Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61957

⸱

11 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół rozwoju i wykorzystania modelu stresu oksydacyjnego poprzez traktowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocąH2O2, analizując morfologię komórek, żywotność, gęstość, glutation i poziom UCP-2. Jest to użyteczny model do badania działania przeciwutleniającego białek wydzielanych przez komórki transpozonowe w celu leczenia zwyrodnienia neuroretinalnego.

Streszczenie

Stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach zwyrodnieniowych, w tym w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), patologii, która dotyka ~30 milionów pacjentów na całym świecie. Prowadzi to do zmniejszenia liczby czynników neuroprotekcyjnych syntetyzowanych przez nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE), np. czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego (PEDF) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), a następnie utraty komórek RPE, a ostatecznie śmierci fotoreceptorów i komórek zwojowych siatkówki (RGC). Stawiamy hipotezę, że odtworzenie neuroprotekcyjnego i neurogennego środowiska siatkówki przez podsiatkówkowy przeszczep transfekowanych komórek RPE z nadekspresją PEDF i GM-CSF może potencjalnie zapobiegać zwyrodnieniu siatkówki poprzez łagodzenie skutków stresu oksydacyjnego, hamowanie stanu zapalnego i wspieranie przeżycia komórek. Korzystając z systemu transpozonów Sleeping Beauty (SB100X), ludzkie komórki RPE zostały transfekowane genami PEDF i GM-CSF i wykazały stabilną integrację genów, długoterminową ekspresję genów i wydzielanie białek za pomocą qPCR, western blot, ELISA i immunofluorescencji. Aby potwierdzić funkcjonalność i siłę działania PEDF i GM-CSF wydzielanych przez transfekowane komórki RPE, opracowaliśmy test in vitro w celu ilościowego określenia redukcji stresu oksydacyjnego wywołanego przezH2O2na komórkach RPE w hodowli. Ochronę komórek oceniano, analizując morfologię komórki, gęstość, wewnątrzkomórkowy poziom glutationu, ekspresję genu UCP2 i żywotność komórek. Zarówno transfekowane komórki RPE z nadekspresją PEDF i / lub GM-CSF, jak i komórki nietransfekowane, ale wstępnie potraktowane PEDF i / lub GM-CSF (dostępne na rynku lub oczyszczone z transfekowanych komórek) wykazywały znaczną ochronę komórek przeciwutleniających w porównaniu z kontrolami nieleczonymi. Obecny modelH2O2-Model jest prostym i skutecznym podejściem do oceny działania przeciwutleniającego czynników, które mogą być skuteczne w leczeniu AMD lub podobnych chorób neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

Opisany tutaj model oferuje użyteczne podejście do oceny skuteczności środków biofarmaceutycznych w zmniejszaniu stresu oksydacyjnego w komórkach. Wykorzystaliśmy model do zbadania ochronnego wpływu PEDF i GM-CSF na stres oksydacyjny za pośrednictwemH2O2na komórki nabłonka barwnikowego siatkówki, które są narażone na wysoki poziomO2 i światło widzialne, oraz fagocytozę błon zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, generując znaczne poziomy reaktywnych form tlenu (ROS)1, 2. Uważa się, że są one głównym czynnikiem przyczyniającym się do patogenezy beznaczyniowego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (aAMD)3,4,5,6,7,8. Poza tym następuje spadek czynników neuroprotekcyjnych syntetyzowanych przez RPE, w szczególności czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego (PEDF), insulinopodobnych czynników wzrostu (IGF) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF), co prowadzi do dysfunkcji i utraty komórek RPE, a następnie do śmierci fotoreceptorów i komórek zwojowych siatkówki (RGC)3,4,5. AMD jest złożoną chorobą, która wynika z interakcji między czynnikami metabolicznymi, funkcjonalnymi, genetycznymi i środowiskowymi4. Brak leczenia aAMD jest główną przyczyną ślepoty u pacjentów w wieku powyżej 60 lat w krajach uprzemysłowionych9,10. Odtworzenie neuroprotekcyjnego i neurogennego środowiska siatkówki poprzez podsiatkówkowe przeszczepienie genetycznie zmodyfikowanych komórek RPE z nadekspresją PEDF i GM-CSF może potencjalnie zapobiegać zwyrodnieniu siatkówki poprzez łagodzenie skutków stresu oksydacyjnego, hamowanie stanu zapalnego i wspieranie przeżycia komórek11,12,13,14,15,16. Mimo że istnieje kilka metodologii dostarczania genów do komórek, wybraliśmy niewirusowy, nadpobudliwy system transpozonów Sleeping Beauty, aby dostarczyć geny PEDF i GM-CSF do komórek RPE ze względu na jego profil bezpieczeństwa, integrację genów z genomem komórek gospodarza i skłonność do integracji dostarczonych genów w miejscach nieaktywnych transkrypcyjnie, jak pokazaliśmy wcześniej17, 18,19.

Stres oksydacyjny w komórkach hodowanych in vitro może być indukowany przez kilka czynników utleniających, w tym nadtlenek wodoru (H2O2), 4-hydroynonenal (HNE), tertbutylohydronadtlenek (tBH), wysokie napięcia tlenu i światło widzialne (pełne spektrum lub promieniowanie UV)20,21. Wysokie napięcie tlenu i światło wymagają specjalnego sprzętu i warunków, co ogranicza możliwość przenoszenia do innych systemów. Czynniki takie jakH2O2, HNE i tBH indukują nakładające się na siebie zmiany molekularne i komórkowe stresu oksydacyjnego. WybraliśmyH2O2do przetestowania aktywności przeciwutleniającej PEDF i GM-CSF, ponieważ jest to wygodne i biologicznie istotne, ponieważ jest wytwarzane przez komórki RPE jako reaktywny produkt pośredni tlenu podczas fagocytozy zewnętrznego segmentu fotoreceptora22 i znajduje się w tkankach oka in vivo23. Ponieważ utlenianie glutationu może być częściowo odpowiedzialne za produkcjęH2O2w oku, w naszych badaniach przeanalizowaliśmy poziomy GSH/glutationu, które są związane ze stresem oksydacyjnym wywołanym przezH2O2i zdolnością regeneracyjną komórek21,22. Analiza poziomu glutationu jest szczególnie istotna, ponieważ uczestniczy on w antyoksydacyjnych mechanizmach ochronnych w klasie eye24. Narażenie naH2O2 jest często używane jako model do badania podatności na stres oksydacyjny i aktywności przeciwutleniającej komórek RPE1,25,26,27,28,29,30, a dodatkowo wykazuje podobieństwa do uszkodzeń spowodowanych stresem oksydacyjnym wywołanym światłem, "fizjologicznym" źródłem stresu oksydacyjnego21.

Aby ocenić funkcjonalność i skuteczność czynników neuroprotekcyjnych, opracowaliśmy model in vitro, który pozwala na analizę w celu ilościowego określenia antyoksydacyjnego wpływu czynników wzrostu wyrażanych przez komórki genetycznie zmodyfikowane do nadekspresji PEDF i GM-CSF. Tutaj pokazujemy, że komórki RPE transfekowane genami PEDF i GM-CSF są bardziej odporne na szkodliwe działanieH2O2niż nietransfekowane komórki kontrolne, o czym świadczy morfologia komórki, gęstość, żywotność, wewnątrzkomórkowy poziom glutationu i ekspresja genu UCP2, który koduje mitochondrialne białko rozprzęgające 2, które, jak wykazano, redukuje reaktywne formy tlenu (ROS)31.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury dotyczące pobierania i wykorzystywania ludzkich oczu zostały zatwierdzone przez Kantonalną Komisję Etyczną ds. Badań (nr 2016-01726).

1. Izolacja komórek i warunki hodowli

  1. Ludzka linia komórkowa ARPE-19
    1. Hodować 5 x 105 komórek ARPE-19, ludzkiej linii komórkowej RPE, w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham´s F-12) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 80 U/mL penicyliny, 80 µg/mL streptomycyny oraz 2,5 µg/mL amfoterycyny B (pożywka kompletna) w temperaturze 37 °C w atmosferze z 5% CO2 i 95% powietrza w kolbie T75 (inne gęstości komórek podano w Tabeli 1).
    2. Wymieniać pożywkę trzy razy w tygodniu.
    3. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie około 90% (ocena jakościowa), odessać pożywkę i przemyć komórki sterylnym 1x PBS.
    4. Inkubować komórki z 5% roztworem Trypsyny-2% EDTA przez 7-10 min w temperaturze 37 °C (objętości podano w Tabeli 1). Kontrolować odrywanie komórek wizualnie.
    5. Zatrzymać trypsynizację poprzez dodanie pożywki kompletnej zawierającej 10% FBS (objętości podano w Tabeli 1).
    6. Przeprowadzić transfekcję komórek (patrz krok 2. protokołu), poddać komórki subkulturze w stosunku 1:10 (raz w tygodniu) lub wysiać na płytkę 96-dołkową zgodnie z poniższym opisem (patrz kroki 3.3 i 3.4 protokołu).
Pożywka (ml)
Powierzchnia (cm²) Gęstość wysiewu komórek ARPE-19 (komórek/dołek)ZastosowanieDo hodowli komórkowejAby zatrzymać działanie trypsynyObjętość trypsyny (mL)
kolba T75755,00,000Wzrost komórek ARPE-191073
Płytka 6-dołkowa 9.61,00,000Wysiew transfektowanych komórek ARPE-19310.5
Płytka 24-dołkowa 250,000Wysiewy transfektowanych komórek hRPE10.80.2
Płytka 96-dołkowa0.325 000 do eksperymentów nad stresem oksydacyjnym z wykorzystaniem transfekowanych komórek (Rys. 1)Doświadczenia z wykorzystaniem stresu oksydacyjnego0.2
3 000 do eksperymentów dotyczących stresu oksydacyjnego z wykorzystaniem komórek nietransfekowanych oraz białek (Ryc. 1)

Tabela 1: Objętości hodowli komórkowych.Zalecane objętości mediów dla płytek i kolb do hodowli komórkowych w przypadku hodowli komórek ARPE-19 oraz pierwotnych ludzkich komórek RPE.

  1. Pierwotne ludzkie komórki RPE
    1. Wyizolować pierwotne ludzkie komórki RPE zgodnie z opisem Thumann i wsp.17 i hodować je w pożywce kompletnej uzupełnionej o 20% FBS.
    2. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji (monitorowanej wizualnie), zmniejszyć stężenie FBS do 1%, aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi.
    3. Przeprowadzić transfekcję komórek (patrz krok 2 protokołu) lub wysiać je na płytkę 96-dołkową zgodnie z poniższym opisem (patrz kroki 3.3 i 3.4 protokołu).
      UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały zebrane z hodowli komórek RPE uzyskanych z oczu czterech ludzkich dawców. Tabela 2 szczegółowo opisuje dane demograficzne dawców z Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Oczy zostały enukleowane 12,7 ± 5,7 h (średnia ± SD) po śmierci, po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z Deklaracją Helsińską.
Niewiekpłećczas od śmierci do utrwalenia (godziny)koniec z izolacjąhodowlahodowlaSymbol na wykresie
(dni)przed transfekcją (dni)po transfekcji (dni)
280M20.7814036Koncepcja równowagi statycznej; ΣFx=0; diagram; analiza równowagi i badanie bilansu sił
386F12.888545Symbol czarnego równobocznego trójkąta skierowanego w dół; równowaga statyczna; schemat geometryczny.
486F8.5526133Symbol nabla, ∇, reprezentuje wektorowy operator różniczkowy w rachunku różniczkowym, powiązany z gradientem, rotacją i dywergencją.
883F8.961827Symbol delta (Δ), reprezentujący zmianę w równaniach matematycznych; stosowany w analizie matematycznej i fizyce.
średnia83.812.76.867.360.3
SD2.95.71.557.049.1

​Tabela 2: Dane demograficzne ludzkich dawców komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.

2. Elektroporacja komórek ARPE-19 i pierwotnych ludzkich komórek RPE

  1. Przeprowadź trypsynizację komórek ARPE-19 lub pierwotnych ludzkich komórek RPE zgodnie z opisem w krokach 1.1.3-1.1.5 protokołu.
  2. Wykonaj elektroporację przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do transfekcji (patrz Tabela materiałów).
    1. W celu transfekcji komórek ARPE-19 należy odwołać się do publikacji Johnen et al.32, a dla pierwotnych hRPE do Thumann et al.17. W skrócie: zawiesić 1 x 105 komórek ARPE-19 lub 5 x 104 pierwotnych komórek hRPE w 11 µL buforu R i dodać 2 µL mieszaniny plazmidów zawierającej 0,03 µg transpozazy pSB100X33 oraz 0,47 µg transpozonu pT2-CMV-PEDF-His lub pT2-CMV-GMCSF-His (stosunek transpozaza:transpozon 1:16). Dla komórek poddanych podwójnej transfekcji PEDF i GM-CSF zastosować stosunek 1:16:16 (0,03 µg pSB100X, 0,47 µg pT2-CMV-PEDF-His oraz 0,47 µg pT2-CMV-GMCSF-His). Zastosować następujące parametry elektroporacji: dwa impulsy 1350 V przez 20 ms (szerokość impulsu) dla komórek ARPE-19; dwa impulsy 1100 V przez 20 ms dla komórek pierwotnych.
  3. Wysiać 1 x 105 transfekowanych komórek ARPE-19 lub 5 x 104 transfekowanych pierwotnych komórek hRPE odpowiednio na płytki 6-dołkowe i 24-dołkowe, w medium uzupełnionym o 10% FBS bez antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych. Penicylinę (80 U/mL), streptomycynę (80 µg/mL) oraz amfoterycynę B (2,5 µg/mL) dodać podczas pierwszej wymiany medium 3 dni po transfekcji.
  4. Wzrost komórek określać poprzez cotygodniowe monitorowanie mikroskopowe. Wydajność transfekcji monitoruje się poprzez analizę ekspresji genów metodą RT-PCR oraz sekrecję białek metodą ELISA i WB (metody wyjaśnione w Materiałach uzupełniających).
    UWAGA: Wydajność transfekcji można ocenić po raz pierwszy, gdy komórki osiągną konfluencję, tj. odpowiednio po ok. 7 dniach dla komórek ARPE-19 i po 4 tygodniach dla pierwotnych komórek hRPE od momentu transfekcji.
  5. Wysiać komórki na płytkę 96-dołkową zgodnie z poniższym opisem (patrz krok 3.5 protokołu).

3. Indukcja stresu oksydacyjnego (leczenie H2O2) i neuroprotekcja (leczenie PEDF i/lub GM-CSF)

  1. Przygotowanie pożywki warunkującej z transfektowanych komórek ARPE-19
    1. Należy użyć komórek ARPE-19 transfektowanych genami PEDF, GM-CSF lub obydwoma (patrz krok 2 protokołu); hodować komórki przez 28 dni zgodnie z opisem w kroku 1.1 protokołu.
    2. W 28. dniu po transfekcji należy poddać komórki trypsynizacji (patrz kroki 1.1.3-1.1.5 protokołu), policzyć komórki za pomocą komory Neubauera34,35 i wysiać 5 x 105 komórek do kolb T75 w pożywce kompletnej, zgodnie z opisem w kroku 1.1.1 protokołu. Pożywkę należy wymienić, gdy kultura komórek osiągnie około 80% konfluencji (mniej więcej po 1 tygodniu; weryfikacja jakościowa). Pożywkę należy zebrać po 24 h.
    3. Pożywkę przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Wystarczające stężenie rekombinowanego PEDF i GM-CSF w pożywce warunkującej zweryfikowano metodą WB i oznaczono ilościowo za pomocą testu ELISA, zgodnie z opisem w Materiałach uzupełniających.
  2. Oczyszczanie PEDF i GM-CSF z pożywki warunkującej z transfektowanych komórek ARPE-19
    1. Pożywkę zebraną w kroku 3.1.2 należy odwirować z prędkością 10 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
    2. Do oczyszczania białek z tagiem His należy zastosować Ni-NTA superflow (patrz Tabela materiałów) zgodnie z protokołami producenta, jak opisano poniżej.
      1. Do probówki 1,5 mL należy pipetować 30 µL mieszaniny Ni-NTA, odwirować z prędkością 2 600 x g przez 30 s i odrzucić nadsącz. Osad należy przemyć dwukrotnie 200 µL 1x buforu inkubacyjnego.
      2. Odwirować z prędkością 2 600 x g przez 30 s i odrzucić nadsącz. Dodać 40 µL 4x buforu inkubacyjnego i resuspendować.
      3. Dodać 900 µL odwirowanej pożywki warunkującej i inkubować przy 70 obr./min (mieszadło orbitalne) przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować z prędkością 2 600 x g przez 1 min i odrzucić nadsącz.
      4. Osad przemyć dwukrotnie 175 µL 1x buforu inkubacyjnego. Odwirować z prędkością 2 600 x g przez 30 s i odrzucić nadsącz.
      5. W celu elucji białek PEDF i GM-CSF z tagiem His należy dodać 20 µL buforu elucyjnego i inkubować przy 70 obr./min (mieszadło orbitalne) przez 20 min w RT. Odwirować z prędkością 2 600 x g przez 30 s. Należy zachować supernatant zawierający rekombinowany PEDF lub GM-CSF.
    3. Całkowitą zawartość białka należy oznaczyć ilościowo za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu do oznaczania białek BCA (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Roztwór białka przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Bufor inkubacyjny (4x) zawiera 200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl i 40 mM imidazolu; bufor elucyjny zawiera 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl i 250 mM imidazolu.
  3. Traktowanie nietransfektowanych komórek ARPE-19/pierwotnych hRPE pożywką warunkującą z dodatkiem H2O2 (Rysunek 1A)
    1. Wysiać 3 000 nietransfektowanych komórek ARPE-19 (z kroku 1.1.6 protokołu) lub pierwotnych hRPE (z kroku 1.2.3 protokołu) na dołek w płytce 96-dołkowej i hodować w 200 µL pożywki warunkującej z transfektowanych komórek ARPE-19.
    2. Hodować komórki przez 10 dni w temperaturze 37 °C w zwilżonej atmosferze zawierającej 5% CO2 i 95% powietrza. Pożywkę warunkującą wymieniać codziennie. Komórki należy poddać działaniu 350 µM H2O2 przez 24 h.
    3. Ocenić uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym i określić efekt antyoksydacyjny PEDF i GM-CSF poprzez ilościowe oznaczenie poziomu glutationu (patrz krok 4.1 protokołu), analizę mikroskopową (patrz krok 4.2 protokołu) oraz test cytotoksyczności (patrz krok 4.2 protokołu).
      UWAGA: Czas trwania eksperymentu wynosi 12 dni. Do oceny luminescencji oraz morfologii komórek stosuje się przezroczyste płytki mikrotitracyjne z płaskim dnem. Aby jednocześnie przeprowadzić test cytotoksyczności i oznaczenie glutationu, w tym samym dniu należy wysiać komórki na dwie płytki.
  4. Traktowanie nietransfektowanych komórek ARPE-19/pierwotnych hRPE czynnikami wzrostu PEDF i GM-CSF z dodatkiem H2O2 (Rysunek 1B)
    1. Wysiać 3 000 nietransfektowanych komórek ARPE-19 (z kroku 1.1.6 protokołu) lub pierwotnych hRPE (z kroku 1.2.3 protokołu) na dołek (płytki 96-dołkowe z przezroczystym płaskim dnem) w 200 µL kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej 500 ng/mL rekombinowanego PEDF i/lub 50 ng/mL rekombinowanego GM-CSF, oczyszczonych z pożywki transfektowanych komórek ARPE-19 lub dostępnych komercyjnie. Hodować komórki przez 48 h w temperaturze 37 °C w zwilżonej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza. Pożywkę zawierającą czynniki wzrostu PEDF i GM-CSF wymieniać codziennie.
      ​UWAGA: Czynniki wzrostu należy dodawać do pożywki na świeżo.
    2. Po 48 h traktowania komórek czynnikami wzrostu usunąć pożywkę i dodać pożywkę kompletną zawierającą 350 µM H2O2 oraz 500 ng/mL PEDF i/lub 50 ng/mL GM-CSF.
    3. Ocenić uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym i określić efekt antyoksydacyjny PEDF i GM-CSF poprzez ilościowe oznaczenie poziomu glutationu (patrz krok 4.1 protokołu), analizę mikroskopową (patrz krok 4.2 protokołu) oraz test cytotoksyczności (patrz krok 4.2 protokołu).
      UWAGA: Czas trwania eksperymentu wynosi 3 dni.
  5. Traktowanie transfektowanych komórek ARPE-19/pierwotnych hRPE za pomocą H2O2 (Rysunek 1C)
    1. Zweryfikować wystarczającą ekspresję genów i sekrecję białek w transfektowanych komórkach metodą WB i ELISA, zgodnie z opisem w Materiałach uzupełniających.
    2. Usunąć pożywkę z dołków zawierających transfektowane komórki (patrz krok 2 protokołu).
    3. Poddać komórki trypsynizacji zgodnie z opisem w krokach 1.1.3-1.1.5 protokołu. Policzyć komórki za pomocą komory Neubauera34,35.
    4. Wysiać 5 000 transfektowanych komórek/dołek w płytce 96-dołkowej w 200 µL pożywki kompletnej. Hodować komórki przez 24 h w temperaturze 37 °C w zwilżonej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza. Po 24 h poddać komórki działaniu 350 µM H2O2 przez 24 h.
    5. Ocenić uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym i określić efekt antyoksydacyjny PEDF i GM-CSF poprzez ilościowe oznaczenie poziomu glutationu (patrz krok 4.1 protokołu), analizę mikroskopową (patrz krok 4.2 protokołu), test cytotoksyczności (patrz krok 4.2 protokołu) oraz oznaczenie ekspresji genu UCP2 (patrz krok 4.3 protokołu).
      UWAGA: Czas trwania eksperymentu wynosi 2 dni.

Oś czasu hodowli komórkowej z nadtlenkiem wodoru; test glutationowy GSH-Glo; schemat blokowy eksperymentu.
Rycina 1: Harmonogramy testu H2O2 w trzech różnych podejściach eksperymentalnych. 3 000 nieotransfekowanych komórek traktowanych pożywką kondycjonowaną/białkami rekombinowanymi lub 5 000 komórek transfekowanych wysiano na płytki 96-dołkowe w celu traktowania H2O2. Aby określić wpływ pożywki kondycjonowanej, komórki hodowano w 100% pożywce hodowlanej przez 10 kolejnych dni, wymieniając pożywkę każdego dnia. Aby określić wpływ rekombinowanych czynników wzrostu, komórki hodowano, dodając odpowiednią ilość czynników wzrostu każdego dnia przez 3 kolejne dni. Należy zauważyć, że komórki nieotransfekowane wysiano w zagęszczeniu 3 000 komórek na dołek, aby uniknąć nadmiernego rozrostu podczas dłuższego czasu hodowli w porównaniu z komórkami transfekowanymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Analiza poziomu stresu oksydacyjnego i zdolności antyoksydacyjnej

  1. Oznaczenie poziomu glutationu
    1. Poziom glutationu (GSH) należy zmierzyć przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: należy przygotować odpowiednią objętość 1x mieszaniny reagentów (100 µL reagentu/dołek): substrat Luciferyna-NT oraz glutation S-transferaza rozcieńczone 1:100 w buforze reakcyjnym.
      ​UWAGA: Płytka 96-dołkowa wymaga 10 mL 1x mieszaniny reagentów, którą przygotowuje się poprzez dodanie 100 µL substratu Luciferyna-NT i 100 µL glutation S-transferazy do 10 mL buforu reakcyjnego. 1x mieszaninę reagentów należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Nie należy przechowywać przygotowanej mieszaniny reagentów do późniejszego wykorzystania.
    2. Reagent detekcyjny lucyferyny należy przygotować, przenosząc jedną butelkę buforu do rekonstytucji do liofilizowanego reagentu detekcyjnego lucyferyny.
    3. Krzywą wzorcową należy przygotować przy użyciu roztworu wzorcowego glutationu (GSH) (5 mM). Roztwór 5 mM GSH należy rozcieńczyć 1:100 w dH2O (dodać 10 µL roztworu 5 mM GSH do 990 µL dH2O). Następnie należy wykonać 7 seryjnych rozcieńczeń 1:1 w 500 µL dH2O. 10 µL każdego rozcieńczonego wzorca należy przenieść do odpowiedniego dołka w dwóch powtórzeniach.
      ​UWAGA: Końcowe stężenie glutationu będzie mieścić się w zakresie od 0,039 µM do 5 µM.
    4. Należy przygotować próbkę ślepą (1x mieszanina reagentów) i przenieść 10 µL (duplikaty) do odpowiednich dołków.
    5. Komórki traktowane H2O2 należy wyjąć z inkubatora.
      ​UWAGA: Morfologię komórek traktowanych H2O2 należy udokumentować za pomocą mikroskopii w polu jasnym (40x).
      ​Komórki utlenione mają bardziej zaokrąglony kształt i są mniej rozprzestrzenione.
    6. Należy ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną. Do każdego dołka należy dodać 100 µL przygotowanej 1x mieszaniny reagentów. Komórki należy mieszać z reagentem przez 15 s przy 500 rpm na wytrząsarce orbitalnej.
    7. Płytkę należy inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min. Do każdego dołka należy dodać 100 µL zrekonstytuowanego reagentu detekcyjnego lucyferyny.
    8. Roztwór należy mieszać przez 15 s przy 500 rpm na wytrząsarce orbitalnej. Płytkę należy inkubować przez 15 min w RT.
    9. Luminescencję należy oznaczyć za pomocą czytnika płytek, korzystając z zainstalowanego programu ADP-Glo.
      ​UWAGA: Płytkę należy włożyć do czytnika bez pokrywy.
      1. Należy kliknąć Change Layout i wybrać następujące ustawienia w sekcji Basic Parameters: płyta Costar 96-well; optyka górna (top optic); opóźnienie pozycjonowania: 0,1; czas rozpoczęcia pomiaru: 0,0; odstęp czasowy pomiaru: 1,0; czas normalizacji wyników: 0,0; wzmocnienie (gain) jest dostrajane automatycznie przez urządzenie. Należy zdefiniować próbki ślepe, wzorce i próbki badawcze. Następnie należy kliknąć Start Measurement.
      2. Dane należy wyeksportować do pliku Excel. Stężenie GSH w każdej próbce należy obliczyć metodą interpolacji z krzywej wzorcowej.
  2. Test cytotoksyczności i analiza mikroskopowa
    1. Z komórek należy odessać pożywkę i do każdego dołka dodać 100 µL pożywki kompletnej zawierającej 1% FBS. Komórki należy zwrócić do inkubatora.
      UWAGA: Stosuje się 1% FBS, ponieważ wyższe stężenia FBS mogą zakłócać pomiar luminescencji, dlatego w tym przypadku użyto 1% FBS.
    2. Żywotność komórek należy zmierzyć przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do testów cytotoksyczności (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: mieszaninę reagentów przygotowuje się poprzez dodanie buforu do testu do liofilizowanego substratu. Reagent lizujący przygotowuje się poprzez dodanie 33 µL digitoniny do 5 mL buforu do testu (dla jednej płytki 96-dołkowej). Należy dokładnie wymieszać roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby zapewnić homogeniczność.
      ​UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy używać świeżo przygotowanej mieszaniny reagentów. W przypadku przechowywania w RT należy jej użyć w ciągu 12 h. Mieszaninę reagentów można przechowywać w 4 °C do 7 dni lub w jednorazowych alikwotach do 4 miesięcy w -70 °C. Należy unikać zamrażania i rozmrażania. Reagent lizujący można przechowywać w 4 °C do 7 dni.
    3. Krzywą wzorcową należy przygotować z nietraktowanych komórek ARPE-19.
      1. Komórki należy trypsynizować zgodnie z opisem w krokach 1.1.3-1.1.5 protokołu i policzyć za pomocą komory Neubauera34,35. Komórki należy wirować przy 120 g przez 10 min w RT. Należy odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w pożywce DMEM/Ham's F12 zawierającej 1% FBS do końcowego stężenia 1 x 105 komórek/mL.
      2. Należy przygotować 7 seryjnych rozcieńczeń 1:1 w 200 µL pożywki zawierającej 1% FBS. 100 µL każdego wzorca należy przenieść do odpowiednich dołków (duplikaty). Do wszystkich dołków należy dodać 50 µL mieszaniny reagentów.
    4. Komórki należy mieszać z reagentem przez 15 s przy 500 rpm na wytrząsarce orbitalnej. Płytkę należy inkubować przez 15 min w RT. Luminescencję należy zmierzyć za pomocą czytnika płytek zgodnie z opisem w kroku 4.1.9 protokołu. Następnie należy dodać 50 µL reagentu lizującego i inkubować przez 15 min. Luminescencję należy ponownie zmierzyć za pomocą czytnika płytek zgodnie z opisem w kroku 4.1.9 protokołu.
    5. Należy obliczyć procent żywych komórek: (100 - % komórek martwych) oraz procent komórek martwych = [pierwszy pomiar luminescencji (komórki martwe w próbce)] / [drugi pomiar luminescencji (wszystkie komórki martwe po traktowaniu digitoniną)] x 100.
  3. Analiza ekspresji UCP2 metodą RT-qPCR
    1. Komórki transfekowane należy trypsynizować zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.1.3-1.1.5 protokołu).
    2. Komórki należy policzyć za pomocą komory Neubauera34,35.
    3. W płytkach 96-dołkowych należy wysiać po 5 000 transfekowanych komórek ARPE-19 na dołek.
    4. Po 24 h hodowli komórki należy traktować 350 µM H2O2 przez 24 h.
    5. Całkowite RNA należy wyizolować przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji RNA z niewielkiej liczby komórek (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta.
    6. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) należy przeprowadzić zgodnie z opisem w Materialach uzupełniających. W skrócie: cDNA generuje się poprzez odwrotną transkrypcję przy użyciu dostępnej komercyjnie mieszaniny zawierającej zoptymalizowaną odwrotną transkryptazę M-MLV (patrz Tabela materiałów).
    7. Do qPCR należy zastosować gotowy koktajl reakcyjny zawierający wszystkie składniki (w tym SYBR Green) z wyjątkiem starterów (patrz Tabela S1 w Materialach uzupełniających) i matrycy DNA. Należy zastosować następujące warunki termocyklingu: wstępna denaturacja w 95 °C przez 10 min, 40 cykli obejmujących denaturację w 95 °C przez 15 s, przyłączanie w 60 °C przez 30 s oraz elongację w 72 °C przez 32 s.
    8. Do analizy należy zastosować metodę 2^(-ΔΔCT)36.
  4. Przygotowanie lizatu komórkowego do analizy SDS-PAGE i WB pAkt (Ser473)
    1. W płytkach 6-dołkowych należy wysiać 3 x 105 komórek ARPE-19 transfekowanych GM-CSF na dołek (≥21 dni po transfekcji), aby określić, czy GM-CSF chroni komórki RPE przed uszkodzeniem przez H2O2 poprzez aktywację szlaku przeżycia Akt15.
    2. Po 24 h hodowli komórki poddaje się działaniu 350 µM H2O2 przez 24 h.
    3. Należy wymieszać 1 mL buforu RIPA z 10 µL koktajlu inhibitorów proteaz i fosfataz, 10 µL 0,5 M EDTA oraz 25 µL 8 M mocznika (objętości stosowane dla jednego dołka).
    4. Należy ostrożnie odessać pożywkę i przemyć komórki 1x PBS.
    5. Do komórek należy dodać całą objętość mieszaniny buforu RIPA.
    6. Należy wymieszać roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    7. Lizat należy zebrać do probótek 1,5 mL.
    8. Próbki należy wirować przy 20 000 x g przez 30 min w 4 °C.
    9. Nadsącz należy przenieść do nowej probówki 1,5 mL.
    10. Poziom pAkt w 15 µL nierozcieńczonego lizatu komórkowego należy oznaczyć metodą WB zgodnie z opisem w Materialach uzupełniających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Indukcja stresu oksydacyjnego w ludzkich komórkach nabłonka pigmentowego siatkówki
Komórki ARPE-19 oraz pierwotne komórki hRPE poddano działaniu różnych stężeń H2O2 przez 24 h, a następnie oznaczono wewnątrzkomórkowy poziom antyoksydacyjnego glutationu (Rycina 2A,B). Stężenia H2O2 wynoszące 50 µM i 100 µM nie wpłynęły na produkcję glutationu, podczas gdy przy stężeniu 350 µM odn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół oferuje podejście do analizy funkcji antyoksydacyjnej i ochronnej PEDF i GM-CSF wytwarzanych przez transfekowane komórki, które można zastosować do komórek transfekowanych dowolnym przypuszczalnie korzystnym genem. W genowych strategiach terapeutycznych, które mają na celu dostarczanie białek do tkanek poprzez przeszczepianie genetycznie zmodyfikowanych komórek, kluczowe znaczenie ma uzyskanie informacji na temat poziomu ekspresji białka, długowieczności ekspresji i skuteczności wyrażonego bi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Greggowi Sealy'emu i Alainowi Conti za doskonałą pomoc techniczną oraz prof. Zsuzsannie Izsvák z Centrum Maxa-Delbrücka w Berlinie za uprzejme dostarczenie plazmidów pSB100X i pT2-CAGGS-Venus. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauk i Komisję Europejską w ramach siódmego programu ramowego. Projekt Z.I został sfinansowany przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 24-dołkoweCorning353047
6-dołkoweGreiner7657160
96-dołkowa płytka hodowlana biała z przezroczystym płaskim dnem Costar3610Pozwala na sprawdzenie komórek przed pomiarem luminescencji (test GSH-Glo)
Płytki 96-dołkoweCorning 
Akrylamid 40%Biorad161-0144
Amfoterycyna BAMIMED4-05F00-H
Przeciwciało anty-GMCSFThermoFisher ScientificPA5-24184
Przeciwciało anty-mysie IgG/IgA/IgM Przeciwciało AgilentP0260
anty-PEDF Santa Cruz Biotechnology Incsc-390172
Przeciwciało anty-penta-His Qiagen34660
Przeciwciało anty-fosfo-AktTechnologia sygnalizacji komórkowej9271
Przeciwciało anty-królicze IgG H & L-HRPAbcamab6721
Przeciwciało przeciwko królikowi Alexa Fluor 594 ThermoFisher Naukowy A11034
Przeciwciało kozie anty-myszy Alexa 488ThermoFisher ScientificA-11029
Linia komórkowa ARPE-19ATCC CRL-2302
BSA komorowe Sigma-AldrichA9418-500G
Corning354118
Test cytotoksyczności CytoTox-Glo PromegaG9291
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
DMEM/Ham's F12 Sigma-AldrichD8062
Duo Set Zestaw ELISAR& D Systems DY215-05
EDTAThermoFisher Scientific78440
ELISAzestaw ilościowyBioProducts MDPED613-10-Ludzkie
oczy (człowiek)Lwy Dar Wzroku Bank Oczu (Saint Paul, MN)
FBS BrunschwigP40-37500
Fluoromount Wodny środek montażowySigma-AldrichF4680-25ML
Czytnik płytek FLUOstar Omega Oprogramowanie BMG Labtech
GraphPad Prism (wersja 8.0)Oprogramowanie GraphPad, Inc.
Test glutationu GSH-GloPromegaV6912
nadtlenek wodoru (H2O2)Oprogramowanie Merck107209
ImageJ (program do przetwarzania obrazu)W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997– 2014
Imidazol Mikroskop AxonlabA1378.0010
Leica DMI4000B Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II Oprogramowanie Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1Roche Molecular Systems
NaClSigma-Aldrich71376-1000
NaH2PO4Axonlab3468.1000
System transfekcji neonowej ThermoFisher ScientificMPK5000
System Transfekcji Neonowej 10 & mikro; L ZestawThermoFisher ScientificMPK1096
Komora NeubauerMarienfeld-superior640010
Ni-NTA superflow Qiagen30410
Nitroceluloza VWR732-3197
System obrazowania żelowego Omega Lum GAplegen Life Science
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicylina/StreptomycynaSigma-AldrichP0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuantabio95072-012
PFA Sigma-Aldrich158127-100G
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA Podkłady ThermoFisher Scientific23227
 Invitrogen Patrz tabela 1 w materiałach uzupełniających
pSB100X (250 ng/&mikro; L)Má t&eaostry; S i wsp., 2009. Dostarczone przez prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-Jego plazmidowe DNA (250 ng/&mikro; L)Skonstruowany przy użyciu istniejącego plazmidu pT2-CMV-PEDF-EGFP opisanego w Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-Jego plazmidowe DNA (250 ng/&mikro; L)Skonstruowany przy użyciu istniejącego plazmidu pT2-CMV-PEDF-EGFP opisanego w Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51304
rekombinowany hGM-CSF Peprotech100-11
rekombinowany hPEDF   BioProductsMD004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System MiniprepPromegaZ6011
Bufor RIPAThermoFisher Scientific89901
Zestaw DNaz bez RNazQIAGEN79254
RNeasy Mini KitQIAGEN74204
SDSApplichemA2572
Transfer półsuchy system do WB Bio-Rad
SuperMix qScriptQuantabio95048-025
sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) ThermoFisher Scientific15504020
Triton X-100AppliChemA4975
Trypsin/EDTASigma-AldrichT4174
Tween AppliChem A1390
MocznikThermoFisher Scientific29700
Podłoże WesternBright ECL HRPAdvanstaK-12045-D50
Membrana nitrocelulozowa WhatmanChemie BrunschwigMNSC04530301
353072Szkiełka szklane

Bibliografia

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model nadtlenku wodorutransfekcja PEDF GM CSFpomiar glutationuekspresja genu UCP2analiza Western blottest ywotno ci kom rekprzygotowanie po ywki kondycjonowanej
Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.