Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61987

⸱

4 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Streszczenie

Nasze coraz bardziej starzejące się społeczeństwo prowadzi do coraz częstszego występowania chorób neurodegeneracyjnych. Do tej pory mechanizmy patologiczne nie są wystarczająco poznane, co utrudnia ustalenie zdefiniowanych metod leczenia. Oparte na komórkach addytywne terapie genowe mające na celu zwiększenie ekspresji czynnika ochronnego są uważane za obiecującą opcję leczenia chorób neurodegeneracyjnych, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Opracowaliśmy metodę stabilnej ekspresji genu kodującego czynnik pochodzenia nabłonka barwnikowego (PEDF), który charakteryzuje się jako białko neuroprotekcyjne i antyangiogenne w układzie nerwowym, do genomu pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego (PE) za pomocą układu transpozonów Sleeping Beauty (SB). Pierwotne komórki PE wyizolowano z ludzkich oczu dawcy i utrzymywano w hodowli. Po osiągnięciu konfluencji, 1 x 104 komórki zawieszono w 11 μl buforu do resuspensji i połączono z 2 μl oczyszczonego roztworu zawierającego 30 ng nadpoaktywnego plazmidu transpozazy SB (SB100X) i 470 ng plazmidu transpozonu PEDF. Modyfikacja genetyczna została przeprowadzona za pomocą systemu elektroporacji kapilarnej z wykorzystaniem następujących parametrów: dwa impulsy o napięciu 1 100 V i szerokości 20 ms. Transfekowane komórki przeniesiono na płytki hodowlane zawierające pożywkę uzupełnioną płodową surowicą bydlęcą; Antybiotyki i leki przeciwgrzybicze zostały dodane przy pierwszej wymianie pożywki. Skuteczna transfekcja została wykazana w niezależnie przeprowadzonych eksperymentach. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) wykazała zwiększoną ekspresję transgenu PEDF. Wydzielanie PEDF było znacznie zwiększone i pozostawało stabilne, co oceniano za pomocą immunoblottingu i oznaczano ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Transfer, w którym pośredniczy SB100X, pozwolił na stabilną integrację genu PEDF z genomem komórek PE i zapewnił ciągłe wydzielanie PEDF, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania terapii dodawania genów opartej na komórkach w leczeniu AMD lub innych chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Co więcej, analiza profilu integracji transpozonu PEDF z ludzkimi komórkami PE wykazała niemal losowy rozkład genomu.

Wprowadzenie

Zaawansowany wiek jest opisany jako główne ryzyko chorób neurodegeneracyjnych. Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), choroba wielogenowa prowadząca do poważnej utraty wzroku u pacjentów w wieku powyżej 60 lat, należy do czterech najczęstszych przyczyn ślepoty i upośledzenia wzroku1 i oczekuje się, że wzrośnie do 288 milionów osób w 2040 roku2. Dysfunkcje nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), pojedynczej warstwy ciasno upakowanych komórek znajdujących się między naczyniówką włosowatą a fotoreceptorami siatkówki, przyczyniają się do patogenezy AMD. RPE spełnia wiele zadań, które są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania siatkówki3 i wydziela różnorodne czynniki wzrostu i czynniki niezbędne do utrzymania integralności strukturalnej siatkówki i naczyniówki, wspierając w ten sposób przeżycie fotoreceptorów i stanowiąc podstawę dla krążenia i dostarczania składników odżywczych.

W zdrowych oczach, czynnik pochodzenia nabłonka barwnikowego (PEDF) jest odpowiedzialny za równoważenie działania czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i chroni neurony przed apoptozą, zapobiega proliferacji komórek śródbłonka i stabilizuje śródbłonek naczyń włosowatych. Przesunięty stosunek VEGF do PEDF jest związany z neowaskularyzacją oka, którą zaobserwowano w modelach zwierzęcych4,5, a także w próbkach pacjentów z neowaskularyzacją naczyniówkową (CNV) spowodowaną AMD i proliferacyjną retinopatią cukrzycową6,7,8,9,10. Zwiększone stężenie VEGF jest celem dla obecnego standardowego leczenia. Leki anty-VEGF bewacyzumab, ranibizumab, aflibercept i ostatnio brolucizumab poprawiają ostrość widzenia u około jednej trzeciej pacjentów z CNV, a raczej stabilizują widzenie w 90% przypadków11,12,13. Jednak częste, często comiesięczne wstrzyknięcia do ciała szklistego niosą ze sobą ryzyko wystąpienia zdarzeń niepożądanych14, utrudniają przestrzeganie zaleceń przez pacjenta i stanowią znaczne obciążenie ekonomiczne dla systemów opieki zdrowotnej15. Co więcej, pewien odsetek pacjentów (2%-20%) nie reaguje lub reaguje słabo na terapię anty-VEGF16,17,18,19. Te negatywne współczynniki wymagają opracowania alternatywnych metod leczenia, np. implantów wewnątrzgałkowych, metod terapii komórkowej i/lub genowej.

Terapia genowa ewoluowała jako obiecująca metoda leczenia chorób dziedzicznych i niedziedzicznych i ma na celu przywrócenie niefunkcjonalnych sekwencji genów lub stłumienie nieprawidłowo funkcjonujących. W przypadku chorób wielogenowych, w przypadku których identyfikacja i zastąpienie czynników wywołujących jest prawie niemożliwe, strategie mają na celu ciągłe dostarczanie czynnika ochronnego. W przypadku AMD opracowano różne terapie addytywne, takie jak stabilna ekspresja endostatyny i angiostatyny20, antagonista VEGF rozpuszczalna w fms kinaza tyrozynowa-1 (sFLT-1)21,22, klaster białka regulatorowego dopełniacza o różnicowaniu 59 (CD59)23 lub PEDF24,25. Oko, a zwłaszcza siatkówka, jest doskonałym celem dla leków opartych na genach ze względu na zamkniętą strukturę, dobrą dostępność, niewielkie rozmiary i przywilej immunologiczny, co pozwala na miejscowe dostarczanie niskich dawek terapeutycznych i sprawia, że przeszczepy są mniej podatne na odrzucenie. Co więcej, oko umożliwia nieinwazyjne monitorowanie, a siatkówka może być badana za pomocą różnych technik obrazowania.

Wektory wirusowe są, ze względu na ich wysoką skuteczność transdukcji, głównym narzędziem dostarczania genów terapeutycznych do komórek docelowych. Jednak w zależności od użytego wektora wirusowego opisano różne działania niepożądane, takie jak reakcje immunologiczne i zapalne26, efekty mutagenne i onkogenne27,28, lub rozsiewanie w innych tkankach29. Do praktycznych ograniczeń należy ograniczony rozmiar opakowania30, a także trudności i koszty związane z produkcją partii klasy klinicznej31,32. Te wady sprzyjały dalszemu rozwojowi niewirusowych wektorów opartych na plazmidach, które są przenoszone za pomocą lipo-/polipleksów, ultradźwięków lub elektroporacji. Jednak genomowa integracja transgenu z genomem gospodarza zwykle nie jest promowana przez wektory plazmidowe, co prowadzi do przejściowej ekspresji.

Transpozony to naturalnie występujące fragmenty DNA, które zmieniają swoje położenie w genomie, cecha, która została zaadoptowana do terapii genowej. Ze względu na aktywny mechanizm integracji, systemy wektorowe oparte na transpozonach pozwalają na ciągłą i stałą ekspresję wprowadzonego transgenu. Transpozon Śpiącej Królewny (SB), odtworzony ze starożytnego transpozonu typu Tc1/marynarskiego znalezionego w fish33 i dalej ulepszony przez ewolucję molekularną, w wyniku której powstał hiperaktywny wariant SB100X34, umożliwił efektywną transpozycję w różnych komórkach pierwotnych i był używany do korekcji fenotypowej w różnych modelach chorób35. Obecnie rozpoczęto 13 badań klinicznych z wykorzystaniem systemu transpozonów SB. System transpozonów SB100X składa się z dwóch elementów: transpozonu, który składa się z genu zainteresowania otoczonego końcowymi odwróconymi powtórzeniami (TIR), oraz transpozy, która mobilizuje transpozon. Po dostarczeniu plazmidowego DNA do komórek, transpozaza wiąże TIR i katalizuje wycięcie i integrację transpozonu z genomem komórki.

Opracowaliśmy niewirusową terapię addytywną opartą na komórkach do leczenia neowaskularnego AMD. Podejście to polega na opartej na elektroporacji insercji genu PEDF do komórek pierwotnego nabłonka barwnikowego (PE) za pomocą systemu transpozonów SB100X36,37,38. Informacja genetyczna transpozazy i PEDF jest dostarczana na oddzielnych plazmidach, co umożliwia dostosowanie idealnego stosunku transpozonów SB100X do PEDF. Elektroporacja jest wykonywana za pomocą systemu transfekcji kapilarnej opartego na pipetach, który charakteryzuje się maksymalizacją wielkości szczeliny między elektrodami przy jednoczesnej minimalizacji ich powierzchni. Wykazano, że urządzenie osiąga doskonałe wskaźniki transfekcji w szerokim zakresie komórek ssaków39,40,41. Mała powierzchnia elektrody zapewnia jednolite pole elektryczne i redukuje różne skutki uboczne elektrolizy42.

Antyangiogenna funkcjonalność PEDF wydzielanego przez transfekowane komórki nabłonka pigmentowego została pokazana w różnych eksperymentach in vitro analizujących kiełkowanie, migrację i apoptozę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej43. Ponadto, przeszczepienie komórek transfekowanych PEDF w króliczym modelu neowaskularyzacji rogówki44, a także na szczurzym modelu CNV43,45,46 wykazało spadek neowaskularyzacji.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół stabilnej insercji genu PEDF do pierwotnych ludzkich komórek RPE za pomocą systemu transpozonów SB100X przy użyciu systemu transfekcji kapilarnej. Transfekowane komórki utrzymywano w hodowli przez 21 dni, a następnie analizowano pod kątem ekspresji genu PEDF za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) oraz pod względem wydzielania białka PEDF za pomocą immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA, Figura 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzkie oczy dawcy zostały pobrane z Banku Rogówki w Akwizgranie Oddziału Okulistyki (Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen) po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z Deklaracją Protokołów Helsińskich. Procedury pobierania i wykorzystywania próbek pochodzących od ludzi zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną.

1. Izolacja pierwotnych ludzkich komórek RPE

  1. Rozłóż sterylną odzież ochronną i rękawice. Umieść sterylną serwetkę pod przepływem laminarnym.
  2. Umieść sterylne narzędzia do przygotowywania i inny niezbędny sterylny sprzęt pod przepływem laminarnym.
  3. Zapisz odbiór kul ocznych, początek przygotowania, a także ewentualne nieprawidłowości. Zarejestruj wiek dawcy, płeć, przyczynę zgonu oraz okres między śmiercią a usunięciem oka.
  4. Umieść gałkę oczną w sterylnym kompresie z gazy i trzymaj ją w jednej ręce.
  5. Oddziel odcinek przedni od tylnego za pomocą cięcia obwodowego około 3,5 mm za rąbkiem za pomocą skalpela i bardzo cienkich, spiczastych nożyczek do oczu.
  6. Po odchyleniu tylnego odcinka w dół ostrożnie usuń ciało szkliste i siatkówkę za pomocą kleszczyków colibri.
  7. Dyskretnie przestaw zapadnięty kompleks RPE/choroidea za pomocą prostych kleszczyków do tęczówki, a następnie przytrzymaj go w odpowiedniej pozycji za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki.
  8. Napełnij tylną muszlę oczną 1 ml zmodyfikowanej mieszanki składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's (DMEM/F12) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 80 U/ml penicyliny i 80 μg/ml streptomycyny (Pen/Strep) oraz 2,5 μg/ml amfoterycyny B (AmphoB).
    UWAGA: W przeciwieństwie do izolacji pierwotnych komórek RPE z oczu świni lub bydła36,37, tylna muszla oczna nie musi być wypełniona i inkubowana trypsyną.
  9. Zbierz komórki RPE, delikatnie muskając nabłonek barwnikowy siatkówki od nerwu wzrokowego w kierunku rąbka za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z zakrzywionego szkła, jednocześnie mocując kompleks RPE/choroidea na rąbku za pomocą kleszczy colibri. Przenieść zawiesinę komórkową na szalkę Petriego.
  10. Powtórz kroki 1.8 i 1.9 i zbierz wszystkie komórki na szalce Petriego. Zawiesinę komórek należy ostrożnie zawiesić, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety jednokanałowej (100-1 000 μl).
  11. Zawiesinę komórek RPE z każdej gałki ocznej należy umieścić w trzech dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i wypełnić je do 1 ml DMEM / F12 uzupełnionym FBS, Pen / Strep i AmphoB.
  12. Utrzymuj hodowle komórek RPE w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze składającej się w 95% z powietrza i 5% z CO2 aż do osiągnięcia konfluencji. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych dwa razy w tygodniu.

2. Elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE

  1. Przygotowanie mieszaniny plazmidu transpozy SB100X/transpozonu PEDF
    1. Oczyść DNA transpozazy transpozazy SB100X i transpozonu plazmidu PEDF za pomocą zwykłych zestawów do oczyszczania plazmidu, które zostały zidentyfikowane jako odpowiednie do stosowania w zastosowaniach takich jak transfekcja, zgodnie z protokołem producenta.
    2. Określić ilościowo zawartość plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i dostosować je do stężenia 250 ng/μL za pomocą 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).
    3. Wymieszaj jedną porcję 250 ng/μL plazmidowego DNA transpozazy SB100X (np. 2,5 μL) z 16 porcjami 250 ng/μL transpozonu plazmidowego DNA transpozonu PEDF (np. 40 μL). Resztkowa mieszanina plazmidów może być przechowywana w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania mieszaniny plazmidów.
    4. Umieścić 2 μl mieszaniny plazmidu transpozy SB100X i transpozonu transpozonu PEDF, zawierającej 29,4 ng plazmidu transpozy SB100X i 470,6 ng plazmidu transpozonu PEDF, w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z bezpiecznym zamknięciem. Trzymaj na lodzie, aż wymieszają się z komórkami.
  2. Konfiguracja systemu transfekcji kapilarnej
    UWAGA: Elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE została przeprowadzona za pomocą systemu transfekcji kapilarnej przy użyciu zestawu 10 μL zgodnie z protokołem producenta. System składa się z urządzenia do transfekcji, pipety do transfekcji i stacji pipetowej. Zestaw zawiera końcówki do transfekcji o pojemności 10 μl, probówki buforowe, bufor elektrolityczny E (bufor E) i bufor do resuspensji R (bufor R).
    1. Podłącz stację pipetową do urządzenia do transfekcji.
    2. Napełnij probówkę buforową 3 ml buforu E i włóż ją do stacji pipetowej, aż usłyszysz kliknięcie.
      UWAGA: Upewnij się, że elektroda boczna rurki buforowej jest podłączona do bocznego tłoka kulkowego stacji pipetowania.
    3. W celu elektroporacji pierwotnych ludzkich komórek RPE należy ustawić następujące warunki impulsu w urządzeniu transfekcyjnym: 1 100 V (napięcie impulsu), 20 ms (szerokość impulsu), dwa impulsy (liczba impulsu).
  3. Przygotowanie hodowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE
    1. Udokumentuj kształt i morfologię pierwotnych kultur komórek RPE za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Weź mikrofotografie o małym powiększeniu, aby zademonstrować wzrost komórek RPE do zlewającej się i zintegrowanej monowarstwy, a także mikrofotografie o większym powiększeniu, aby wskazać typową morfologię komórek RPE na bruku.
    2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć komórki dwukrotnie 1 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS, pH 7,4).
    3. Trypsynizować pierwotne ludzkie komórki RPE za pomocą 0,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 przez 7-15 minut (maksymalnie). Sprawdź odwarstwienie komórki pod mikroskopem.
    4. Zatrzymaj trypsynizację za pomocą 1 ml DMEM/F12 uzupełnionego FBS. Pobrać podwielokrotność 20 μl do zliczania komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować zawiesinę komórek RPE o sile 106 x g przez 10 minut.
    5. Zmieszać podwielokrotność 20 μl z 20 μl roztworu błękitu trypanowego. Pobrać pipetę po 10 μl do każdej połówki hemocytometru i policzyć komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym.
    6. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórek RPE w 1 ml PBS.
    7. Pobrać 10 000-100 000 komórek RPE na reakcję transfekcji i odwirować je przy 106 x g przez 10 min.
      UWAGA: Oprócz reakcji transfekcji z zastosowaniem pola elektrycznego i dodaniem plazmidowego DNA, każde podejście obejmuje również dwie różne kultury kontrolne: (1) bez zastosowania pola elektrycznego i bez plazmidowego DNA; (2) z zastosowaniem pola elektrycznego, ale bez plazmidowego DNA.
    8. Zawiesić osad komórkowy w 11 μl buforu R i połączyć go z 2 μl mieszaniny plazmidu transpozy/transpozonu SB100X (patrz krok 2.1.4).
      UWAGA: Po ponownym zawieszeniu w buforze R, komórki muszą zostać przetworzone w ciągu 15 minut, aby uniknąć zmniejszenia żywotności komórek i wydajności transfekcji.
    9. Włóż głowicę pipety do transfekcji do końcówki transfekcyjnej o pojemności 10 μl, aż zacisk całkowicie podniesie trzpień mocujący tłoka. Pobrać roztwór komórki/plazmidu do końcówki transfekcyjnej.
      UWAGA: Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza i ich zasysania do końcówki transfekcyjnej.
    10. Dostarczyć 1 ml DMEM/F12 uzupełnionego FBS, ale bez Pen/Strep i bez AmphoB, do wymaganej liczby dołków 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
  4. Proces elektroporacji
    1. Włóż pipetę do transfekcji do rurki buforowej umieszczonej w stacji pipetowej (patrz krok 2.2.2), aż usłyszysz kliknięcie.
      UWAGA: Upewnij się, że metalowa głowica pipety do transfekcji jest podłączona do tłoka kulowego wewnątrz stacji pipetowania i do rurki buforowej.
    2. Naciśnij Start na ekranie dotykowym urządzenia transfekcyjnego. Przed zastosowaniem impulsu elektrycznego urządzenie automatycznie sprawdza, czy rurka buforowa i pipeta transfekcyjna są prawidłowo włożone. Po dostarczeniu impulsów elektrycznych, na ekranie dotykowym wyświetlany jest komunikat Complete.
    3. Ostrożnie wyjąć pipetę do transfekcji ze stacji pipetowania i natychmiast uwolnić elektroporowane komórki z końcówki do transfekcji o pojemności 10 μl, pipetując roztwór komórki/plazmidu do przygotowanych dołków płytki do hodowli komórkowej (patrz krok 2.3.10).
    4. Utrzymuj transfekowane hodowle komórek RPE w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze składającej się w 95% z powietrza i 5%CO2. Dodać Pen/Strep i AmphoB z pierwszą wymianą pożywki 3 dni po elektroporacji.

3. Analizy transfekowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE

  1. Przygotowanie próbki
    1. Po czasie hodowli wynoszącym 3 tygodnie, ostatecznie inkubować kultury komórkowe RPE w określonej objętości 1,0 ml DMEM/F12 uzupełnionej FBS, Pen/Strep i AmphoB przez określony czas 24 godzin.
    2. Pobrać supernatanty z kultur komórkowych i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania w czasie zbliżonym do czasu lub w temperaturze -80 °C w przypadku próbek niestabilnych termicznie i długotrwałego przechowywania.
    3. Trypsynizować transfekowane hodowle komórek RPE za pomocą 0,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5%CO2 przez 10 minut.
    4. Zatrzymaj trypsynizację za pomocą 1 ml DMEM/F12 uzupełnionego FBS. Weź małe podwielokrotności do zliczania komórek za pomocą hemocytometru (patrz krok 2.3.5). Odwirować zawiesiny komórek RPE w stężeniu 106 x g przez 10 minut.
    5. Przechowuj granulki komórek RPE w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.
  2. Ocena wydzielania PEDF przez western blotting
    UWAGA: W celu oceny jakościowej supernatanty z hodowli komórkowych (patrz krok 3.1.2) analizuje się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie western blot. W zależności od zastosowanego plazmidu transpozonu PEDF, supernatanty muszą być przetwarzane w różny sposób.
    1. Oczyszczanie białek fuzyjnych PEDF znakowanych przez Hisa z supernatantów do hodowli komórkowych
      1. Pobrać 30 μl zawiesiny kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA) na próbkę za pomocą końcówki ze skosem i granulować żywicę Ni-NTA przez odwirowanie (2,660 x g przez 30 s).
      2. Ostrożnie ponownie zawiesić żywicę Ni-NTA z 200 μl 1x buforu inkubacyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, pH 8,0) i zagnieździć przez odwirowanie (2,660 x g przez 30 s).
      3. Powtórz poprzedni krok.
      4. Ostrożnie zawiesić żywicę Ni-NTA z 40 μl 4x buforem inkubacyjnym (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazolu, pH 8,0) na próbkę.
      5. Zmieszać 900 μl supernatantu do hodowli komórkowych z 260 μl 4-krotnego buforu do inkubacji i 55 μl wstępnie przetworzonej gnojowicy Ni-NTA (patrz krok 3.2.1.4).
      6. Inkubować mieszaninę na kołyszącym się shakerze w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
      7. Żywicę Ni-NTA osadzać przez odwirowanie (2660 x g przez 60 s).
      8. Ostrożnie ponownie zawiesić żywicę Ni-NTA ze 175 μl 1x buforu inkubacyjnego i żywicy w postaci granulek przez odwirowanie (2,660 x g przez 60 s).
      9. Powtórz poprzedni krok.
      10. Ostrożnie zawiesić żywicę Ni-NTA z 30 μl buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, pH 8,0) i inkubować mieszaninę na wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      11. Żywicę Ni-NTA osadzać przez odwirowanie (2,660 x g przez 30 s).
      12. Ostrożnie pobrać supernatant i wymieszać go z 2x buforem próbki SDS47.
      13. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i oddzielić oczyszczone białka Ni-NTA od 10% żelu poliakryloamidowego SDS.
      14. Wykonaj western blot przy użyciu przeciwciał anty-Penta-His (monoklonalne myszy, 1:500) i przeciwciał anty-mysich sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) (poliklonalny królik, 1:1,000), jak opisano wcześniej36,37.
    2. Bezpośrednia analiza nieznakowanych białek PEDF
      1. Weź 15 μl supernatantu do hodowli komórkowych i wymieszaj go z 2x buforem próbki SDS47.
      2. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i oddzielić białka od 10% żelu poliakryloamidowego SDS.
      3. Wykonaj western blot przy użyciu przeciwciał anty-ludzkich PEDF (poliklonalne króliki, 1:4,000) i sprzężonych z HRP przeciwciał anty-króliczych (kozie poliklonalne, 1:2,000), jak opisano wcześniej38.
    3. Kwantyfikacja wydzielania PEDF za pomocą testu ELISA
      1. Analizować supernatanty do hodowli komórkowych (patrz krok 3.1.2) przy użyciu ludzkiego zestawu PEDF ELISA zgodnie z protokołem producenta.
      2. Odnieś ilość wydzielanego PEDF do czasu i liczby komórek oznaczonych dla każdej reakcji transfekcji (patrz krok 3.1.4).
    4. Analiza ekspresji genu PEDF w transfekowanych komórkach RPE
      1. Wyizolować całkowite RNA z osadów komórek RPE (patrz krok 3.1.5) za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta.
      2. Określ ilościowo zawartość RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      3. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję na 0,1 μg RNA przy użyciu systemu odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.
      4. Wykonaj qPCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej38.
    5. Analiza miejsc insercji transgenu w transfekowanych komórkach RPE
      1. Wyizolować genomowe DNA z granulek komórek RPE (patrz krok 3.1.5) za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta.
      2. Określić ilościowo zawartość DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      3. Generuj biblioteki miejsc wstawiania przy użyciu wspomaganego obliczeniowo schematu PCR specyficznego dla hemi, jak opisano wcześniej38.
      4. Wykonaj analizę obliczeniową zgodnie z wcześniejszym opisem38.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hodowla i elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE
Wykazaliśmy, że wysianie odpowiedniej liczby pierwotnych komórek RPE pochodzenia zwierzęcego pozwala na ich hodowlę i wzrost do postaci zintegrowanej monowarstwy pigmentowanych komórek o sześciokątnym kształcie36,37,48Ich zdolność do tworzenia złączy ścisłych, wykazania aktywności fagocytycznej oraz ekspresji specyficz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W naszym projekcie dążymy do niewirusowej produkcji genetycznie zmodyfikowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE, które w sposób ciągły wykazują nadekspresję i wydzielają skuteczny czynnik, aby wykorzystać transfekowane komórki jako długoterminową terapię w celu ustanowienia i utrzymania środowiska ochronnego. Udało nam się wprowadzić gen kodujący PEDF, wszechobecne w ekspresji wielofunkcyjne białko o funkcjach antyangiogennych i neuroprotekcyjnych. Opisany tutaj protokół może być używany do stabilnego i powtarzalnego tr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Zoltán Ivics i Zsuzsanna Izsvák są wynalazcami kilku patentów na technologię transpozonów SB

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Siódmy Program Ramowy Unii Europejskiej w zakresie badań, rozwoju technologicznego i demonstracji, umowa o grant nr 305134. Zsuzsanna Izsvák została sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Autorzy pragną podziękować Annie Dobias i Antje Schiefer (Oddział Okulistyki, Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen) za doskonałe wsparcie techniczne, a także Bankowi Rogówki w Akwizgranie (Oddział Okulistyki, Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen) za udostępnienie ludzkich oczu dawcy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izolacja pierwotnych ludzkich komórek RPE
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejEppendorf, Hamburg, Niemcy0030722019
Amfoterycyna B [250 &mikro; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, NiemcyA2942
Colibri KleszczeGeuder, Heidelberg, NiemcyG-18950
Zakrzywione kleszcze do tęczówki Geuder, Heidelberg, NiemcyG-18856
Jednorazowy skalpel (nr 11)Feather, Osaka, Japonia
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni/Szynka" s F-12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, NiemcyP04-41150
Bardzo cienkie szpiczaste nożyczki do oczu Geuder, Heidelberg, NiemcyG-19405
Płodowa surowica bydlęca [0,2 i mikro; m Sterylne filtrowane] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, NiemcyP40-37500
Marka szklanych pipet Pasteura, Wertheim, Niemcy747715
Penicylina [10 000 jednostek/ml] i streptomycyna [10 mg/mL] (długopis/paciorkowiec)Merck, Darmstadt, NiemcyP0781
Końcówki do pipet (1000 &mikro; L)Starlab, Hamburg, Niemcy
Pipeta jednokanałowa (100-1000 i mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Sterylna serwetaLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Niemcy
Sterylny kompres z gazy Fink-Walter, Merchweiler, Niemcy321063
Sterylne rękawiczkiSempermed, Wiedeń, Austria
Sterylna szalka Petriego (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Sterylny fartuch chirurgicznyHalyard Health, Alpharetta, GA
Kleszcze do prostych tęczówek Geuder, Heidelberg, NiemcyG-18855
Elektroporacja pierwotnych ludzkich komórek RPE
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowejThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejEppendorf, Hamburg, Niemcy
Amfoterycyna B [250 &mikro; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, NiemcyA2942
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni/Szynka" s F-12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, NiemcyP04-41150
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock (1,5 ml)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Surowica bydlęca płodu [0,2 i mikro; m Sterylny filtrowany] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, NiemcyP40-37500
Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Niemcymikroobjętościowy Leica DMi8
(spektrofotometr NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
System transfekcji kapilarnej (system transfekcji neonu)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
System transfekcji neonowej 10 i mikro; L ZestawThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemocytometr (komora Neubauera)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Niemcy0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+Biochrom, Berlin, NiemcyL182-50
Penicylina [10 000 jednostek/ml] i streptomycyna [10 mg/ml] (długopis/paciorkowiec)Merck, Darmstadt, NiemcyP0781
Końcówki do pipet (10 &mikro; L)Starlab, Hamburg, Niemcy
Końcówki do pipet (1000 µ L)Starlab, Hamburg, Niemcy
Końcówki do pipet (200 i mikro; L)Starlab, Hamburg, Niemcy
Plasmid Maxi KitQiagen, Hilden, Niemcy12163
Pipeta jednokanałowa (0,1-10 i mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Pipeta jednokanałowa (100-1000 µ L)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Pipeta jednokanałowa (10-200 &mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Roztwór błękitu trypanowegoMerck, Darmstadt, NiemcyT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Analizy transfekowanych pierwotnych ludzkich komórek RPE
10% SDS-Poliakryloamid Gel
1x Bufor do inkubacji (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0)
2x Bufor
4x Bufor do inkubacji (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0)
Amersham Protran Obsługiwany 0,2 i mikro; m  Nitceluloza Blotting MembraneCytiva, Marlborough, MA10600015
Amfoterycyna B [250 &mikro; g / mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, NiemcyA2942
Przeciwciała anty-PEDF (poliklonalne króliki)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Przeciwciała anty-penta-his (monoklonalne myszy)Qiagen, Hilden, Niemcy34660
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni/Szynka" s F-12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, NiemcyP04-41150
Bufor elucyjny (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) 
Surowica bydlęca płodu [0,2 i mikro; m Sterylny filtrowany] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, NiemcyP40-37500
(komora Neubauera)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Niemcy0640110
Chrzanowe przeciwciała anty-mysie sprzężone z peroksydazą chrzanową (poliklonalne królika)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Przeciwciała anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową (koza poliklonalna)Abcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab6721
Ludzki zestaw PEDF ELISA BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 System obrazowaniaFujifilm, Minato, Japonia
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, Penzberg, Niemcy
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Niemcy12239264001
LightCycler  Naczynia włosowate (20 μ l)Roche Life Science, Penzberg, Niemcy4929292001
Spektrofotometr mikroobjętościowy (spektrofotometr NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Moduł odlewania komórek TetraBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy1658015
Mini-PROTEAN  Pionowa komórka do elektroforezy Tetra do mini żeli prefabrykowanych, 4-żeloweBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Niemcy30410
Prestained Protein Ladder PageRulerThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Penicylina [10 000 jednostek/ml] i streptomycyna [10 mg/ml] (pióro/paciorkowiec)Merck, Darmstadt, NiemcyP0781
Końcówki do pipet (10 &mikro; L)Starlab, Hamburg, Niemcy
Końcówki do pipet (1000 µ L)Starlab, Hamburg, Niemcy
Końcówki do pipet (200 i mikro; L)Starlab, Hamburg, Niemcy
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Niemcy51304
System odwrotnej transkrypcji Promega, Madison, WIA3500
Zestaw DNaz bez RNazQiagen, Hilden, Niemcy79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Niemcy74104
Wytrząsarka kołyszącaCole-Parmer, Staffordshire, Wielka BrytaniaProbówki do mikrowirówek SSM3
Safe-Lock (1,5 ml)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock (2,0 ml)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Pipeta jednokanałowa (0,1-10 &mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Pipeta jednokanałowa (100-1000 µ L)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
Pipeta jednokanałowa (10-200 &mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Niemcy
System Turbotransferu Trans-BlotBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Niemcy1704150
Roztwór błękitu trypanowegoMerck, Darmstadt, NiemcyT8154
Trypsyna-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
0030722019 Mikroskop odwrócony Spektrofotometr MPK5000do próbek SDS Hechocytometr

Bibliografia

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850(2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049(2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845(2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja genu PEDFelektroporacja naczyń kapilarnychprzygotowanie plazmidowego DNAanaliza Western blotilościowe oznaczenie metodą ELISAoczyszczanie za pomocą niklu NTAstabilna integracja transgenu
Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.