Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja obwodu krwi w modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62007

⸱

3 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric and Adolescent Medicine, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Department of Pediatric Surgery, Chengdu Women's and Children's Central Hospital, 3The Key Laboratory of Hainan Trauma and Disaster Rescue, The first affiliated Hospital of Hainan Medical University, 4Department of Infectious Diseases, West German Centre of Infectious Diseases, Universitätsmedizin Essen, University Duisburg-Essen, 5Department of Nephrology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazano nowatorską technikę rekonstrukcji obwodu krwi w heterotopowym modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej.

Streszczenie

Technika chirurgiczna heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u myszy jest standardowym modelem do badań w immunologii transplantacyjnej. W tym artykule przedstawiono ustaloną technikę zmodyfikowanej rekonstrukcji obwodu krwi w heterotopowym modelu przeszczepu serca w jamie brzusznej. Metoda ta wykorzystuje żyłę główną dolną w klatce piersiowej (IIVC) zamiast tętnicy płucnej serca dawcy do zespolenia z żyłą główną dolną biorcy. Ułatwia i poprawia wskaźniki powodzenia przeszczepu serca w jamie brzusznej u myszy.

Wprowadzenie

Technika chirurgiczna heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u myszy stanowi standardowy model badań w immunologii transplantacyjnej1,2,3. Jest to jednak bardzo trudne do wykonania, co implikuje ograniczenie do powszechnego stosowania tego modelu4,5.

W tradycyjnym przeszczepie serca u myszy (THTx), aorta dawcy i aorta brzuszna biorcy są zespolene, podczas gdy tętnica płucna jest zespolena z żyłą główną dolną biorcy6,7,8.

W tej zmodyfikowanej technice przeszczepu serca u myszy, aorta dawcy jest zespolona z aortą brzuszną biorcy, a dawca IIVC jest zespoleny z żyłą główną dolną biorcy(3,4,6) (Rysunek 2 i Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (zatwierdzona przez komisję etyki, #G1071/09).

UWAGA: Wstępne przygotowanie, znieczulenie, opieka pooperacyjna i monitorowanie są takie same, jak wykonywane tradycyjnymi metodami chirurgicznymi1,2,4. Myszy BALB/c służyły jako dawcy serca, a C57BL/6J jako biorcy przeszczepów. Myszy były w wieku 8-12 tygodni, ważyły ~ 30 g podczas przeszczepu i były trzymane w standardowych warunkach.

1. Kroki przygotowawcze

  1. W celu znieczulenia podaj myszom wziewny izofluran (2%) do momentu zaśnięcia, a następnie wstrzyknięcia dootrzewnowe ketaminy (100 mg / kg) + ksylazyny (10 mg / kg) + acepromazyny (2 mg / kg). W przypadku znieczulenia pooperacyjnego należy stosować Metamizol (200 mg/kg) p.o. i karprofen (5 mg/kg) s.c.
    UWAGA: Celowo wstrzymano się od stosowania antybiotyków, ponieważ substancje te mogą wpływać na odpowiedź immunologiczną.
  2. Do operacji użyj zestawu mikroskopijnych narzędzi, w tym mikronożyczek, mikrokleszczyków, uchwytu na igłę i mikro zacisków hemostatycznych. Niezbędny jest również długopis elektrochirurgiczny. Wykonaj szwy przy użyciu nylonu typu 7/0er, 10/0er i 4/0er.
  3. Umieść mysz w pudełku do inhalacji izofluranu (2%) na 40-60 sekund. Określ głębokość znieczulenia, ściskając łapę pęsetą. Jeśli występuje całkowity brak odpowiedzi na ten bodziec, przejdź do następnego kroku.
  4. Gdy mysz zaśnie, zważ mysz.
  5. Zastosować dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) + ksylazyny (10 mg/kg) + acepromazyny (2 mg/kg) do znieczulonej myszy.
  6. Obetnij sierść na brzuchu i połóż mysz na stole operacyjnym. Wykonaj dezynfekcję za pomocą jodku powidonu 3 razy, a następnie odpowiednio ułóż mysz za pomocą fenestrowanego ręcznika chirurgicznego.

2. Procedura operacji dawcy

  1. Za pomocą nożyczek przeciąć skórę od szyi do podbrzusza i oderwać całą warstwę skóry do linii środkowej obu pach.
  2. Za pomocą nożyczek przeciąć mięśnie ściany brzucha i delikatnie przesunąć wnętrzności w lewo (od strony operatora). Owiń wnętrzności gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby bezpiecznie odsłonić żyłę główną dolną.
  3. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć powoli 0,4 ml roztworu heparyny (zawiera 500 j. heparyny) do dolnej żyły głównej i odczekać 1 minutę przed wyciągnięciem igły.
  4. Wyciągnij igłę i za pomocą mikronożyczek przeciąć zarówno żyłę główną dolną, jak i aortę brzuszną, aby przyspieszyć wykrwawienie.
  5. Użyj nożyczek, aby otworzyć jamę klatki piersiowej, wykonując cięcie w kształcie litery U; całkowicie odsłoń serce, płuca i wszystkie naczynia krwionośne klatki piersiowej.
    1. Odsłoń aortę piersiową, odetnij 1/2 światła, a następnie przetnij żyłę płucną, aby ułatwić irygację i drenaż.
    2. Włożyć rurkę irygacyjną do otworu aorty piersiowej, wstrzyknąć co najmniej 2 ml zimnego roztworu kardioplegii histydyny-tryptofanu-ketoglutaranu o temperaturze 4 °C (roztwór Custodiol HTK)9, aż odpływ z żyły płucnej będzie całkowicie czysty, a serce całkowicie przestanie bić.
  6. Wyciągnij rurkę irygacyjną i odłącz mostek.
  7. Użyj mikronożyczek, aby usunąć grasicę i lekko usunąć tłuszcz wokół łuku aorty.
  8. Użyj prostych i zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić i podwiązać pień tętnicy płucnej (po prawej stronie łuku aorty) za pomocą szwu 10/0.
  9. Użyj mikrokleszczyków, aby oddzielić tłuszcz i tkankę łączną przyczepioną do IIVC, odsłonić i podwiązać żyłę główną górną (po lewej stronie łuku aorty) za pomocą szwu 7/0 i użyj mikronożyczek, aby przeciąć ją za podwiązaniem.
  10. Wykonaj szew 7/0 wokół podstawy serca pod łukiem aorty, IIVC i obiema małżowinami usznymi. Następnie podwiązaj gałęzie tętnicy płucnej i żylne naczynia płucne.
  11. Użyj mikronożyczek, aby przeciąć łuk aorty tak dystalnie, jak to możliwe, naczynia płucne pod ligaturą i IIVC w pobliżu przepony. Wyjmij serce z klatki piersiowej.
  12. Umieścić eksplantowane serce dawcy w zimnym roztworze HTK do kardioplegii o temperaturze 4 °C i zachować tymczasowo.

3. Procedura obsługi odbiorcy

UWAGA: Początkowe kroki operacji są podobne do tych wcześniej pokazanych dla myszy dawcy, w tym znieczulenie i dezynfekcja.

  1. Wykonać nacięcie skóry brzucha w sposób poprzeczny, przykryć narządy jamy brzusznej mokrą gazą z roztworem soli fizjologicznej.
  2. Użyj mikrokleszczyków, aby odsłonić żyłę główną dolną i aortę brzuszną i uwolnić je od otaczającej tkanki tłuszczowej.
  3. Użyj mikrokleszczyków do podwiązania lub elektrokoagulacji bocznych naczyń rozgałęzionych (bocznych lub pod żyłą/aortą) poniżej naczyń nerkowych.
  4. Za pomocą kleszczyków z aplikatorem klipsowym umieść dwa mikro zaciski hemostatyczne w brzusznej części żyły/aorty idącej z prawej strony, pozostawiając więcej niż 1 cm odległości dla obu aorty/żyły, aby zapewnić miejsce na budowę zespolenia między nimi.
  5. Użyj mikronożyczek, aby wykonać nacięcie w aorcie nieco bliżej dolnego zacisku niż górnego zacisku. Alternatywnie użyj igły 30 G, aby zrobić mały otwór i otwórz go mikronożyczkami.
  6. Ustaw mysz biorcy tak, aby aorta była skierowana w stronę operatora, a żyła główna znajdowała się po drugiej stronie. Następnie umieść serce w jamie brzusznej i przykryj je małym mokrym gazikiem.
  7. Użyj szwu 10/0, aby dostosować i zszyć aortę dawcy do aorty biorcy, zaczynając doogonowo, wykonaj węzeł i kontynuuj szew biegnący do górnej części nacięcia (około 4-5 szwów). Następnie odwróć serce w prawo (od strony osoby badanej), przykryj je ponownie i kontynuuj szew po lewej stronie, aż dojdziesz do końca ogonowego i zawiąż go.
  8. Za pomocą rurki irygacyjnej wstrzyknąć co najmniej 0,5 ml roztworu HTK do kardioplegii o temperaturze 4 °C w celu przepłukania IIVC dawcy.
  9. Za pomocą mikronożyczek wyciąć okrągły otwór w żyle głównej dolnej brzucha biorcy, który powinien mieć ten sam rozmiar światła IIVC dawcy. Nacięcie powinno znajdować się powyżej ujścia zespolenia aorty. Spraw, aby nacięcie żyły było większe niż nacięcie aorty.
  10. Użyj szwu 10/0, aby przyszyć IIVC dawcy do żyły głównej biorcy, zaczynając doogonowo. Zawiąż węzeł i wykonaj szew biegowy, aż do osiągnięcia górnej części nacięcia. Użyj pięciu szwów i kontynuuj szew po lewej stronie. Na koniec zawiąż węzeł w rogu ogona i ostrożnie zaciśnij (uważając, aby nie pociągnąć zbyt mocno).
  11. Umieść małe części gąbki hemostatycznej wokół żyły i zespoleń aorty.
  12. Za pomocą kleszczyków z aplikatorem clip usuń najpierw dolne, a następnie górne zaciski mikrohemostatyczne i przepłucz jamę brzuszną 0,9% chlorkiem sodu o temperaturze 38,0°C.
  13. Użyj mikro kleszczyków, aby usunąć gąbkę hemostatyczną.
  14. Obserwuj bicie serca przeszczepionego serca.
  15. Użyj kleszczy, aby umieścić jelita z powrotem w jamie brzusznej i dwuwarstwowych szwów (mięśnie brzucha, a następnie skóra), aby zamknąć ranę brzucha za pomocą szwu 4/0.
  16. Umieść myszy w komorze stacji roboczej do kontroli tlenu i temperatury (np. INVIVO2-400), aby zapewnić ciepłe i bogate w tlen środowisko dla przeszczepionych myszy do regeneracji, poczekaj, aż myszy się obudzą.
  17. W przypadku znieczulenia pooperacyjnego należy podawać Metamizol w dawce 200 mg/kg na os po operacji. Cztery i 16 godzin po operacji podać Metamizol 200 mg/kg na os+ Karprofen (5 mg/kg) s.c. W dalszej obserwacji należy podawać karprofen (5 mg/kg) s.c przeszczepionym myszom co 24 godziny przez trzy kolejne dni po operacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym materiale przedstawiono zmodyfikowaną technikę heterotopowego przeszczepu serca do jamy brzusznej u myszy, opracowaną wcześniej w naszym laboratorium i sprawdzoną w ciągu ostatnich 16 lat. Wcześniej wykazano, że w łącznie 40 przypadkach procedury anastomozy żyła główna do żyły głównej (grupa V-V) w porównaniu do 40 przypadków tradycyjnej procedury anastomozy tętnicy płucnej do żyły głównej (grupa P-V)4 (Tabela 1), czas anastomozy naczyń wyniósł 20,8±1,3 min w grupie V...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika chirurgiczna heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u myszy jest bardzo trudna, co implikuje ograniczenie do powszechnego stosowania tego modelu.

Jedną z wad konwencjonalnej techniki jest ograniczona długość tętnicy płucnej dawcy (PA). Zwykle ma około 2 mm długości, podczas gdy długość IIVC serca dawcy używana w naszym modelu wynosi na ogół około 1 cm (ryc. 2). Oznacza to, że w zmodyfikowanym modelu zespolenie IIVC zapewnia wyraźniejszy obraz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Dziękujemy dr Yun Xu za pomoc jako aktorce głosowej, dr med. Jianhua Peng za pomoc w edycji wideo oraz dr Annice Kuckhahn za komentarze i wsparcie. Prace te były częściowo wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) w celu promowania współpracy międzynarodowej (HO2581/4-1 do AH) oraz Chińską Narodową Fundację Naukową (NSFC; #81760291 do FJ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 30GBraun456300
acepromazynaCP, Pharma,Tranquisol P
, BALB/c, AnNCrl, myszy,Charles River. Niemcynr katalogowy
Maść do oczu BepanthenHaus-ApothekePZN 01578675
Bonn Micro KleszczeFST11083-07
Pudełko na izolację i urządzenie do dostarczania tlenuRUSKINNINVIV
C57BL/6J  myszyCharles River. Niemcynr katalogowy
CarprofenZoetisRimadyl 50 mg/ml
CEWNIK-FEP 26GTERUMOSurflo-W
Clip Aplikator Kleszcze StyleFST18057-14
Kleszcze zakrzywioneWPI14114-G
custodiol/HTKDr. Franz Kö hler Chemienr numer katalogowy
Dezynfekcja skóry CutaseptVWR
BovieCHANGE-A-TIP
gaziki, waciki BawełnianeLohmann-Rauscher13353
Mata grzewczaTHERMO MAT PRO 30WHTP-30
Gąbka hemostatycznaCuraSponJ1276A
roztwór heparynyHaus-ApothekePZN 03029820
Pojemnik na lódPETZNr Dostępny
Urządzenie do znieczulenia wziewnegoGROPPLERBKGM 0616
urządzenie do izolacji i dostarczania tlenuRUSKINNINVIV
izofluranCP PharmaIsofluran CP 1 ml/ml
ketaminyZoetisnr katalogowy
metamizoleWDTnr katalogowy
MikronożyczkiFST15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Zacisk ) Kątowy / 16 mmFST18055-06
MikroskopLeicaLEICAMZ6
Mikroskop światłoSCHOTTKL2500LED
Saline roztwór (NaCl 0,9%)Haus-ApothekePZN 06178437
NożyczkiPeha Instruments991083/4
mała szalka PetriegoSarstedt833900
Kleszcze prosteWPI14113-G
Taśma chirurgicznaBSN4120
Kleszczyki do wiązania szwów - 10 cmFST18025-10
Szwy(10-0)Nici MedtronicN2540
(4-0)Szwy ETHILONV4940H
(7-0)ETHILON1647H
(0,3 ml)BD
(1 ml)BD320801
ksylazynaBayerRompun
, , , Długopis elektrochirurgiczny BODL980365 gazik numer katalogowyStrzykawka Strzykawka 324826

Bibliografia

  1. Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
  2. Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
  3. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
  4. Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
  5. Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
  6. Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
  7. Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513(2019).
  8. Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423(2014).
  9. Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
  10. Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
  11. Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
  12. Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
  13. Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Brzuszny przeszczep sercaprzeszczep heterotopowyżyła główna dolnaanastomoza naczyniowaimmunologia transplantacjiaorta dawcyciepłe niedokrwienieponowne bicie przeszczepu
Rekonstrukcja obwodu krwi w modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.