Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61980

⸱

3 kwietnia 2021

 ,  , 
1Institute of Physiology, Christian-Albrechts-University Kiel

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Streszczenie

Chociaż ogólna architektura hipokampa jest podobna wzdłuż jego osi podłużnej, ostatnie badania wykazały wyraźne różnice w kryteriach molekularnych, anatomicznych i funkcjonalnych, sugerując podział na różne podobwody wzdłuż jego rozciągłości rostro-ogonowej. Ze względu na zróżnicowaną łączność i funkcję najbardziej fundamentalne rozróżnienie występuje między hipokampem grzbietowym i brzusznym, które są preferencyjnie zaangażowane odpowiednio w przetwarzanie przestrzenne i emocjonalne. W związku z tym prace in vivo dotyczące tworzenia pamięci przestrzennej skupiły się na grzbietowym hipokampie.

Dla kontrastu, elektrofizjologiczne zapisy in vitro były preferencyjnie wykonywane na pośrednio-brzusznym hipokampie, głównie motywowane takimi czynnikami jak żywotność plasterków i integralność obwodu. Aby umożliwić bezpośrednią korelację danych in vivo dotyczących przetwarzania przestrzennego z danymi in vitro, dostosowaliśmy poprzednie metody sekcji, aby uzyskać wysoce żywotne poprzeczne wycinki mózgu z grzbietowo-pośredniego hipokampa do długoterminowych zapisów głównych komórek i interneuronów w zakręcie zębatym. Ponieważ zachowania przestrzenne są rutynowo analizowane u dorosłych myszy, połączyliśmy tę procedurę przekrojowego krojenia z zastosowaniem roztworów ochronnych w celu zwiększenia żywotności tkanki mózgowej dojrzałych zwierząt. Stosujemy to podejście dla myszy w wieku około 3 miesięcy. Metoda ta stanowi dobrą alternatywę dla preparatu koronalnego, który jest często stosowany w badaniach in vitro na grzbietowym hipokampie. Porównujemy te dwa preparaty pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Wprowadzenie

Hipokamp był intensywnie badany pod kątem jego kluczowej roli w różnych aspektach uczenia się i pamięci, nawigacji przestrzennej oraz emocji. Podstawowy obwód hipokampa, powszechnie nazywany "obwodem trisynaptycznym", to sieć blaszkowata w osi poprzecznej, która jest w dużej mierze zachowana wzdłuż osi podłużnej1. Wkład hipokampa w różne zachowania poznawcze i emocjonalne prawdopodobnie wynika z różnorodnych połączeń, które ten podstawowy obwód tworzy wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej z kilkoma innymi obszarami mózgu2,3. Jednak poza łącznością aferentną i odprowadzającą, coraz więcej badań wskazuje na dalsze różnice wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej hipokampa. Różnice te dotyczą wewnętrznej architektury i łączności, a także różnic we wzorcach ekspresji genów i morfologii neuronów4,5,6,7,8.

Biorąc pod uwagę istnienie takich różnic w podstawowych obwodach, rozsądne jest wybranie konkretnego podobwodu hipokampa do zbadania zgodnie z pytaniami, które są poruszane. Jeśli na przykład pytanie dotyczy mechanizmów neuronalnych zaangażowanych w przetwarzanie przestrzenne, interesujący jest hipokamp grzbietowy, a nie brzuszny, chociaż oba nie działają niezależnie in vivo ze względu na podłużną łączność wewnątrz hipokampa9,10,11. W związku z tym należy wziąć pod uwagę nie tylko różnice wzdłuż osi podłużnej, ale także należy zachować ostrożność, aby jak najlepiej zachować obwody lokalne i dalekiego zasięgu. Dla zachowania ścieżek włókien i łączności niezbędny jest kąt, pod którym mózg zostanie przecięty.

Pierwsza metoda opisana w literaturze, która obejmowała obwód tryzynaptyczny, najpierw odizolowała hipokamp od mózgu, a następnie wykonała poprzeczne przekroje (prostopadłe do osi podłużnych) za pomocą rozdrabniacza tkanek12 i vibratome13. Późniejsi fizjolodzy woleli uzyskiwać wycinki z całego bloku mózgu, aby zachować również sąsiednie struktury mózgowe połączone z hipokampem. Dla tych preparatów blokowych opracowano różne kąty przekroju w odniesieniu do hipokampa, takie jak przygotowanie warstwy koronalnej14 lub poziome przygotowanie warstwy o nazwie HEC slice w celu zachowania połączeń kory hipokampowo-śródwęchowej15,16,17.

W ostatnim przygotowaniu płat ciemieniowy jest cięty pod kątem 0° lub 12° w stosunku do płaszczyzny poziomej wzdłuż osi rostro-ogonowej, tworząc podstawę bloku. Plastry są następnie zbierane, zaczynając od brzusznej powierzchni mózgu, co pozwala głównie na zbieranie pośrednich brzusznych obszarów hipokampa. Metoda ta stała się najpopularniejszym wyborem do badań fizjologicznych i może być niezawodnie wykonywana zgodnie z kilkoma opublikowanymi protokołami18,19,20.

Jednakże, jeśli zainteresowanie badawcze dotyczy konkretnych aspektów uczenia się przestrzennego, grzbietowy hipokamp może być bardziej odpowiednim regionem badań i przydatne byłoby znalezienie procedury krojenia o podobnej jakości dla tego obszaru hipokampa. Opracowano kilka protokołów, które koncentrują się na samym biegunie rostralnym, które mogą zaspokoić to zapotrzebowanie 21,22.

W tym protokole, zamiast tego, opisujemy podejście do uzyskania żywotnych przekrojów poprzecznych z grzbietowo-pośredniego hipokampa, które wykorzystuje kąt przekroju opisany wcześniej dla przygotowań poziomych18,19 (Rysunek 1A&B). Jakość tego protokołu pokazujemy porównując zapisy elektrofizjologiczne i rekonstrukcje morfologiczne w tym preparacie z tymi uzyskanymi w plastrach koronalnych. Protokół ten jest szczególnie odpowiedni do łączenia z eksperymentami anatomicznymi i behawioralnymi na dorosłych myszach (w naszym przypadku w wieku trzech miesięcy).

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt doświadczalnych były zgodne z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt i zatwierdzone przez komisję etyki uniwersytetu w Kilonii. Myszy Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre) 23 (Jackson laboratories, numer repozytorium 008069) utrzymywano jako heterozygotyczne kolonie lub krzyżowano z myszami reporterowymi Ai9 Cre24 (Jackson laboratories, numer repozytorium 007909). Użyto samic i samców myszy między P40-P90. Myszy utrzymywano w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w standardowych warunkach grupowych i dostarczano im jedzenie i wodę ad libitum.

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Przygotuj świeże roztwory na każdy dzień eksperymentalny używając wody ultraczystej (UPW) (rezystywność w temperaturze 25 °C 18,2 MΩcm). Roztwory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C maksymalnie przez jeden dzień. Roztwory magnezu i wapnia mogą być przechowywane oddzielnie jako 1 M roztwory podstawowe. Wszystkie roztwory robocze muszą być nasycone karbogenem (95% O2:5% CO2 ) w celu optymalnego natlenienia i utrzymania pH przed i w trakcie użytkowania.

  1. Przygotuj roztwór tnący (500 ml na mysz) (w mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 5 Na-askorbinian, 4 Na-pirogronian, 0,5 CaCl2·2H2O i 10 MgSO4·7H2O. Miareczkować do pH 7,4 pod kapturem chemicznym za pomocą 4-5 ml 16% kwasu solnego przed dodaniem kationów dwuwartościowych. Pozwoli to uniknąć wytrącania się MgSO4,
    UWAGA: KCl i NaH2PO4 mogą być przechowywane jako 10x roztwory w temperaturze 4°C. Wykonujemy dwie indywidualne partie roztworu do cięcia. Jeden dzień przed nagraniem (przechowywany w zamrażarce przez noc w celu wytworzenia kruszonego lodu) i jeden w dniu nagrania.
  2. Przygotować roztwór do przechowywania (250 ml na mysz) (w mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 5 Na-askorbinian, 4 Na-pirogronian, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O. Miareczkować do pH 7,3-7,4 za pomocą 1 N NaOH.
    UWAGA: NaCl, KCl i NaH2PO4 mogą być przechowywane w postaci 10x roztworu w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować ACSF do zapisu (w mM): 122 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukozy, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O, 2 Na-askorbinian, 4 Na-pirogronian. Miareczkować pH do 7,3-7,4 za pomocą 1 N NaOH.
    UWAGA: NaCl, KCl i NaH2PO4 można łączyć w 10-krotnym roztworze podstawowym w temperaturze 4°C.

2. Przygotowanie ławki do krojenia

  1. Przygotować na lodzie zlewkę (150 ml) i dwie szklane szalki Petriego (o średnicy 10 cm) i napełnić je świeżym roztworem do krojenia. Utrzymuj roztwór natleniony za pomocą urządzenia do bulgotania karbogenu (perforowana rurka lub kamień napowietrzający podłączony do systemu karbogenicznego).
    UWAGA: Roztwór w zlewce zostanie użyty do perfuzji, podczas gdy szalki Petriego zostaną użyte podczas procedury cięcia.
  2. Wyposaż stół operacyjny w ostrze ze stali nierdzewnej, pęsetę z zaokrągloną końcówką, pęsetę z cienką końcówką, duże nożyczki, małe nożyczki, dużą metalową szpatułkę, cienką metalową szpatułkę, pędzel, płytkę wibratomu i klej cyjanoakrylowy lub mniej toksyczny klej cyjanoakrylowy n-butyloestrowy. Zanurz ostrze ze stali nierdzewnej i kawałek bibuły filtracyjnej w jednej ze szklanych szalek Petriego na lodzie. Ten Petri zostanie użyty do przecięcia mózgu. Narysuj trzy równoległe linie na spodzie plastikowej szalki Petriego i umieść tę szalkę blisko narzędzi chirurgicznych.
  3. Przygotuj zestaw do perfuzji przezsercowej zgodnie z opublikowanymi protokołami25.
  4. Przygotuj wibratom, montując nowe ostrze na uchwycie ostrza i ustaw parametry cięcia (kąt ostrza od płaszczyzny poziomej 17°, amplituda oscylacji ostrza 1,5 mm, prędkość ruchu ostrza do przodu około 2 mm min-1, częstotliwość oscylacji 90 Hz, grubość przekroju 350 μm). Napełnij tackę wibratomu lodowatym roztworem do cięcia i utrzymuj ją pod stałym natlenieniem.
    UWAGA: Dodajemy kruszony lód wykonany z pierwszej partii roztworu do cięcia do schłodzonego świeżego roztworu do cięcia, aby utrzymać niską temperaturę. Zwróć uwagę, aby podczas krojenia nie dopuścić do lodu z ostrza.
  5. Przygotować komorę inkubacyjną wypełnioną roztworem tnącym pod stałym natlenieniem. Umieścić komorę w podgrzanej łaźni wodnej (35 °C).
    UWAGA: Przykład komory inkubacyjnej można znaleźć w Edwards and Konnerth (1992)26.
  6. Przygotuj komorę do przechowywania plastrów wypełnioną roztworem do przechowywania i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej i pod stałym natlenieniem. W przypadku, gdy w tkance występuje ekspresja białka fluorescencyjnego lub aktywowanej światłem opsyny, zaleca się trzymanie komory w ciemności, na przykład w pudełku.
    UWAGA: komora magazynowa z wieloma niezależnymi studzienkami jest przydatna do rozróżnienia poziomu plastrów wzdłuż grzbietowo-brzusznej osi hipokampa. Można zbudować komorę na zamówienie (Rysunek 1D). Weź kawałek siatki dystansowej fiolki z pudełka do przechowywania fiolek kriogenicznych 81x i przyklej spód do nylonowej siatki. Włóż górną jedną trzecią plastikowej końcówki pipety o pojemności 5 ml do środka tej siatki, tak aby wystawała na około 3 cm u dołu. Ta plastikowa końcówka służy jako podstawka siatki, a później utrzymuje rurę przewodzącą powietrze w celu natlenienia. Włóż siatkę wraz ze stojakiem do cylindrycznego plastikowego pudełka (np. opakowania filtrów strzykawkowych), aby nie mogła się przechylać ani chwiać. Zbiornik ten pomieści 250 ml roztworu do przechowywania.

3. Przygotowanie plastrów hipokampa

  1. Znieczulij mysz w komorze pudełkowej za pomocą izofluranu (około 0,5 ml) pod maską. Pozostaw mysz w odpoczynku, aż oddech będzie powolny i regularny (około 2-3 minut). Przetestuj brak reakcji bólowych przy szczypnięciu palca u nogi.
  2. Przeprowadź perfuzję przezsercową przy użyciu 25 ml gazowanego roztworu tnącego ze zlewki na lodzie zgodnie z opublikowanymi protokołami25,27. Ten krok jest zalecany, aby szybko schłodzić mózg i szybko spowolnić metabolizm neuronów.
  3. Odetnij głowę zwierzęcia za pomocą dużych nożyczek i umieść głowę na schłodzonej szalce Petriego na lodzie zawierającym roztwór do cięcia.
  4. Otwórz skórę cienkimi nożyczkami, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj małe boczne nacięcia u podstawy czaszki po obu stronach otworu wielkiego. Następnie przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od otworu wielkiego, aż do szwu nosowo-czołowego nad opuszką węchową. Podciągnij nożyczki podczas cięcia strzałkowego, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki mózgowej.
    UWAGA: Trzymanie głowicy zanurzonej w roztworze tnącym pomaga oczyścić ją z krwi i utrzymuje niską temperaturę.
  5. Użyj pęsety z zaokrągloną końcówką, aby podciągnąć kości ciemieniowe, aby odsłonić mózg. Zwróć uwagę, aby złapać i usunąć opony mózgowe. Pozostawione mogą uszkodzić mózg podczas ekstrakcji.
  6. Użyj małej szpatułki, aby delikatnie zgarnąć mózg na drugą szalkę Petriego.
  7. Przetnij mózg na pół wzdłuż podłużnej szczeliny za pomocą wstępnie schłodzonego ostrza.
  8. Użyj dużej szpatułki, aby podnieść jedną półkulę z roztworu tnącego na plastikową szalkę Petriego. Gdy półkula leży na jej przyśrodkowej powierzchni, wyrównaj korę ciemieniową z jedną z równoległych linii, aby mieć odniesienie do drugiego cięcia, jak pokazano na Rysunek 1B.
  9. Wykonaj drugie cięcie w brzusznej części półkuli, ustawiając ostrze równolegle do linii, aby uzyskać powierzchnię, która jest później używana do przyklejenia mózgu do uchwytu próbki (patrz następny krok), jak pokazano w Rysunek 1B. Włóż półkulę z powrotem do natlenionego roztworu tnącego szklanej szalki Petriego i wykonaj tę samą procedurę na drugiej półkuli.
  10. Przyklej półkule świeżo przyciętą stroną brzuszną do uchwytu na wibratom-próbkę za pomocą kleju. Nałóż kilka kropel roztworu tnącego na półkule, aby zestalić klej i przenieś uchwyt próbki do tacki z wibratomem. W ten sposób krojenie będzie przebiegać od grzbietu do brzusznego hipokampa.
  11. Usuń początkowy jeden lub dwa niepoprzeczne plasterki (Rysunek 1C,ii-iii), aż obszar zainteresowania stanie się widoczny, a następnie zacznij zbierać plasterki.
    UWAGA: Niepoprzeczne, ale użyteczne, zdrowe plastry można uzyskać z grzbietowego hipokampa na początku procedury krojenia (Rysunek 1C,ii-iii). Zebranie każdej kromki zajmuje około 3-4 minut. Rozpoczynając cięcie od grzbietu, a nie brzusznego hipokampa, oszczędzamy około 10 minut, co poprawia żywotność plastrów grzbietowych.
  12. Za pomocą plastikowej pipety (odciąć wąski koniec końcówki) przenieść każdą kromkę do komory inkubacyjnej (zawierającej roztwór tnący o temperaturze 35 °C) i odstawić na 12 minut. Krótki okres rekonwalescencji w ciepłym roztworze do cięcia znacznie zmniejsza początkowy obrzęk neuronów, jak opisano w Ting et al. (2014)28. Następnie za pomocą pędzla przenieś plasterek do komory magazynowej (zawierającej roztwór do przechowywania w temperaturze pokojowej) i pozwól mu odpocząć do rozpoczęcia eksperymentu.

4. Zapis całych komórek i wypełnienie biocytyną

UWAGA: Opis zapisu krosówki na całej komórce jest tutaj zredukowany tylko do kluczowych kroków, które pomagają uzyskać dobre wypełnienie biocytyną i mają ogólne zastosowanie do neuronów w ACSF. Szczegółowe informacje na temat procedur zapisów elektrofizjologicznych można znaleźć w kilku innych protokołach29,30.

  1. Wybierz odpowiedni roztwór wewnątrzkomórkowy zgodnie z parametrami, które mają być rejestrowane. Na przykład do pomiarów cęgowych prądu można użyć roztworu na bazie glukonianu potasu (w mM): 135 K-glukonian, 3 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 10 fosfokreatyno-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na2-GTP. Doprowadzić pH do 7,3 za pomocą 1 M KOH. Osmolalność powinna wynosić około 285-290 mOsmol/kg po dodaniu 3-5 mg/ml biocytyny.
    UWAGA: Aby monitorować kształt neuronu podczas zapisu, do roztworu wewnątrzkomórkowego można dodać 0,3-0,5 μL/ml 1 mM Alexa Fluor Hydrazide. W tym przypadku należy pamiętać o objawieniu biocytyny, aby dopasować kolor barwnika Alexa do sondy fluorescencyjnej sprzężonej ze streptawidyną.
  2. Przygotować elektrody krosowe o średnicy końcówki ≤1 μm i rezystancji 3-5 MΩ z grubościennych kapilar borokrzemianowych.
  3. Uruchom system perfuzyjny zestawu patch-clamp z prędkością 2,5-3 ml/min w temperaturze pokojowej lub 35-37 °C i zabezpiecz plaster w komorze za pomocą kotwy w kształcie litery U.
  4. Zidentyfikuj obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania i wybierz zdrowy neuron z somą co najmniej 30-50 μm poniżej powierzchni wycinka.
    UWAGA: Soma zdrowego neuronu ma gładką powierzchnię, a granice błony są lekko skontrastowane. Soma niezdrowego neuronu wydaje się skurczona i silnie skontrastowana lub spuchnięta i półprzezroczysta.
  5. Załadować szklaną pipetę roztworem wewnątrzkomórkowym, aż końcówka elektrody AgCl zostanie zakryta. Przenieś pipetę do roztworu komory rejestrującej, wywierając lekkie nadciśnienie, aby końcówka szklanej elektrody była wolna.
    UWAGA: Jeśli roztwór zawiera barwnik Alexa, ciśnienie można kontrolować, wizualnie dostosowując ilość roztworu fluorescencyjnego uwalnianego z końcówki. Minimalne ciśnienie pozwoliłoby uniknąć zabarwienia tkanki wokół komórki.
  6. Podejdź do komórki pod kątem ukośnym i nawiąż kontakt w pierwszej jednej trzeciej powierzchni somy podczas formowania giga-seal. Zwolnij ciśnienie, powoli przesuń potencjał utrzymywania do -65 mV i zastosuj delikatne ssanie ustami, aby ułatwić tworzenie giga-uszczelnienia.
  7. Aby ustalić konfigurację całej komórki, zastosuj silne i krótkie ssanie, aby przerwać membranę. Odrzuć zapis, jeśli neuron ma potencjał błonowy bardziej zdepolaryzowany niż -50 mV, jeśli prąd podtrzymujący wzrasta powyżej 100 pA lub jeśli rezystancja dostępu wzrasta powyżej 30 MΩ.
  8. Po nagraniu (dla wystarczającego napełnienia somatów i dendrytów zaleca się co najmniej 15 minut; w przypadku wypełnienia złożonych aksonów może być wymagane do jednej godziny31) ostrożnie wyjmij elektrodę. W tym celu należy ustawić potencjał utrzymywania na 0 mV i spróbować ponownie utworzyć giga-uszczelnienie, powoli cofając pipetę w kierunku przeciwnym do podejścia, na przykład w celu uzyskania konfiguracji łaty na zewnątrz.
    UWAGA: Obecność barwnika Alexa w roztworach wewnątrzkomórkowych pomaga w wizualnie sterowanym usuwaniu pipety z powierzchni neuronu. Jeśli jądro komórki nie styka się z końcówką pipety, szybką metodą naprawy uszczelnienia jest wyciągnięcie pipety z tkanki po przekątnej i w górę z dużą prędkością. Jeśli jądro lub część błony znajduje się w końcówce, istnieje niebezpieczeństwo pęknięcia błony plazmatycznej. W takim przypadku pomocne może być lekkie zastosowanie nadciśnienia i ruch boczny.
  9. Zwróć uwagę na położenie komórki i orientację wycinka. Po utrwaleniu dokładną orientację plastra i integralność wypełnionej komórki można sprawdzić pod mikroskopem fluorescencyjnym.

5. Barwienie immunologiczne, akwizycja obrazu i rekonstrukcja morfologiczna

  1. Po zarejestrowaniu przenieś plastry na 24-dołkową płytkę, aby utrwalić ją w paraformaldehydzie (PFA) 4% w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, w zależności od czułości zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych. Plastry można przechowywać w 0,1 mln PBS i 0,02% NaN3,
    UWAGA: PFA jest toksyczny. Stosować pod maską.
  2. Wykonaj barwienie immunologiczne i ujawnienie biocytyny w ciągu jednego tygodnia od nagrania zgodnie z ustalonymi protokołami32,33.
    UWAGA: Stosujemy procedurę, która pozwala uniknąć ponownego cięcia wycinka, aby zachować integralność procesów dendrytycznych i aksonalnych. Jednak ta procedura wymaga dłuższego czasu inkubacji, ponieważ przeciwciała muszą wniknąć do tkanki. Sugerujemy zbadanie czasu optymalnego przenikania przeciwciał do tkanki przed wykonaniem eksperymentu.
  3. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego z funkcją Z-stack i skanowania płytek.
  4. Wykonaj rekonstrukcję morfologiczną za pomocą Fiji imageJ34.
    UWAGA: Do programu można zaimportować kilka formatów plików graficznych za pomocą wtyczki Bio-format. Zalecamy użycie wtyczki Simple Neurite Tracer (STN)35 do rekonstrukcji dendrytów i aksonu. Prosty i przejrzysty samouczek jest dostępny na https://imagej.net/SNT i http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. Plik zawierający dane śledzące (.traces), jeśli zostanie zapisany w postaci nieskompresowanej, może zostać przekształcony w plik tekstowy i otwarty za pomocą Matlaba lub innego oprogramowania do przetwarzania danych tekstowych.

Wyniki

W niniejszym protokole opisujemy sposób przygotowania ostrych skrawków hipokampa z jego części grzbietowo-pośredniej (Rysunek 1A). Protokół ten jest szczególnie odpowiedni do eksperymentów badających mechanizmy zaangażowane w uczenie się przestrzenne i może być łączony z badaniami behawioralnymi, znakowaniem wirusowym lub strategiami manipulacji w grzbietowej części hipokampa35. Stosując opisaną tutaj procedurę sekcjonowania u zwierząt, którym do grzbietowego hipokampa myszy Pvalb-IRES-Cre wstrzyknięto zależny od Cre wirus adeno-stowarzyszony wykazujący ekspresję GFP (AAV-FLEX-GFP) w różnych współrzędnych Bregma AP-1.94 mm, ML ± 0.5-2 mm, głębokość-1.25-2.25 mm w celu ukierunkowania na różne obszary formacji hipokampa36, byliśmy w stanie uzyskać co najmniej trzy skrawki poprzeczne zawierające zainfekowane obszary (Rysunek 1A jasnozielone zabarwienie na modelu 3D hipokampa). Ponadto z bardziej rostralnych części grzbietowego hipokampa można uzyskać kilka skrawków niepoprzecznych, lecz zdrowych (Rysunek 1C).

Aby zademonstrować jakość i żywotność naszych skrawków, zarejestrowaliśmy podstawowe parametry elektrofizjologiczne i morfologiczne komórek ziarnistych oraz oznakowanych tdTomato interneuronów wykazujących ekspresję parwalbuminy (PV+) w zakręcie zębatym transgenicznych myszy Pvalb-IRES-Cre;Ai9 (w wieku od 7 do 12 tygodni), a następnie porównaliśmy je z pomiarami wykonanymi na skrawkach czołowych tego samego obszaru uzyskanych przy użyciu standardowego protokołu.

Podczas inspekcji wizualnej pod mikroskopem z podczerwienią i kontrastem różnicowym (IR-DIC) zauważyliśmy wyraźne różnice między przekrojem poprzecznym a czołowym. Podczas gdy neurony warstwy komórek głównych w przekrojach czołowych często wydawały się chropowate i wykazywały silnie kontrastujące obrysy, neurony w przekroju poprzecznym wykazywały głównie gładkie powierzchnie i tylko lekko kontrastujące brzegi, co świadczy o lepszej żywotności komórkowej (Rysunek 2A). Przyczyną tych różnic w żywotności komórek między przekrojami czołowymi a poprzecznymi może być orientacja płaszczyzny cięcia względem pęczków włókien. Ponieważ w przekrojach czołowych nie przebiegają one równolegle, aksony i dendryty zostają przecięte. Zgodnie z tym założeniem stwierdziliśmy, że w obrębie skrawków płaszczyzny powierzchniowe warstwy komórek ziarnistych i hilusa wykazywały większą nieciągłość w przekroju czołowym niż w poprzecznym (wielkość kroku w płaszczyznach powierzchniowych: 41,40 ± 3,28 µm vs 25,60 ± 2,94 µm, średnia ± SEM, nieparzysty test t P = 0,023), co sugeruje większy stopień rozłączenia tkanki w przekroju czołowym (Rysunek 2B). Oznacza to, że odpowiednie komórki do rejestracji metodą patch-clamp zostaną znalezione jedynie w głębszych płaszczyznach warstwy komórek ziarnistych w przypadku przekrojów czołowych, co z kolei może zmniejszyć wydajność rejestracji patch-clamp. Rzeczywiście, średni czas do utworzenia uszczelnienia (seal) w naszym przekroju poprzecznym był krótszy niż w przypadku przekrojów czołowych (komórki ziarniste: 12,64 ± 1,50 s, n=11 w przekroju czołowym vs. 8,40 ± 0,75 s, n=14 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0335 test Mann-Whitneya; interneurony PV+: 31,11 ± 2,60 s, n=9 w przekroju czołowym vs. 22,00 ± 2,18, n=7 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0283 test Mann-Whitneya) (Rysunek 2C). Jako wskaźnik integralności i stanu zdrowia komórek zarejestrowaliśmy następnie spoczynkowe potencjały błonowe (RMP) komórek ziarnistych i interneuronów PV+, które były znacznie bardziej zdepolaryzowane zarówno w komórkach ziarnistych, jak i interneuronach PV+ w przekrojach czołowych w porównaniu z poprzecznymi (komórki ziarniste: -62,55 ± 3,54 mV, n=11 w przekroju czołowym vs. -71,06 ± 2,31 mV, n=14 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0455 test Mann-Whitneya; interneurony PV+: -52,75 ± 1,66 mV, n=7 w przekroju czołowym vs. -59,36 ± 2,25 mV, n=6 w przekrojach poprzecznych, średnia ± SEM, P = 0,0271 test Mann-Whitneya) (Rysunek 2D). Dane te sugerują większą liczbę zdrowych neuronów w preparacie przekroju poprzecznego w porównaniu z czołowym. Rzeczywiście, wprowadzenie wartości odcięcia dla akceptowalnego RMP (-55 mV dla komórek ziarnistych; -45 mV dla interneuronów PV+) skutkowało wyższym odsetkiem wykluczonych komórek w przekrojach czołowych niż w poprzecznych (39,67 ± 8,37 %, n=3 sesji eksperymentalnych vs. 23,00 ± 3,85 %, n=4 sesji eksperymentalnych) (Rysunek 2E). Co więcej, rekonstrukcja morfologii neuronalnej zarejestrowanych komórek ziarnistych wykazała, że zgodnie z oczekiwaniami szanse na uzyskanie kompletnego rozgałęzienia aksonalnego komórek ziarnistych były znacznie większe w przekroju poprzecznym (Rysunek 3A,B). Dodatkowo, rekonstrukcja morfologiczna interneuronów PV+ w przekrojach poprzecznych pozwoliła na przedstawienie rozległych rozgałęzień aksonalnych i dendrytycznych, w tym wizualizację drobnych szczegółów, takich jak kolce dendrytyczne35(Rysunek 3C).

Metoda wycinania hipokampa: schematy, przygotowanie skrawków mózgu, proces przycinania, narzędzia.
Rycina 1: Ilustracja procedury cięcia w celu uzyskania skrawków z grzbietowo-pośredniej części hipokampa. (A) Trójwymiarowa reprezentacja formacji hipokampa pokazująca jej orientację przestrzenną w mózgu (zmodyfikowano na podstawie Brain Explorer, Allen Institute)37. Wskazano podziały grzbietowy, pośredni i brzuszny hipokampa (dHPC, iHPC, vHPC) zgodnie z Dong et al. (2009)7. Część grzbietowo-pośrednia hipokampa, która zostanie pocięta, jest zaznaczona na jasny zielony kolor. Wstawka po prawej stronie pokazuje orientację osi odniesienia. (B) Schemat półkuli mózgu przedstawiający wyrównanie kory ciemieniowej z liniami równoległymi na szalce Petriego. Czerwona przerywana linia wskazuje miejsce wykonania cięcia przycinającego (punkt 3.9 w protokole) w celu utworzenia powierzchni do przyklejenia półkuli do uchwytu na preparat. Czarne przerywane linie wskazują miejsca zbierania skrawków. (C) Seria obrazów w polu jasnym przedstawiająca skrawki hipokampa uzyskane zgodnie z tą procedurą. Od powierzchni opon miękkich, od grzbietowej do brzusznej: (i) 0.70 mm, (ii) 1.05 mm, (iii) 1.40 mm, (iv) 1.75 mm, (v) 2.10 mm, (vi) 2.45 mm (vii) 2.80 mm, (viii) 3.15 mm. Pasek skali = 1 mm. (D) Zdjęcie komory do przechowywania i materiałów potrzebnych do jej montażu. 1. Kratka dystansowa do probówek z pudełka do przechowywania probówek kriogenicznych 81x, 2. Cylindryczne plastikowe pudełko, 3. Nylonowa siatka, 4. Końcówka do pipety. Wstawka. Widok boczny kratki i uchwytu do probówek do włożenia do cylindrycznego pudełka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia skrawków mózgu; wykres porównawczy wielkości stopnia; analiza czasu uszczelnienia, RMP i odrzuconych komórek.
Rysunek 2: Przekrój poprzeczny wykazuje zwiększoną żywotność skrawka w porównaniu do przekroju czołowego. (A) Mikrografie DIC-IR pokazujące zdrowe (czarne strzałki) i niezdrowe (białe strzałki) przykłady somat neuronów w przekrojach poprzecznych i czołowych. Hil=hilus, gcl=warstwa komórek ziarnistych, ml= warstwa molekularna. Pasek skali = 50 µm. (B) Obie procedury sekcjonowania powodują powstanie stopnia między powierzchnią warstwy komórek ziarnistych a hilusem (wskazane grotami strzałek). Wysokość stopnia wskazuje na zakres rozłączenia tkanki i jest znacznie niższa w przekrojach poprzecznych niż w czołowych (n=5 skrawków poprzecznych i n=5 skrawków czołowych, Mean±SEM, P=0.0238 test Mann-Whitneya). (C) Czas formowania się uszczelnienia gigaohmowego w komórkach ziarnistych (n=14 komórek w przekroju poprzecznym, n=11 komórek w przekroju czołowym; Mean±SEM, P= 0.0355, test Mann-Whitneya) oraz w PV+ INs (n=7 komórek w przekroju poprzecznym, n=9 komórek w skrawkach czołowych, Mean±SEM, P= 0.0283 test Mann-Whitneya). (D) Spoczynkowy potencjał błonowy (RMP) komórek poddanych patch-clampowi (odpowiednio, n= 14 i n=11 komórek ziarnistych, Mean±SEM, P=0.0455 test Mann-Whitneya; n=7 PV+ INs i n=10 PV+ INs, P= 0.0271 test Mann-Whitneya). (E) Procent odrzuconych komórek w ramach sesji eksperymentalnej (n=3 sesje ze skrawkiem czołowym, n=4 ze skrawkiem poprzecznym, Mean±SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie neuronalne z użyciem biocytyny i tdTomato, wyniki mikroskopowe pokazujące strukturę komórek hipokampa.
Rycina 3: Zachowanie morfologiczne komórek ziarnistych i interneuronów w przekroju poprzecznym. Obrazy konfokalne przedstawiające wypełnione biocytyną komórki ziarniste w przekroju poprzecznym (A) oraz w przekrojach czołowych (B) u myszy transgenicznych Pvalb-IRES-Cre;Ai9. Odpowiednie aksony zrekonstruowano w kolorze szarym i jasnoszarym. Zwróć uwagę na różnicę w długości i złożoności aksonów pomiędzy preparatami. Pasek skali=100 µm. (C1) Obraz konfokalny przedstawiający wypełniony biocytyną, tdTomato-dodatni interneuron. Hil=hilus, gcl=warstwy komórek ziarnistych, ml=warstwa molekularna. Pasek skali=50 µm. (C2) Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką w C1, pokazujące kolce dendrytyczne. Pasek skali=2 µm (D) Rekonstrukcja morfologiczna aksonów i dendrytów wypełnionego biocytyną interneuronu z obrazu C1 (akson w kolorze szarym, soma i dendryty w kolorze czarnym). (E) Zbliżenie na somata komórek przedstawionych w C1, pokazujące kolokalizację biocytyny i immunoreaktywności parwalbuminy (PVir). Pasek skali=20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Hipokamp grzbietowy był szeroko badany pod kątem jego roli w uczeniu się przestrzennym i nawigacji, głównie poprzez eksperymenty behawioralne, śledzenie anatomiczne i manipulacje specyficzne dla regionu. Aby połączyć badania elektrofizjologiczne z tymi technikami, opracowaliśmy protokół, który wykorzystuje podobny kąt przekroju, jak zmodyfikowane cięcie poziome dla pośrednio-brzusznego obszaru hipokampa, ale wykorzystuje odwróconą kolejność krojenia, aby uzyskać wczesne plasterki z obszaru grzbietowo-pośredniego. Takie podejście skraca czas potrzebny do pokrojenia i zebrania grzbietowego obszaru hipokampa, zwiększając w ten sposób żywotność plastrów.

Korzystając z tej metody, jesteśmy w stanie rutynowo pobrać około trzech wycinków na półkulę grzbietowego obszaru hipokampa między 1,4 mm a 2,4 mm od powierzchni pial, jak pokazano na rysunku 1C. Chociaż w tej procedurze nie jest możliwe uzyskanie przekrojów poprzecznych z samego bieguna przegrody hipokampa, możliwe jest zebranie około dwóch dodatkowych żywotnych niepoprzecznych plasterków na półkulę z bieguna przegrody (ryc. 1C ii, iii). Jeśli biegun przegrody hipokampa jest głównym przedmiotem badań, inne protokoły, które pozwalają na pobieranie przekrojów poprzecznych, zwłaszcza z samego bieguna przegrody hipokampa, mogą być lepiej dopasowane21,32. Eksperymenty behawioralne dotyczące nawigacji przestrzennej i uczenia się są korzystnie przeprowadzane na dojrzałych myszach z w pełni rozwiniętą łącznością neuronalną. W związku z tym zoptymalizowaliśmy naszą procedurę krojenia pod kątem aplikacji do mózgów dorosłych zwierząt (pokazanych tutaj dla trzymiesięcznych myszy), które są bardziej wrażliwe na stres niż odporny preparat młodociany. W tym celu połączyliśmy kilka strategii, które zmniejszają stres hipoksyjny, na który narażony jest mózg w czasie między ekstrakcją a umieszczeniem plastrów w natlenionym ACSF. Ochronnym roztworem tnącym jest ACSF 25,27,28 na bazie NMDG o niskiej zawartości Na+ i Ca2+, ale wysokiej Mg2 + w celu zmniejszenia uszkodzeń ekscytotoksycznych i obrzęku komórek w wyniku aktywacji receptorów NMDA. Ponadto HEPES zapewnia stabilne buforowanie, a związki takie jak askorbinian i pirogronian zmniejszają stres oksydacyjny. Perfuzja przezsercowa ze schłodzonym i natlenionym ochronnym roztworem tnącym wykorzystuje niezwykle gęstą sieć naczyń włosowatych zaopatrującą mózg w celu szybkiego i jednorodnego zmniejszenia zapotrzebowania metabolicznego i ekscytotoksyczności indukowanej glutaminianem w tkance mózgowej. Następnie prawie wszystkie etapy po dekapitacji są wykonywane w schłodzonych i natlenionych roztworach, aby ograniczyć metabolizm i deprywację tlenu do minimum podczas całej procedury. Istnieją inne strategie zmniejszania uszkodzeń mózgu podczas krojenia, które mogą być równie ważne38. Aby zademonstrować jakość naszego preparatu, porównujemy go z preparatem z plastrem koronalnym, który jest powszechnie stosowany do nagrywania z grzbietowego hipokampa. Mimo że wycinki koronalne mogą być używane do uzyskania dobrego zapisu patch-clamp w zakręcie zębatym, liczba niezdrowych i rozłączonych neuronów jest wyższa niż w przekroju poprzecznym. Ponadto integralność arboryzacji aksonalnej i dendrytycznej jest lepiej zachowana w przekroju poprzecznym. W rzeczywistości integralność aksonów komórek ziarnistych (ryc. 3A), które biegną prostopadle do osi podłużnej hipokampa, służy jako wskaźnik poprzecznej płaszczyzny krojenia1.

Do wypełnienia załatanych neuronów sugerujemy rezystancję elektrody od 3 do 5 MΩ. Średnica końcówki wynosząca około 1 μm pozwala na uzyskanie dobrej odporności na zgrzewanie podczas nagrywania i dobre ponowne uszczelnienie po wycofaniu elektrody. Najważniejszym szczegółem jest uniknięcie zasysania części somy lub jądra do pipety. Z tego powodu sugerujemy dodanie barwnika Alexa do roztworu wewnątrzkomórkowego, jeśli to możliwe. Barwnik umożliwia monitorowanie kształtu komórki podczas nagrywania i ponownego uszczelniania. Co więcej, pozwala ocenić integralność załatanej komórki po utrwaleniu, co może zaoszczędzić czas immunohistochemii w przypadku nieudanych wypełnień. Ze względu na to, że barwniki Alexa są hartowane z długim czasem utrwalania, sugerujemy krótkie utrwalanie, jeśli to możliwe.

Do późniejszego barwienia immunologicznego stosujemy protokół, który nie wymaga ponownego cięcia plastra. Sugerujemy wykonanie barwienia w ciągu tygodnia po utrwaleniu. Im dłużej plastry pozostają w lodówce, tym większa szansa na degradację tkanek. Jeśli nie można uniknąć długiego przechowywania, sugerujemy zwiększenie stężenia NaN3 w PBS do 0,05% i odświeżanie go co tydzień. Barwienie immunologiczne całego wycinka oznacza, że wydłuża się czas inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Zwykle, aby ujawnić biocytynę, wystarczy jedna nocna inkubacja w temperaturze 4 °C, ale w połączeniu z barwieniem innych białek cała procedura barwienia może trwać znacznie dłużej. Blokowanie przenikania i inkubacja przeciwciał muszą być optymalizowane indywidualnie. Zwykle w przypadku przeciwciała pierwszorzędowego wystarczą dwa dni, podczas gdy jeden dzień może wystarczyć w przypadku przeciwciała wtórnego. Zalecamy wydłużenie czasu trwania etapów mycia wraz z dłuższymi inkubacjami przeciwciał, aby uniknąć wzrostu tła.

W tym protokole przedstawiliśmy metodę krojenia w celu uzyskania poprzecznych lub prawie poprzecznych wycinków hipokampa, zachowując żywotność neuronów dorosłej tkanki oraz praktyczne podejście do odzyskania morfologii i tożsamości neurochemicznej załatanych neuronów. Metodę tę można łatwo wykonać, aby dopasować wyniki elektrofizjologiczne do badań anatomicznych i behawioralnych koncentrujących się na pośredniej grzbietowej części hipokampa.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Kerstin Kronenbitter i Didierowi Gremelle'owi za pomoc techniczną. Dziękujemy Umberto Morelliemu za pomoc w tworzeniu oprogramowania graficznego oraz Mathiasowi Hoppe za filmowanie i montaż wideo. Prace w naszym laboratorium były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Project-ID 434434223) i GRK2154, grant Rady ds. Badań Medycznych G1100546/2 oraz Uniwersytet w Kilonii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 ml Omnifix-FBraun melsungen AG9161406V
24 dołkiSARSTEDT8,33,922
81x pudełko do przechowywania fiolek kriogennychKomora magazynowaFisherscientific15-350-107B
Alexa Barwnik hydrazydowyInvitrogenA10436
Duże nożyczkiNarzędzie do naukiprecyzyjnej 14010-15kleszczyki Graefe
BiocytynaIRIS biotechnologia.LS3510.0250
Kapilary ze szkła borokrzemianowegonaukoweGB150TF-10komora magazynowa
Szczotka 5Leonhardy241Mikro podwójna szpatułka, L 150 mm, szerokość ostrza 4 mm
Chlorek wapnia dwuwodnyRoth5239.2aCSF  roztwór
Pióro do mikrotomu ze stali węglowejC35
Chloridric kwasRothK025.1
Mikroskop konfokalnyZeissLSM880z Airyscan
Klej cyjanoakrylowyUHU509141
Klej cyjanoakrylowy, ester n-butylowy VetBond3M
EGTARoth3054.1
Fidżi ImageJfiji.sc
Bibuła filtracyjna 113AROTILABO RothAP180.1
Pęseta z cienką końcówkąDumont0245fo
Szklany becker (150 ml)ROTILABO RothX690.1komora inkubacyjna i preparacja
Szklane szalki Petriego (średnica 10 cm)ROTILABO Roth0690.1
GlukozaRothX997.2aCSF  roztwór
Podgrzewana kąpiel wodnaGrant Instruments LtdSUB14
HEPESRoth9105.4aCSF  roztwór
Isofluoranbaxter5239.2anestezjologiczna
RothE286.1
Siarczan magnezu siedmiowodnyRoth8793.2roztwór CSF 
Mg-ATPSigma AldrichA9187
MicrofilWorld instrumenty precyzyjneMF34G
Na2-GTPSigma Aldrich51120
N-metylo-D-glukaminaSigma AldrichM2004aCSF  roztwór
Normalna surowica koziaSigma Aldrich566380
Zestaw siatek nylonowychWarner Instruments64-0198komora inkubacyjna i komora magazynowa
ParaformaldeydeSigma AldrichP6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10XPanbiotechP04-53500
Fosfokreatyna disodowaSigma AldrichP7936
Ściągacz do pipetInstrument SutterP-2000
Końcówki do pipet KomorainkubacyjnaSARSTEDT7,07,62,211
Plastikowe pudełko na filtry strzykawkoweKomora magazynowaSUPELCO54135-U
Chlorek potasuRoth6781.3aCSF  roztwór
Glukonian potasuRothP1847
Probenbecker becker (100 ml)Komora inkubacyjnaROTILABORoth HT85.1
Pęseta z zaokrągloną końcówkąNarzędzie do nauki precyzyjnej11051-10
Ostrze ze stali nierdzewnejGilletteVibratome
Małe nożyczkiNarzędzie do majonezu14010-10nożyczki majonezowe proste
Askorbinian soduRoth3149.2aCSF  roztwór
Azydek soduSigma AldrichS2002
Wodorowęglan soduRoth6885.1aCSF  roztwór
Chlorek soduRoth3957.1aCSF  roztwór
Wodorotlenek soduRothK021.1
Fosforan sodu monozasaddihydratRothK300.1aCSF  roztwór
Pirogronian soduRoth8793.2aCSF  roztwór
Streptawidyna połączona Alexa 488Invitogens11223
Cienka szpatułkaRothE286.1Podwójna szpatułka, L 150 mm, szerokość ostrza 9 mm
Pipeta transferowaSarstedt861171
Triton x100Roth3051.1
VibratomeThermoscientificMicrom HM650V
Urządzenie filtrujące do wody ultraczystejMerck-MilliporeMilli-Q IQ 7000
Produkty Duża szpatułka

Bibliografia

  1. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  2. Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
  3. David, A., Pierre, L. Hippocampal Neuroanatomy. The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).
  4. Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).
  5. Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).
  6. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  7. Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).
  8. Cembrowski, M. S., Spruston, N. Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons. Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).
  9. Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).
  10. Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory. European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).
  11. Fredes, F., et al. Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation. Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).
  12. Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
  13. Andersen, P. Long-lasting facilitation of synaptic transmission. Ciba Foundation Symposium. (58), 87-108 (1977).
  14. Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).
  15. Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium. Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).
  16. Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).
  17. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  18. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  19. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  20. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936(2018).
  21. Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus. Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).
  22. Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).
  23. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).
  24. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  25. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  26. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).
  27. Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61377(2020).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).
  29. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  30. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706(2014).
  31. Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).
  32. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. Journal of Visualized Experiments. (118), e54880(2016).
  33. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  36. Murray, A. J., et al. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).
  37. Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release. Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).
  38. Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry. Neuromethods. 67, 103-125 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie świeżych skrawkówpoprzeczne skrawki mózgusekcjonowanie w wibratomieroztwory ochronnerejestracja elektrofizjologicznaanaliza morfologiczna
Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.