Artykuł metodologiczny

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

DOI:

10.3791/62005

⸱

25 stycznia 2021

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, Madison, WI, USA

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw różnicowania i funkcji adipocytów przyniosło ogromne korzyści dzięki zastosowaniu unieśmiertelnionych białych linii komórkowych preadipocytów. Te hodowane linie komórkowe mają jednak ograniczenia. Nie pozwalają one w pełni uchwycić zróżnicowanego spektrum funkcjonalnego heterogenicznych populacji adipocytów, o których obecnie wiadomo, że istnieją w białych magazynach tłuszczu. Aby zapewnić bardziej fizjologicznie odpowiedni model do badania złożoności białej tkanki tłuszczowej, opracowano i zoptymalizowano protokół, który umożliwia jednoczesną izolację pierwotnych białych i brązowych komórek progenitorowych adipocytów od nowonarodzonych myszy, ich szybką ekspansję w hodowli i różnicowanie in vitro w dojrzałe, w pełni funkcjonalne adipocyty. Podstawową zaletą izolowania komórek pierwotnych od nowonarodzonych, a nie dorosłych myszy, jest to, że magazyny tłuszczu aktywnie się rozwijają i dlatego są bogatym źródłem proliferujących preadipocytów. Pierwotne preadipocyty wyizolowane przy użyciu tego protokołu różnicują się szybko po osiągnięciu konfluencji i osiągają pełną dojrzałość w ciągu 4-5 dni, co jest oknem czasowym, które dokładnie odzwierciedla wygląd rozwiniętych poduszeczek tłuszczowych u nowonarodzonych myszy. Hodowle pierwotne przygotowane przy użyciu tej strategii mogą być rozszerzane i badane z wysoką odtwarzalnością, dzięki czemu nadają się do genetycznych i fenotypowych badań przesiewowych oraz umożliwiają badanie autonomicznych komórkowo fenotypów adipocytów genetycznych modeli myszy. Protokół ten oferuje proste, szybkie i niedrogie podejście do badania złożoności tkanki tłuszczowej in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość wynika z chronicznego braku równowagi między spożyciem energii a wydatkiem energetycznym. Wraz z rozwojem otyłości białe adipocyty ulegają ogromnemu rozszerzeniu wielkości komórek, co skutkuje niedotlenieniem w mikrośrodowisku, śmiercią komórek, stanem zapalnym i insulinoopornością1. Dysfunkcyjne, przerośnięte adipocyty nie są w stanie prawidłowo magazynować nadmiaru lipidów, które gromadzą się w innych tkankach, gdzie hamują działanie insuliny2,3. Przewiduje się, że środki poprawiające funkcję adipocytów i przywracające prawidłowy podział lipidów między tkankami będą korzystne w leczeniu stanów związanych z otyłością, charakteryzujących się insulinoopornością, takich jak cukrzyca typu 2. Badania fenotypowe w adipocytach przy użyciu unieśmiertelnionych linii komórkowych, takich jak 3T3-L1, F442A i 10T 1/2, okazały się przydatne do identyfikacji czynników genetycznych regulujących adipogenezę i izolowania proadipogennych cząsteczek o właściwościach przeciwcukrzycowych4,5,6,7. Te linie komórkowe nie odzwierciedlają jednak w pełni niejednorodności typów komórek obecnych w magazynach tłuszczu, która obejmuje białe, brązowe, beżowe i inne podtypy adipocytów o unikalnych cechach, z których wszystkie przyczyniają się do homeostazy ogólnoustrojowej8,9,10. Co więcej, hodowane linie komórkowe często wykazują zmniejszoną reakcję na bodźce zewnętrzne.

Natomiast hodowle adipocytów pierwszorzędowych dokładniej oddają złożoność adipogenezy in vivo, a adipocyty pierwotne wykazują silne odpowiedzi funkcjonalne. Pierwotne preadipocyty są zwykle izolowane z frakcji zrębowej naczyń tłuszczowych magazynów tłuszczowych dorosłych myszy11,12,13,14. Ponieważ jednak magazyny tłuszczu dorosłych zwierząt składają się głównie z w pełni dojrzałych adipocytów, które mają bardzo powolne tempo rotacji15,16,17, takie podejście daje ograniczoną ilość preadipocytów o niskim tempie proliferacji. Dlatego izolacja preadipocytów od nowonarodzonych myszy jest preferowana w celu uzyskania dużych ilości szybko rosnących komórek, które można różnicować in vitro. W tym miejscu opisano protokół, zainspirowany początkowymi pracami z pierwotnymi brązowymi adipocytami Kahn i wsp.18 w celu skutecznego wyizolowania zarówno białych, jak i brązowych preadipocytów, które mogą być namnażane i różnicowane in vitro w w pełni funkcjonalne pierwotne adipocyty (Rysunek 1A). Zaletą izolowania komórek pierwotnych od noworodków, w przeciwieństwie do dorosłych myszy, jest to, że magazyny tłuszczu szybko rosną, a tym samym są bogatym źródłem aktywnie proliferujących preadipocytów17. Komórki wyizolowane przy użyciu tego protokołu mają wysoką zdolność proliferacyjną, co umożliwia szybkie zwiększanie skali hodowli. Ponadto preadipocyty nowonarodzonych szczeniąt wykazują wyższy potencjał różnicowania niż dorośli przodkowie, co zmniejsza zmienność stopnia zróżnicowania, a tym samym zwiększa odtwarzalność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi IACUC Instytutu Badawczego Scripps oraz University of Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.

1. Zbieranie i trawienie magazynów tłuszczu (dzień 1)

  1. Przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml dla każdego szczeniaka: jedną dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) i jedną dla białej tkanki tłuszczowej (WAT). Do każdej probówki dodać 250 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 200 μl 2x buforu izolacyjnego (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2, 5 mM glukozy, 100 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), penicyliny-streptomycyny i 4% albuminy surowicy bydlęcej bez kwasów tłuszczowych) do każdej probówki. Roztwory należy przechowywać w sterylnych warunkach i na lodzie.
  2. Umieść młode w małych komorach (np. w jednym dołku na 6-dołkowej płytce) i umieść je na lodzie, aż staną się hipotermiczne. Upewnij się, że nie ma bezpośredniego kontaktu między szczeniętami a lodem. Nakłuj łapę czubkiem, aby zapewnić utratę przytomności, i poddaj szczenięta eutanazji przez ścięcie głowy ostrymi nożyczkami.
    UWAGA: jeśli pracujesz z różnymi genotypami, przygotuj dodatkową probówkę do pobrania biopsji ogona (nacięcie 3 mm) do genotypowania. Jeśli genotypowanie zostanie przeprowadzone natychmiast, trzymaj uśpione młode na lodzie do czasu sekcji, aby zebrać magazyny tłuszczu.
  3. Oblicz i zważ ilość kolagenazy potrzebną do strawienia wszystkich magazynów. Dodać 50 μl kolagenazy typu I o stężeniu 15 mg/ml w 2x buforze izolacyjnym do każdej probówki. Nie należy ponownie umieszczać kolagenazy w buforze izolacyjnym, dopóki nie zostaną zebrane wszystkie tkanki.
  4. Aby pobrać podskórny WAT, przetnij skórę wokół brzucha szczeniaka (unikaj pęknięcia otrzewnej) i delikatnie pociągnij skórę w dół poniżej nóg. Nie pobierając skóry, ostrożnie zbierz magazyn tłuszczu, który pojawi się jako przezroczysta (P1 lub młodsza) lub biała (P2 i starsze), cienka, wydłużona tkanka przyczepiona po wewnętrznej stronie lub na górze mięśnia czworogłowego uda (Ryc. 1B). Przepłukać magazyn tłuszczu w PBS i umieścić go w jednej z probówek zawierających 250 μL PBS + 200 μL 2x buforu izolacyjnego. Przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Myszy P0 i P1 dają najlepszą wydajność. U szczeniąt P0-1 podskórny magazyn WAT jest prawie przezroczysty. U myszy P2 i starszych magazyn jest łatwiejszy do zidentyfikowania, ponieważ już zmienia kolor na biały, co wskazuje na obecność w pełni dojrzałych, naładowanych lipidami, białych adipocytów.
  5. Aby zebrać międzyłopatkowy BAT, przeciągnij skórę od łopatek nad głowę. Podnieś BAT - ciemnoczerwoną tkankę między łopatkami - i ostrożnie wykonaj nacięcia wokół niej, aby oderwać ją od ciała (Rysunek 1B). Sprawdź konsystencję i kolor; spłukać PBS; umieścić go w drugiej probówce zawierającej 250 μL PBS + 200 μL 2x buforu izolacyjnego; i trzymaj na lodzie.
    UWAGA: Podczas zbierania BAT od myszy P2 i starszych należy ostrożnie usunąć białą tkankę tłuszczową otaczającą BAT. Składa się z cienkiego, miękkiego, białego arkusza adipocytów znajdujących się między skórą a BAT, który znajduje się głębiej między łopatkami.
  6. Po zebraniu wszystkich magazynów delikatnie zmiel każdy magazyn (4-6 razy) za pomocą małych nożyczek bezpośrednio wewnątrz tubek.
  7. Zawiesić kolagenazę typu I w odpowiedniej objętości 2x buforu izolacyjnego, aby otrzymać 10x roztwór podstawowy o stężeniu 15 mg/ml. Dodaj 50 μl 10x kolagenazy do każdej probówki, trzymając probówki na lodzie, aż kolagenaza zostanie dodana do wszystkich probówek.
  8. Szybko odwróć probówki, aby się wymieszać i przenieś do miksera o kontrolowanej temperaturze. Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (częstotliwość 1 400 obr./min w celu efektywnego mieszania próbek).

2. Posiewanie preadipocytów (dzień 1)

  1. Po strawieniu tkanek umieść probówki z powrotem na lodzie.
    UWAGA: Od tego etapu wszystkie prace są wykonywane w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Przecedzić strawione tkanki przez sitko o pojemności 100 μm do nowych probówek o pojemności 50 ml. Jeśli pracujesz tylko z myszami WT lub jeśli znane są genotypy, połącz ze sobą odpowiednie, zdysocjowane BAT; Powtórz to dla WAT. Aby zmaksymalizować wydajność komórek, przepłucz każdą probówkę 1 ml pożywki izolacyjnej (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco + 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 mM HEPES, 1% penicyliny-streptomycyny) i przefiltruj ją przez sitko komórkowe. Jeśli pracujesz z nieznanymi genotypami, przejdź do kroku 2.4
    UWAGA: FBS jest istotnym wyznacznikiem zarówno proliferacji, jak i różnicowania preadipocytów. Rygorystycznie testuj różne partie FBS, aby zapewnić wysoką wydajność i spójność między partiami.
  3. Rozcieńczyć zawiesiny BAT i WAT do płytki 2–3 dołków płytki 6-dołkowej dla każdej próbki BAT i 4–6 dołków płytki 6-dołkowej dla każdej próbki WAT. Na przykład, jeśli 6 BAT i 6 WAT zostało połączonych razem, rozcieńczyć zawiesinę komórek BAT do 24-36 ml, a zawiesinę komórek WAT do 48-72 ml. Płytka 2 ml zawiesin komórkowych na studzienkę.
  4. W przypadku próbek o nieznanych genotypach należy przechowywać każdą próbkę oddzielnie; umieścić sitko do komórek o wielkości 100 μm na każdym dołku płytki 6-dołkowej i przefiltrować jedną próbkę na studzienkę. Przepłukać probówkę 1,5 ml pożywki izolacyjnej i przepuścić ją przez sitko, uzupełniając końcową objętość do 2 ml na studzienkę. Wyrzucić sitko do komórek, przykryć pokrywką płytkę i przenieść płytkę do inkubatora.
    UWAGA: Pożywka w studzienkach powinna wyglądać na mętną z powodu unoszących się krwinek, szczątków komórkowych i lipidów z lizowanych komórek.
  5. 1-1,5 h po posianiu odessać pożywkę i przemyć 2 ml DMEM bez surowicy. Delikatnie poruszyć płytkę, aby oderwać krwinki od dna studzienek. Po 3 płukaniach dodać 2 ml świeżej pożywki izolacyjnej i przenieść komórki do inkubatora (37 °C, 5% CO2 ).
    UWAGA: Sprawdź komórki pod mikroskopem. Unoszący się materiał (krwinki, szczątki komórkowe) powinien być minimalny. Brązowe preadipocyty będą wyglądać jak małe nieprzezroczyste komórki, podczas gdy białe preadipocyty będą miały bardziej wydłużoną formę. Zarówno brązowe, jak i białe preadipocyty powinny być ściśle przymocowane do płytki.

3. Ekspansja hodowli preadipocytów (dzień 2 do dnia 5)

  1. Następnego dnia odessać pożywkę, przemyć komórki 2 ml DMEM bez surowicy i dodać z powrotem 2 ml pożywki izolacyjnej.
  2. Powtarzaj krok 3.1 raz na 2 dni, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji.
    UWAGA: W przypadku pierwotnych brązowych preadipocytów osiągnięcie 80-90% konfluencji może zająć 4-5 dni. W przypadku pierwotnych białych preadipocytów trwa to zwykle 2-3 dni. Gdy preadipocyty osiągną 60% konfluencji, mogą być skutecznie zakażone cząsteczkami wirusa w celu eksperymentów z powaleniem lub nadekspresją. Zakażenie preadipocytów odpowiednią wiremią należy przeprowadzić do 8 godzin. Odradza się stosowanie polimerów kationowych w celu zwiększenia skuteczności infekcji, ponieważ często prowadzi to do toksyczności i znacznego zmniejszenia potencjału adipogennego zakażonych preadipocytów.
  3. Aby podzielić komórki, pokryj nowe płytki docelowe sterylnym roztworem 0,1% w/v żelatyny (rozpuszczonej w wodzie destylowanej; nie używaj ciepła). Użyj wystarczającej objętości, aby przykryć dno studzienki/naczynia. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C do momentu, gdy komórki będą gotowe do wysiewu (co najmniej 10 min).
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Powlekanie płytek do hodowli komórkowych nie wpływa na wydajność ani potencjał różnicowania, ale znacznie upraszcza utrzymanie i obsługę różnicujących się adipocytów.
  4. Gdy komórki osiągną gęstość poniżej zlewania (85-95%), odessaj pożywkę, przemyj PBS i dodaj trypsynę przez 3 minuty, aby oderwać komórki. Zablokuj aktywność trypsyny, dodając 2,5 razy objętość trypsyny w pożywce izolacyjnej. Pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół, aby zmaksymalizować odzysk komórek, i przenieść do nowej probówki. Umyj studzienki 1 ml pożywki izolacyjnej i dodaj ją do pierwszej kolekcji.
  5. Odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 800-1200 × g, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3-5 ml pożywki izolacyjnej. Policz komórki i rozcieńcz je do pożądanej gęstości końcowej.
    UWAGA: Na przykład 50 000-80 000 komórek/ml (2,5, 1 i 0,5 ml odpowiednio dla płytek 6-, 12- i 24-dołkowych) spowoduje pełne zlewanie się studzienek w ciągu 72-96 godzin.
  6. Odessać roztwór powlekający w kroku 3.3 i zmyć nadmiar żelatyny za pomocą PBS. Wysiewaj komórki i włóż płytki z powrotem do inkubatora, aż do całkowitego zlewania się.

4. Różnicowanie białych i brązowych preadipocytów (dni 7 - 12)

  1. Kiedy preadipocyty ulegną zlewowi, odessaj pożywkę i zastąp ją pożywką różnicującą składającą się z 10% FBS w DMEM zawierającej 170 nM insuliny, 1 μM deksametazonu i 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny. W przypadku różnicowania preadipocytów BAT należy również dodać 1 nM trójjodotyroniny (T3). Oznacz dzień, w którym indukowane jest różnicowanie adipogenne, jako dzień 0 różnicowania.
    UWAGA: Zarówno białe, jak i brązowe preadipocyty mogą spontanicznie różnicować się po osiągnięciu konfluencji. Jednak, aby zmaksymalizować różnicowanie adipocytów, należy zastosować tradycyjny koktajl proadipogenny opisany powyżej (plus T3 dla preadipocytów BAT).
  2. Po 48 godzinach (2 dzień różnicowania) odświeżyć pożywkę za pomocą pożywki podtrzymującej składającej się z 10% FBS w DMEM i 170 nM insuliny (plus 1 nM T3 dla BAT).
    UWAGA: W dniu 2 małe kropelki lipidów gromadzące się w komórkach pod mikroskopem można obserwować za pomocą standardowego jasnego pola.
  3. Powtarzaj krok 4.2 raz na 2 dni, aż komórki zostaną wykorzystane do eksperymentów.
    UWAGA: W 4 lub 5 dniu różnicowania większość komórek będzie wydawała się obciążona lipidami. Ostatecznie różnicujące się adipocyty mogą być dłużej trzymane w hodowli lub wykorzystywane na tym etapie do eksperymentów.

5. Powtórne powlekanie do eksperymentów bioenergetycznych

UWAGA: Jeśli zamierzasz przeprowadzić badania bioenergetyczne na dojrzałych adipocytach w formacie 96-dołkowym, należy podjąć następujące kroki. Idealnie byłoby, gdyby użyto komórek, które właśnie w pełni się zróżnicowały (4 lub 5 dzień). Procedura opisana poniżej rozpoczyna się od 1 dołka na płytce 6-dołkowej.

  1. Przed roztrawieniem trypsyny przygotuj powłokę na płytki 96-dołkowe. Do każdego dołka dodać 50 μl 0,1% żelatyny. Pozostaw płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż komórki będą gotowe do wysiewu.
  2. W 4 lub 5 dniu różnicowania odessać pożywkę, przemyć 1 ml PBS i dodać 300 μl 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminowego (na 1 dołek z płytki 6-dołkowej). Delikatnie przechyl płytkę, aby upewnić się, że trypsyna całkowicie pokrywa dno studzienki; Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zablokuj działanie trypsyny za pomocą 700 μl pożywki konserwacyjnej, pipetuj w górę i w dół, aby zmaksymalizować regenerację komórek, a następnie przenieś zawiesinę komórek do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Odwirować komórki w temperaturze 1200 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki konserwacyjnej i policzyć komórki.
    UWAGA: Z jednego dołka na płytce 6-dołkowej powinno upłynąć około 1,5-1,8 miliona komórek.
  4. Rozcieńczyć komórki, aby uzyskać końcowe stężenie od 60 000 do 80 000 komórek/ml dla brązowych adipocytów i od 100 000 do 120 000 komórek/ml dla białych adipocytów. Płytka 100 μl zawiesiny komórek na basenik na płytkach 96-dołkowych pokrytych żelatyną.
    UWAGA: Jedna studzienka z płytki 6-dołkowej zapewnia wystarczającą ilość komórek na maksymalnie dwie płytki 96-dołkowe. W przypadku eksperymentów bioenergetycznych konieczne jest powlekanie o niskiej gęstości (30-40% konfluencji), aby umożliwić dokładny pomiar zużycia tlenu i uniknąć wyczerpania tlenu w studzienkach podczas testu.
  5. Pozwól, aby komórki przylegały do dna płytki przez co najmniej 48 godzin. Jeśli komórki są trzymane na płytce dłużej niż 48 godzin, odśwież pożywkę po 2 dniach.
  6. W dniu testu odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką do oznaczania. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze niekontrolowanym przez CO2 i przeprowadzić test zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekcja 1 protokołu spowoduje niejednorodne zawieszenie komórek, które są widoczne pod standardowym mikroskopem świetlnym. Filtrowanie strawionych tkanek za pomocą sitka komórkowego (sekcja 2) usunie niestrawioną tkankę. Jednak niektóre szczątki komórkowe, komórki krwi i dojrzałe adipocyty przejdą przez (Rysunek 1C). Delikatne mycie 1 godzinę po posiewie usunie nieistotne komórki, ponieważ preadipocyty szybko przyczepiają się do dna studzienki (Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa ma kluczowe znaczenie dla ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę i homeostazy glukozy20. Dysfunkcja adipocytów związana z otyłością jest ściśle związana z wystąpieniem cukrzycy typu 2. Dlatego lepsze zrozumienie podstawowej biologii i fizjologii tkanki tłuszczowej może umożliwić projektowanie nowych metod leczenia zaburzeń metabolicznych. Jako uzupełnienie bezpośredniej analizy funkcjonalnej i transkrypcyjnej dojrzałych adipocytów wyizolowanych z magazynów tłuszczu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Cristinie Godio z Centro Nacional de Biotecnología w Madrycie, Hiszpanii, Mari Gantner z The Scripps Research Institute, La Jolla, oraz Anastasii Kralli z Johns Hopkins University, Baltimore, za pomoc w optymalizacji tego protokołu w oparciu o początkową pracę Kahna i wsp.18. Praca ta została sfinansowana z grantów NIH DK114785 i DK121196 dla E.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)Sigma-AldrichI7018
Płytki 6-dołkoweCorning353046
AdipoRed (czerwień nilowa)LonzaPT-7009
Antymycyna ASigma-AldrichA8674
BenchMark Płodowa surowica bydlęcaGemini Bioproducts LLC100-106
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Sitko do komórekFisher Scientific22363549
Kolagenaza, Typ 1   Worthington Biochemical CorpLS004196
ddH2OSigma-Aldrich6442
DeksametazonSigma-AldrichD4902
DMEMSigma-AldrichD5030Do badań bioenergetycznych
DMEM, wysoka glukoza, GlutamaxGibco10569010
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
Bez kwasów tłuszczowych BSASigma-AldrichA8806
FCCPSigma-AldrichC2920
ŻelatynaSigma-AldrichG1890
GlukozaSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-AldrichH3375
Hoechst 33342InvitrogenH1399
InsulinaSigma-AldrichI6634
KClSigma-AldrichP9333
NaClSigma-AldrichS7653
NoradrenalinaCayman Chemical16673
OligomycynaSigma-Aldrich75351
Pióro/PaciorkowiecGibco15140122
RozyglitazonSigma-AldrichR2408
RotenonSigma-Aldrich557368
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100Do badań bioenergetycznych
Kleszcze chirurgiczneROBOZ Instrument chirurgiczny CoRS-5158
Nożyczki chirurgiczneROBOZ Instrument chirurgiczny CoRS-5880
ThermoMixerEppendorfT1317
trójjodotyronina (T3)Sigma-Aldrich642511

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
  3. Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
  4. Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
  5. Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
  6. Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
  7. Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
  8. Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
  9. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958(2018).
  10. Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
  11. Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  12. Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
  13. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
  15. Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
  16. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  17. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  18. Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
  19. Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
  20. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  21. Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936(2019).
  22. Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
  23. Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
  24. Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
  25. Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
  26. Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Preadipocyte IsolationAdipocyte DifferentiationWhite Adipose TissueBrown Adipose TissueNewborn MicePrimary PreadipocytesCell CultureCollagenase DigestionLipid Droplet AccumulationMitochondrial Stress Test

Powiązane artykuły