Regeneracja serca wywołana kriourazami u aksolotla i echokardiografia oraz bezstronna histologia ilościowa w celu oceny progresji regeneracyjnej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół chirurgiczny mający na celu wywołanie kriouszkodzenia mięśnia sercowego komory aksolotl. Dodatkowo przedstawiono protokół nieinwazyjnego oznaczania frakcji zawałowej w procesie regeneracyjnym za pomocą echokardiografii oraz protokół precyzyjnego pomiaru frakcji zawałowej w wyciętym sercu z bezstronną histologią ilościową.

Streszczenie

urodele, salamandry i traszki, reprezentują grupę filogenetyczną najbliższą ssakom, zdolną do przeprowadzenia pełnej regeneracji mięśnia sercowego po resekcji komorowej. Model resekcji pozwolił uzyskać podstawową wiedzę na temat procesów związanych z naprawą serca. Jednak model ten nie odnosi się dobrze do sytuacji klinicznych, w których uszkodzenie tkanek, apoptoza, martwica, zwłóknienie i przerost są kluczowymi szkodliwymi konsekwencjami zawałów mięśnia sercowego wywołanych niedokrwieniem, a nie usunięcie tkanek. Z drugiej strony, zawał mięśnia sercowego wywołany kriourazami bardziej przypomina zawał mięśnia sercowego wywołany niedokrwieniem. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis procedury kriouszkodzenia aksolotla (Ambystoma mexicanum), który stanowi narzędzie do badania podstawowych mechanizmów naprawy serca w modelu czworonoga. Dodatkowo udostępniamy ilościowe metody nieinwazyjnego szacowania wielkości zawału in vivo za pomocą echokardiografii oraz precyzyjnego pomiaru wielkości zawału za pomocą bezstronnej histologii ilościowej ex vivo.

Wprowadzenie

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów na całym świecie^1,2. Zawał mięśnia sercowego wywołany niedokrwieniem powoduje rozległą śmierć komórek w kardiomiocytach³. Chociaż szybka interwencja medyczna może zmniejszyć ryzyko natychmiastowej śmierci, wynikająca z tego reakcja zwłóknieniowa, którą ludzie dzielą z tradycyjnymi modelowymi zwierzętami ssaków (mysz, szczur, królik, świnia itp.) powoduje tworzenie się tkanki bliznowatej, która może ostatecznie prowadzić do przerostu mięśnia sercowego, arytmii i niewydolności serca⁴. W przeciwieństwie do ssaków, regeneracja serca jest dobrze znana w niektórych nieowodniowych modelach zwierzęcych, takich jak danio pręgowany⁵ i salamandry⁶. Tradycyjnie, regenerację serca badano u tych gatunków po częściowej resekcji komorowej lub szczypaniu^5,6,7,8,9,10. Jednak w 2011 roku trzy grupy niezależnie opracowały technikę zawału mięśnia sercowego wywołanego kriouszkodzeniem u danio pręgowanego^11,12,13. Technika kriouszkodzeń powoduje martwicę i apoptozę w dużej części komory serca danio pręgowanego oraz początkową akumulację tkanki zwłóknieniowej, która dokładniej modeluje patologiczny rozwój serca ssaków po zawale niedokrwiennym w porównaniu z resekcją komorową^11,12,13. Ponadto porównania metodologiczne zawału mięśnia sercowego wywołanego kriourazami z zawałem mięśnia sercowego wywołanym niedokrwieniem przez podwiązanie tętnic wieńcowych u myszy i świni dowiodły, że technika kriouszkodzeń jest użyteczną alternatywą w modelach zwierzęcych ssaków^14,15. Zainspirowani metodami stosowanymi w modelu kriourazów danio pręgowanego^16,17 opracowaliśmy podobny model w axolotl¹⁸, znanym ze swoich zdolności regeneracyjnych¹⁹, który umożliwia badanie mechanizmów zaangażowanych w naprawę serca u tego czworonoga po uszkodzeniu tkanki, a nie jej usunięciu.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół, jak przeprowadzić zawał mięśnia sercowego wywołany kriouszkodzeniem u aksolotl. Kładziemy szczególny nacisk na szybkie i minimalnie inwazyjne kluczowe etapy, które zwiększają przeżywalność, powrót do zdrowia i odtwarzalność eksperymentalną. Dodatkowo udostępniamy instrukcje dotyczące odpowiednich technik oceny regeneracji anatomicznej in vivo za pomocą echokardiografii i ex vivo przy użyciu bezstronnej histologii ilościowej opartej na stereologii.

Zawał mięśnia sercowego wywołany kriouszkodzeniem u aksolotla może być zastosowany do zbadania podstawowych mechanizmów związanych z regeneracją mięśnia sercowego u tego czworonoga. Aksolotl toleruje zawał mięśnia sercowego wywołany kriourazami, który dotyka co najmniej 45% komory, powodując zmniejszenie objętości wyrzutowej i rzutu serca bez żadnych zmian behawioralnych w jego stosunkowo ospałym trybie życia, jednak poważniejsze urazy potencjalnie doprowadzą do pogorszenia stanu zdrowia zwierząt.

W skrócie, aby wywołać kriouraz, wykonuje się brzuszne nacięcie na klatce piersiowej znieczulonego aksolotl. Dostęp do komory odbywa się za pomocą rozwarstwienia i przez 10 s stosuje się wstępnie schłodzoną kriosondę w celu wywołania kriouszkodzenia. Nacięcie brzuszne jest zszywane, a zwierzę szybko wraca do zdrowia bez oznak zmian behawioralnych po odzyskaniu przytomności. Zwierzęta kontrolne/pozorowane są poddawane podobnemu leczeniu, ale doświadczają nieschłodzonej kriosondy. Wydolność serca można monitorować za pomocą echokardiografii (niezbędne systemy ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości, ≥20 MHz), jak wyczerpująco opisano na zdrowych sercach aksolotla wcześniej²⁰, a frakcję zawału można oszacować nieinwazyjnie i wielokrotnie podczas procesu regeneracji. Serca po zawale mogą być pobierane w dowolnym momencie podczas 3-miesięcznego procesu regeneracji, kriosekcji do histologii i barwione przy użyciu standardowych procedur (np. eozyny i hematoksyliny lub barwienia trichromem Massona). W szczególności barwienie trichromowe Massona pozwala na wyraźne rozróżnienie między zawałem a zdrowymi częściami komory. Frakcja zawału komory jest oznaczana za pomocą technik stereologicznych opisanych wcześniej dla badań kardiologicznych²¹.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny ze wszystkimi instytucjonalnymi (Uniwersytet w Aarhus) i krajowymi (protokół Duńskiego Narodowego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach nr 2015−15−0201−00615) przepisami i wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie kriosondy

1. Utnąć trzy pasma miedzianego drutu o średnicy 1 mm na odcinki o długości 10 cm.
2. Skręcić miedziane pasma w jeden sznur.
3. Za pomocą palnika gazowego stopić jeden koniec miedzianego sznura, aby utworzyć sferyczne zakończenie o średnicy 2 mm.
   UWAGA: Miedź charakteryzuje się wysoką przewodnością cieplną (401 W m^-1 K^-1 w 0 °C) i może być formowana w łatwo zarządzalnych temperaturach (temperatura topnienia 1084,6 °C), jednak powierzchnia miedzi ma tendencję do korozji z upływem czasu, zwłaszcza w kontakcie z krwią, co znacznie obniża przewodność cieplną. W związku z tym miedzianą kriosondę należy okresowo polerować. Alternatywnymi, bardziej stabilnymi metalami, które mogą być również stosowane do produkcji kriosond, są srebro (przewodność cieplna 428 W m^-1 K^-1 w 0 °C, temperatura topnienia 961,8 °C) oraz złoto (przewodność cieplna 318 W m^-1 K^-1 w 0 °C, temperatura topnienia 1064,2 °C).
4. Wyjąć tłok z strzykawki 2-mL i zdjąć miękką gumową głowicę.
5. Przełożyć niesferyczny koniec miedzianego sznura przez strzykawkę i przywiązać go do tłoka.
6. Umieścić tłok z powrotem w strzykawce (Rysunek 1A).
   UWAGA: Gdy kriosonda nie jest używana, miedziany sznur powinien być chroniony poprzez całkowite wycofanie tłoka. Podczas użytkowania tłok jest wsuwany całkowicie, aby wystawić miedziany sznur na działanie łaźni chłodzącej.

2. Zawał mięśnia sercowego indukowany kriourazem

1. Zanurzyć aksolotla w roztworze anestetyku benzokainy o stężeniu 200 mg/L w celu znieczulenia. Trzydziestominutowa kąpiel zapewni ok. 2,5 h całkowitej anestezji.
   UWAGA: Benzokaina nie rozpuszcza się w wodzie, dlatego należy ją najpierw rozpuścić w 3 mL acetonu (na każde 200 mg benzokainy), który następnie dodaje się do kąpieli wodnej. Przedłużone przebywanie w benzokainie może upośledzić wybudzanie, dlatego czas ekspozycji na ten środek należy starannie monitorować.
2. Umieścić aksolotla stroną brzuszną do góry na tacy chirurgicznej (głową w lewą stronę dla chirurga praworęcznego). Unieruchomić zwierzę, owijając wszystkie części ciała z wyjątkiem klatki piersiowej chusteczkami nasączonymi roztworem anestetyku (Rysunek 1B).
   UWAGA: Owinięcie zwierzęcia mokrymi chusteczkami zapewnia wilgotne środowisko, kluczowe dla płazów wodnych, i eliminuje konieczność stosowania maści weterynaryjnej na oczy. W kolejnych krokach należy używać narzędzi autoklawowanych, aby zapewnić sterylność podczas operacji.
3. Za pomocą nożyczek do irydektomii wykonać nacięcie skóry o długości ok. 1 cm wzdłuż osi ciała, lekko na prawo od linii środkowej klatki piersiowej (Rysunek 1C).
4. Za pomocą pęsety uwolnić płytki chrzęstne obręczy barkowej.
   UWAGA: Obręcz barkowa jest strukturą delikatną; należy uważać, aby nie uszkodzić jej elementów, ponieważ może to upośledzić późniejsze gojenie rany, lokomocję oraz dobrostan zwierzęcia.
5. Ostrożnie otworzyć odsłonięte osierdzie nacięciem, nie uszkadzając leżących poniżej struktur serca. Zanim płyn z osierdzia wypłynie, odessać go do strzykawki 1 mL z tępą igłą 2 Gauge (Rysunek 1D).
6. Wprowadzić do rany tępą pęsetę z ustalonym rozwarciem (ok. 1 cm), aby rozsunąć brzegi rany i płytki chrzęstne (Rysunek 1E).
7. Umieścić kriosondę w ciekłym N₂ z odsłoniętym miedzianym drutem na co najmniej 2 minuty.
   UWAGA: Jeśli masa miedzianego drutu jest zbyt mała (tzn. jest zbyt krótki) lub jeśli zostanie niedostatecznie schłodzony, może dojść do niepożądanego, niepełnego transmuralnego uszkodzenia kriogenicznego.
8. Delikatnie osuszyć odsłoniętą komorę za pomocą patyczka bawełnianego lub ciasno zwiniętych chusteczek, aby upewnić się, że na powierzchni komory nie ma płynu (Rysunek 1F).
9. Wyjąć kriosondę schłodzoną do -196 °C z ciekłego N₂ i przyłożyć ją bezpośrednio do odsłoniętej komory (Rysunek 1H). Sonda przywrze do komory. Kriosondę należy umieścić po bocznej stronie komory w kierunku wierzchołka, aby uniknąć uszkodzenia innych struktur serca i umożliwić późniejsze wykonanie przekrojów poprzecznych do mikroskopii, zawierających zarówno zdrowe, jak i zawałowe mięsień sercowy. Po 10 s nanieść wcześniej zebrany płyn z osierdzia na końcówkę kriosondy (Rysunek 1I). Spowoduje to rozmrożenie sondy i umożliwi jej oddzielenie od komory.
   UWAGA: Przyłożenie kriosondy do komory z nadmiarem wody prowadzi albo do niepełnego zawału kriogenicznego (jeśli sonda ogrzeje się zbyt szybko), albo do zbyt rozległego uszkodzenia mięśnia sercowego (jeśli cienka warstwa wody pokrywająca całą powierzchnię komory zostanie błyskawicznie zamrożona). Żadna z tych sytuacji nie jest pożądana. W przypadku pomyślnego wywołania uszkodzenia kriogenicznego na komorze pojawi się mały, czerwony, okrągły obrzęk (Rysunek 1J). W przypadku zwierząt z grupy kontrolnej (sham), niechłodzoną kriosondę przykładamy w ten sam sposób przez 10 s (Rysunek 1G).
10. Nałożyć osierdzie na komorę, usunąć pęsetę rozszerzającą ranę i ułożyć płytki chrzęstne obręczy barkowej.
    UWAGA: Jeśli planowane jest późniejsze badanie echokardiograficzne w celu oceny funkcji serca, kluczowe jest usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza, nawet tych drobnych, które mogą powstawać pod płytkami chrzęstnymi, ponieważ powodują one artefakty obrazowania. Pęcherzyki te można usunąć poprzez delikatne uciśnięcie tkanek lub poprzez naniesienie na powierzchnię rany autoklawowanego roztworu Ringera dla płazów (6,6 g/L NaCl, 0,15 g/L KCl, 0,15 g/L CaCl₂, 0,2 g/L NaHCO₃ w wodzie destylowanej), aby rozpuścić pęcherzyki powietrza.
11. Zszyć skórę (3-5 szwów) przy użyciu nici rozpuszczalnej (6-0) (Rysunek 1K).
12. Przykryć obszar operacyjny wilgotnymi chusteczkami uniesionymi nad raną, a następnie nasączyć je roztworem anestetyku.
13. Umieścić tacę chirurgiczną ze zwierzęciem na lodzie na 2 h, aby umożliwić początkowe sformowanie naskórka rany i zamknięcie brzegów rany przed wystawieniem zwierzęcia na niesterylne środowisko wodne.
14. Przenieść zwierzę do czystego pojemnika z wodą akwariową. Do tego czasu zwierzę powinno odzyskiwać przytomność. Obserwować zwierzę do momentu pełnego odzyskania przytomności i skoordynowanych ruchów. Przez dwa dni po operacji zaprzestać karmienia i wymiany wody oraz trzymać aksolotla samotnie we własnym akwarium, aby umożliwić zamknięcie rany przed ponownym wprowadzeniem czynników stresogennych.
    UWAGA: Po odzyskaniu przytomności większość aksolotli wykazuje chęć połykania powietrza. Aby ułatwić ten proces i ograniczyć potrzebę ruchu, pomocne może być obniżenie poziomu wody w akwarium krótko po operacji oraz przez 1-2 dni po zabiegu. Niskie stężenie benzokainy (20 mg/L) może być stosowane jako środek przeciwbólowy przez 24 h po operacji.

3. Nieinwazyjny pomiar frakcji zawału za pomocą echokardiografii

1. Zanurz axolotla w środku znieczulającym zgodnie z opisem w kroku 2.1.
2. Umieść zwierzę w pozycji na plecach w małym pojemniku z 3-5 mm roztworu znieczulającego pokrywającego powierzchnię brzuszną.
3. Umieść przetwornik ultradźwiękowy wzdłuż osi długiej zwierzęcia, nieco na prawo od linii środkowej klatki piersiowej.
4. W celu dwuwymiarowej oceny frakcji zawału [IF(ultrasound, 2D)], przesuwaj przetwornik, aż strefa zawału i komora będą maksymalnie widoczne w trybie B (Rycina 2A-D, Materiał uzupełniający 1-2).
5. Nagraj ≥3 cykle serca z częstotliwością > 50 klatek/s.
6. Zmierz pole przekroju poprzecznego komory (CSAv) oraz strefy zawału (CSAi) w końcowej rozkurczu i oszacuj dwuwymiarową frakcję zawału, przyjmując sferyczny kształt komory i półsferyczny kształt strefy zawału, korzystając z równania:
   (1)
   UWAGA: Aby ocenić założenia geometryczne dotyczące kształtu komory i strefy zawału, przetwornik można obrócić o 90˚, aby wyświetlić obraz serca w osi krótkiej (Rycina 2E-F, Materiał uzupełniający 3).
7. W przypadku trójwymiarowej oceny frakcji zawału, przesuń przetwornik w lewo lub w prawo, aż w polu widzenia pojawi się tylko niewielka część komory w końcowej fazie rozkurczu komory.
8. W krokach (z) o wielkości 0,5 mm (dla małych zwierząt, masa ciała ≤ 20 g) lub 1 mm (duże zwierzęta, masa ciała > 20 g) przesuwaj przetwornik przez komorę i rejestruj co najmniej 3 cykle serca na każdy krok/przekrój.
   UWAGA: Dla uzyskania odpowiedniej precyzji należy zarejestrować od 8 do 12 przekrojów (n).
9. Zmierz CSAv i CSAi w końcowej rozkurczu dla każdego przekroju (j) i oszacuj trójwymiarową frakcję zawału [IF(ultrasound, 3D)] bez żadnych założeń geometrycznych co do kształtu komory i zawału, korzystając z równania:
   (2)
   UWAGA: Zarówno akwizycja dwuwymiarowa, jak i trójwymiarowa mogą być wykorzystane do geometrycznego pomiaru funkcji serca (objętość wyrzutowa i rzut serca), jak opisano w sekcjach 3 i 6 pracy Dittrich et al. (2018)²⁰. Podobnie, całki prędkości w czasie uzyskane za pomocą fali impulsowej (Rycina 2G) mogą być również użyte do pomiaru funkcji serca, zgodnie z opisem w sekcji 3 pracy Dittrich et al. (2018)²⁰.
10. Wyodrębnij obszary zainteresowania wyznaczonych w kroku 3.9 CSAv i CSAi jako maski binarne z odstępem z między przekrojami, aby stworzyć trójwymiarowy model komory i strefy zawału w końcowej rozkurczu i końcowej skurczu (Rycina 2H, Materiał uzupełniający 4).

4. Obiektywna analiza histologiczna ilościowa w celu pomiaru frakcji zawału

1. Wyeksponować serce znieczulonego aksolotla zgodnie z opisem w krokach 2.2 – 2.6.
2. Używając strzykawki 1-mL wyposażonej w igłę 26G, powoli wstrzyknąć do zatoki żylnej 5 µL/g masy ciała heparynowanego roztworu Ringera dla płazów o stężeniu 1000 IU/mL i odczekać 2 min, aby przeciwkrzepliwo rozprowadziło się w krwiobiegu.
3. Eutanazować zwierzę poprzez dekapitację i zniszczenie rdzenia przedłużonego, a następnie wyciąć całe serce, przecinając najpierw naczynia doprowadzające, a potem trakt odpływowy.
4. Przenieść serce do szalki Petriego o wymiarach 60 × 15 mm² zawierającej roztwór Ringera dla płazów, delikatnie podnosząc je za trakt odpływowy.
5. Pod powiększeniem wypłukać pozostałą w sercu krew, delikatnie wypełniając zatokę żylną heparynowanym roztworem Ringera o stężeniu 100 IU/mL.
   UWAGA: Chociaż prefiksację serca można przeprowadzić poprzez perfuzję buforowanym formalinem lub paraformaldehydem, nie jest ona konieczna, ponieważ sekcjonowanie odbywa się w temperaturze zamrażania. Następnie można przeprowadzić fiksację przekrojów na szkiełkach przedmiotowych. Całkowicie wypłukane serce powinno mieć blady, białawy kolor i nie zawierać śladów erytrocytów. Na powierzchni komory i przedsionków mogą utworzyć się niewielkie skrzepy krwi. Nie wpływają one na precyzję w późniejszej procedurze histologii ilościowej.
6. Przenieść serce na beztkankowy papier do osuszania i pozostawić na 1 min.
7. Przygotować kriotykiel o odpowiednim rozmiarze, nakładając jedną kroplę związku OCT (optimal cutting temperature compound), a następnie przenieść serce do kropli. Delikatnie docisnąć serce do dna.
8. Dodać więcej związku OCT, aby wypełnić kriotykiel, upewniając się, że komora znajduje się na dnie. Pozostawić formę na 5 min, aby związek OCT rozprowadził się w próbce.
9. Szybko zamrozić formę, kładąc ją na pokrywce pudełka z końcówkami do pipet pływającej na ciekłym azocie.
   UWAGA: W celu bardziej kontrolowanego szybkiego zamrażania serca można przechowywać przez 1 h do nocy w 10-30% roztworze sacharozy, a zamrażanie przeprowadzić w izopentanie (2-metylobutan) chłodzonym ciekłym azotem. W naszym doświadczeniu wynik końcowy nie różni się znacząco.
10. Kondycjonować kriotykiel w kriotomie ustawionym na -18 do -22 °C przez co najmniej 1 h przed sekcjonowaniem.
11. Wyciąć przekroje próbki o grubości 10 µm i zbierać co 10^ty przekrój, aby uzyskać grubość bloku (t) wynoszącą 100 µm. Kontynuować sekcjonowanie, aż zostanie wycięte całe serce.
    UWAGA: Można zastosować inną grubość przekrojów i bloków, jednak ważne jest, aby zbieranie przekrojów rozpoczęło się w momencie, gdy ostrze dotknie komory, oraz aby całe serce zostało pocięte na co najmniej 10-12 równomiernie rozmieszczonych bloków. Aby uzyskać zestawy powtórzeń, można zbierać więcej niż jeden przekrój na blok.
12. Przebarwić przekroje tkankowe zgodnie ze standardowymi protokołami dla hematoksyliny i eozyny lub trichromu Massona, aby uzyskać wyraźne rozróżnienie między osierdziem, mięśniem sercowym, zastawkami i strefą zawału.
13. Zdigitalizować przekroje tkanek za pomocą mikroskopu z kamerą lub skanera do szkiełek przy powiększeniu wystarczającym do wyraźnego ukazania trabekularnej struktury komory aksolotla (Ryc. 2I).
14. Wczytać stos obrazów do programu ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) i uruchomić wtyczkę cell counter (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
15. Uruchomić makro wielozadaniowej siatki (https://imagej.nih.gov/ij/macros/Multipurpose_grid.txt) i wygenerować siatkę punktową o odpowiedniej gęstości.
    UWAGA: Gęstość siatki (pole siatki) zależy od wielkości i morfologii próbki. Aby zapewnić pożądaną precyzję, należy zagwarantować co najmniej 100-200 przecięć punktów siatki z każdą z badanych struktur.
16. Policzyć liczbę przecięć siatki punktowej ze strukturami zainteresowania, korzystając z wtyczki cell counter (Ryc. 2I, powiększenie po prawej).
    UWAGA: Dla zachowania precyzji ważne jest, aby uwzględniać tylko te przecięcia, które znajdują się dokładnie w punkcie celowania celownika.
17. Obliczyć frakcję zawału na podstawie zdefiniowanego obszaru siatki punktowej [Ai(p) i Av(p)], grubości bloku oraz liczby przecięć siatki punktowej w każdym bloku (P_j) z zawałowym mięśniem sercowym i całkowitym mięśniem komory, korzystając ze wzoru:
    (3)

Wyniki

U aksolotli o masie ciała 11,8 ± 1,3 g i całkowitej długości 11,8 ± 0,5 cm procedura krioobrazowania wykonana za pomocą kriosondy o średnicy 2 mm skutkuje powstaniem obszaru zawału obejmującego 45,4 ± 14,2% mięśnia komór serca w 7. dniu po urazie, w którym strefa zawału jest w pełni rozwinięta [Rycyna 2I, porównaj przekrój zdrowego serca przed zawałem (góra) i 7 dni po zawale (dół)]. Wskaźnik śmiertelności dla tej procedury wynosi 2,2% (2/90 zwierząt). Procedura ta prowadzi do powstania wyraźnie zdefiniowanej strefy uszkodzenia, którą można wizualizować, kwantyfikować i modelować za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii (Rycina 2C-H, materiały uzupełniające 1-4). Początkowo wywołany krioobrazowaniem zawał mięśnia sercowego znacząco wpływa na funkcję serca, redukując objętość wyrzutową do 62,2% oraz rzut serca do 73,9% w 7. dniu po urazie w porównaniu do stanu przed urazem, z stopniowym powrotem do pierwotnej formy i funkcji w ciągu trzech miesięcy (dane nie zostały przedstawione). U stosunkowo spokojnych aksolotli nie obserwuje się zmian behawioralnych po krioobrazowaniu mięśnia sercowego.

Rycina 1: Procedura krioztwardnienia. A, niestandardowa kriosonda wykonana poprzez zwinięcie trzech miedzianych drutów, przetopienie końcówki w kształt kuli i przymocowanie drutu do tłoka strzykawki 2,5-mL. B-L, procedura krioztwardnienia. Po owinięciu wszystkich części ciała z wyjątkiem strefy operacyjnej mokrymi chusteczkami do tkanek (B), za pomocą nożyczek do irydektomii (C) wykonuje się nacięcie brzuszne w obrębie klatki piersiowej, nieco na prawo od linii środkowej (pokazane na B), a pas piersiowy zostaje uwolniony poprzez sekcję kikutową. Osierdzie jest delikatnie otwierane nacięciem, a płyn osierdziowy jest odsysany do strzykawki 1-mL za pomocą tępiej igły 23-gauge (D). Komora zostaje odsłonięta, a ranę utrzymuje się otwartą za pomocą pęsety o określonej szerokości rozwarcia (E), a wszelki pozostały płyn na komorze jest wycierany (F). W przypadku operacji pozorowanej (sham) niechłodzoną kriosondę (G) aplikuje się w ten sam sposób, co w przypadku krioobrażenia, w którym kriosonda schłodzona w ciekłym azocie (-196 °C) jest aplikowana do ściany bocznej komory w stronę wierzchołka (H). Po 10 s płyn osierdziowy jest ponownie aplikowany na kriosondę, aby oddzielić ją od komory (I). Daje to wyraźnie zdefiniowaną strefę krioobrażenia (J). Na koniec osierdzie i pas piersiowy są ułożone na sercu, a skórę zszywa się (3-5 szwów) nicią rozpuszczalną (K). Zwierzę pozostawia się na lodzie przez 2 godziny, aby zainicjować proces gojenia rany (L). Kierunek kranialny znajduje się po lewej stronie na B-L, co reprezentuje orientację zwierzęcia dla chirurga praworęcznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Przewidywane wyniki.A i B, obrazy B-mode w osi długiej zdrowej komory axolotla w fazie rozkurczu (A) i skurczu (B). C i D, obrazy B-mode w osi długiej komory axolotla po krioobłędzie (2 dni po urazie) w fazie rozkurczu (C) i skurczu (D). E i F, obrazy B-mode w osi krótkiej komory axolotla po krioobłędzie (2 dni po urazie) w fazie rozkurczu (E) i skurczu (F). G, całki prędkości w czasie uzyskane za pomocą Dopplera impulsowego dla serca przed zawałem (góra) i 2 dni po zawale (dół). H, modelowanie serca przed zawałem i 2 dni po zawale na podstawie trójwymiarowego obrazowania ultradźwiękowego. I, reprezentatywne poprzeczne przekroje histologiczne przez komorę axolotla 4 dni po zabiegu pozorowanym (góra) i 7 dni po zawale (dół), barwione trichromem Massona. Powiększenie po prawej stronie pokazuje siatkę punktową do stereologicznego pomiaru frakcji zawału. Punkty zaznaczone niebieskimi i czerwonymi okręgami reprezentują przecięcie z tkanką zdrową (niebieskie okręgi) i zawałową (czerwone okręgi). Kierunek kranialny znajduje się po prawej stronie w A-D, a prawa strona zwierzęcia znajduje się po lewej stronie w E-F, co odpowiada konwencjonalnemu sposobowi wyświetlania obrazów echokardiograficznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Materiał uzupełniający 1: Oś długa, zdrowa komora przed zawałem, tryb B (patrz Rysunek 2A-B). Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Materiał uzupełniający 2: Długa oś, zawał komory (2 dni po zawale), tryb B (patrz Rysunek 2C-D). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Materiał uzupełniający 3: Oś krótka, zawał komory (2 dni po zawale), tryb B (patrz Rysunek 2E-F). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Materiał uzupełniający 4: Trójwymiarowe modele interaktywne tego samego serca, przedstawionego na Rysunku 2A-H oraz w materiałach uzupełniających 1-3, przed i po zawale. Plik interaktywnego PDF należy uruchomić w programie Adobe Acrobat Reader 9 lub nowszym. Aby aktywować funkcję 3D, należy kliknąć model. Model można obracać, powiększać i przesuwać za pomocą kursora. W drzewie modelu po lewej stronie ekranu wszystkie segmenty można aktywować/dezaktywować lub uczynić przezroczystymi. Drzewo modelu ma strukturę hierarchiczną zawierającą kilka podwarstw, które można otworzyć (wybierając znak +). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Aby zminimalizować zmienność eksperymentalną, zabieg chirurgiczny kriouszkodzenia powinien przebiegać zgodnie ze sterylnymi procedurami, a szkolenie chirurgiczne powinno być przeprowadzone na wielu zwierzętach przed próbą wykorzystania zwierząt do określonych eksperymentów regeneracyjnych. Dzięki treningowi zabieg kriourazów można przeprowadzić na wielu osobach o różnych rozmiarach i wieku, od osobników młodocianych (5 g, 7 cm) do dużych dorosłych (100 g, 25 cm). Bardzo ważne jest, aby kriosonda miała wystarczający rozmiar i była odpowiednio chłodzona, aby zapewnić solidne i powtarzalne kriouszkodzenie komory aksolotl. W przypadku bardzo małych zwierząt (5-8 g, 7-9 cm) kriosonda może być skonstruowana o mniejszej średnicy. Chociaż konieczne jest, aby protokół kriourazów był przeprowadzany przy użyciu środka znieczulającego o właściwościach przeciwbólowych, takich jak benzokaina i MS-222 (lub z dodatkowym zastosowaniem wtórnego środka przeciwbólowego), kontrolna echokardiografia może być przeprowadzona z innymi środkami znieczulającymi o ograniczonych właściwościach przeciwbólowych, takimi jak propofol, który został opisany jako wpływający na czynność serca w mniejszym stopniu niż benzokaina i MS-222 w aksolotlu²².

Procedura kriouszkodzenia jest ograniczona w tym sensie, że nie powoduje zawału mięśnia sercowego wywołanego niedokrwieniem przez niedrożność tętnic wieńcowych w taki sam sposób, jak zabiegi podwiązania tętnic wieńcowych, które bardziej przypominają kliniczne przypadki zawału mięśnia sercowego u ludzi. Jednak metoda oparta na podwiązaniu nie ma zastosowania w sercu z belekułą, z bardzo małym unaczynieniem wieńcowym i głównie dopływem tlenu w światło. Opisano również zawał mięśnia sercowego wywołany kriouszkodzeniem, aby podsumować większość patologicznych konsekwencji zawałów mięśnia sercowego wywołanych niedokrwieniem^14,16. Strefa uszkodzenia generowana przez kriourazę jest silnie zlokalizowana w tkance w pobliżu kriosondy i chociaż nie przypomina to złożonego i rozgałęzionego zawału wynikającego z niedrożności naczyń wieńcowych, jest korzystna w warunkach eksperymentalnych, ponieważ można łatwo rozpoznać strefę graniczną między zdrową tkanką a zawałem i można badać postęp nowo powstałych kardiomiocytów.

Aksolotl jest znacznie większym zwierzęciem niż danio pręgowany, z bardziej skomplikowanym układem sercowo-naczyniowym, w tym sercem składającym się z trzech komór (dwóch przedsionków, jednej komory) i funkcjonalnym, choć nie anatomicznym, oddzieleniem przepływu krwi w prądach natlenionych i odtlenionych²³ w porównaniu z dwukomorowym sercem i szeregowym systemem przepływu znajdującym się w teleostach. Opisana wcześniej procedura kriouszkodzenia u danio pręgowanego nie polega na pooperacyjnym zszywaniu naciętej powierzchni brzusznej^16,17. Jest to konieczne w przypadku aksolotla w celu uniknięcia niepotrzebnego narażenia serca na niesterylne środowisko wodne w środowisku laboratoryjnym zwierzęcia.

Bezstronna histologia ilościowa oparta na stereologii jest obecnie niedostatecznie opisana w dziedzinie regeneracji, w której większość ilościowych pomiarów frakcji zawału opiera się na obszarze pobieranym na podstawie przekroju histologicznego w środkowej strefie zawału, a w niektórych przypadkach dwóch sąsiednich odcinków²⁴. Ponieważ koncepcja stereologii może być stosowana w badaniach histologicznych u dowolnego gatunku modelowego w celu zapewnienia bardziej solidnych i bezstronnych pomiarów, proponujemy, aby ta swobodnie dostępna metoda została włączona do ilościowych ocen regeneracji serca nie tylko u aksolotla, ale u wszystkich gatunków regeneracyjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
S& T Nożyce SAS-15	S& T AG - Instrumenty mikrochirurgiczne Nożyczki		do irydektomii
Vevo 2100	Fujifilm, VisualSonics		Skaner ultrasonograficzny wysokiej częstotliwości