Artykuł metodologiczny

Sferoidy serca jako bioinżynieryjne tkanki serca in vitro do badania patofizjologii ludzkiego serca

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61962

⸱

23 stycznia 2021

 , 
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu wytworzenie sferoid 3D serca (CS) poprzez kokulturację komórek w wiszących kroplach. CS z kolagenem są leczone doksorubicyną (DOX, środek kardiotoksyczny) w stężeniach fizjologicznych w celu modelowania niewydolności serca. Badania in vitro z wykorzystaniem CS poddanych działaniu DOX mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych terapii dla pacjentów z niewydolnością serca.

Streszczenie

Pomimo wielu postępów w inżynierii tkanek serca, jednym z głównych wyzwań do pokonania pozostaje stworzenie w pełni funkcjonalnej sieci naczyniowej o kilku poziomach złożoności w celu dostarczania tlenu i składników odżywczych w bioinżynieryjnych tkankach serca. Nasze laboratorium opracowało trójwymiarowy model serca ludzkiego in vitro, znany jako "sferoida serca" lub "CS". Przedstawia to biochemiczne, fizjologiczne i farmakologiczne cechy typowe dla ludzkiego serca i jest generowane przez kokulturę jego trzech głównych typów komórek, takich jak miocyty serca, komórki śródbłonka i fibroblasty. Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CM lub iCM) są hodowane w proporcjach zbliżonych do tych, które występują in vivo z ludzkimi fibroblastami serca (HCF) i ludzkimi komórkami śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAEC) w wiszących płytkach hodowlanych przez trzy do czterech dni. Analiza konfokalna CS barwionych przeciwciałami przeciwko sercowej troponinie T, CD31 i wimentynie (markery odpowiednio miocytów serca, komórek śródbłonka i fibroblastów) pokazuje, że CS prezentują złożoną sieć komórek śródbłonka, przypominającą natywną sieć znajdującą się w ludzkim sercu. Potwierdza to analiza renderingu 3D tych obrazów konfokalnych. CS prezentują również białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) typowe dla ludzkiego serca, takie jak kolagen typu IV, laminina i fibronektyna. Wreszcie, CS wykazują aktywność skurczową mierzoną jako kurczliwość syncytialną, bliższą tej typowej dla ludzkiego serca w porównaniu z CS, które zawierają tylko iCM. W przypadku leczenia kardiotoksycznym środkiem przeciwnowotworowym, takim jak doksorubicyna (DOX, stosowana w leczeniu białaczki, chłoniaka i raka piersi), żywotność CS leczonych DOX jest znacznie zmniejszona przy 10 μM genetyczne i chemiczne hamowanie śródbłonkowej syntazy tlenku azotu, dalszego celu DOX w HCF i HCAEC, zmniejszyło jego toksyczność w CS. Biorąc pod uwagę te unikalne cechy, CS są obecnie używane jako modele in vitro do badania biochemii, patofizjologii i farmakologii serca.

Wprowadzenie

Ludzkie serce ma ograniczoną zdolność do regeneracji, podczas gdy choroby układu krążenia (CVD) pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie, pomimo ostatnich postępów w inżynierii tkankowej i technologiach komórek macierzystych1. Potrzeba nowatorskich metod terapeutycznych, w tym metod molekularnych i komórkowych, w celu naprawy uszkodzonego serca lub zapobiegania jego niewydolności, jest obecnie jedną z głównych potrzeb klinicznych pacjentów cierpiących na choroby serca2,3,4. Głównym celem inżynierii tkanki serca jest wytworzenie trójwymiarowej (3D) tkanki serca, która prezentuje cechy molekularne, komórkowe i zewnątrzkomórkowe typowe dla ludzkiego serca, w tym sieć naczyniową i fizjologiczną funkcję skurczu4,5,6.

W celu bioinżynierii i wytworzenia funkcjonalnej tkanki serca ludzkiego, która naśladuje ludzkie serce do zastosowań in vitro i in vivo, zbadano kilka podejść, w tym zmodyfikowane tkanki serca (EHT), arkusze komórkowe i hodowle sferoidalne7,8. Jednak tkanki te nie są w stanie odtworzyć optymalnego mikrośrodowiska 3D typowego dla ludzkiego serca, a ich potencjalne zastosowanie dla pacjentów z CVD nie może bezpośrednio przenieść się z ławki do łóżka pacjenta7. Dzieje się tak dlatego, że nie podsumowują one złożonej biologii, morfologii i fizjologii tkanek serca in vivo9. Jednym z głównych wyzwań w inżynierii tkankowej serca jest rozwój hierarchicznej sieci naczyniowej w bioinżynieryjnej tkance serca, ponieważ każda tkanka o średnicy większej niż 200 μm rozwija śmierć komórki w środku2,10. Prawidłowo utworzona sieć naczyniowa w tkance ludzkiego serca odgrywa główną rolę w dostarczaniu krwi, tlenu i składników odżywczych do komórek serca11. Podczas rozwoju embrionalnego naczynia włosowate i tętnice wieńcowe tworzą się poprzez waskulogenezę (tworzenie naczyń krwionośnych de novo) i angiogenezę (generowanie naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących) z komórek progenitorowych śródbłonka8,12. Fibroblasty serca odgrywają również ważną rolę w prawidłowym tworzeniu sieci naczyniowej, zapewniając optymalną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i skład wzrostu13,14.

Sieć naczyniowa 3D bioinżynieryjnych tkanek serca kontroluje przeżywalność i funkcjonowanie komórek poprzez tworzenie gradientów tlenu i składników odżywczych oraz sygnalizacji parakrynnej, takich jak homotypowa interakcja komórkowa, heterotypowa interakcja komórkowa, interakcja komórek poprzez wydzielane rozpuszczalne białka i interakcje między komórką a ECM3,10,15,16,17,18. Zapobiega to śmierci komórki w środku tkanki i wspomaga żywotność komórek oraz funkcje fizjologiczne w bioinżynieryjnych tkankach serca16,18,19.

Hodowle sferoidalne z komórek macierzystych zostały ostatnio zbadane jako modele in vitro ludzkiego serca20. Aby jeszcze bardziej poprawić mikrośrodowisko serca in vitro, naukowcy wykorzystali wszystkie główne typy komórek występujące w ludzkim sercu, takie jak miocyty serca, komórki śródbłonka i fibroblasty. Hodowle sferoidalne zapewniają wymagane wsparcie strukturalne 3D dla wzrostu i funkcjonowania komórek i mogą być wykorzystane do bioinżynierii sieci naczyniowej14,20,21,22. W tym kontekście, nasze laboratorium opracowało sferoidy ludzkiego serca (CSs) poprzez wspólną hodowlę miocytów serca, komórek śródbłonka i fibroblastów w proporcjach znalezionych w ludzkim sercu14. Model ten jest rozszerzeniem modelu sferoidalnego komórek serca komory szczura, generowanego przez kokulturację komórek serca w hodowlach wiszących, używanego do modelowania zwłóknienia serca21. Ludzkie CS mogą być stosowane jako testy toksyczności poprzez leczenie ich doksorubicyny (DOX, środka przeciwnowotworowego stosowanego w leczeniu białaczki, chłoniaka i raka piersi), która jest dobrze znana z wywoływania zwłóknienia serca i niewydolności serca (HF) nawet 17 lat po jej podaniu14.

W tym manuskrypcie opisujemy, jak generować ludzkie CS poprzez współhodowlę ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM lub iCMs), ludzkich fibroblastów serca (HCF) i ludzkich komórek śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAEC) w hodowlach wiszących kropli. W celu wykorzystania i zobrazowania CS do badań in vitro, są one zatopione w żelu kolagenowym. Analiza konfokalna CS barwionych przeciwciałami przeciwko CD31, markerowi komórek śródbłonka, wykazała, że komórki te tworzą sieć podobną do tej obserwowanej in vivo. Aby indukować niewydolność serca i potencjalnie testować nowe środki, które mogą ją leczyć lub jej zapobiegać, CS potraktowano 10 μM DOX (stężenie znajdujące się w krwiobiegu pacjentów z rakiem otrzymujących lek). Po barwieniu kalceiną-AM i homodimerem etydyny (barwienie odpowiednio żywych i martwych komórek), CS traktowane DOX wykazują znaczny spadek żywotności w porównaniu z CS, które nie otrzymały leku. CS wykazują również jednorodną aktywność skurczową, gdy są stymulowane za pomocą stymulacji potencjału pola w zakresie od 1 do 3 Hz.

Protokół

UWAGA: hiPSC-CM używane dla tego protokołu są dostępne na rynku. Jeśli jest to wymagane, należy uzyskać zgodę instytucjonalnej komisji etyki człowieka przed rozpoczęciem tej pracy.

1. Posiewanie i wzrost ludzkich fibroblastów sercowych i hodowli komórek śródbłonka

  1. Rozmrażać kriowiale zawierające HCF i HCAEC w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez jedną minutę.
  2. Przenieś kriowiale pod sterylną komorę bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym klasy 2.
  3. Zebrać 1 ml zawiesiny komórek z kriowiów za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 μl i dodać do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 7 ml pożywki z ludzkich fibroblastów serca dla HCF i 7 ml ludzkiej pożywki dla wzrostu mezo endo dla HCAECs.
    UWAGA: Aby zebrać większość komórek z każdego kriowialu, przepłucz je dwukrotnie 1 ml pożywki hodowlanej z tej samej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Delikatnie wymieszaj zawiesiny komórkowe.
  5. Przenieść zawiesiny komórek do oddzielnych kolb hodowlanych T75 za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  7. Po 18 godzinach odessać pożywkę z obu kolb hodowlanych i przepłukać je sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia zamarzającej pożywki i martwych komórek.
  8. Zastąpić PBS 7 ml odpowiedniej pożywki dla każdej kolby hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C.
  9. Regularnie badaj ekspansję i żywotność komórek i wymieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 80-90% konfluacyjności.

2. Posiewanie i wzrost kultur iCM

  1. Wstępnie pokryć dwie kolby hodowlane T25 2 ml PBS zawierającego 40 μg/ml fibronektyny (FN) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 4 godziny.
  2. Po 4 godzinach zebrać jeden kriowial zawierający iCM i umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 4 minuty.
  3. Przenieś kriowial pod sterylną komorę bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym klasy 2.
  4. Delikatnie przenieś iCM z kriowialu do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml.
  5. Przepłucz puste kriowialne iCM 1 ml pożywki galwanicznej o temperaturze pokojowej, aby odzyskać wszelkie resztki komórek. Przenieść 1 ml pożywki galwanicznej do płukania kroplami z kriowialu przez 90 sekund do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę komórek iCM.
    UWAGA: Delikatnie obracaj probówką, dodając pożywkę, aby całkowicie wymieszać roztwór i zmniejszyć szok osmotyczny na rozmrożonych komórkach.
  6. Powoli dodawać 8 ml pożywki galwanicznej o temperaturze pokojowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj pierwszy 1 ml kroplami przez 30 - 60 s. Następnie dodaj pozostałą objętość w ciągu następnych 30 sekund. Delikatnie zakręć probówką wirówkową, dodając pożywkę galwaniczną. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, odwracając ją 2-3 razy (unikając energicznego wstrząsania lub wirowania).
  7. Natychmiast wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru i określ gęstość żywotnych komórek (w komórkach / ml).
  8. Wziąć kolby T25 z powłoką FN i zassać roztwór FN-PBS, nie dopuszczając do wyschnięcia kolb. Do tego dodać objętość wysiewu iCM (1,6 x 10,6 żywotnych iCM w 8 ml pożywki galwanicznej o temperaturze pokojowej).
  9. Hodowla iCM w inkubatorze przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  10. Rozmrozić Maintenance Medium przez noc w temperaturze 4 °C dziennie przed użyciem.
  11. Zrównoważyć podłoże konserwacyjne w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i natychmiast zużyć.
  12. Po 2 dniach przenieś kolby iCMs T25 pod szafę bezpieczeństwa biologicznego.
  13. Delikatnie zmyj martwe komórki i zanieczyszczenia, delikatnie pipetując podłoże galwaniczne 5 razy w górę i w dół.
  14. Zassać pożywkę galwaniczną i zastąpić ją 8 ml wstępnie podgrzanego podłoża konserwacyjnego. Umieścić kolby T25 z powrotem w inkubatorze. Wymieniaj pożywkę konserwacyjną co drugi dzień i regularnie sprawdzaj zbiegowisko.

3. Izolacja i liczenie komórek

  1. Zacznij od zebrania najpierw HCAEC i HCF, a następnie iCM, wykonując kroki 3.2-3.12.
  2. Przygotować pożywkę hodowlaną CS, mieszając 10 ml pożywki podtrzymującej iCMs, 5 ml pożywki z ludzkich fibroblastów serca i 5 ml pożywki wzrostowej Meso Endo.
  3. Usunąć pożywkę hodowlaną z każdej kolby tkankowej zawierającej HCF i HCAEC i przepłukać raz 5 ml PBS w przypadku kolb T75. Usuń PBS.
  4. Dodać 5 ml 0,25% roztworu trypsyny EDTA do każdej kolby T75 i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Po odłączeniu komórek natychmiast zneutralizuj roztwór trypsyny EDTA za pomocą 5 ml pożywki hodowlanej.
  6. Przenieść zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 300 x g przez 4 minuty.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant z każdej probówki. Dodaj 1 ml pożywki CS do każdej pożywki komórkowej i ponownie je zawieś. Trzymaj probówkę na lodzie i policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
  8. Usunąć pożywkę konserwacyjną z kolb tkankowych zawierających iCM i przepłukać raz 3 ml PBS.
  9. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny EDTA do każdej kolby T75 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Sprawdzaj komórki co minutę, dopóki nie zostaną odłączone.
  10. Po odłączeniu komórek natychmiast zneutralizuj roztwór trypsyny EDTA za pomocą 4 ml pożywki hodowlanej.
  11. Przenieść zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować je przy 300 x g przez 5 minut.
  12. Ostrożnie usunąć supernatant z każdej probówki. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej do osadu komórkowego i ponownie go zawiesić. Trzymaj probówkę na lodzie i policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.

4. CS generacja i wzrost

  1. Wymieszaj iCM, HCF i HCAEC w stosunku 2:1:1, posiewając 10 000 iCM, 5 000 HCF i 5 000 HCAEC na wiszącą kulturę kroplową zawierającą 20 μl pożywki CS. Dostosuj do końcowej głośności całkowitej liczby CS.
  2. Odpipetować 20 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na 384-dołkowej płytce HDC ręcznie lub za pomocą zrobotyzowanej pipety wielokanałowej do automatycznego przenoszenia cieczy.
  3. Odpipetować 1,5 ml sterylnego PBS z każdej strony kanału wokół wiszącej płytki, aby zapobiec wysychaniu CSs. Inkubować płytkę HDC w temperaturze 37 °C.
  4. Codziennie badaj powstawanie CS, aż w większości odwiertów zaobserwuje się w pełni uformowaną sferoidę. Dodawaj 7,5 μl pożywki CS do każdej studzienki co drugi dzień, aż powstanie CS.

5. CS zatapianie w żelach kolagenowych

  1. Zbierz CS za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Konieczne jest odcięcie końcówki pipety około 0,2 cm od krawędzi przed jej użyciem sterylną ostrą powierzchnią (skalpelem lub nożyczkami), aby zapobiec uszkodzeniu sferoid zatopionych w żelu podczas ich pobierania.
  2. Zebrać zawiesinę CS do probówki o pojemności 50 ml na lodzie.
  3. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 5 min.
    UWAGA: uzyskany granulat należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  4. Przygotuj roztwór żelu kolagenowego (100 μl/dołek na 30 dołków z 96-dołkową płytką) na lodzie, używając kolagenu z ogona szczura i pożywki CS w stosunku 3:7.
  5. Usunąć supernatant z probówki zawierającej CSs.
  6. Wymieszaj granulowane CS w roztworze żelu kolagenowego.
  7. Dodać 1 μl/ml 5 mM wodorotlenku sodu do zawiesiny żelu CS-collagen i delikatnie wymieszać.
  8. Przenieść 100 μl żelu kolagenowego CS na przezroczystą 96-dołkową czarną mikropłytkę polistyrenową z płaskim dnem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

6. Pomiary żywotności i toksyczności CS poddanych działaniu DOX

  1. Po 30 minutach zebrać 96-dołkową płytkę z inkubatora
  2. Przygotuj DOX 10 μM (w oparciu o wcześniej ustalony protokół śmierci komórki w CSs14).
    UWAGA: Aby potencjalnie przetestować inne agenty, które mogą chronić przed HF w CSs, wygeneruj roztwory zawierające DOX + Agent A, B itp.
  3. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworów zawierających DOX i/lub inne czynniki. Kultury kontrolne zawierają pożywki bez DOX.
  4. Inkubować płytkę przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Następnego dnia zbierz roztwory podstawowe odczynników barwiących żywych/martwych i pozwól im rozmrozić się na lodzie w ciemności w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  6. Przygotować roztwór zawierający barwienie Hoechsta, 4 μM homodimeru etydyny i 2 μM kalceiny-AM.
  7. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu homodimeru kalceiny-AM/etydyny Hoechst.
  8. Zmierzyć fluorescencję w każdym dołku odpowiednio przy 645 nm dla homodimeru etydyny i przy 530 nm dla kalceiny-AM, używając wielomodowego czytnika mikropłytek.
  9. Przenieś pomiary fluorescencji do Graphpad PRISM (lub równoważnego oprogramowania do analizy statystycznej).
  10. Korzystaj z oprogramowania GraphPad Prism do analizy danych i statystyk.
  11. W celu kontroli jakości sprawdzić pod mikroskopem epifluorescencyjnym zabarwienie jąder wraz z kalceiną-AM i homodimerem etydyny.

7. CS ocena funkcji kurczliwości

  1. Zebrać mikropłytkę zgodnie z przygotowaniem w kroku 5.8.
  2. Włącz komputer zawierający oprogramowanie IonOptix do wideodetekcji krawędzi, interfejs wspomagania fluorescencji i stymulator pola MyoPacer.
  3. Umieść nowe szkiełko nakrywkowe na platformie uchwytu na chusteczki higieniczne i zmontuj łaźnię wodną z elektrodami.
  4. Delikatnie zbierz CS z żeli kolagenowych za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml wyciętej 0,5 mm od krawędzi i przenieś je do probówki Falcon. Dodaj pożywkę do CS, aby zapobiec wysychaniu CSs. Przenieś CS (pojedynczo) z kilkoma μl pożywki na stolik systemu IonOptix.
  5. Wybierz CS do analizy, ustawiając piki po lewej i prawej stronie CS za pomocą oprogramowania IonOptix.
  6. Użyj komputerowego analizatora ruchu, aby śledzić ruch krawędzi CS.
    UWAGA: Zwykle kurczliwość jest mierzona w % skrócenia komórek lub % skrócenia frakcyjnego. W tym przypadku zmierzyliśmy % skrócenia sferoidów.
  7. Ustabilizuj zarówno szczyty, dostosowując próg, jak i opcje krawędzi z komputera.
  8. Wystaw CS na działanie różnych częstotliwości (0,3, 0,6, 1, 2 i 3 Hz) i napięć (1, 2, 3 i 5 V) za pomocą stymulatora pola mięśniowego.
  9. Rejestruj skracanie sferoid jako zmiany długości CS CS poddanych działaniu DOX i nieleczonych. Analizuj dane za pomocą oprogramowania Soft-Edge i uśredniaj dla każdego CS.

8. Mikroskopia CS: utrwalanie i znakowanie immunologiczne

  1. Po 30 minutach zebrać 96-dołkową płytkę (jak przygotowano w kroku 5.8) i utrwalić CS w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Usuń PFA i spłucz trzykrotnie PBS zawierającym 0,01% azydku sodu (PBSA).
  3. Usuń PBSA.
  4. Dodać 200 μl PBSA zawierającego 0,02% Triton-X-100 do każdego dołka na 30 minut na wytrząsarce.
    UWAGA: Ten krok przenika CS w celu lepszej infiltracji przeciwciał.
  5. Dodać 200 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej w roztworze PBSA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ten krok blokuje niespecyficzne wiązanie przeciwciał w CSs.
  6. Przygotować roztwór zawierający 10 μg/ml pierwotnych mysich przeciwciał przeciwko CD31 rozcieńczonych w roztworze blokującym.
  7. Dodać 100 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
  8. Opłucz płytkę trzykrotnie PBSA przez 20 minut w temperaturze pokojowej na bujanej płycie.
  9. Przygotować roztwór zawierający barwnik DNA Hoechsta i 10 μg/ml sprzężonego z Cy3 drugorzędowego przeciwciała przeciwko mysim osłom rozcieńczonego w roztworze blokującym.
  10. Do każdej studzienki dodać 100 μl drugorzędowego roztworu przeciwciała zawierającego barwnik Hoechst i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
    UWAGA: Od tego momentu przykryj płytkę folią aluminiową.
  11. Opłucz płytkę trzy razy przez 20 minut PBSA w temperaturze pokojowej na bujanej płycie.
  12. Do każdej studzienki dodać 100 μl podłoża montażowego Vectashield.
  13. Obraz CS pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym. Wykonaj przekrój optyczny wzdłuż osi Z i zwiń obrazy w jedną płaszczyznę ogniskową za pomocą oprogramowania ImageJ.

Wyniki

Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie stanowi alternatywne podejście do wytwarzania złożonej sieci komórek śródbłonka serca w bioinżynieryjnej tkance serca, charakteryzującej się poprawioną żywotnością i funkcją komórek w porównaniu z istniejącymi modelami (Rysunek 1). Odtworzenie trójwymiarowego mikrośrodowiska serca in vivo wewnątrz CSs zwiększyło ich odpowiedź na DOX w stężeniu występującym w krwiobiegu pacjentów onkologicznych (między 5 a 10 μM, Rysunek 2). CSs traktowane DOX wykazały statystycznie istotny spadek żywotności komórek w porównaniu z grupą kontrolną (bez DOX) w ciągu 24 h (Rysunek 2), co jest efektem toksycznym obserwowanym u pacjentów z nowotworami nawet 17 lat po leczeniu tym lekiem.

Schemat hodowli w kropli wiszącej; tworzenie sferoidów z iCMs, HCAECs, HCFs; wyniki barwienia fluorescencyjnego.
Rycina 1. Analiza tworzenia i unaczynienia CS. (A) Protokół przedstawiający etapy tworzenia CS z kokultury iCMs, HCAECs i HCFs w kroplach wiszących. Obrazy w świetle widzialnym po prawej stronie pokazują progresywne tworzenie sferoidów z pojedynczych komórek w kroplach wiszących. (B) Złożone obrazy Z-stack z mikroskopii konfokalnej CS barwionego przeciwciałami przeciwko troponinie T serca (cTNT), PECAM oraz wimentynie, barwiącymi odpowiednio kardiomiocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza żywotności i toksyczności, wyniki testu fluorescencyjnego, wykresy oceny efektu leku, DOX.
Rycina 2. Żywotność i toksyczność w CSs. Analizy statystyczne fluorescencji calcein-AM (A) oraz etydyny homodimeru (B) w CSs traktowanych w obecności samych mediów (DOX 0 μM) lub doksorubicyny (10 μM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Z punktu widzenia rozwoju prawidłowe tworzenie sieci naczyniowej ma kluczowe znaczenie dla wytwarzania funkcjonalnych tkanek, w tym ludzkiego serca 10,12,23,24,25,26. Uwzględnienie prawidłowego unaczynienia tkanek 3D umożliwia wymianę tlenu, czynników wzrostu, cząsteczek sygnałowych i składników odżywczych, zapobiegając rozwojowi martwicy komórek w obrębie każdej tkanki grubszej niż 200 μm 6,10,12,17,24,25,26,27,28 . Obecnie dostępne modele 3D serca in vitro, które prezentują sieć naczyniową, prezentują przede wszystkim niezorganizowane sieci naczyniowe o rozmiarach naczyń włosowatych i brakuje im hierarchicznego złożonego unaczynienia rozgałęzionego obserwowanego in vivo 6,8,29. Alternatywne podejście do opracowania złożonej sieci komórek śródbłonka serca opisane w tym manuskrypcie charakteryzuje się lepszą żywotnością i funkcją komórek w porównaniu z istniejącymi modelami (ryc. 1)14,22. CS 3D in vitro modelują ludzkie serce poprzez lepsze odtworzenie jego mikrośrodowiska in vivo, w tym jego składników molekularnych, komórkowych i zewnątrzkomórkowych14,22. Wytwarzanie CS z komórek pochodzących z komórek macierzystych w wiszących kroplach pozwala na ich hodowle w określonych warunkach (np. typy i proporcje komórek, prawidłowe tworzenie tkanek). Kohodowle iCM wraz z HCF i HCAEC w CS definiują molekularne i komórkowe przesłuchy, które regulują patofizjologię serca, w tym jego funkcję skurczową i odpowiedź na leki w stężeniach znajdujących się w krwiobiegu pacjenta14. Ze względu na te unikalne cechy, CS zostały wykorzystane do modelowania zwłóknienia serca, poważnej konsekwencji zawału mięśnia sercowego i niewydolności serca21. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że obecność zarówno komórek śródbłonka, jak i fibroblastów ma kluczowe znaczenie dla rekapitulacji mikrośrodowiska naczyniowego w ludzkim sercu, umożliwiając optymalne odkładanie białek ECM pochodzących z fibroblastów, takich jak laminina, fibronektyna i kolagen typu IV, zlokalizowanych w pobliżu rozwijającej się sieci komórek śródbłonka14,21.

DOX jest dobrze znanym lekiem kardiotoksycznym, który może rozwinąć niewydolność serca u pacjentów z rakiem nawet 17 lat po leczeniu30 lat. Niemniej jednak pozostaje lekiem z wyboru w leczeniu białaczki i chłoniaka u pacjentów pediatrycznych oraz raka piersi u kobiet30. Leczenie DOX w CS zostało następnie wykorzystane do modelowania niewydolności serca (HF) in vitro, w celu zbadania zarówno mechanizmów regulujących toksyczność miocytów serca, komórek śródbłonka i fibroblastów14 , jak i do modelowania zwłóknienia serca wywołanego przez HF21. Żywotność komórek była statystycznie zmniejszona w CS traktowanych DOX w ciągu 24 godzin po ekspozycji na lek w stężeniu znajdującym się w krwiobiegu pacjentów z rakiem (między 5 a 10 μM)14 (Figura 2). Wcześniejsze badania w naszym laboratorium wykazały również toksyczne działanie DOX zarówno na komórki śródbłonka serca, jak i fibroblasty poprzez śródbłonkową syntazę tlenku azotu (eNOS) przy użyciu zarówno genetycznych, jak i chemicznych inhibitorów tego szlaku sygnałowego14. Zastosowanie genetycznych (NOS3 shRNA) i chemicznych (N5-(1-iminoetylo)-L-ornityny, dichlorowodorku lub L-NIO) antagonistów szlaku sygnałowego eNOS jako dalszego celu DOX zapobiegło jego toksycznemu działaniu zarówno w komórkach śródbłonka serca, jak i fibroblastach14.

Aktywność skurczową w obrębie CS zmierzono również dzięki elektrycznemu sprzężeniu komórek serca pod wpływem stymulacji potencjału pola. Odkryliśmy, że CS hodowane z pożywką kontrolną (DOX 0 μM) kurczą się spontanicznie i jednorodnie z szybkością dudnienia, którą można stymulować przez stymulację polową w zakresie 1 i 3 Hz, porównywalną ze zdrowym ludzkim sercem. Z drugiej strony, CS poddane działaniu DOX nie podążają za stymulacją elektryczną, ponieważ nie mogą się kurczyć. Wraz z pomiarami żywotności i toksyczności komórek przy użyciu kalceiny-AM i homodimera etydyny, ten funkcjonalny test funkcji skurczowej CS pozwala na ocenę złożonego scenariusza typowego dla ludzkiego serca in vitro, który obecnie nie jest osiągalny za pomocą innych modeli. W porównaniu z pomiarami aktywności kurczliwej pojedynczych komórek serca przy użyciu tego samego systemu, nie jesteśmy w stanie wizualizować i mierzyć sarkomeru w CS. W związku z tym jesteśmy ograniczeni do pomiarów % skrócenia sferoidy w czasie, testu, który musieliśmy opracować w naszym laboratorium. Ponieważ kontrolujemy liczbę komórek, kohodujemy w każdym CS, a tym samym wielkość każdego CS, używamy CS o podobnej wielkości, które rzeczywiście mają jednorodną funkcję skurczu. Jednak nawet w przypadku, gdy wygenerowaliśmy CS o różnych rozmiarach, ich aktywność skurczowa nie uległa zmianie.

Ważne jest również, aby poinformować, że wielokomórkowy charakter CS sprawia, że są one wystarczająco ciężkie, aby zlokalizować się na dnie szkiełka nakrywkowego w systemie Ion-Optix, nawet w przypadku, gdy są przekrwione. Opierając się na fakcie, że CS siedzą same w określonej pozycji, nie musimy zmuszać ich do przylegania do pokrywy, w przeciwieństwie do tego, co jest powszechnie robione z pojedynczymi komórkami serca w większości laboratoriów.

Analiza mikroskopowa CS barwionych przeciwciałami przeciwko troponinie sercowej T, CD31 / PECAM i PECAM (jako markery odpowiednio iCM, HCAEC i HCF) wykazała tworzenie sieci komórek śródbłonka (ryc. 1, niebieski). Aby całkowicie wykluczyć martwicę w wewnętrznej części CSs, w naszym laboratorium przeprowadzono przestrzenną ocenę żywotności komórek poprzez konfokalną analizę CS barwionych homodimerem kalceiny-AM/etydyny (dane nie pokazane). Należy jednak pamiętać, że przyszłe postępy w dziedzinie biofabrykacji pozwolą lepiej odtworzyć inne złożone cechy typowe dla ludzkiego serca in vivo, które obecnie nie są dostępne w istniejącym modelu. Należą do nich: i) funkcja skurczowa typowa dla dorosłych kardiomiocytów; ii) przepływ krwi i siły ciśnienia; iii) sygnalizacja parakrynna; iv) odpowiedź immunologiczna, która będzie miała kluczowe znaczenie dla poprawy tego i innych modeli serca in vitro6. Podobnie jak każdy inny model ma na celu podsumowanie głównych cech zdrowej tkanki lub stanu chorobowego, protokół generowania i stosowania CS opisany w tym manuskrypcie ma na celu pomoc badaczowi w odpowiedzi na konkretne pytania, które mogą nie być wyczerpujące przy użyciu tego podejścia. Na przykład potencjalne wykorzystanie komórek pochodzących od pacjentów do generowania CS dostarczyłoby narzędzi dla medycyny spersonalizowanej, które obecnie nie są dostępne przy użyciu powszechnie dostępnych testów o wysokiej przepustowości do badań sercowo-naczyniowych.

Podsumowując, zademonstrowaliśmy prosty sposób na lepsze odtworzenie mikrośrodowiska ludzkiego serca za pomocą komórek serca. Sferoidy serca prezentują sieć komórek śródbłonka, która lepiej podsumowuje tę obecną w ludzkim sercu w porównaniu z jednowarstwowymi kulturami komórek serca. Ze względu na swoje unikalne cechy, stanowią one zaawansowane narzędzia do badań in vitro w badaniach sercowo-naczyniowych. Przyszłe badania z wykorzystaniem komórek pochodzących od pacjentów mogą dostarczyć opcji dla medycyny spersonalizowanej i nowatorskich terapii, zarówno w celu zapobiegania, jak i lepszego leczenia chorób sercowo-naczyniowych.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla Nata Johnstona za nagranie i montaż filmu.

Poonam Sharma był wspierany przez Uniwersytet w Newcastle stypendiami UNIPRS i UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050). Carmine Gentile był wspierany przez UTS Seed Funding, Grant Katolickiej Archidiecezji Sydney na badania nad dorosłymi komórkami macierzystymi oraz Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA1933
Przeciwciała wtórne przeciwko myszom osłaJackson Immunological Research Labs, Inc.715-165-150Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z cyjaniną Cy3
Chlorowodorek doksorubicynySigma-AldrichD1515
FibronektynaSigma-AldrichF1141-1MGz osocza bydlęcego
Ludzkie fibroblasty serca (HCF)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA306AK-05a5x10^5 komórek (dorosłych), średnie i Odczynniki do subkultur
Ludzkie komórki śródbłonka tętnic wieńcowych (HCAEC)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA300K-05a5x10^5 komórek (dorosłych), pożywki i Subkultura Odczynniki
Ludzkie kardiomiocyty pochodzące z iPSC (iCM)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Zestaw kardiomiocytów, 01434
HCF GrowthMedium Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA316-500
Ludzkie medium do wzrostu komórek mezoEndo Cell Application, Inc., San Diego, CA, USA212-500
ŻYWY/MARTWY zestaw żywotności/cytotoksycznościInvitrogen, Carlsbad, CA, USAL3224
Pożywka konserwacyjna (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057Zestaw kardiomiocytów iCell, 01434
Mysi monoklonalny anty-ludzki CD31/PECAMBD Pharmingen, San Diego, CA, USA566177
Odczynnik NucBlue Live ReadyProbe (Hoechst 33342)Invitrogen, Carlsbad, CA, USAR37605
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma-AldrichD8537
Podłoże galwaniczne (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057Zestaw kardiomiocytów iCell, 01434
Kolagen ze szczurzego ogonaSigma-AldrichC3867
Azydek soduSigma-AldrichS2002
Trypsyna– EDTA, 0,25%Gibco, Thermofisher Scientific25200072
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco, Termofisher Scientific15250061
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
(T25)Thermofisher Scientific156367
96-dołkowe płaskie, przezroczyste dno Czarne płytki polistyrenowe z polistyrenu poddanego działaniu TC Corning, Nowy Jork, USA3603
384-dołkowa wisząca płyta opadająca3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USAHDP1385
Termolokatory do hodowli tkankowych

Bibliografia

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848(2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25(2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538(2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079(2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23(2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95(2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154(2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005(2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147(2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210(2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model ludzkiego sercatechnika kokulturyhodowla w wisz cej kroplimikroskopia konfokalnapomiar aktywno ci kurczliwejtest toksyczno ci doksorubicynysie kom rek r db onkabia ka macierzy pozakom rkowejizolacja kardiomiocyt w

Powiązane artykuły