Obrazowanie żywych zwierząt i metody sortowania komórek do badania neurodegeneracji w modelu nekrozy ekscytotoksycznej C. elegans

Podsumowanie

W modelu ekscytotoksyczności C. elegans, ten protokół wykorzystuje obrazowanie in vivo do analizy regulacji neurodegeneracji martwiczej, wpływu genów kodujących potencjalne mediatory oraz udziału mitochondriów. Dysocjacja i sortowanie komórek służy do specyficznego uzyskiwania zagrożonych neuronów do specyficznej dla komórki analizy transkryptomicznej mechanizmów neurodegeneracji i neuroprotekcji.

Streszczenie

Nekroza ekscytotoksyczna jest wiodącą formą neurodegeneracji. Ten proces regulowanej martwicy jest wywoływany przez synaptyczne nagromadzenie neuroprzekaźnika glutaminianu i nadmierną stymulację jego receptorów postsynaptycznych. Brakuje jednak informacji na temat późniejszych zdarzeń molekularnych, których kulminacją jest wyraźna morfologia obrzęku neuronów tego typu neurodegeneracji. Inne aspekty, takie jak zmiany w określonych przedziałach subkomórkowych lub podstawy zróżnicowanej wrażliwości komórkowej różnych podtypów neuronów, pozostają niedostatecznie zbadane. Co więcej, szereg czynników, które wchodzą w grę w badaniach z użyciem preparatów in vitro lub ex vivo, może modyfikować i zniekształcać naturalny postęp tej formy neurodegeneracji. Dlatego ważne jest, aby badać nekrozę ekscytotoksyczną u żywych zwierząt poprzez monitorowanie efektów interwencji, które regulują zakres martwicy neuronów w genetycznie podatnym i przezroczystym systemie modelowym nicienia Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje metody badania nekrozy ekscytotoksycznej w neuronach C. elegans, łącząc analizę optyczną, genetyczną i molekularną. Aby wywołać warunki ekscytotoksyczne u C. elegans, nokaut genu transportera glutaminianu (glt-3) łączy się z neuronalnym uwrażliwiającym tłem genetycznym (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) w celu wytworzenia hiperstymulacji receptora glutaminianu i neurodegeneracji. Różnicowy kontrast interferencyjny Nomarskiego (DIC), mikroskopia fluorescencyjna i konfokalna u żywych zwierząt to metody stosowane do ilościowego określania neurodegeneracji, śledzenia subkomórkowej lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie i ilościowego określania morfologii mitochondriów w degenerujących się neuronach. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją neuronów (FACS) służy do wyraźnego sortowania zagrożonych neuronów w celu analizy transkryptomicznej neurodegeneracji specyficznej dla typu komórki. Połączenie metod obrazowania na żywo i FACS, a także korzyści płynące z organizmu modelowego C. elegans pozwalają naukowcom wykorzystać ten system do uzyskania powtarzalnych danych przy dużej wielkości próby. Wnioski uzyskane dzięki tym testom mogą przełożyć się na opracowanie nowych celów dla interwencji terapeutycznej w chorobach neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

Ekscytotoksyczność jest główną przyczyną śmierci neuronów w niedokrwieniu mózgu i czynnikiem przyczyniającym się do wielu chorób neurodegeneracyjnych1^,2,3,4,5,6^,7,8,9. Zakłócenie przepływu natlenionej krwi do mózgu (np. z powodu zakrzepu krwi) powoduje nieprawidłowe działanie transporterów glutaminianu, co prowadzi do gromadzenia glutaminianu w synapsie. Ten nadmiar glutaminianu nadmiernie aktywuje postsynaptyczne receptory glutaminianu (GluR), prowadząc do nadmiernego (katalitycznego, niestechiometrycznego) napływu Ca²⁺ do neuronów (Figura 1A). Ten szkodliwy napływ prowadzi do postępującej postsynaptycznej neurodegeneracji, która morfologicznie i mechanicznie waha się od apoptozy do regulowanej martwicy^10,11,12. Chociaż opierały się one na udanych interwencjach na modelach zwierzęcych, wiele badań klinicznych antagonistów GluR, które miały na celu zablokowanie wejścia Ca²⁺ i promowanie żywotności komórek, nie powiodło się w warunkach klinicznych^13,14,15,16. Prawdopodobnym krytycznym czynnikiem przyczyniającym się do tych niepowodzeń jest fakt, że (w przeciwieństwie do modeli zwierzęcych) leczenie w warunkach klinicznych jest podawane kilka godzin po wystąpieniu udaru, co powoduje, że interwencja blokuje późno działające mechanizmy neuroprotekcyjne, jednocześnie nie przerywając sygnalizacji zwyrodnieniowej poniżej GluRs^14,16,17. Alternatywne podejście, które opiera się na trombolizie, może być podawane tylko w bardzo ograniczonym oknie czasowym, co sprawia, że wielu pacjentów (którzy cierpią na udar w domu z trudnym do zidentyfikowania czasem wystąpienia) nie może z niego skorzystać¹⁷. Niepowodzenia te podkreślają potrzebę skoncentrowania badań nad ekscytotoksycznością na badaniu zdarzeń zachodzących po hiperstymulacji GluR i odróżnienia późniejszych kaskad zwyrodnieniowych od współistniejących procesów neuroprotekcyjnych. Takie podejście może pomóc w zapobieganiu uszkodzeniom komórek i identyfikacji skutecznych celów leków, które można podać później po wystąpieniu uszkodzenia.

Jednym z podejść do identyfikacji kolejnych zdarzeń ekscytotoksyczności jest zbadanie mechanizmów sygnalizacji śmierci komórki po hiperstymulacji GluR, takich jak te prowadzące do upadku mitochondriów. Drastyczne zaburzenia fizjologii i dynamiki mitochondriów są cechą charakterystyczną neurodegeneracji, co widać w ekscytotoksyczności^18,19,20. Podczas gdy wszystkie komórki zależą od funkcji mitochondriów i dostępności do przetrwania, aktywności i utrzymania komórek, neurony są szczególnie zależne od produkcji energii mitochondrialnej, aby wspierać transmisję i propagację sygnału. W szczególności neurony zużywają ~ 50% energii związanej z sygnalizacją, aby przywrócić spoczynkowy potencjał błonowy po aktywacji receptorów/kanałów postsynaptycznych ²¹, przy dużej zależności od tlenu i glukozy. Zmniejszona dostępność glukozy i tlenu obserwowana w udarze prowadzi do poważnych zmian w mitochondriach, powodując dalsze zmniejszenie produkcji ATP^19,22,23,24. Jednak badania mające na celu zidentyfikowanie sekwencji zdarzeń, które doprowadziły do upadku mitochondriów, przyniosły kontrowersyjne wyniki i nie przyniosły konsensusu. Analiza morfologii mitochondriów może pomóc w zrozumieniu tych zdarzeń prowadzących do patologii mitochondriów, ponieważ jest to dobry wskaźnik zdrowia neuronów^{25,26,27,28,29}. Mitochondria nitkowate są reprezentatywne dla zdrowego neuronu, podczas gdy rozdrobnione mitochondria ujawniają znaczne uszkodzenia neuronów, które mogą prowadzić do śmierci komórki. Analiza morfologii mitochondriów u żywych zwierząt w różnych warunkach genetycznych może pomóc w skupieniu się na konkretnych genach i szlakach zaangażowanych w neurodegenerację zależną od mitochondriów w ekscytotoksyczności.

Innym podejściem do identyfikowania kolejnych zdarzeń, które mogą regulować zakres ekscytotoksycznej neurodegeneracji, jest badanie transkrypcyjnych mechanizmów neuroprotekcyjnych, które łagodzą niektóre skutki ekscytotoksyczności^14,16. Jednak brak swoistości kluczowych neuroprotekcyjnego czynników transkrypcyjnych i rozbieżność konfiguracji eksperymentalnych utrudniają powodzenie wysiłków zmierzających do jasnej identyfikacji podstawowych programów neuroprotekcyjnych (zwłaszcza w regulowanej martwicy).

Dlatego zarówno badanie dalszych szlaków sygnalizacji śmierci, jak i badanie neuroprotekcji transkrypcyjnej w ekscytotoksyczności napotkały duże trudności i niezgodności co do obserwowanych wyników. Wiele z tych kontrowersji prawdopodobnie wynika z zastosowania modeli ekscytotoksyczności ex vivo lub in vitro oraz zmienności wynikającej ze specyfiki różnych konfiguracji doświadczalnych. Dlatego bardzo korzystne jest skupienie się na identyfikacji podstawowych mechanizmów, które są wysoce konserwatywne, i badanie ich in vivo. Prosty system modelowy nicienia C. elegans oferuje szczególnie skuteczną opcję, ze względu na silne połączenie szczególnie potężnych i zróżnicowanych narzędzi badawczych, zachowanie podstawowych szlaków śmierci komórki oraz bogate informacje na temat struktury i połączeń układu nerwowego ^30,31,32,33. Rzeczywiście, przełomowa praca laboratorium Driscoll nad analizą genetyczną nekrotycznej neurodegeneracji neuronów mechanosensorycznych jest doskonałą demonstracją siły tego podejścia³⁴. Co ważne dla analizy ekscytotoksyczności, zachowanie szlaków sygnałowych u nicieni obejmuje wszystkie główne składniki neurotransmisji glutaminergicznej^35,36.

Model ekscytotoksyczności nicieni opiera się na tych przełomowych badaniach, pozwalając badaczowi na badanie procesów biochemicznych podobnych do tych, które występują w udarze mózgu i innych chorobach neurodegeneracyjnych dotkniętych neurotoksycznością zależną od glutaminianu. Aby wywołać warunki ekscytotoksyczne u C. elegans, to eksperymentalne podejście wykorzystuje szczep ekscytotoksyczności, który jest kombinacją nokautu genu transportera glutaminianu (glt-3) i neuronalnego uwrażliwiającego tła genetycznego (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) w celu wytworzenia hiperstymulacji GluR i neurodegeneracji³⁷. Ten szczep ekscytotoksyczności naraża 30 specyficznych neuronów (eksprymujących glr-1), które są postsynaptyczne do połączeń glutaminergicznego na neurodegenerację ekscytotoksyczną. Spośród tych 30 zagrożonych neuronów, poszczególne neurony przechodzą martwicę w miarę postępu rozwoju zwierzęcia (z mieszaną stochastycznością i częściową preferencją w stosunku do pewnych określonych neuronów³⁸), podczas gdy w tym samym czasie stopniowo usuwane są również zwłoki komórek. W połączeniu z dostępnością wielu zmutowanych szczepów, podejście to pozwala na badanie wielu szlaków, które wpływają na neurodegenerację i neuroprotekcję. Podejścia te zostały już wykorzystane do analizy niektórych kaskad sygnalizacji śmierci w dół strumienia³⁹ i regulatorów transkrypcji neurodegeneracji ekscytotoksycznej w ekscytotoksyczności^38,40. Podobnie jak inne przypadki neurodegeneracji martwiczej u robaka⁴¹, neurodegeneracja ekscytotoksyczna nicienia nie obejmuje klasycznej apoptozy⁴⁰.

Ten artykuł o metodach opisuje podstawowy system do indukcji, kwantyfikacji i manipulacji ekscytotoksycznej nekrotycznej neurodegeneracji u C. elegans. Ponadto przedstawiono w nim dwa główne protokoły, które są obecnie stosowane w celu usprawnienia badań nad określonymi aspektami ekscytotoksyczności nicieni. Korzystając z reporterów fluorescencyjnych i obrazowania in vivo, badacz może badać zaangażowanie i dynamikę mitochondriów w modelu neurodegeneracji ekscytotoksycznej nicieni. Aby określić wpływ określonych neuroprotekcyjnych czynników transkrypcyjnych, badacz może wykorzystać specyficzną dla typu komórki ekspresję markerów fluorescencyjnych, dysocjację zwierząt na pojedyncze komórki oraz FACS do wyizolowania określonych neuronów, które są zagrożone martwicą z powodu ekscytotoksyczności. Te specyficzne dla typu komórki izolowane neurony mogą być następnie wykorzystane do sekwencjonowania RNA w szczepach, które zawierają mutacje w kluczowych czynnikach transkrypcyjnych. Podsumowując, metody te mogą pozwolić naukowcom na poznanie molekularnych podstaw ekscytotoksycznej neurodegeneracji i neuroprotekcji in vivo z dużą jasnością i precyzją.

Protokół

1. Szczepy używane do badania neurodegeneracji ekscytotoksycznej i neuroprotekcji

1. Stosować szczep ekscytotoksyczności nicieni ZB1102 jako punkt odniesienia dla standardowej neurodegeneracji ekscytotoksycznej.
   UWAGA: Ekscytotoksyczność zależna od glutaminianu u C. elegans jest wytwarzana w szczepie ZB1102 przez połączenie nokautu (ko) transportera glutaminianu z transgenem, który uwrażliwia neurony u tych zwierząt na neurotoksyczność i ulega ekspresji w podzbiorze neuronów połączeń postsynaptycznych do glutaminergiczne³⁷. Ta kombinacja genetyczna jest określana jako szczep ekscytotoksyczności nicieni i jest swobodnie dostępna w Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC).
2. Aby zbadać wpływ genów kodujących kandydujące regulatory nekrozy ekscytotoksycznej, należy połączyć mutację w takich genach (np. Dapk-1 lub Crh-1) ze szczepem ekscytotoksyczności nicieni.
3. Przeprowadzaj krzyżówki genetyczne zgodnie ze standardowymi metodami C. elegans³⁰, zgodnie z opisem w wormbook.org^42,43.
4. Ponieważ molekularne podstawy mutacji są zazwyczaj udokumentowane, należy podążać za potomstwem krzyżowym, genotypując określone locus za pomocą PCR. Rozróżnij WT i mutanta na podstawie wielkości fragmentu (w przypadku delecji) lub sekwencjonowania (w przypadku mutacji punktowych).
   UWAGA: Tabela 1 przedstawia szczepy, które zostały wykorzystane do badania różnych ścieżek neurodegeneracji i neuroprotekcji, szczególnie dla tego protokołu.
5. Wyprowadź wszystkie krytyczne szczepy za pomocą dwóch niezależnych linii i przetestuj je osobno, aby potwierdzić ważność obserwowanego fenotypu.

2. Pożywki wzrostowe i hodowla zwierząt

1. Hoduj robaki w temperaturze 16-25 °C na standardowych płytkach NGM^30,37,42 lub płytkach MYOB^38,44 obsianych OP50 E.coli zgodnie ze standardowymi metodami.
   UWAGA: Płytki MYOB dają identyczne wyniki jak płytki NGM, ale są nieco łatwiejsze w przygotowaniu.
2. Utrzymuj szczepy doświadczalne niezmiennie dobrze odżywione.
   UWAGA: Głód może wpływać na neurodegenerację i zmniejszać liczbę umierających neuronów głowy. Jeśli robaki są źle odżywione lub wygłodzone, ułóż je na świeżych talerzach i odczekaj kilka pokoleń przed kontynuowaniem eksperymentów. Międzypokoleniowy efekt głodu zaniknie po kilku pokoleniach.

3. Kwantyfikacja degenerujących się neuronów głowy za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego Nomarskiego (DIC) i punktacji

1. Użyć szczepu ekscytotoksyczności nicieni (ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V) jako kontroli doświadczalnej do oznaczania ilościowego, reprezentującego normalne poziomy ekscytotoksyczności. Protokół nie śledzi tego samego zwierzęcia przez różne etapy rozwoju. Zamiast tego daje migawkę populacji zwierząt w stadium mieszanym, tak że w sumie zbiera się informacje od różnych zwierząt, aby reprezentować wszystkie stadia rozwoju.
   UWAGA: Transgen nuls5 [Pglr-1::GαS (Q227L). Pglr-1::GFP]⁴⁵ (który wyraża aktywowane Gαs i GFP w neuronach połączeń postsynaptycznych do glutaminergicznym) wytwarza niezależny od GluR poziom nekrotycznej neurodegeneracji w tle: ~1 umierający neuron/zwierzę (w dowolnym momencie rozwoju). Dodanie glt-3 (ko) zwiększa nekrotyczną neurodegenerację postsynaptycznych neuronów wyrażających nuIs5 w sposób zależny od GluR, osiągając do 4-5 umierających neuronów głowy/zwierzęcia w trzecim stadium larwalnym (L3)³⁷.
2. Do badań szczepów należy użyć zwierząt z niedawno zakończonej krzyżówki genetycznej lub rozmrozić interesujące nas szczepy o temperaturze -80 °C zamrożone przygotowane ze świeżych krzyżówek. Poczekaj kilka pokoleń (≥4) przed oceną fenotypu i neurodegeneracji.
3. Wytnij i usuń mały kawałek agaru z talerza z mieszaną populacją dobrze odżywionych zwierząt i umieść go na szkiełku nakrywkowym, odwracając kawałek agaru tak, aby zwierzęta, które pełzały po powierzchni agaru, były teraz zwrócone w stronę szkiełka nakrywkowego.
   UWAGA: Zwierzęta nadal mogą się poruszać, ale są teraz nieco skrępowane i można je obserwować bez znieczulenia. Taki kawałek może być używany przez ~1 godzinę przed zastąpieniem go świeżym.
4. Korzystając z odwróconej lunety DIC z okularem x10 i obiektywem x40 lub x63, skanuj losowo zwierzęta, ręcznie przesuwając szkiełko nakrywkowe. Podczas gdy inne etapy obrazowania opisane poniżej można przeprowadzić na mikroskopach odwróconych lub pionowych, badanie robaków w kawałku agaru wymaga odwróconego zakresu.
5. Zidentyfikuj stadium rozwojowe każdego zwierzęcia na podstawie kształtu jego macicy (patrz schematy macicy w wormbook.org).
6. Dla każdego zwierzęcia zapisz jego etap rozwoju i liczbę umierających (tj. wakuolizowanych) neuronów. Policz i zapisz całkowitą liczbę umierających neuronów w głowie, liczbę umierających neuronów w zwoju zapęcherzykowym (co daje łatwą identyfikację określonych komórek) oraz liczbę umierających neuronów w ogonie (na który glutaminian nie ma wpływu i służy jako kontrola wewnętrzna, potwierdzająca, że uwrażliwiający transgen nuIs5 jest w pełni aktywny).
7. Zapisz te dane w tabeli, w której zwierzęta z danego szczepu są pogrupowane według kategorii etapu rozwojowego.
8. Podczas każdej sesji zbieraj losowo dane od robaków na kilku etapach rozwoju; wykonuj kilka sesji oceniania w ciągu kilku dni, aby zebrać wystarczającą ilość danych do analizy statystycznej. Rejestruj poziomy neurodegeneracji na wielu etapach i skonstruuj wykres słupkowy podobny do Rysunek 1C.
   UWAGA: Ta metoda pozwoli określić, czy określone leczenie lub mutacja podnosi/zmniejsza poziom neurodegeneracji na wszystkich etapach (przesunięcie dystrybucji w górę/w dół), czy też przesuwa szczyt neurodegeneracji do wcześniejszego lub późniejszego etapu rozwoju (przesunięcie rozkładu w lewo/w prawo).
9. Zbieraj dane, będąc zaślepionym na tożsamość genotypu. Potwierdź w dwóch niezależnych izolatach linii genetycznej (w celu zminimalizowania niebezpieczeństwa niezamierzonych skutków innych/nieoczekiwanych różnic genetycznych między izolatami) i zbierz dane do analizy.
10. W każdym szczepie oblicz średnią i SEM liczby degenerujących się neuronów w głowie (w tym zwoju zapęcherzykowym) na każdym etapie rozwoju (Rysunek 1D). W razie potrzeby przeprowadź podobną analizę umierających neuronów zapęcherzykowych i ogonowych tylko zwojów pęcherzykowych.

4. Identyfikacja specyficznych degenerujących się neuronów głowy

1. Zamontuj pojedyncze (lub małe grupy-) zwierząt na podkładce agarowej⁴⁶ i sparaliżuj robaka tetramizolem (patrz poniżej, sekcja 5).
2. Za pomocą połączonej fluorescencji i oscyloskopu DIC (pionowego lub odwróconego) zlokalizuj określone wakuolizowane neurony.
3. Określ specyficzną tożsamość neuronu wakuolizowanego neuronu, śledząc jego procesy znakowane GFP i porównując lokalizację ciała komórki i kształt procesów z neuronami, o których wiadomo, że wyrażają glr-1 za pomocą WormAtlas⁴⁷.
   UWAGA: Alternatywnie, identyfikacja może być wspomagana przez nowe metody szybkiej identyfikacji neuronów za pomocą wielokolorowego etykietowania, które wkrótce pojawią się w Hobert lab⁴⁸.

5. Obrazowanie na żywo morfologii mitochondriów neuronów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szczepów reporterowych

1. W celu zobrazowania zmian mitochondrialnych w degenerujących się neuronach postsynaptycznych (które są znakowane cytoplazmatycznym GFP w oryginalnym szczepie ekscytotoksyczności) należy zbadać fluorescencję mito-mCherry.
2. Skrzyżuj badany szczep ekscytotoksyczności ze szczepami, które znakują mitochondria neuronów postsynaptycznych czerwoną fluorescencją (poprzez ekspresję fuzji między białkiem fluorescencyjnym a N-końcem TOM-20 pod promotorem glr-1; szczegółowe informacje na temat konstruktów i szczepów można znaleźć na stronie⁴⁹). Zwierzęta można teraz obrazować za pomocą zwykłego mikroskopu epifluorescencyjnego (pionowego lub odwróconego) lub mikroskopu konfokalnego.
3. Aby sparaliżować robaka bez wpływu na przeżycie neuronów, należy pobrać pipetą 5 μl 10 mM tetraizolu na świeżo przygotowaną podkładkę agarozową. Zobacz Arnold et al.⁴⁶, aby uzyskać szczegółowy protokół przygotowania padów.
4. Umieść zwierzęta na środku kropli tetramisole i zamontuj za pomocą szkiełka nakrywkowego.
5. Uszczelnij boki szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozwól lakierowi do wyschnąć.
6. W ciągu 20 minut od leczenia tetramizolem i przy użyciu lunety z DIC i obrazowaniem fluorescencyjnym zlokalizuj robaki za pomocą soczewki obiektywowej 20x.
7. Gdy głowa robaka zostanie zlokalizowana (lub neurony będące przedmiotem zainteresowania), przejdź do 100-krotnego celu oleju i skup się na znakowaniu fluorescencyjnym mitochondriów w somie.
8. Przechwytuj obrazy Z-stack przy użyciu ustawień filtrów DIC, GFP i TxRed.

6. Punktacja morfologii mitochondriów neuronalnych i kwantyfikacja

1. Analizuj morfologię mitochondriów podczas obrazowania robaka na żywo lub po uzyskaniu obrazu za pomocą ImageJ lub innego oprogramowania do obrazowania.
2. W celu łatwej identyfikacji i powtórnej analizy określonych neuronów, zidentyfikuj trzy neurony w zwoju zapęcherzykowym, RIGL/R i AVG (w niektórych przypadkach tylko dwa są obecne ze względu na klirens zwłok komórek w ekscytotoksyczności).
3. Podziel mitochondria na trzy główne grupy: nitkowate, pośrednie i rozdrobnione^50,51,52.
   UWAGA: Mitochondria nitkowate pojawiają się jako ciągłe cienkie struktury w somie neuronów, zwykle otaczające jądro. Mitochondria pośrednie pojawiają się jako kombinacja co najmniej jednej pozornej nitkowatej sieci, choć z przerwami i pewną fragmentacją w somie. Rozdrobnione mitochondria wykazują całkowite pęknięcia w sieci mitochondrialnej, mają spuchnięty wygląd i są rozproszone po całej somie (Figura 2A).
4. Dla każdego robaka oceń procent neuronów z nitkowatymi, pośrednimi lub fragmentarycznymi mitochondriami, co daje w sumie co najmniej 30 robaków.
5. Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu Tukeya post hoc dla każdej morfologii mitochondriów między szczepami⁵³.

7. Przygotowanie buforu i odczynnika do dysocjacji robaków dla FACS neuronów zagrożonych neurodegeneracją

1. Przygotować bufor M9 w następujący sposób: 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, H₂O do 1 L. Sterylizować w autoklawie. Dodać 1 ml wysterylizowanego przez filtr 1 M MgSO₄. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować bufor jaj w następujący sposób: 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ ; autoklaw do sterylizacji. Dodać 2 M roztworu podstawowego HEPES pH 7,3 (uprzednio przefiltrowanego filtrem butelkowym 0,2 μm) do końcowego stężenia 25 mM. Doprowadzić pH do 7,3 za pomocą 1 N NaOH (nie więcej niż 10 ml). Użyj osmometru, aby upewnić się, że końcowa osmolarność mieści się w zakresie 335 -345 mOsm. Filtruj sterylizuj bufor jaj za pomocą filtrów butelkowych 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Sole łatwiej się rozpuszczają przy użyciu MgCl₂ ·6H₂O i CaCl₂·2H₂O do przygotowania odpowiednich roztworów podstawowych MgCl₂ i CaCl₂. Możesz również zrobić zapas 10x bufora do jaj i rozcieńczyć go w razie potrzeby w sterylnej wodzie dejonizowanej.
3. Przygotuj SDS-DTT w następujący sposób: 20 mM HEPES pH 8,0, 0,25% SDS, 200 mM DTT, 3% sacharozy. W kapturze do hodowli tkankowej wysterylizuj SDS-DTT za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Przechowywać 300 μl porcji w temperaturze -20 °C przykryte folią w celu ochrony przed światłem.
4. Przygotować roztwór pronazy w następujący sposób: przygotować dzień dysocjacji 15 mg/ml pronazy w buforze jajowym. Przechowywać na lodzie.

8. Synchronizacja wieku dla FACS specyficznych dla neuronów

1. Należy użyć zwierząt, które łączą genotyp ekscytotoksyczności (i inne mutacje, w zależności od potrzeb) z transgeniczną ekspresją silnego markera fluorescencyjnego, który może być łatwo wykorzystany do sortowania (np. FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)⁵⁴. Hoduj zwierzęta na dwóch lub trzech płytkach NGM/MYOB o średnicy 100 mm w temperaturze 20 °C, aż płyta będzie wypełniona głównie grawitacyjnymi robakami.
2. Zmyj robaki z płytek za pomocą bufora M9. Przenieść robaki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
3. Wirować w temperaturze pokojowej przez 2,5 minuty przy 250x g i usunąć supernatant.
4. Zawiesić osad robaka w 10 ml roztworu wybielacza (2%, 10 N, NaOH i 5% świeżego wybielacza domowego w sterylnej wodzie dejonizowanej).
5. Umieść rurki na wytrząsarce poziomo, kołysz się z małą prędkością. Upewnij się, że robaki nie osiądą na dnie rurki. Wybielacz otwiera naskórek robaka, ale nie wpływa na zarodki, które są chronione przez skorupkę jaja.
   1. Ten etap wybielania trwa około 5 minut, ale to się różni. Aby upewnić się, że nie dojdzie do nadmiernego bielenia, monitoruj proces, pobierając próbkę co minutę: Delikatnie odpipetuj 10 μl z każdej probówki na szklanym szkiełku mikroskopowym i zbadaj robaki za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
6. Gdy większość grawitacyjnych robaków zostanie rozłupana, ale nie całkowicie rozpuszczona, przerwij etap bielenia, wypełniając stożkowe rurki buforem do jaj.
7. Aby pobrać jaja/zarodki, należy odwirować probówki o stężeniu 250 g przez 2,5 minuty, usunąć supernatant i ponownie przemyć buforem do jaj.
8. Powtórz jeszcze cztery prania.
9. Zawiesić jaja poprzez delikatne pipetowanie granulki i rozprowadzić na czterech 100-milimetrowych płytkach NGM/MYOB z nasionami. Pozwól zarodkom wykluć się i rosnąć w temperaturze 20 °C przez 3 dni.
   UWAGA: Talerze powinny być teraz pełne głównie grawitacyjnych robaków.
10. Powtórz synchronizację wieku, powtarzając ten protokół synchronizacji wybielacza/wieku.
11. Odpipetować jaja na osiem płytek NGM/MYOB o średnicy 100 mm. Pozwól zwierzęciu wykluć się i rosnąć w temperaturze 20 °C, aż osiągnie pożądane stadium larwalne.

9. Dysocjacja całych komórek robaka dla FACS

1. Hoduj zsynchronizowane robaki do pożądanego etapu rozwoju. Delikatnie zmyć płytki o średnicy 100 mm buforem M9 i szklanymi pipetami serologicznymi i przenieść do probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
2. Dodaj zimny M9 do 45 ml. Umieść probówki na lodzie na 30 minut, aby robaki mogły osiąść na dnie pod wpływem grawitacji, podczas gdy wszelkie resztki bakterii z płytek będą unosić się w supernatancie.
3. Usunąć supernatant i umyć robaki świeżym M9.
4. Powtórz 30-minutową grawitację osiadającą na lodzie.
5. Usunąć supernatant, dodać M9 do 45 ml i odwirować przy 250 x g przez 5 minut.
6. Przenieść osad do probówki mikrowirówkowej i dodać M9 do 1 ml.
7. Wirować z prędkością 14 000 obr./min na wirówce stołowej przez 1 minutę i usunąć supernatant.
8. Aby przerwać naskórek, ponownie wymieszaj osad robaka za pomocą SDS-DTT, używając (w przybliżeniu) podwójnej objętości osadu i inkubuj z kołysaniem w temperaturze pokojowej przez 4 minuty w przypadku stadium L2-dorosłego.
   UWAGA: Nie należy przekraczać 4 minut inkubacji w SDS-DTT, ponieważ sygnał białka fluorescencyjnego drastycznie spadnie przy dłuższej obróbce SDS-DTT. Ponieważ SDS-DTT jest wrażliwa na światło, nie powinna mieć więcej niż 3 miesiące, ponieważ roztwór mógł z czasem stracić moc; Dysocjacje najlepiej sprawdzają się w przypadku niedawno przygotowanego rozwiązania SDS-DTT.
9. Dodać 1x bufor jaj (pH 7,3, 335-345 mOsm) do 1 ml, aby zatrzymać leczenie SDS-DTT.
10. Wirować z prędkością 14 000 obr./min na wirówce stołowej przez 1 minutę i usunąć supernatant.
11. Aby jeszcze bardziej zakłócić naskórek i oddzielić komórki zwierząt, ponownie zawiesić osad z roztworem pronazy o temperaturze pokojowej, używając trzykrotnie większej objętości osadu.
12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut.
13. Pipetę P-200 lub P-1000 należy pipetować w górę i w dół 40 razy co 5 minut, dotykając końcówką pipety dna probówki.
    UWAGA: Ciśnienie wytwarzane przez końcówkę dotykającą dna rurki ułatwia dysocjację ślimaków. Użyj końcówki filtra, aby ślimaki nie dostały się przypadkowo do trzonu pipety podczas szybkiego pipetowania.
14. Po 15 minutach sprawdź postęp dysocjacji robaków, delikatnie pipetując 5 μl na szkiełku podstawowym i obserwując postęp pod mikroskopem preparacyjnym. Kiedy większość (~90%) nienaruszonych robaków pęknie, proces jest zakończony.
    UWAGA: Inkubacja pronazy może zostać przedłużona, jeśli wiele robaków pozostaje nienaruszonych.
15. W kapturze do hodowli komórkowej dodaj 1x bufor jaj do 1,5 ml, aby zatrzymać leczenie pronazą.
16. Przełóż do probówek FACS, dodaj 5 ml buforu do jaj i wiruj w 800 x g przez 5 minut.
17. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml buforu do jaj
.
18. Umieść nasadkę sitka o wielkości 70 μm na nowych probówkach FACS, pipetuj zawiesinę komórek na sitku i wiruj z prędkością 800 x g przez 1 minutę. Zbierz zawiesinę komórek wypływowych.
19. Umieść nasadkę sitka o wielkości 5 μm na nowych probówkach FACS, odpipetuj zawiesinę komórek na sitku i wiruj z prędkością 800 x g przez 1 minutę.
20. Dodaj DAPI do uzyskania końcowego stężenia 0,5 μg/ml w buforze jaj, umieść na lodzie z pokrywką/pokrywką w celu ochrony przed światłem.
21. Wykonaj FACS tak szybko, jak to możliwe. Sygnał białka fluorescencyjnego zmniejsza się wraz z upływem czasu i ekspozycją na światło, dlatego ważne jest, aby jak najszybciej wykonać protokół dysocjacji i wykonać FACS natychmiast po zakończeniu dysocjacji.
    UWAGA: Protokół dysocjacji robaków został zaadaptowany z protokołów z Miller lab^55,56,57, Murphy lab⁵⁸ i Shaham lab⁵⁹.

10. Modyfikacje działania maszyny FACS do identyfikacji neuronów C. elegans

1. Do sortowania neuronów C. elegans należy użyć 4 litrów schłodzonego (4 °C) buforu jajowego zamiast standardowego płynu osłonkowego.
   UWAGA: Osmolarność komórek C. elegans jest znacznie wyższa niż komórek ssaków, a standardowy płyn osłonkowy rozsadzi neurony. Wszystkie ustawienia i kalibracje maszyny są wykonywane po dodaniu bufora do jaj, ponieważ lepkość bufora do jaj jest inna niż w przypadku standardowego płynu osłonowego. Technik sortowania przepuści kulki diagnostyczne przez maszynę, aby upewnić się, że lasery działają prawidłowo.
2. Gdy posortowane neurony mają być wykorzystane w kolejnych badaniach transkryptomicznych, należy posortować minimum 100 000 komórek GFP+ bezpośrednio na 800 μl Trizol-LS + 10 μl inhibitora RNazy.
3. Odwróć komórki w Trizol 15 razy, aby wymieszać.
4. Zamrozić błyskawicznie w kąpieli suchego lodu/etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowy do ekstrakcji RNA ze wszystkich próbek do jednego eksperymentu sekwencjonowania RNA.
   UWAGA: Podczas gdy większość posortowanych komórek jest pobierana bezpośrednio do Trizolu w celu analizy transkryptomu, należy pobrać niewielką próbkę komórek posortowanych GFP+ (z każdego szczepu) zebranych do bufora jaj, w celu mikroskopowej walidacji wydajności sortowania.

11.Strategia bramkowania FACS

1. Do identyfikacji dodatniego sygnału GFP należy użyć lasera 488 nm z filtrem 530/30 i długim przepustem 502 (LP).
2. Do identyfikacji komórek dodatnich i ujemnych DAPI należy użyć lasera 405 nm z filtrem 450/50.
3. Do identyfikacji komórek autofluorescencyjnych, które można pomylić z komórkami GFP-dodatnimi, należy użyć lasera 488 nm z filtrem 610/20 i 595 LP (komunikacja osobista, Stanka Semova, kierownik operacyjny, Centrum Zasobów Cytometrii Przepływowej, Uniwersytet Rockefellera).
4. Wykonaj standardową strategię bramkowania i usuń zdarzenia z dużym obszarem rozproszenia bocznego (SSC-A) i małym obszarem rozproszenia do przodu (FSC-A), które mogą reprezentować skupiska komórek i szczątków.
5. Wyodrębnij podkoszulki rozproszenia przedmowy, a następnie podkoszulki rozproszenia bocznego.
6. Izoluj komórki o wysokim sygnale GFP i niskim sygnale autofluorescencji.
   UWAGA: Komórki o wysokim poziomie autofluorescencji i niższym GFP nie są prawdziwymi komórkami GFP dodatnimi.
7. Próg dla bramki GFP+ jest określany przez porównanie komórek GFP- (tj. N2) z komórkami GFP+^55,56.
8. Usuń wszelkie martwe komórki za pomocą żywej/martwej bramki, w oparciu o selektywną przepuszczalność DAPI dla martwych komórek: Próg dla żywej martwej bramy określa się przez porównanie niebarwionych komórek z komórkami barwionymi DAPI.
   UWAGA: Podczas sortowania wielu próbek należy przepłukać strumień między próbkami, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego.

12. Mikroskopia posortowanych neuronów w celu sprawdzenia skuteczności strategii bramkowania FACS

1. Narysuj okrąg na szklanym szkiełku mikroskopowym za pomocą pisaka odstraszającego płyny.
2. Odpipetować 10 μl zawiesiny posortowanych komórek w buforze jajowym wewnątrz koła. Umieść szkiełko nakrywkowe na próbce i uszczelnij lakierem do paznokci na obwodzie szkiełka nakrywkowego.
3. Po wyschnięciu lakieru do paznokci sprawdź pod pionowym/odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym, czy posortowane komórki to rzeczywiście głównie komórki GFP +.
   UWAGA: Wykonuj tę kontrolę po każdej sesji sortowania, aby zweryfikować strategię bramkowania FACS⁵⁷.

13. Ekstrakcja RNA i kwantyfikacja jakości RNA w automatycznym systemie elektroforezy kontroli jakości

UWAGA: Wszystkie prace związane z RNA powinny być wykonywane z najwyższą starannością, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą (włączając staranne przygotowanie odczynników, materiałów eksploatacyjnych i najlepszych praktyk bezpiecznych dla RNaz).

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki, w których próbki zawierają fenol i/lub chloroform w dygestoriach.

1. Rozmrozić fiolki z komórkami w Trizolu w temperaturze pokojowej.
2. Używając końcówki do pipety P200, kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby homogenizować próbkę.
3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
4. Dodać 0,2 ml chloroformu na 1 ml odczynnika Trizol używanego do lizy, a następnie szczelnie zakryć probówkę.
5. Odwrócić probówki 15 razy i inkubować (w temperaturze 20-25 °C) przez 2-3 minuty.
6. Odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C. Mieszanina rozdziela się na dolną czerwoną fenol-chloroform, interfazę i bezbarwną górną fazę wodną.
7. Zebrać wyłącznie górną fazę wodną zawierającą RNA i przenieść do nowej probówki o niskiej zawartości DNA/RNA o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: W niektórych przypadkach, jeśli stosunek komórek w buforze jaj, które wypadły z sortownika komórek do Trizolu, jest większy niż stosunek 1:3 próbki:Trizol-LS, wysoka zawartość soli w buforze jaj może spowodować odwrócenie warstw; jeśli tak się stanie, dodaj więcej Trizol-LS i powtórz inwersję i odwirowanie. Można tego również uniknąć, zwracając uwagę na wzrost objętości próbki po sortowaniu; jeśli stosunek 1:3 nie jest zachowany, przed rozpoczęciem ekstrakcji RNA dodać wystarczającą ilość trizolu.
8. Aby dalej oczyścić RNA, użyj chemii kolumny ekstrakcyjnej RNA.
9. Użyj zautomatyzowanego systemu elektroforezy Quality Control, aby zmierzyć liczbę integralności RNA (RIN) i potwierdzić RNA RIN 8,0 lub więcej w celu wprowadzenia do kolejnych eksperymentów sekwencjonowania RNA.

Wyniki

Model ekscytotoksyczności nicieni i identyfikacja wakuolizowanych, degenerujących neuronów
Przedstawione tutaj dane są odtworzone z poprzednich publikacji^37,38. Aby naśladować neurodegenerację wywołaną ekscytotoksycznością, nokaut genu transportera glutaminianu (glt-3) łączy się z neuronalnym uwrażliwiającym tłem transgenicznym (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L); Pglr-1::GFP)]). Konstrukt tr...

Dyskusja

Podczas gdy powszechne kontrowersje i niepowodzenia sugerują, że ekscytotoksyczność stanowi wyjątkowo trudny proces do rozszyfrowania, analiza ekscytotoksyczności nicieni oferuje szczególnie atrakcyjną strategię wyjaśnienia konserwatywnych szlaków śmierci komórek nerwowych w tej krytycznej postaci neurodegeneracji. Badacz może polegać na bogatym zbiorze narzędzi badawczych dostępnych w tym systemie, a w szczególności na przezroczystości zwierzęcia (umożliwiającej analizę in vivo) i dużym repertuarze żywotnych mutantów (d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	VWR	AAA10752-0E
Bactopeptone	VWR	90000-264
BD FACSAriaIII
Bleach	Dowolna domowa
CaCl2	VWR	97062-586
CaCl2· 2H2O	BioExpress	0556-500G
Sitko do komórek, PluriStrainer mini 70um	PluriSelect	43-10070-40
Sitko do komórek, PluriStrainer mini 5um	Wirówka PluriSelect	43-10005-60
- 15-50 mL Sorval stołowe  LEGENDX1R TC	Fisher Sci	75618382
Wirówka - mikrofuga ; Ependorff 5424	VWR	MP022629891
Chloroform	VWR	97064-680
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
DAPI	Fisher Sci	EN62248
Suchy lód	United City Ice Cube
DTT	VWR	97061-340
E. coli OP50	CGC	OP50
Etanol (100%)	VWR	EM-EX0276-1S
Etanol (90%)	Rurki VWR	BDH1160-4LP
FACS	USA Sci	1450-2810
Końcówki filtrów	USA Sci	1126-7810
Szklane pipety serologiczne 10 ml	USA Sci	1071-0810
Blok grzewczy	BioExpress	D-2250
Hepes	VWR	97061-824
Olejek immersyjny - Carl Zeiss Immersol	Fisher Sci	12-624-66A
Izopropanol	VWR	EM-PX1830-4
KCl	VWR	BDH9258-2,5 KG
KH2PO4	VWR	BDH9268-2,5KG
Probówki 1,5 ml o niskim wiązaniu	USA Sci	4043-1021
Oprogramowanie do obrazowania metamorficznego			molekularne
MgCl2	VWR	97063-152
MgCl2· 6H2O	BioExpress	0288-500g
MgSO4	VWR	97061-438
Mikroskop konfokalny do obrazowania fluorescencyjnego	Mikroskop Zeiss	LSM 880
, odwrócony, do obrazowania fluorescencyjnego	Mikroskop Zeiss	Axiovert 200 M
Kamera	Q-Imaging	Retiga R1
Mikroskop Źródło światła do obrazowania fluorescencyjnego	Lumencor	SOLA SE Light Engine Microscope
, Nomarski DIC	Zeiss	Axiovert Observer A1
Nomarski DIC	Nikon	Eclipse Ti-S
Na2HPO4	VWR	97061-588
NaCl	VWR	BDH9286-2,5 kg
NaOH	VWR	97064-476
szalki Petriego, 100 mm	szalki Petriego Fisher Sci	FB0875712
, 60 mm	TriTech	T3308
Kontroler pipet	Wyposażenie	P2002
Pipetor P10 Końcówki	USA Sci	1110-3000
Pipettor P1000 Końcówki	USA Sci	1111-2020
Pipettor P200 Końcówki	USA Sci	1110-1000
Pronase	Sigma	P8811-1G
RNAzsypułka w sprayu Fisher	Sci	7000TS1
Pipety serologiczne bez RNAzy,	USA Sci	1071-0810
Probówki 50 ml bez RNAz	USA Sci	5622-7261
RNeasy micro	Qiagen	74004
SDS	VWR	97064-496
Siarczan streptomycyny	Sigma	S6501-100G
Sacharoza	VWR	AAJ63662-AP
SUPERaza· w inhibitorze RNazy	Fisher Sci	AM2694
Kontrola jakości zautomatyzowany system elektroforezy: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
Tapestation - Drabinka taśmowa RNA o wysokiej czułości	Agilent	5067-5581
Tapestation - Bufor do próbek RNA ScreenTape o wysokiej czułości	Agilent	5067-5580
Tapestation - Vortexer IKA MS3	Agilent/IKA	4674100
Tapestation - adapter wirowy IKA przy 2000 obr./min	Agilent/IKA	3428000
Tapestation - Wskazówki dotyczące ładowania	Agilent	5067- 5152 lub 5067- 5153
Tapestation - Nakładka optyczna 8x Strip	Agilent	401425
Tapestation - Tuba optyczna 8x Strip	Agilent	401428
Quality Control: TapeStation 2200	Agilent	G2964AA
Tetramisole	Sigma	L9756-10G
Tris base	Fisher Sci	BP152-500
Tris chlorowodorek Fisher	Sci	BP153-500
Trizol-LS	Fisher Sci	10296-010
Wescor Vapro 5520 Osmometr ciśnienia pary	Fisher Sci	NC0044806
Wheaton Unispense μ Dozownik P	VWR	25485-003