Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Podsumowanie

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Streszczenie

Układ sercowo-naczyniowy jest kluczowym graczem w fizjologii człowieka, dostarczając pożywienia większości tkanek w ciele; naczynia są obecne w różnych rozmiarach, strukturach, fenotypach i wydajności w zależności od każdej konkretnej perfundowanej tkanki. Dziedzina inżynierii tkankowej, która ma na celu naprawę lub zastąpienie uszkodzonych lub brakujących tkanek ciała, opiera się na kontrolowanej angiogenezie w celu stworzenia prawidłowego unaczynienia w zmodyfikowanych tkankach. Bez układu naczyniowego grube konstrukty inżynieryjne nie mogą być wystarczająco odżywione, co może skutkować śmiercią komórki, słabym wszczepieniem i ostatecznie niepowodzeniem. Dlatego zrozumienie i kontrolowanie zachowania zmodyfikowanych naczyń krwionośnych jest wyjątkowym wyzwaniem w tej dziedzinie. W pracy przedstawiono wysokoprzepustowy system, który pozwala na tworzenie zorganizowanych i powtarzalnych sieci naczyń do badania zachowania statków w środowisku rusztowań 3D. Ten dwuetapowy protokół wysiewu pokazuje, że naczynia w systemie reagują na topografię rusztowania, prezentując charakterystyczne zachowania kiełkowania w zależności od geometrii komory, w której się znajdują. Uzyskane wyniki i zrozumienie z tego wysokowydajnego systemu mogą być wykorzystane w celu poinformowania o lepszych projektach biodrukowanych rusztowań 3D, w których produkcja różnych geometrii 3D nie może być szybko oceniona przy użyciu druku 3D jako podstawy dla komórkowych środowisk biologicznych. Co więcej, wiedza uzyskana dzięki temu wysokoprzepustowemu systemowi może zostać wykorzystana do poprawy szybkich badań przesiewowych leków, szybkiego rozwoju modeli kokultur oraz badania bodźców mechanicznych wpływających na tworzenie naczyń krwionośnych w celu pogłębienia wiedzy o układzie naczyniowym.

Wprowadzenie

Dziedzina inżynierii tkankowej szybko rozwija się w kierunku wytwarzania inżynieryjnych konstrukcji, które zastępują brakujące lub uszkodzone organy i tkanki¹. Jednak w pełni funkcjonalne konstrukty nie zostały jeszcze osiągnięte, częściowo dlatego, że generowanie działających sieci naczyniowych do odżywiania tkanek pozostaje wyjątkowym wyzwaniem. Bez odpowiedniego unaczynienia, zmodyfikowane tkanki są ograniczone do biernego transportu dyfuzyjnego tlenu i składników odżywczych, ograniczając maksymalną żywotną grubość tkanki do granicy dyfuzji, około 200^μm2. Takie grubości nie są odpowiednie do naprawy dużych ubytków tkanek ani do pełnego wytwarzania narządów, co sprawia, że obecność funkcjonalnej sieci naczyniowej jest obowiązkową cechą dla funkcjonalnych i wszczepialnych tkanek³.

Układ naczyniowy składa się z szerokiej gamy naczyń krwionośnych, o różnych rozmiarach, fenotypach i organizacji, ściśle związanych z tkanką gospodarza. Zrozumienie zachowań, reakcji i decyzji migracyjnych podejmowanych przez rozwijające się i kiełkujące naczynia może poinstruować ich integrację w zmodyfikowanych tkankach⁴. Obecnie najpowszechniejszym podejściem do tworzenia sieci naczyniowych in vitro jest łączenie komórek śródbłonka (EC) z komórkami podporowymi (SC, ze zdolnością do różnicowania się w komórki ścienne), osadzonymi w trójwymiarowym mikrośrodowisku. To środowisko dostarcza chemicznych i fizycznych wskazówek, które umożliwiają komórkom przyłączanie się, namnażanie i samoorganizację w sieci naczyń krwionośnych^2,5^,6,7^,8. Podczas wspólnej hodowli SC wydzielają białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), zapewniając jednocześnie mechaniczne wsparcie EC, które tworzą struktury kanalikowe. Co więcej, wzajemna interakcja między oboma typami komórek sprzyja tubuliogenezie, kiełkowaniu naczyń i migracji, a także dojrzewaniu i różnicowaniu SC w komórki muralu α ekspresji aktyny w mięśniach gładkich (αSMA)⁴. Rozwój sieci naczyń jest najczęściej badany w środowiskach 3D tworzonych przy użyciu hydrożeli, porowatych rusztowań polimerowych lub ich kombinacji. Ta ostatnia opcja zapewnia w równym stopniu środowisko przyjazne dla komórek i wymagane wsparcie mechaniczne zarówno dla komórek, jak i klasy ECM9.

Wykonano wiele pracy w celu zbadania rozwoju naczyń krwionośnych, w tym kohodowli komórek na hydrożelach¹⁰, kombinacje hydrożeli i rusztowań^11,12, platformy 2D i urządzenia mikroprzepływowe¹³. Jednak hydrożele mogą być łatwo odkształcane przez siły wywierane przez komórki¹⁴, podczas gdy systemy 2D i mikrofluidyczne nie są w stanie odtworzyć środowiska bliższego naturze, aby uzyskać bardziej ekstrapolowalną odpowiedź^15,16. Zrozumienie, w jaki sposób formujące się naczynia reagują na otaczające je środowisko, może dostarczyć krytycznych informacji, które mogą pozwolić na wytworzenie środowisk inżynieryjnych z możliwością kierowania rozwojem statków w przewidywalny sposób. Zrozumienie zjawisk tworzenia naczyń krwionośnych jest szczególnie ważne, aby nadążyć za szybkim pojawianiem się technik wytwarzania w skali submikronowej, takich jak stereolitografia, litografia z projekcją cyfrową, ciągła produkcja interfejsu cieczy, pisanie strumieniowe 3D melt-electro, pisanie elektrostrumieniowe 3D oparte na rozwiązaniach i nowe techniki biodruku^{17,18,19,20,21}. Dostosowanie kontroli tych technik mikroprodukcji do pogłębionego zrozumienia biologii naczyń krwionośnych jest kluczem do stworzenia odpowiedniego zmodyfikowanego układu krwionośnego dla tkanki docelowej.

Tutaj prezentujemy system 3D do badania reakcji nowych naczyń formujących i kiełkujących na otaczającą geometrię rusztowania, obserwując ich pochodzenie kiełków i późniejszą migrację²². Wykorzystując rusztowania 3D z mozaikową geometrią przedziałów i dwuetapową techniką wysiewu, udało nam się stworzyć wysoce zorganizowane sieci naczyniowe w przejrzysty i łatwy do analizy sposób. Geometrie teselacyjne zapewniają system o wysokiej przepustowości, w którym poszczególne jednostki zawierają naczynia, które reagują na lokalne środowisko. Korzystając z wielokolorowych ECs, prześledziliśmy początki powstawania kiełków i późniejsze wzorce migracji, skorelowane z geometrią przedziału i lokalizacją SCs²².

Chociaż proponowany protokół został przygotowany do analizy wpływu wskazówek geometrycznych na zachowanie unaczynienia, to podejście może być rozszerzone i zastosowane do wielu nowych zastosowań. Teselowane rusztowanie i łatwe do obrazowania sieci pozwalają na prostą analizę różnych interakcji EC i SC, dodawanie określonych komórek narządów i ich interakcję z sieciami naczyniowymi, wpływ leków na sieci naczyniowe i wiele innych. Proponowane przez nas wyniki systemu są bardzo wszechstronne i charakteryzują się prostą produkcją i obróbką.

Protokół

1. Produkcja rusztowań mozaikowych

UWAGA: Fotolitografia jest szeroko rozpowszechnioną techniką, która wymaga specjalistycznego sprzętu, zazwyczaj znajdującego się w zakładzie nanofabrykacji/laboratorium. Metoda przedstawiona w tym protokole została w jak największym stopniu uogólniona dla publiczności; Jednak w zależności od sprzętu dostępnego dla czytelnika mogą być konieczne niewielkie zmiany w procedurach. Zalecamy wykonywanie tych procedur w czystym pomieszczeniu w zakładzie nanoprodukcji, aby zapewnić najwyższą jakość procesu. Przed rozpoczęciem należy uzyskać dostęp do wyrównywacza maski (lub zestawu do ekspozycji na promieniowanie UV), powlekarki wirowej, płyt grzejnych, stacji mycia rozpuszczalników, fotomaski i myjki plazmowej. Rozpuszczalniki i chemikalia używane w procedurze są niebezpieczne, dlatego należy zachować najwyższą ostrożność, aby uniknąć narażenia na działanie substancji chemicznych. Projektując fotomaskę, określ, jakie rozmiary wafli krzemowych i fotomasek są kompatybilne z powlekarką spinową i wyrównywaczem maski. Dodatkowo, fotorezyst znajdujący się w kierunku krawędzi płytki krzemowej jest zwykle zdeformowany podczas obsługi; W związku z tym wykonaj projekty w kierunku środkowej części płytki.

1. Przygotuj rusztowania techniką fotolitografii z wybraną geometrią, która Cię interesuje.
   1. Przed wirowaniem należy oczyścić wafel silikonowy. Można to zrobić za pomocą czyszczenia plazmowego lub techniki na bazie rozpuszczalnika. W przypadku czyszczenia plazmowego postępuj zgodnie ze standardową procedurą operacyjną przyrządu, aby uzyskać szczegółowe informacje operacyjne. Spryskaj sprężonym azotem i sprawdź płytkę, aby upewnić się, że jest wolna od zanieczyszczeń przed wirowaniem. Płytka ta posłuży jako podłoże, na którym tworzone są rusztowania.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, zacznij od świeżego wafla. Wafle mogą być ponownie użyte, ale powinny być wolne od starego fotorezystu, wad powierzchniowych i zanieczyszczeń. Pomocne jest użycie pęsety waflowej do przenoszenia.
   2. Wyśrodkuj wafel silikonowy na uchwycie wirówkowym za pomocą prowadnicy. Krótko obróć wafel, aby upewnić się, że został prawidłowo wyśrodkowany na uchwycie, wyreguluj w razie potrzeby, aż zostanie prawidłowo wyśrodkowany. Należy to zrobić za każdym razem, gdy wafel jest umieszczany na wirówce. Dozuj 1-4 ml odczynnika lift-off na wafel (będzie to zależeć od wielkości płytki). Około 2 ml odczynnika lift-off dobrze sprawdza się w przypadku 4-calowej płytki.
      1. Ustaw prędkość rozprowadzania wirówki na 500 obr./min na 5 sekund, a prędkość wirowania na 1000 obr./min na 30 sekund, a następnie odwiruj odczynnik do zdejmowania. Sprawdź wafel, aby upewnić się, że ma równomierną powłokę na płytce. Wszelkie zanieczyszczenia pozostawione na wafli będą w tym momencie bardzo widoczne. Wszelkie rusztowania w obszarze z gruzem prawdopodobnie nie będą nadawały się do użytku. Po odwirowaniu przełóż na gorącą płytę i piecz przez 1 minutę w temperaturze 200 °C.
   3. Powtórz poprzedni krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać w sumie trzy warstwy.
   4. Pokryć wirowo płytkę krzemową pokrytą odczynnikiem lift-off fotorezystem SU-8 2050 aż do uzyskania grubości około 100 μm.
      1. Dozować 1 ml rezystu na każde 25 mm średnicy podłoża.
         UWAGA: Uważaj, aby uniknąć bąbelków podczas nalewania rezystu. W przypadku SU-8 2050 dobrze sprawdza się wylanie koła o średnicy około 2 cali, przy użyciu 4-calowej płytki krzemowej.
      2. Powłoka obrotowa SU-8 2050. Rozprowadzać z prędkością 500 obr./min przez 5 sekund, a następnie z prędkością wirowania od 1700 do 1800 obr./min, aby osiągnąć grubość około 100 μm.
      3. Opcjonalnie: Po odwirowaniu pozostaw wirujące wafle do odgazowania na noc na równej powierzchni chronionej przed światłem przed wstępnym pieczeniem. Może to pomóc w pozbyciu się wszelkich pęcherzyków powietrza i umożliwić wyrównanie defektów.
         UWAGA: Rzeczywista grubość rezystancji i powstałych rusztowań może się różnić w zależności od błędu użytkownika i parametrów sprzętu. W związku z tym grubość rusztowań należy zweryfikować później, w kroku 1.6. Odpowiednio zmodyfikuj procedury powlekania wirowego, aby uzyskać pożądaną grubość.
   5. Przed ekspozycją wstępnie upiecz wafle w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 40-50 minut. Przed ekspozycją przetestuj powierzchnię rezystu, naciskając krawędź pęsetą, aby upewnić się, że nie jest już lepka/lepka. Pomocne jest ściągnięcie wafla z płyty grzejnej i pozostawienie go do ostygnięcia przez 0,5-1 minuty przed oceną lepkości.
      UWAGA: Powolne czasy narastania temperatury (ogrzewanie i chłodzenie) mogą pomóc w zapobieganiu wypaczaniu się rusztowań.
2. Wystaw fotorezystor na działanie światła UV (350-400 nm) przez fotomaskę o energii ekspozycji 215-240 mJ/^cm2 dla grubości rezystu 85 - 110 μm. Zapoznaj się z wytycznymi producenta fotorezystu, aby uzyskać zalecane korelacje energii ekspozycji i grubości.
   1. Upewnij się, że ekspozycja jest prawidłowo skalibrowana, tak aby energia została zweryfikowana. W razie potrzeby dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać żądaną energię ekspozycji. Ponadto nakładki maski mogą pozwalać na różne tryby ekspozycji: kontakt próżniowy, twardy kontakt, miękki kontakt i kontakt zbliżeniowy (konkretne warunki mogą się różnić). Ogólnie rzecz biorąc, będą one miały wpływ na rozdzielczość i wyrównanie funkcji. Autorzy zazwyczaj używali trybu "twardego kontaktu".
   2. W przypadku małych obiektów lub wielu warstw, w przypadku których wyrównanie będzie miało znaczenie, należy dokładniej rozważyć tryby ekspozycji i procedury wyrównywania maski. Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę wysokość oporu podczas regulacji wartości grubości. Zapoznaj się ze standardowymi procedurami operacyjnymi maski-alignera, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat operacji.
      UWAGA: Konstrukcja fotomaski określi rozmiar rusztowania, geometrię komory i liczbę rusztowań uzyskanych w partii. Użycie fotomaski z twardego szkła lub kwarcu zapewni najwyższą rozdzielczość; Jednak w przypadku tych dużych rozmiarów elementów (>10 μm) można zazwyczaj stosować fotomaskę z przezroczystej folii z miękkiego polimeru. Zastosowanie filmu-fotomaski może prowadzić do powstania cech topograficznych wzdłuż osi z porów rusztowania w wyniku gorszej rozdzielczości obiektów. Może to mieć potencjalny wpływ na zachowanie komórek. Sprawdź żądaną rozdzielczość, skonsultuj się z osobą, która produkuje fotomaskę, aby upewnić się, że osiągnięto żądaną rozdzielczość.
3. Wafelek piecze się natychmiast po ekspozycji na promieniowanie UV w temperaturze 65 °C przez 2-5 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 8-10 minut.
4. Rozwiń rusztowania, aby usunąć nierozwinięty opór.
   1. Zanurz rusztowania w małej objętości roztworu wywoływacza SU-8 na 7-10 minut, aby rozpuścić nierozwinięty opór.
   2. Spłucz alkoholem izopropylowym (IPA).
   3. Suchy wafel ze sprężonym azotem.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas kroku 1.4, aby nie spowodować przedwczesnego zwolnienia rusztowań. Aby to osiągnąć, konieczne są niewielkie ilości wywoływacza i delikatne obchodzenie się z nim.
5. Po wytworzeniu wafle pieczemy na twardo w temperaturze 150 °C przez 15 min.
   UWAGA: Po twardym pieczeniu wyłączenie płyty grzejnej, aby wafle ostygły bardzo powoli, może być korzystne w zapobieganiu wypaczaniu/zwijaniu się końcowych rusztowań.
6. Opcjonalnie: Po twardym pieczeniu i przed startem należy ocenić grubość rusztowania, ponieważ rusztowania powinny być nadal delikatnie przylegające do powierzchni płytki. W przypadku tej procedury dobrze sprawdza się profilometria kontaktowa; Można jednak zastosować każdą odpowiednią metodę.
7. Podnieś rusztowania z wafla.
   1. Zanurz rusztowania w wywoływaczu SU-8, aby spowodować, że natychmiast oderwą się od płytki. Jeśli rusztowania nie podnoszą się, delikatnie popchnij rusztowania pęsetą waflową.
   2. Usuń nadmiar programisty.
   3. Przenieść rusztowania do nowego pojemnika i zanurzyć w alkoholu izopropylowym. Spłucz w IPA co najmniej 6 razy, aby upewnić się, że cały wywoływacz został usunięty.
8. Rusztowania należy suszyć na powietrzu przez co najmniej tydzień przed użyciem.

2. Powłoka fibronektyny rusztowania

1. W celu dezynfekcji zanurz rusztowania w 70% etanolu (v/v) na co najmniej 15 minut, a przed użyciem umyj 2 razy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   UWAGA: Rusztowania SU-8 są kruche i łatwo się łamią. Zaleca się obchodzenie się z nimi przy użyciu kleszczy z i zakrzywionymi końcówkami i należy obchodzić się z nimi z najwyższą ostrożnością. Łatwiejszą obsługę można osiągnąć, zanurzając rusztowania w cieczy, aby uniknąć interakcji elektrostatycznych między rusztowaniami a powierzchnią.
2. Przygotować rozcieńczenie 50 μg/ml ludzkiej fibronektyny w PBS i pokryć rusztowania adsorpcją białek.
   1. Wymieszaj 1,5 μl roztworu podstawowego fibronektyny (1 mg/ml) z 28,5 μl PBS na każde rusztowanie, które ma być wysiewane. Zaleca się przygotowanie tylko jednego rozcieńczenia fibronektyny, które będzie stosowane do wszystkich rusztowań, aby uniknąć błędów w pipetowaniu.
      1. Na 10 rusztowań wymieszać 15 μl podstawowego roztworu fibronektyny w 285 μl PBS, co daje łącznie 300 μl rozcieńczenia fibronektyny 50 μg/mL.
   2. Rusztowania należy umieścić z rzadka na powierzchni hydrofobowej (tj. 10-centymetrowym naczyniu z kulturą nietkankową (nonTC)) i przykryć każde rusztowanie 30 μl rozcieńczenia fibronektyny przygotowanego w kroku 2.2.1.
      UWAGA: Upewnij się, że w komorach rusztowania nie są uwięzione żadne pęcherzyki. Jeśli pęcherzyki są obecne, można je usunąć, delikatnie potrząsając rusztowaniem w kropli lub lekkim pipetowaniem.
   3. Załóż pokrywę płytki i umieść rusztowania pokryte fibronektyną w inkubatorze o temperaturze 37 °C i wilgotności 100% na co najmniej godzinę.
   4. Po inkubacji lekko przepłucz rusztowania w PBS, aby usunąć resztki fibronektyny. Rusztowania można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do tygodnia przed użyciem.

3. Wysiewanie komórek śródbłonka

1. Przygotować pożywkę EC, mieszając podłoże podstawowe z odpowiadającymi mu składnikami zestawu pożywki, w tym roztworem antybiotyku (Pen/Strep), płodową surowicą bydlęcą (FBS) i suplementami wzrostu komórek śródbłonka, zgodnie ze wskazaniami producenta.
2. Wykonać zawiesinę ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka tkanki tłuszczowej (HAMEC) w pożywce EC o stężeniu 4 x 10⁶ komórek/mL.
   UWAGA: Obrazowanie w czasie rzeczywistym można przeprowadzić, jeśli użyte komórki śródbłonka są wcześniej transfekowane w celu ekspresji białka fluorescencyjnego lub wstępnie wybarwione przy użyciu nietoksycznego barwnika błony cytoplazmatycznej (dalej określanego jako znakowane EC).
3. Za pomocą kleszczy umieść jedno rusztowanie pokryte fibronektyną na studzience 24-dołkowej bez TC.
4. Przykryj każde rusztowanie 25 μl kropelkami zawiesiny HAMEC. Należy uważać, aby zawiesina nie spływała z rusztowania, ponieważ może to utrudnić przyleganie komórek.
5. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 100%. Pozostawić do inkubacji przez minimum 60 minut i maksymalnie 90 minut.
   UWAGA: Podczas inkubacji umieszczenie płytki na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze poprawia przyczepianie komórek do ścian rusztowania. Wytrząsarka orbitalna powinna być ustawiona na nie więcej niż 5 obr./min.
6. Po inkubacji napełnić każdą studzienkę 700 μl pożywki EC za pomocą pipety.
   UWAGA: Spodziewaj się, że na dnie studni zobaczysz EC, ponieważ niektóre komórki nie przyczepiają się do rusztowania i wpadają przez puste przestrzenie rusztowania.
7. Inkubuj śródbłonkowe rusztowania do momentu, gdy będzie można zaobserwować zbieg EC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej na ścianach rusztowania (w przypadku stosowania znakowanych EC) lub przez 3 dni (w przypadku stosowania nieznakowanych EC), co zapewnia wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie zbiegu EC. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.

4. Wspieraj wysiewanie komórek i kokulturę

1. Przygotuj pożywkę z komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC) (DPSCm), mieszając 500 ml zmodyfikowanego Eagle medium o niskiej zawartości glukozy Dulbecco (DMEM o niskiej glukozie), 57,5 ml FBS, 5,75 ml aminokwasów endogennych (NEAA), 5,75 ml GlutaMAX i 5,75 ml roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny.
2. Przenieś śródbłonkowe rusztowania na nową 24-dołkową płytkę bez TC, aby wyrzucić EC przymocowane do dna studzienek za pomocą kleszczy.
   1. Wyrzuć wszystkie media z bieżącej płytki za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub odsysania próżniowego. Uważaj, aby nie nakładać podciśnienia bezpośrednio na rusztowanie.
   2. Umieść jedno rusztowanie na studzienkę, najlepiej na środku studni, aby uniknąć spływania cieczy w kierunku ścian z powodu wpływu napięcia powierzchniowego. Osusz obszar otaczający rusztowanie lekkim podciśnieniem, ale unikaj całkowitego wyschnięcia rusztowania.
3. Przygotować zawiesinę DPSC w roztworze fibryny w postaci żelu wstępnego.
   1. Rozcieńczyć roztwory podstawowe trombiny i fibrynogenu PBS aż do uzyskania końcowego stężenia odpowiednio 5 U/ml i 15 mg/ml.
   2. Przygotować zawiesinę 8 x 10⁶ DPSC/ml w rozcieńczeniu trombiny 5 U/ml i rozprowadzić w poszczególnych eppendorfach 12,5 μl wspomnianej zawiesiny na rusztowanie przeznaczone do wysiewu.
   3. Ustaw pipetę o pojemności 5-50 μl (lub podobną) na 12,5 μl i napełnij ją roztworem fibrynogenu o stężeniu 15 mg/ml.
   4. Nie zdejmując końcówki, ustaw pipetę na 25 μl. Materiał w końcówce powinien unieść się i pozostawić pustą objętość w kierunku otworu końcówki.
   5. Powoli naciskać przycisk tłoka, aż płyn dotrze do otworu końcówki, ale nie wycieknie. Przytrzymaj tłok w tej pozycji i umieść końcówkę w jednej z probówek do mikrowirówek zawierających komórki w zawiesinie trombiny, upewniając się, że końcówka styka się z cieczą.
      UWAGA: Sieciowanie fibryny rozpocznie się natychmiast po kontakcie trombiny i fibrynogenu. Następny krok należy wykonać szybko.
   6. Delikatnie zwolnić przycisk tłoka i wciągnąć zawiesinę ogniwa do końcówki. Dokładnie wymieszaj oba materiały, unikając tworzenia się pęcherzyków.
4. Szybko dozuj zmieszane materiały na wierzch śródbłonkowego rusztowania. Powtórz poprzednie kroki dla każdego rusztowania, upewniając się, że zawsze zmieniasz końcówki między użyciami, aby uniknąć nieoczekiwanego tworzenia się żelu fibrynowego w końcówce.
5. Założyć pokrywę płytki i inkubować rusztowania w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 100% przez 30 minut.
6. Po inkubacji napełnij każdą studzienkę 1 ml pożywki 1:1 DPSC i EC.
   1. Kultura przez 1 tydzień, zmiana podłoża co drugi dzień.
   2. Podczas hodowli usuń pożywkę ze studzienki i zobrazuj konstrukty za pomocą mikroskopu konfokalnego w różnych punktach czasowych, aby zbadać rozwój naczyń krwionośnych lub dowolny inny interesujący parametr.
      UWAGA: Ten krok można wykonać tylko wtedy, gdy eksperyment jest wykonywany przy użyciu oznaczonych EC. Zobacz Krok 6 - UWAGA w celu uzyskania dalszych wyjaśnień.

5. Barwienie immunofluorescencyjne dla charakterystycznych markerów naczyniowych

UWAGA: Następujące kroki można wykonać w tych samych studniach, w których hodowano konstrukty. Bardzo ważne jest, aby zawsze upewnić się, że rozwiązania całkowicie zakrywają rusztowania. Ponadto, jeśli to możliwe, zaleca się wykonywanie czynności na wytrząsarce orbitalnej, choć nie jest to obowiązkowe.

1. W dniu 7 wyrzuć pożywkę ze studzienek i przepłucz rusztowania, dodając PBS do studzienek i usuwając go za pomocą próżni.
2. Napraw rusztowania, dodając 4% paraformaldehydu przez 20 minut. Prać w PBS 3 razy po 5 minut na pranie.
3. Przepuszczalność utrwalonych komórek za pomocą 0,3% Triton-X w PBS (v/v) przez 15 minut. Prać w PBS 3 razy po 5 minut na pranie.
4. Przygotować 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze blokującym PBS (w/v) i przykryć rusztowania. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
   UWAGA: Wszystkie wymagane ilości roztworu będą zależeć od liczby rusztowań do barwienia. Przygotować roztwory w razie potrzeby, zachowując podane stężenia.
5. Przygotuj i nałóż pierwszorzędowy roztwór barwiący przeciwciała .
   1. Rozcieńczyć królicze przeciwciało anty-von Willebranda (vWF) 1:150 i mysie przeciwciało anty-SMA 1:50 w świeżym roztworze blokującym.
      UWAGA: Można stosować inne markery komórek śródbłonka, takie jak CD31 lub VE-Kadheryna.
   2. Przykryć rusztowania roztworem przeciwciał pierwszorzędowych i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj w PBS trzy razy po 5 minut na pranie.
6. Przygotować i nałożyć wtórny roztwór barwiący przeciwciała.
   1. Rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-mysie Cy3 1:150 i kozie anty-królicze Alexa-Fluor 488 1:400 w PBS.
   2. Przykryć rusztowania roztworem przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj 3 razy w PBS po 5 minut na pranie. Poplamione rusztowanie należy przechowywać w 0,3% PFA w PBS (v/v) przez okres do miesiąca.

6. Obrazowanie konfokalne rusztowania i analiza rozwoju naczyń

UWAGA: Następujące kroki mogą być wykonane na stałych i barwionych rusztowaniach w wybranym końcowym punkcie czasowym lub, jeśli użyto komórek fluorescencyjnych, podczas okresu hodowli komórkowej bez konieczności przerywania eksperymentu. W przypadku tych ostatnich zaleca się ustawienie określonych punktów czasowych; ta praca pokazuje dzień 0 (przed rozstawieniem SC) oraz dni 1, 3, 5 i 7 po rozstawieniu SC (Rysunek 3A).

1. Zobrazuj rusztowania za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 5X i zoomem 0,5 oraz pełnym zakresem z rusztowania. Pozwoli to na uchwycenie 9 oddzielnych przegródek dla geometrii kwadratowej i kołowej lub 8 pełnych przegródek dla geometrii sześciokątnej. Zobrazuj sygnał fluorescencyjny i przepuszczane światło, aby uzyskać zarówno strukturę sieci naczynia, jak i geometrię komory (Rysunek 3A).
2. Za pomocą ImageJ (lub dowolnego innego oprogramowania do przetwarzania obrazu) przytnij każdy pojedynczy przedział; w tym procesie istotne są tylko markery sieci naczyniowych. Usuń wszelkie naczynia, które nie znajdują się w obszarze komory. Utwórz projekcję o maksymalnej intensywności i zapisz każdą pojedynczą przyciętą komorę jako obraz TIFF.
   1. W ImageJ naciśnij File > Open i wybierz żądany obraz TIFF zawierający kilka przegródek. Obraz powinien mieć co najmniej dwa kanały, sieć naczyń fluorescencyjnych i obraz w świetle przechodzącym.
   2. Na pasku narzędzi wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów. Wybierz kanał światła przechodzącego. Kliknij jeden z rogów sześciokątnej komory, na styku obszaru przedziału ze ścianą rusztowania, co rozpocznie definicję maski. Kontynuuj klikanie kolejnych rogów w kolejności sekwencyjnej, aż zostanie wybrany początkowy róg, zamykając maskę.
      UWAGA: To wyjaśnienie dotyczy komory sześciokątnej. Jeśli przegródka jest kwadratowa lub okrągła, użyj odpowiednio narzędzi Prostokąt lub Owal, aby utworzyć odpowiednią maskę. Niezależnie od kształtu, zawsze dopasowuj maskę tak, aby podążała za wewnętrzną ścianą rusztowania.
   3. Kliknij Analizuj narzędzia > > menedżera ROI. W menedżerze ROI (ROI, region zainteresowania) kliknij przycisk Dodaj, aby zapisać utworzoną maskę. Nowa maska pojawi się na liście po lewej stronie. Ten krok pozwala na spójność analizy między różnymi obrazami.
      UWAGA: W menedżerze ROI możliwe jest zapisanie pliku ze wszystkimi utworzonymi maskami, klikając Więcej > Zapisz. W oknie Zapisz wybór wybierz nazwę i lokalizację, a następnie zapisz plik .roi. Aby odzyskać maskę, w menedżerze ROI kliknij Więcej > Otwórz i wybierz żądany plik .roi.
   4. Wybierz obraz sieci naczyń fluorescencyjnych i kliknij Edytuj > Wyczyść na zewnątrz. Pozostanie tylko obraz zawarty w masce, a reszta zostanie wyeliminowana.
   5. Po otwarciu wyczyszczonego obrazu sieci kliknij Obraz > Duplikuj. W oknie podręcznym Duplikuj wpisz nazwę obrazu. Jeśli zaznaczona jest opcja Zduplikowany hiperstos, usuń jej zaznaczenie i kliknij przycisk OK. Zostanie utworzony nowy obraz zawierający tylko przycięte sieci naczyń fluorescencyjnych.
   6. Zapisz przycięty obraz, klikając Plik > Zapisz jako > Tiff. Wybierz nazwę i katalog, a następnie kliknij przycisk OK.
3. Przeanalizuj rozwój naczyń krwionośnych na przyciętych obrazach.
   1. Pobierz i zainstaluj bezpłatne oprogramowanie analityczne AngioTool, które zapewnia narzędzia ilościowe do ilościowego określania różnych parametrów naczyniowych. Oprogramowanie można pobrać pod następującym adresem https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
   2. Ustaw wartość skali obrazów, aby uzyskać wyniki w jednostkach milimetrowych i załaduj obraz.
      1. Kliknij zakładkę Ustawienia i wypełnij pola Odległość w pikselach i Odległość w mm reprezentatywnymi wartościami z wykonanych zdjęć. Korzystając z wyżej wymienionych parametrów obrazowania, wartości do wypełnienia wynoszą 400 pikseli na 1 mm.
      2. Naciśnij przycisk Otwórz obraz i wyszukaj interesujący Cię obraz.
   3. Wybierz parametry analizy, aby określić ilościowo rozwój statku na karcie Analiza.
      1. W polu Średnica i intensywność naczynia usuń zaznaczenie dowolnego obecnego znacznika z górnego selektora zakresu i aktywuj znacznik reprezentujący liczbę 3.
      2. W polu Średnica i intensywność naczynia, na dolnym selektorze zakresu, przesuń dolny znacznik zakresu na 60 i pozostaw wysoki zakres na 255.
      3. Aktywuj pole Usuń małe cząstki i ustaw znacznik na 100.
      4. W polu Preferencje zapisywania wybierz nazwę i lokalizację pliku arkusza kalkulacyjnego, w którym zostaną zapisane wyniki, a następnie naciśnij przycisk Uruchom analizę. Jeśli zaznaczone jest pole Zapisz obraz wyniku, Angiotool wygeneruje i zapisze nowy obraz jpeg przedstawiający parametry ilościowe sieci statków.
         UWAGA: Dla każdej wykonanej analizy bez zmiany nazwy pliku arkusza kalkulacyjnego zostanie dodany nowy wiersz na dole pliku, z nowo uzyskanymi wynikami.
4. Uporządkuj dane i przeprowadź analizę statystyczną.
   1. Dla wszystkich przetworzonych obrazów wybierz interesujący Cię parametr z arkusza kalkulacyjnego (np. Całkowita długość naczynia i Powierzchnia naczynia) i wprowadź je do oprogramowania do analizy statystycznej, aby prawidłowo przestudiować uzyskane wyniki (Rysunek 3C).

7. Obrazowanie poklatkowe do wykrywania pochodzenia kiełkowania i śledzenia migracji

1. Alternatywnie, zamiast hodować rusztowania w inkubatorze, jak opisano w kroku 4.6, należy ustawić komorę hodowlaną mikroskopu konfokalnego na 37 °C, 5% CO₂ i 100% wilgotności.
   1. Umieść płytkę zawierającą w pełni obsadzone rusztowania w komorze mikroskopu konfokalnego i ustaw parametry obrazowania na żądane wartości.
   2. Ustaw interwał robienia zdjęć na 30 minut, a całkowity czas obrazowania na 72 godziny. Umożliwi to całkowite uruchomienie filmu poklatkowego bez konieczności zmiany średniego źródła.
      UWAGA: W przypadku, gdy pożądane jest obrazowanie poklatkowe o dłuższym czasie, należy przeprowadzić staranną kalibrację położenia, aby móc odzyskać pierwotną lokalizację obrazowania, ponieważ zmiany podłoża wymagają wyjęcia płytki z inkubatora konfokalnego i umieszczenia w sterylnym kapturze biologicznym.
      UWAGA: Odłączanie EC od ścian rusztowania i tworzenia konstrukcji rurowych rozpocznie się w ciągu pierwszej godziny po wysiewie SC (krok 4) i może potrwać do 50 godzin. Po początkowym uformowaniu rurki nowe kiełki zaczną migrować do komory z otaczających naczyń. Kiełkowanie i późniejsza przebudowa sieci będą kontynuowane przez cały eksperyment mniej więcej do 10 dnia, kiedy sieci statków staną się stabilne²². Skorzystaj z tych informacji, aby odpowiednio wybrać punkt początkowy upływu czasu i krok czasowy.
2. Zapisz cały plik filmu poklatkowego jako sekwencję TIFF.
3. Otwórz ImageJ i kliknij Plik > Importuj > sekwencji obrazów i wybierz swoje pliki. Spowoduje to otwarcie sekwencji TIFF jako filmu.
4. Otwórz wtyczkę Manual Tracking, klikając Plugins > Manual Tracking. Spowoduje to otwarcie okna Śledzenie.
5. Obejrzyj film i wybierz statek, który chcesz śledzić. Zwróć uwagę na jego pochodzenie i migrację.
6. Aktywuj pole Pokaż parametry i wprowadź 30 minut w polu Interwał czasu. Kalibracja x/y będzie zależeć od ilości pikseli wybranej podczas obrazowania.
7. Kontynuuj ręczne śledzenie naczyń kiełkujących od konturu rusztowania.
   1. Naciśnij przycisk Dodaj utwór. W pierwszej klatce filmu naciśnij lokalizację statku, który ma być śledzony. Po tym czasie film automatycznie przejdzie do następnej klatki.
   2. Kliknij na obrazek drugiej ramki, w której znajduje się naczynie. Również w tym przypadku film automatycznie przejdzie do następnej klatki.
   3. Kontynuuj podróż tym samym statkiem, aż do zakończenia pełnego śledzenia migracji.
   4. W oknie Tracking (Śledzenie) kliknij przycisk Overlay Dots & Lines, aby narysować wizualną ścieżkę migracji statku na filmie. Spowoduje to otwarcie kopii filmu z kropką reprezentującą aktualną pozycję trackera i linią pokazującą poprzednią ścieżkę.
   5. Kliknij przycisk End Track (Zakończ ścieżkę), aby sfinalizować rejestrowanie bieżącego ruchu statku.
   6. Kliknij ponownie przycisk Dodaj ścieżkę, aby zacząć od nowa z nowym statkiem. Robiąc to, znaczniki linii i kropek automatycznie zmienią kolor dla nowego naczynia. Powtarzaj, aż wszystkie żądane naczynia zostaną wyśledzone.
      UWAGA: Położenie x/y, prędkość statku i przebytą odległość można pobrać z wyskakującego okienka Wyniki. Każdy statek będzie identyfikowany na podstawie numeru toru w skrajnej lewej kolumnie. Dane te można skopiować i wkleić do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia dalszej analizy.

Wyniki

Prezentowany protokół, wykorzystujący techniki stereolitografii, pozwala na wytwarzanie mozaikowych rusztowań wykonanych z fotorezystu SU-8. Uzyskano rusztowania o różnych geometriach przedziałów (kwadraty, sześciokąty i koła) oraz bardzo dokładnych i powtarzalnych cechach (Rysunek 1).

Rysunek 1...

Dyskusja

Potrzeba bogatego układu naczyniowego w tkankach osadzonych w inżynierii ma kluczowe znaczenie dla przetrwania konstrukcji i prawidłowego funkcjonowania¹. Chociaż inżynieria układu naczyniowego była przedmiotem ogromnej liczby badań, wiele pozostaje jeszcze do zbadania i zrozumienia²⁴. W szczególności podczas odtwarzania określonej tkanki mikrokrążenie powinno zachowywać się i organizować odpowiednio¹². Najczęstszym podejściem do generowania mikronac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Darmowe oprogramowanie Angiotool	NIH-CCR		do pobrania za darmo pod adresem https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Surowica albuminy bydlęcej Probumin	Millipore	82-045-1
Komórki macierzyste miazgi zębowej	Lonza	PT-5025
ECM media + zestaw pocisków	Sciencell	#1001
Etanol 96%	Grupa Gadot	64-17-5
Uszczelniacz fibrynowy Evicel	Johnson& Johnson	EVB05IL	Dostarcza zarówno roztwory trombiny, jak i fibrynogenu (BAC2)
GlutaMAX	Gibco	35050061
Goat przeciwciało anty-mysie Cy3	Jackson	115-166-072
Koza anty-królik Alexa-Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A11034
Ludzkie komórki mikronaczyniowe tkanki tłuszczowej	Sciencell	#7200
Człowiek fibronektyna	Sigma	F0895-5MG	Stężenie magazynowe: 1 mg / ml
ImageJ	NIH		Bezpłatne pobieranie pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Alkohol izopropylowy	Gadot-Group	67-63-0
Odczynnik do liftingu	Kayaku Advanced Materials, Inc	G112850	Nazwa handlowa Omnicoat
Low-glucose	DMEM Biological Industries	01-050-1A
Mysie przeciwciało anty-SMA	Dako	M0851
NEAA	Gibco	11140068
Roztwór paraformaldehydu 4% w PBS	ChemCruz	SC-281692
Roztwór penicyliny, streptomycyny i nystatyny	Przemysł biologiczny	03-032-1B
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
Królicze przeciwciało anty-vWF	Abcam	ab9378
Wafel krzemowy	Silicon Valley Microelectronics (SVM)		Wafle 4 ", typ N-1-10, grubość 500-550 mikronów
Fotorezystor SU-8 2050	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
SU-8 deweloper	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	Numer katalogowy: 57836