Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61950

⸱

9 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Chemistry, Azusa Pacific University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy test biologiczny z użyciem bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) do testowania wcześniej zsyntetyzowanych oksymów spirocyklicznych.

Streszczenie

Spirocykliczne heterocykle zostały ostatnio opisane w literaturze jako potencjalne leki do terapii raka. Synteza tych nowatorskich ortogonalnych układów pierścieniowych jest wyzwaniem. Niedawno opublikowano skuteczną metodologię syntezy tych związków, która opisywała syntezę w fazie stałej w czterech etapach, a nie jak wcześniej podawano, w pięciu etapach. Zaletą tej krótszej syntezy jest wyeliminowanie stosowania toksycznych odczynników. Stwierdzono, że żywica na bazie łącznika o niskim obciążeniu Regenerating Michael (REM) ma kluczowe znaczenie w syntezie, ponieważ wersje o wysokim obciążeniu zapobiegały dodawaniu odczynników zawierających duże łańcuchy boczne fenylowe i aromatyczne. Kolorymetryczny test bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT) zastosowano do zbadania cytotoksyczności stężeń mikromolowych tych nowych cząsteczek spirocyklicznych in vitro. MTT jest łatwo dostępny na rynku i daje stosunkowo szybkie, wiarygodne wyniki, co czyni ten test idealnym dla tych spirocyklicznych heterocykli. Badano ortogonalne struktury pierścieniowe, a także furfuryloaminę (prekursor w metodzie syntezy zawierający podobny 5-członowy motyw pierścieniowy).

Wprowadzenie

Małocząsteczkowe hamowanie interakcji myszy z dwuminutowym homologiem 2 (MDM2) ubikwityny ubikwityny (MDM2) z p53 przywraca indukcję apoptozy komórek nowotworowych za pośrednictwem p531,2,3. MDM2 jest negatywnym regulatorem szlaku p53 i często ulega nadekspresji w komórkach nowotworowych4,5,6,7,8,9. Ostatnie badania krystalograficzne i biochemiczne wykazały, że małe cząsteczki zawierające szkielet spirocykliczny mogą skutecznie hamować interakcje MDM2-p5310. Struktura spirocykliczna (Rysunek 1, zacieniowany na niebiesko) jest uważany za motyw uprzywilejowany, ponieważ derywatyzacja tego sztywnego ortogonalnego systemu pierścieniowego doprowadziła do odkrycia nowych leków terapeutycznych. Dostęp do tej interesującej architektury stanowi wyzwanie przy użyciu tradycyjnych technik syntezy organicznej. Chociaż efekty terapeutyczne cząsteczek spirocyklicznych w układach biologicznych zostały już zbadane, synteza tych cząsteczek jest nadal uciążliwym procesem. Niepożądane produkty uboczne, stosowanie trudnych warunków i niebezpieczne metale przejściowe są często problematyczne.

Potencjalne wykorzystanie motywu spirocyklicznego w rozwoju leków doprowadziło do opracowania protokołu wykorzystującego syntezę fazy stałej do generowania biblioteki cząsteczek z motywem oprócz innych wymiennych grup funkcyjnych11,12. Separację produktów i reagentów między etapami można osiągnąć po prostu za pomocą łącznika REM przymocowanego do kulki żywicy i naczynia filtrującego do fazy stałej. Ograniczyłoby to liczbę kroków i potencjalnie zwiększyłoby plony. To syntetyczne podejście może doprowadzić do powstania szerokiej gamy potencjalnych kandydatów na leki. Jednak skuteczność tych cząsteczek w systemie biologicznym wymagałaby dalszych badań.

Aby określić cytotoksyczność tych związków spirocyklicznych, zastosowano test MTT13,14. Metoda ta mierzy żywotność komórek i może być stosowana do pośredniego określania cytotoksyczności komórek. Różne stężenia inhibitorów dodano do hodowanych komórek na 96-dołkowej płytce, a proporcję żywych komórek mierzono za pomocą analizy kolorymetrycznej zakresu redukcji żółtego MTT przez dehydrogenazy mitochondrialne do fioletowego związku formazanu (Figura 2). Aktywność jest najczęściej podawana jako wartość IC50 - stężenie, przy którym wzrost komórek jest zahamowany o 50% w porównaniu z nieleczoną kontrolą. W artykule opisano protokół testu MTT oraz wstępne wyniki tych nowych cząsteczek spirocyklicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Kilka substancji chemicznych i odczynników biologicznych używanych w tym protokole jest toksycznych i rakotwórczych. Przed użyciem należy zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Przed rozpoczęciem eksperymentu należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (okulary ochronne zatwierdzone przez Administrację Bezpieczeństwa i Zdrowia w Pracy, odpowiednie rękawice, fartuchy laboratoryjne, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami). Ponadto należy przyjąć odpowiednie praktyki bezpieczeństwa podczas przeprowadzania syntezy i obchodzenia się z toksycznymi chemikaliami i odczynnikami (dygestoria).

1. Synteza w fazie stałej spirocyklicznych heterocykli 6 i 7

UWAGA: Synteza została oparta na wcześniej opublikowanych pracach11,12. Zaktualizowany protokół ujawnia, że katalizowane fluorkiem tetrabutyloamonu otwarcie pierścienia trójpierścieniowego heterocyklu nie było potrzebne, a tym samym jego eliminacja skraca procedurę syntezy.

  1. Wykonaj dodawanie furfuryloaminy przez Michaela do łącznika REM (czas trwania: 25 min setup + 24 h czasu reakcji).
    1. Dodać 1 g (1 ekwiwalent [ekwiwalent]) żywicy REM, 20 ml (20 ekwiwalentów) dimetyloformamidu (DMF) i 2,4 ml furfuryloaminy do naczynia reakcyjnego w fazie stałej o pojemności 25 ml. Mieszać naczynie reakcyjne w temperaturze pokojowej przez 24 godziny po rozpoczęciu reakcji.
      UWAGA: Upewnij się, że żywica jest dokładnie wymieszana, aby żywica nie osiadła na dnie naczynia.
    2. Przemyć żywicę DMF 1x po zakończeniu reakcji. Następnie przemyj 4x, na przemian z dichlorometanem (DCM) i metanolem. Po przemyciu dokładnie wysuszyć żywicę w naczyniu reakcyjnym.
  2. Wykonaj tandemową addycję Michaela/cykloaddycję 1,3-dipolarną (czas trwania: ustawienie 25 min + czas reakcji 48 godzin).
    1. Do suchej żywicy dodać 1,48 ml (5 ekwiwalentów) trietyloaminy (TEA), 0,637 g (2 ekwiwalenty) nitroolefiny i 10 ml suchego toluenu do naczynia reakcyjnego.
    2. Następnie dodać 1,085 ml (4 ekwiwalenty) chlorku trimetylosililu (TMSCl) do naczynia reakcyjnego w dobrze wentylowanym dygestorium.
      UWAGA: Ponieważ w wyniku tej reakcji powstaje gaz HCl, nie należy zakręcać naczynia reakcyjnego, dopóki gaz nie zostanie uwolniony pod wyciągiem.
    3. Szczelnie zakryć naczynie reakcyjne i mieszać w temperaturze pokojowej przez 48 h.
      UWAGA: Upewnij się, że żywica dokładnie wymieszała się z odczynnikami.
    4. Użyj 5 ml metanolu, aby wygasić reakcję.
    5. Opróżnij naczynie, aby usunąć roztwór, a następnie przemyj 4x, na przemian DCM i metanolem. Po przemyciu dokładnie wysuszyć żywicę w naczyniu reakcyjnym.
  3. Przeprowadzić N-alkilację heterocyklu związanego z żywicą w celu wytworzenia czwartorzędowej aminy (czas trwania: 10 min ustawienie + 24 godziny czasu reakcji).
    1. Do suchej żywicy w naczyniu reakcyjnym dodać 5 ml DMF i 10 równoważników halogenku alkilu i mieszać w temperaturze pokojowej przez 24 godziny
      UWAGA: Upewnij się, że odczynniki dokładnie wymieszały się z żywicą.
    2. Przemyć żywicę DMF 1x po zakończeniu reakcji. Następnie używaj naprzemiennie DCM i metanolu do mycia 4x. Po przepłukaniu wysuszyć żywicę w naczyniu reakcyjnym.
  4. Przeprowadzić β-eliminację czwartorzędowej aminy do rozszczepienia z nośnika polimerowego (czas trwania: 15 min setup + 24 h czasu reakcji).
    1. Do suchej żywicy w naczyniu reakcyjnym dodać 3 ml DCM i 1,49 ml (odpowiednik 5) herbaty, aby odciąć heterocykl od nośnika polimerowego.
    2. Mieszać mieszaninę reakcyjną przez 24 godziny, aby zapewnić dokładne wymieszanie żywicy z roztworem. Umyć 4x, na przemian z DCM i metanolem. Zebrać elucję ze wszystkich płukanek i zagęścić przez odparowanie rotacyjne.
    3. Rozcierać metanolem w celu oczyszczenia oksymu spirocyklicznego. Żywicę należy dokładnie wysuszyć w naczyniu reakcyjnym po przepłukaniu w celu ponownego użycia w przyszłych eksperymentach.

2. Test cytotoksyczności przy użyciu MTT 14

  1. Przygotować 20 ml roztworu MTT o stężeniu 5 mg/mL, używając sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 0,9% NaCl w wodzie) jako rozcieńczalnika. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Następnie należy przygotować roztwór MTT rozcieńczony w stosunku 1:1 z kroku 2.1 w pożywce do hodowli komórkowych bez surowicy (DMEM).
  2. Przygotować po 1 ml roztworu podstawowego w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml po 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM i 0,01 μM badanych związków w dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 200 μl na dawkę roztworów roboczych badanych związków, rozcieńczając podstawowe stężenia 1:1000 w podłożu bez surowicy w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  3. W kapturze do hodowli tkankowej nasiona COS-7 (komórki nerkowe afrykańskiej zielonej małpy, nerka Cercopithecus aethiops) w kompletnym podłożu [DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)] na płaskodennych, 96-dołkowych płytkach poddanych hodowli tkankowej o stężeniu 4 × 103 komórek/200 μl na studzienkę przy użyciu pipetora wielokanałowego. Komórki COS-7 zostały wybrane, ponieważ (1) są to powszechnie używane komórki do testów cytotoksyczności i (2) były już dostępne w instytucji.
  4. Inkubować komórki COS-7 przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  5. Odessać supernatant ze studzienek za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej. Dozować komórki trzykrotnie ze związkami badanymi, stosując roztwory robocze przygotowane w kroku 2.2 (patrz Tabela 1). Inkubować komórki zgodnie z opisem w kroku 2.4.
  6. Odessać supernatant ze studzienek. Dodaj 200 μl roztworu MTT do każdego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 4 godziny.
  7. Delikatnie odessać supernatant ze studzienek, nie naruszając fioletowych kryształów formazanu. Dodaj 200 μl DMSO do każdego dołka, aby rozpuścić fioletowe kryształy formazanu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  8. Zmierz absorbancję przy 590 nm14 lub 600 nm dla każdej studzienki za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Używaj studzienek bez komórek jako tła i uśredniaj wartość absorbancji. Uśrednioną wartość tła absorbancji należy odjąć od wartości absorbancji każdego studzienki poddanej działaniu substancji. Znormalizuj dane jako procent średniej wartości dawki zerowej (uśrednij trzy wartości dawki zerowej). Wykreśl dane na osi y: liniowa (% względnej żywotności komórki); Oś x: log (stężenie). Wykreśl każdą serię jako pojedynczą krzywą (np. dane potrójne powinny mieć 3 krzywe)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Spirocykliczne oksymy 6 i 7 zsyntetyzowano przy użyciu zmodyfikowanego protokołu (Rycina 1). Addycja Michaela furfurylaminy do łącznika REM 1b doprowadziła do otrzymania polimeru związanego z żywicą 2. Postęp reakcji monitorowano za pomocą spektroskopii w podczerwieni (IR), wykrywając zanik estru α,β-nienasyconego przy 1722 cm-1 (Rycina 3). Żywica 4 z wiązaniem spirocyklicznym została otrzymana z 2 poprzez przejściowy produkt pośredni 3. Hydroliza met...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Synteza związków spirocyklicznych opierała się na wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przez to laboratorium, ale z pewnymi modyfikacjami (ryc. 1)11,12. Postęp każdego etapu reakcji był monitorowany za pomocą spektroskopii IR. Dodanie przez Michaela łącznika REM 1 z furfuryloaminą zapewnia wiązanie polimeru 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Z po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu Faculty Research Council dla K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. i J.F.M. są laureatami stypendium Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. i B.M.R. są laureatami stypendiów STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Jesteśmy wdzięczni dr Matthew Berezukowi i dr Philipowi Coxowi za wskazówki dotyczące testów biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< SILNE>KOMÓRKI< / silne>
komórki COS-7 (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651Komórki nerkowe afrykańskiej zielonej
małpyCHEMIKALIA
1-bromooktanoweSigma-Aldrich152951Halogenek alkilu
AllylbromekSigma-Aldrich337528Halomek alkilowy
BenzymekSigma-AldrichB17905Halogenek alkilu
CisplatynaCayman Chemical13119Kontrola cytotoksyczności
Dichlorometan (DCM)Rozpuszczalnik Sigma-Aldrich270997
Dimetyloformamid (DMF)Rozpuszczalnik 227056 Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich276855Rozpuszczalnik
DMEM, wysoka zawartość glukozy, z L-glutaminąGenesee Scientific25-500Pożywka do hodowli komórkowych
FBS (płodowa surowica bydlęca)Sigma-AldrichF4135Pożywka do hodowli komórkowych
FurfurylaminaAcros Organics119800050odczynnik 
JodometanSigma-Aldrich289566halogenek alkilowy
Metanol Sigma-Aldrich34860Rozpuszczalnik
MTT ((bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu)EMDMilliporeCalbiochem 475989-1GMOdczynnik
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Genesee Scientific25-507Pożywka do hodowli komórkowych
Żywica REMNova Biochem8551010005Nośnik polimerowy; 0,500 mmol/g Loading
trans-β-nitrostyrenSigma-AldrichN26806Odczynnik nitro-olefinowy
ToluenSigma-Aldrich244511Rozpuszczalnik
Trietyloamina (TEA)Sigma-AldrichT0886Odczynnik do beta-eliminacji
Chlorek trimetylosililu (TMSCl)Odczynnik do 386529 Sigma-Aldrich; UWAGA - bardzo niestabilny; tworzy HCl gaz
SZKŁO/OPRZYRZĄDOWANIE
25 mL naczynie reakcyjne fazy stałejChemglassCG-1861-02Szkło z filtrem
96 Czytnik płytek studzienkowychPromega (Turner Biosystems)9310-011Instrument
AVANCE III NMR SpektrometrBrukerN/AInstrument; 300 MHz; Rozpuszczalniki: CDCl3 i CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZAInstrument
Wytrząsarka nadgarstkowaBurrell Scientific757950819Instrument

Bibliografia

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
  2. Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
  3. Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
  4. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
  5. Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
  6. Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
  7. Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
  8. Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  9. Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
  10. Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
  11. Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).
  13. Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
  14. MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza na fazie sta ejtest cytotoksyczno ci MTTspektroskopia w podczerwienitest ywotno ci kom rekprekursor furfurylaminycisplatyna jako kontrola pozytywnaregeneruj cy cznik Michaelaywica o niskim stopniu obci enia
Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.