje się, że proponowane podejście do stworzenia systemu mikrofizjologicznego imitującego raka w stanie stałym wypełni lukę między modelami raka in vivo i in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Symulacja komputerowa tworzenia się gradientu tlenu

  1. Generowanie modelu geometrii 3D do drukowania chipa raka hipoksyjnego (cancer-on-a-chip)
    1. Uruchom oprogramowanie 3D CAD.
    2. Naszkicuj model geometrii chipa raka hipoksyjnego. Kliknij Szkic i wybierz odpowiednią płaszczyznę do narysowania geometrii. Szczegółową skalę każdej części przedstawiono na rysunku (Rysunek 2A).
    3. Ustaw grubość geometrii, klikając Funkcja-Wyprowadzenie Boza/Podstawy. W pustym polu wprowadź żądaną grubość (patrz Rysunek 2A) i wybierz zieloną ikonę zatwierdzenia, aby utworzyć geometrię 3D.
      UWAGA: Wymiary chipa raka hipoksyjnego są definiowane na podstawie pożądanych objętości medium i hydrożelu. W niniejszym eksperymencie pożądane objętości medium i hydrożelu wynosiły odpowiednio około 1,500 µL i 500 µL, co oparto na wcześniejszych doświadczeniach praktycznych dotyczących rozdzielczości biodrukarki ekstruzyjnej.
    4. Zapisz plik geometrii w formacie pliku 3D CAD (.prt lub .stl).
  2. Wyznaczenie gęstości komórkowej dla indukcji rdzenia hipoksyjnego
    1. Uruchom program do symulacji dyfuzji fizycznej.
    2. Kliknij LiveLink i wybierz używane oprogramowanie CAD. Kliknij Synchronizuj, aby zaimportować geometrię chipa raka hipoksyjnego do programu symulacyjnego. Ponieważ w rzeczywistym układzie eksperymentalnym wewnętrzna przestrzeń komory zostanie wypełniona pożywką hodowlaną, tlen będzie dyfundował przez wewnętrzną przestrzeń komory i konstrukt komórkowy, który będzie składał się z hydrożeli zawierających komórki.
      UWAGA: Szczegóły dotyczące parametrów fizycznych znajdują się w poprzednim badaniu15.
    3. Zdefiniuj zaimportowaną geometrię 3D jako objętość kontrolną przestrzeni, w której dyfunduje tlen, a komórki go zużywają (Rysunek 2B).
    4. Przeprowadź analizę komputerową dyfuzji gazów zgodnie z instrukcją użytkownika i wcześniej opracowanymi metodami16,17.
    5. Na podstawie wyników analizy komputerowej wyeksportuj szacowane dane dotyczące stężenia tlenu w przekroju A-A' dla każdego punktu czasowego zgodnie z instrukcją użytkownika. Równanie sterujące opiera się na pierwszym prawie Ficka, wyrażonym w równaniu (1) (Rysunek 2C).
      Równanie reakcji-dyfuzji, wzór opisujący zmiany stężenia w procesie biochemicznym.
      gdzie c to stężenie, D to współczynnik dyfuzji tlenu, Ncell to gęstość komórek, VO2,max, symbol wzoru dla maksymalnego poboru tlenu w badaniach fizjologii wysiłku. to maksymalna szybkość poboru tlenu, a Km to stała Michaelisa-Menten. Stałe zastosowano zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji15.
      UWAGA: Każdy punkt czasowy oznacza krok obserwacji zmian dyfuzji tlenu w czasie.
    6. Oceń, czy minimalny poziom tlenu osiąga próg hipoksji, i powtórz proces analizy komputerowej, zwiększając lub zmniejszając gęstość komórkową.
      UWAGA: Przyjmuje się, że gradient hipoksji tworzy się w konstrukcie, jeśli poziom tlenu w obszarze hydrożelu na wysokości 80% jest mniejszy niż 0,02 mM po 24 h.
    7. Potwierdź liczbę komórek wymaganą do wytworzenia gradientu tlenowego indukującego hipoksję w regionie centralnym, korzystając z pierwszego prawa Ficka z kroku 1.2.5 oraz wyników symulacji z kroku 1.2.6.
      UWAGA: W tym protokole liczba komórek wynosiła 2 × 106 komórek/każdy konstrukt.

2. Hodowla komórek nowotworowych i komórek zrębowych

  1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowej w celu uniknięcia stresu fizjologicznego
    1. W przypadku komórek U-87 MG (uniezmiertawiona linia komórkowa glejaka wielopostaciowego człowieka), należy umieścić 12 mL wysokoglukozowej pożywki Dulbecco's modified Eagle zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny w kolbie hodowlanej T-75 w inkubatorze z nawilżaniem, w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na 30 min, aby zminimalizować wpływ termiczny i alkaliczny pożywki na komórki.
      UWAGA: Glejak wielopostaciowy wybrano jako typ nowotworu litego, ponieważ wykazuje on agresywne cechy w środowisku hipoksycznym. Do tego modelu można zastosować również inne rodzaje nowotworów.
    2. W przypadku ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVECs), należy umieścić 12 mL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka w kolbie hodowlanej T-75 w inkubatorze z nawilżaniem, w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na 30 min.
      UWAGA: Komórki HUVECs wybrano, ponieważ są jedną z najbardziej reprezentatywnych linii komórek śródbłonka. Do tego modelu można zastosować również różne typy komórek zrębu.
  2. Szybkie rozmrażanie krio konserwowanych komórek nowotworowych i komórek zrębu oraz ich utrzymanie
    1. Przenieść krioamputki zawierające 5 x 105 komórek U-87 MG i HUVECs z pojemnika z ciekłym azotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Natychmiast poluzować i ponownie dokręcić zakrętkę, aby zwolnić ciśnienie wewnętrzne.
    2. Ostrożnie umieścić krio konserwowane komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 2 min, dbając, aby zakrętka znajdowała się poza wodą. Opłukać amputki 70% etanolem w warunkach przepływu laminarnego, aby zapobiec kontaminacji.
    3. Przenieść rozmrożone komórki do kolb zawierających przygotowane pożywki do hodowli komórkowej opisane w punkcie 2.1 i umieścić kolby z komórkami w inkubatorze z nawilżaniem, w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 w celu regeneracji komórek.
    4. Wymieniać pożywki do hodowli komórkowej co 2 dni i utrzymywać wzrost komórek.
    5. Po 24 h od rozmrożenia wymienić pożywki do hodowli komórkowej, aby uniknąć cytotoksyczności dimetylosulfotlenku (DMSO), który został użyty do mrożenia komórek. Należy używać komórek HUVECs, które przeszły mniej niż 6 pasażów.

3. Przygotowanie roztworu przedżelowego kolagenu

  1. Rozpuszczanie gąbki kolagenowej w 0,1 N kwasie solnym (HCl)
    1. Przygotować roztwór 0,1 N HCl i przefiltrować go za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm.
    2. Dla 3 mL 1% (w/v) zneutralizowanego roztworu pre-żelu kolagenowego przygotować gąbki kolagenowe pocięte na kawałki o wymiarach 5 x 5 mm2 i masie 30 mg.
    3. Przenieść pocięte kawałki kolagenu do sterylnej szklanej fiolki o pojemności 10 mL.
      UWAGA: Przygotować 1,5-krotną objętość wymaganego hydrożelu kolagenowego, biorąc pod uwagę straty hydrożelu wynikające z lepkości roztworu kolagenu.
    4. Dodać 2,4 mL 0,1 N HCl do szklanej fiolki z kolagenem i inkubować na homogenizatorze obrotowym (rocker) przy 15 rpm i 4 °C przez 3 dni.
      UWAGA: Objętość roztworu 0,1 N HCl stanowiła cztery piąte końcowej objętości wymaganego hydrożelu kolagenowego. W tym przypadku przygotowano 3 mL kolagenu.
    5. Po trawieniu oddzielić nierozpuszczone cząsteczki kolagenu za pomocą sita komórkowego 40 µm. Przechowywać kwaśny roztwór kolagenu w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 7 dni.
  2. Regulacja pH dla 1% zneutralizowanego roztworu pre-żelu kolagenowego
    1. Odwirować kwaśny roztwór kolagenu przy 1224 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    2. Do roztworu pre-żelu kolagenowego dodać 30 µL roztworu czerwieni fenolowej jako wskaźnika pH do stężenia końcowego 1% (v/v) oraz 300 µL 10x fosforanu sodu w roztworze soli fizjologicznej (PBS) do stężenia końcowego 10% (v/v).
    3. Zneutralizować pH do wartości 7 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH), weryfikując zmianę barwy.
      UWAGA: Na podstawie wzoru: mole H+ = molalność H+ x objętość H+ = mole OH-= molalność OH- x objętość OH-, dodać 240 µL NaOH.
    4. Dodać wodę destylowaną do uzyskania objętości całkowitej 3 mL.
    5. Po regulacji pH przechowywać 1% (w/v) zneutralizowany roztwór pre-żelu kolagenowego w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
      UWAGA: Aby wstępnie sprawdzić żelowanie zneutralizowanego roztworu pre-żelu kolagenowego, nanieść krople kolagenu o objętości 50 µL na małą płytkę za pomocą pipety wypierającej i inkubować w inkubatorze w 37 °C przez 1 h. W celu weryfikacji sieciowania kropli kolagenu zastosować następujące trzy metody:
    6. Sprawdzić, czy kolor kolagenu zmienił się z przezroczystego na matowobiały.
    7. Przechylić naczynie i sprawdzić, czy kolagen przylega do dna naczynia.
    8. Wlać 1x PBS na krople i sprawdzić, czy struktura kolagenowa nie rozpada się w roztworze.

4. Drukowanie 3D bariery przepuszczalnej dla gazów

  1. Druk 3D poświęcalnej formy z poli(octanu etylenu-winylu) (PEVA)
    1. Wygenerować geometrię 3D poświęcalnej formy PEVA zdefiniowanej w kroku 1 przy użyciu oprogramowania 3D CAD (Rysunek 3A).
      UWAGA: Geometria 3D oraz szczegółowa skala modelu, w tym wymiary, jednostki i typy linii, zostały przedstawione na Rysunku 2A.
    2. Konwertować plik 3D CAD na format pliku STL, klikając File | Save-File type as STL. Należy również kliknąć Option | Output form as ASCII w celu wygenerowania kodu G.
    3. Kliknąć File | Open STL file i wybrać zapisany plik STL, aby zaimportować wygenerowany plik STL. Kliknąć Slice model w programie STL-CAD exchanger, aby automatycznie wygenerować kod G dla poświęcalnej formy PEVA (Rysunek 3B, C).
      UWAGA: Ścieżka druku jest generowana poprzez połączenie punktów przecięcia między figurą podstawową pliku STL a płaszczyzną cięcia (tj. warstwą). W zasadzie figurą podstawową fragmentu w pliku STL jest trójkąt zawierający współrzędne 3D. Po uzyskaniu punktów przecięcia trójkąta z warstwą, generowany jest kod G do druku poprzez połączenie każdego punktu bez nakładania się ścieżek na warstwie18. Do generowania ścieżek druku dla wykonania chipa można użyć dowolnego algorytmu generowania kodu G w oprogramowaniu pokładowym.
    4. Przygotować sterylną, przylepną i hydrofilową szkiełko histologiczne.
      UWAGA: Hydrofilowe szkło jest kluczowe dla trwałego wiązania polidimetylosiloksanu (PDMS) ze szkłem oraz adhezji konstruktów kolagenowych kapsułkujących komórki nowotworowe i komórki zrębu.
    5. Wydrukować poświęcalną formę PEVA na szkiełku za pomocą dyszy precyzyjnej 50 G przy ciśnieniu pneumatycznym 500 kPa w temperaturze 110 °C.
      UWAGA: Szerokość linii zależy od prędkości posuwu, rozmiaru dyszy i temperatury materiału. Użyto dyszy 50 G i zastosowano prędkość posuwu 400, aby uzyskać szerokość linii 500 µm dla poświęcalnej ścianki. Rozmiar dyszy, ciśnienie pneumatyczne i prędkość posuwu zostały określone na podstawie wyników praktycznych19. Poświęcalna ścianka musi być wystarczająco gruba, aby utrzymać roztwór PDMS, co stanowi kolejny krok wykonania.
  2. Odlewanie bariery z polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. Wymieszać homogenicznie 6 mL elastomeru bazowego PDMS i 0,6 mL czynnika sieciującego przez 5 min w plastikowym zbiorniku. Pozwala to na wykonanie 6 chipów nowotworowych w warunkach hipoksji, biorąc pod uwagę straty wynikające z lepkości PDMS.
    2. Przenieść zmieszany roztwór PDMS do jednorazowej strzykawki 10 mL i wyposażyć głowicę strzykawki w plastikową stożkową końcówkę dozującą 20 G.
    3. Wypełnić poświęcalną formę PEVA zmieszanym roztworem PDMS ze strzykawki. Zmieszany PDMS wypełni poświęcalną formę PEVA, tworząc wypukłą powierzchnię. Wysokość bariery PDMS będzie większa niż wysokość formy PEVA.
    4. Utwardzić barierę PDMS w piekarniku w temperaturze 40 °C przez ponad 36 h, aby uniknąć stopienia PEVA. Nie zwiększać temperatury powyżej 88 °C, która jest temperaturą topnienia PEVA.
    5. Oddzielić poświęcalną formę PEVA za pomocą pęsety precyzyjnej i wysterylizować barierę przepuszczalną dla gazów w temperaturze 120 °C w autoklawie.

5. Przygotowanie bio-atramentów kolagenowych z enkapsulowanymi komórkami

  1. Odłączenie przygotowanych komórek nowotworowych i komórek zrębu
    UWAGA: Ze względu na żywotność komórek, cały proces drukowania powinien zostać zakończony jak najszybciej po odłączeniu komórek.
    1. Przemyć komórki nowotworowe i komórki zrębu 10 mL 1x PBS za pomocą pipety serologicznej; potraktować 2 mL 0,25% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) za pomocą pipety i inkubować przez 3 min w 37 °C.
    2. Zneutralizować trypsynizowane komórki 3 mL pożywki do hodowli komórkowej; zebrać zawiesiny komórek do stożkowych probówek 15 mL i wirować przy 516 x g przez 5 min w 20 °C.
    3. Powoli odessać nadosad; resuspender osady komórkowe w 5 mL pożywki do hodowli komórkowej i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    4. Przenieść 5 x 106 komórek każdego typu do nowych stożkowych probówek 15 mL i wirować przy 516 x g przez 5 min w 20 °C.
    5. Odessać nadosad i umieścić probówki na wilgotnym lodzie.
  2. Mieszanie każdego typu komórek z 1% zneutralizowanym roztworem pre-żelu kolagenowego
    UWAGA: Aby uniknąć termicznej solidyfikacji 1% zneutralizowanego roztworu pre-żelu kolagenowego, proces ten należy przeprowadzać na wilgotnym lodzie.
    1. Resuspender każdy z osadów komórkowych zebranych w kroku 5.1.4 w 20 µL pożywki do hodowli komórkowej.
    2. Dodać 1 mL 1% zneutralizowanego roztworu pre-żelu kolagenowego do każdej z resuspenderowanych zawiesin komórkowych i wymieszać homogenicznie za pomocą pipety o dodatnim przemieszczeniu. Końcowe stężenie każdego typu komórek wyniesie 5 x 106 komórek/mL.
    3. Przenieść bioatramenty kolagenowe z enkapsulowanymi komórkami do jednorazowych strzykawek 3 mL za pomocą jednorazowej pipety i przechowywać strzykawki w 4 °C do czasu drukowania komórek w 3D.

6. Drukowanie 3D koncentrycznych pierścieni z komórek nowotworowych i zromatycznych

  1. Biodruk 3D bioatramentów kolagenowych zawierających komórki nowotworowe i komórki zrębowe
    1. Wygenerować geometrię 3D koncentrycznych pierścieni nowotwór-zrąb zdefiniowanych w kroku 1.2 przy użyciu oprogramowania CAD 3D.
      UWAGA: Wymiary koncentrycznych pierścieni nowotwór-zrąb są określone za pomocą parametrów symulowanych. Końcowe wartości parametrów wymiarowych przedstawiono na Rysunku 3A.
    2. Konwertować plik CAD 3D do formatu STL i wygenerować G-kod dla koncentrycznych pierścieni nowotwór-zrąb przy użyciu konwertera STL-CAD.
      UWAGA: Algorytm generowania G-kodu znajduje się w uwadze do kroku 4.1.2.
    3. Załadować bioatramenty kolagenowe z enkapsulowanymi komórkami, znajdujące się w jednorazowych strzykawkach o pojemności 3 mL, do głowicy drukarki 3D i ustawić temperaturę głowicy oraz platformy na 15 °C.
      UWAGA: Jeśli temperatura głowicy i platformy drukarki wzrośnie powyżej 37 °C, bioatrament ulegnie sieciowaniu i przestanie być drukowalny.
    4. Wczytać wygenerowaną ścieżkę druku do oprogramowania sterującego drukarką 3D.
    5. Klikając przycisk Start, wydrukować bioatramenty kolagenowe zawierające komórki nowotworowe i komórki zrębowe na barierze przepuszczalnej dla gazów zgodnie z wczytanym G-kodem, używając plastikowej igły 18 G przy ciśnieniu pneumatycznym około 20 kPa w temperaturze 15 °C.
    6. Po zakończeniu każdej operacji drukowania ręcznie umieścić wysterylizowane szkiełko podstawowe o wymiarach 22 mm x 50 mm na wierzchu bariery przepuszczalnej dla gazów, aby wytworzyć gradient hipoksji.
      UWAGA: Porównać dwie grupy w zależności od obecności szkiełka (GR+) lub jego braku (GR-), aby zweryfikować powstanie gradientu hipoksji.
    7. Po przygotowaniu trzech hipoksycznych układów cancer-on-chip, przenieść chipy do inkubatora w temperaturze 37 °C na 1 h w celu sieciowania bioatramentów kolagenowych.
  2. Zakończenie procesu wytwarzania i utrzymanie hipoksycznego układu cancer-on-a-chip
    1. Po zakończeniu wszystkich procesów biodruku 3D hipoksycznego układu cancer-on-a-chip, delikatnie docisnąć szkiełka podstawowe na wierzchu barier przepuszczalnych dla gazów za pomocą skrobaka do komórek w celu zapewnienia szczelnego połączenia (Rysunek 4A,B).
      UWAGA: Szkiełko podstawowe i bariera przepuszczalna dla gazów są łączone poprzez wiązanie hydrofobowe bez użycia klejów chemicznych, poprzez proste dociskanie (skrobanie) łączonej części między szkiełkiem a barierą z PDMS.
    2. Wprowadzić 1,5 mL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka do każdego chipa. Aby uniknąć odklejenia się konstrukcji nowotworowej, wprowadzać pożywkę hodowlaną z jednej strony chipa. Przechylać chip, aby umożliwić przepływ pożywki za pomocą pipety.
    3. Wymieniać pożywkę hodowlaną codziennie przez tydzień. Do aspiracji pożywki używać pipety; nie używać pompy ciśnieniowej.

7. Ocena żywotności komórek po drukowaniu

  1. Przygotowanie próbek i traktowanie roztworem kalceiny AM i EthD-1
    1. Podgrzać 1x PBS w łaźni wodnej do 37 °C.
    2. Przygotować roztwór analityczny, dodając 0,75 µL octano-metylestru kalceiny (calcein AM) oraz 3 µL etydinium homodimeru (EthD-1) do 1,5 mL uprzednio podgrzanego PBS.
    3. Ostrożnie odessać całe medium z chipa za pomocą pipety.
    4. Przemyć konstrukt nowotworowy podgrzanym PBS. Napełnić chip 1,5 mL PBS za pomocą pipety i pozostawić na 10 min w temperaturze pokojowej. Aby uniknąć deformacji konstruktu nowotworowego, wprowadzać 1x PBS z jednej strony chipa i przechylać go, aby umożliwić przepływ 1x PBS.
    5. Odessać PBS z chipa; dodać 1,5 mL roztworu analitycznego i inkubować chip w 37 °C przez 20 min, używając folii w celu ochrony przed światłem. Do odessania 1x PBS użyć pipety; nie używać pompy próżniowej.
  2. Obrazowanie żywotności komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
    1. Obserwować i utrwalać obrazy znakowanych komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (Rycina 4C).
      UWAGA: Calcein AM znakuje żywe komórki zieloną fluorescencją (długość fali ~488 nm). EthD-1 generuje sygnał z martwych komórek w postaci czerwonej fluorescencji (długość fali ~594 nm).
    2. Policzyć liczbę żywych i martwych komórek przy użyciu oprogramowania do obrazowania lub otwartoźródłowego programu do przetwarzania obrazów, a następnie obliczyć żywotność na podstawie uzyskanych liczb.

8. Immunofluorescencja w celu walidacji tworzenia się hipoksji centralnej oraz jej wpływu na złośliwość nowotworu

  1. Fiksacja, permeabilizacja i blokowanie konstruktu nowotworowego
    1. Przygotować w temperaturze pokojowej 1x PBS, 4% paraformaldehyd (PFA), 0.1% (v/v) Triton X-100 oraz 2% (w/v) albuminę surowicy bydlęcej (BSA).
    2. Ostrożnie odessać całe medium z chipa za pomocą pipety i wypłukać chip trzy razy 1x PBS. Aby uniknąć deformacji konstruktu nowotworowego, wprowadzać 1x PBS z jednej strony chipów i przechylać je, aby umożliwić przepływ 1x PBS. Pomiędzy każdym etapem płukania pozostawić chip z 1x PBS na 5 min w celu usunięcia pozostałości roztworów.
      UWAGA: 1x PBS odsysano za pomocą pipety, a nie pompy ciśnieniowej.
    3. Za pomocą pipety dodać 500 µL 4% PFA do konstruktu nowotworowego na chipie; pozostawić na 15 min i wypłukać trzy razy 1x PBS, aby utrwalić komórki w konstrukcie nowotworowym.
    4. Potraktować konstrukt nowotworowy 500 µL 0.1% Triton X-100 za pomocą pipety w temperaturze pokojowej przez 5 min i wypłukać trzy razy 1x PBS, aby zsolubilizować i permeabilizować błonę komórkową.
    5. Potraktować konstrukt nowotworowy 500 µL 2% BSA za pomocą pipety w temperaturze pokojowej przez 1 h w celu zablokowania reaktywnych epitopów.
      UWAGA: Przykryć chip folią parafinową, aby zapobiec odparowywaniu.
    6. Po 1 h wypłukać chip trzy razy 1x PBS.
  2. Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przeciwciałami wtórnymi oraz DAPI i obrazowanie struktury za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    1. Przygotować przeciwciała kontrolne izotypowe oraz koktajl przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając przeciwciała w 1x PBS do odpowiednich stężeń roboczych.
      UWAGA: Szczegółowe informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli materiałów. Należy stosować takie same stężenia robocze przeciwciał kontrolnych izotypowych, jak i przeciwciał pierwszorzędowych.
    2. Ostrożnie odessać cały 1x PBS z chipa za pomocą pipety i inkubować chip z 200 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze 4 °C przez noc. Przykryć chipy folią parafinową, aby zapobiec odparowywaniu.
    3. Odessać roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i wypłukać chip trzy razy 1x PBS.
    4. Rozcieńczyć przeciwciała wtórne i DAPI w 1x PBS do pożądanego stężenia roboczego.
      UWAGA: W tym przypadku użyto przeciwciała wtórnego sprzężonego z zieloną fluorescencją w stosunku 1:200. DAPI zastosowano w stosunku 1:1000.
    5. Ostrożnie odessać cały 1x PBS z chipa za pomocą pipety i inkubować chip z 200 µL roztworu przeciwciał wtórnych i DAPI w temperaturze 4 °C przez 3 h. Przykryć chip folią parafinową, aby zapobiec odparowywaniu, a następnie owinąć folią aluminiową, aby zapobiec fotoblaknięciu.
    6. Odessać roztwór przeciwciał wtórnych i DAPI i wypłukać chip trzy razy 1x PBS.
    7. Po zakończeniu etapu barwienia przenieść konstrukt nowotworowy do szalki konfokalnej, delikatnie chwytając go pęsetą.
    8. Zwizualizować i zarejestrować obraz znakowanych komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rycina 5).
      UWAGA: Długość fali mikroskopu konfokalnego dostosowano w zależności od rodzaju znaczników fluorescencyjnych. Szczegółowe informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli materiałów. Aby efektywnie zlokalizować komórki, zaleca się w pierwszej kolejności obserwację jąder konstruktu zabarwionych DAPI. Długości fal wzbudzenia/emisji sygnałów fluorescencyjnych wynosiły 358/461 nm (DAPI, niebieski), 494/517 nm (zielony) oraz 590/617 nm (czerwony). Powiększenia wynosiły 4x, 10x i 20x, dostosowane od najniższego do najwyższego.

9. Analiza statystyczna

  1. Liczenie komórek za pomocą programu do przetwarzania obrazów
    1. Uruchom program do przetwarzania obrazów, aby policzyć liczbę żywych i martwych komórek.
    2. Otwórz pliki obrazów fluorescencyjnych. Kliknij File | Open i zaimportuj obrazy TIFF.
    3. Konwertuj obrazy na 16-bitowe obrazy w skali szarości. Kliknij Image | Type | 16-bit Grayscale.
    4. Dostosuj próg, klikając Image | Adjust | Threshold, a następnie ustaw kolor komórek na czarny.
    5. Rozdziel zlane komórki, klikając Process | Binary | Watershed, aby uzyskać precyzyjne liczenie komórek.
    6. Policz liczbę komórek, klikając Analyze, a następnie trzykrotnie Analyze Particles; oblicz średnią i przedstaw dane jako średnia ± błąd standardowy.
      UWAGA: Markery immunofluorescencyjne analizowano poprzez porównanie intensywności fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hipoksyjny model nowotworu na chipie (cancer-on-a-chip) opracowano z wykorzystaniem technologii komputerowego wspomagania 3D biodruku komórkowego, aby odtworzyć hipoksję oraz patologię związaną z nowotworami (Rysunek 1). Transport i zużycie tlenu zasymulowano przy użyciu modelu geometrii 3D. Chip zaprojektowano w formie koncentrycznych pierścieni, aby naśladować radialną dyfuzję i wyczerpywanie się tlenu w tkankach nowotworowych (Rysunek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisujemy proces wytwarzania niedotlenionego nowotworu na chipie opartego na technologii drukowania komórek 3D. Powstawanie gradientu hipoksyjnego w zaprojektowanym chipie zostało przewidziane za pomocą symulacji komputerowych. Środowisko, które może wywołać niejednorodny gradient hipoksyjny, zostało odtworzone za pomocą prostej strategii łączącej wydrukowaną w 3D barierę przepuszczalną dla gazów i szklaną pokrywę. Związane z niedotlenieniem patologiczne cechy glejaka, w tym pseudopalisada i niewielka popul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Research Foundation of Korea (NRF) finansowane przez Ministerstwo Edukacji (nr 2020R1A6A1A03047902 i NRF-2018H1A2A1062091) oraz rząd Korei (MSIT) (No. NRF-2019R1C1C1009606 i NRF-2019R1A3A3005437).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
komórki
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowejPromocellC-12200
U-87 MG komórkiATCCATCC HTB-14
Jednorazowe
0,2 μ m filtr strzykawkowySartorius16534-K
10 ml jednorazowa strzykawkaJung Rim10ml 21G32
10 ml szklana fiolkaHubenaA0039
10 ml Serologiczna końcówka do pipetySPL lifescience91010
15 mL rurka stożkowaSPL lifescience50015
18G igła z tworzywa sztucznego inżynieriaMusashiPN-18G-B
20G plastikowa stożkowa końcówka dozującaMusashi engineeringTPND-20G-U
22x50 szklana pokrywaMARIENFIELD0101142
25 mL Serologiczna końcówka do pipetySPL lifescience90125
mL jednorazowe strzykawkiHENKE-JET4020-X00V0
40 µ m Sitko do komórekFalcon352360
5 ml Serologiczna końcówka do pipetySPL lifescience91005
50 ml rurka stożkowaSPL lifescience50050
50 mL Serologiczna końcówka do pipetySPL lifescience90150
50N dysza precyzyjnaMusashi engineeringHN-0.5ND
Folia aluminiowaSINKWANG
Końcówki kapilarneGilsonCP1000
Skrobak do komórekSPL lifescience90030
Naczynie konfokalneSPL lifescience200350
ParafilmBemisPM996
Wstępnie powlekane szkiełko histologiczneMATSUNAMIMAS-11
ZbiornikSPL lifescience23050
Kolba do hodowli komórkowych T-75SPL lifescience70075
Sprzęt
3DX drukarkaT& R Autoklaw Biofab
Wirówka JEIOTECHAC-12
Cyrozen1580MGR
Konfokalna mikroskopia laserowaOlympus Life ScienceFV 1000
Mikroskop fluorescencyjnyFISHER SCEINTIFICO221S366
KleszczKorea Ace ScientificHC.203-30
Wskaźnik dłoni licznikKTRIO
HemocytometrMARIENFIELD0650030
InkubatorPanasonicMCO-170AIC
Komora laminarnaDAECHUNG SCIENCECB-BMMS C-001
Metalowa strzykawkaIWASHITA engineeringSUS BARREL 10CC
Nożyczki operacyjneHiroseHC.13-122
PiekarnikJEIOTECHOF-12, H070023
Pipeta wyporowaGILSONNJ05652
LodówkaSAMSUNGCRFD-1141
Mikser VoltexDAIHAN scientificVM-10
Łaźnia wodnaDAIHAN SCIENTIFICWB-11
Oczyszczacz wodyWASSER LABDI-GR
Materiały
0,25 % Trypsyna-EDTAGibco25200-072
10x PBSIntronIBS-BP007a
4% ParaformaldehydBiosesang
70% EtanolDaejung4018-4410
Przeciwciało anty-CD31Abcamab28364
Przeciwciało anty-HIF-1 alfaAbcamab16066
Przeciwciało anty-SHMT2/SHMTAbcamab88664
Przeciwciało anty-SOX2Abcamab75485
Albumina surowicy bydlęcejThermo scientificJ10857-22
Kolagen ze skóry świniDalim tissenPC-001-1g
DAPI (4',6- Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)ThermofisherD1306
Endothelial Cell Growth Medium-2PromocellC22011
Płodowa surowica bydlęcaGibco12483-020
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H + L), Alexa Fluor 488TheromofisherA-11001
Kozia anty-królicza IgG (H + L) Adsorbowana krzyżowo wtórna Przeciwciało, Alexa Fluor 594TheromofisherA-11012
Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy" s Zmodyfikowany hyklon Eagle Medium (DMEM)SH30243-0
Kwas solnySigma-Aldrich311413-100ML
Zestaw do oznaczania żywych/martwychzwierząt InvitrogenL3224
Mysz IgG1, kappa monoklonalny [15-6E10A7] - Kontrola izotypuAbcamab170190
Penicylina/streptomycynaGibco15140-122
Czerwień fenolowa roztwórSigma-AldrichP0290-100ML
Poli(etylen-octan winylu) Poly science06108-500
PolidimetylosiloksanDowhitechsylgard 184
IgG królika, poliklonalny - Kontrola izotypuAbcamab37415
Roztwór wodorotlenku soduSamchunS0610
Triton X-100BiosesangTRI020-500-50
Trypan BlueSigma-AldrichT8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5aCOMSOL AB
IMS beameroprogramowanie wewnętrzne
Pakiet SolidWorks DassaultSystems SolidWorks Corporation
3

Bibliografia

  1. Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157(2019).
  2. Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4(2019).
  3. Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
  4. Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
  5. Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16(2018).
  6. Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  7. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665(2013).
  8. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  9. Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  10. Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107(2020).
  11. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382(2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  13. Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
  14. Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengineering. 4 (1), 10(2017).
  15. Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
  16. Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
  17. Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
  18. Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
  19. Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014(2012).
  20. Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003(2020).
  21. Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Drukowanie kom rek 3Dkoncentryczne pier cienie z dormantnego zr bu nowotworowegobariera przepuszczalna dla gaz wzneutralizowany pregiel kolagenowyodlewanie bariery z PDMSpo wi calna forma z PEVAekspresja HIF1 alfakom rki SHMT2 dodatniekom rki SOX2 dodatnie
Drukowany w 3D hipoksyjny rak na chipie do rekapitulacji patologicznej progresji raka litego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.