Artykuł metodologiczny

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

DOI:

10.3791/62009

⸱

23 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak piersi (BC) pozostaje główną przyczyną zgonów kobiet. Pomimo ponad 700 milionów dolarów inwestowanych rocznie w badania nad BC, 97% potencjalnych leków BC nie przechodzi badań klinicznych. W związku z tym potrzebne są nowe modele, które pozwolą nam lepiej zrozumieć tę chorobę. Program NIH Microphysiological Systems (MPS) został opracowany w celu poprawy klinicznego przekładu odkryć z zakresu nauk podstawowych i obiecujących nowych strategii terapeutycznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę generowania MPS dla raka piersi (BC-MPS). Model ten adaptuje wcześniej opisane podejście do hodowli pierwotnej ludzkiej białej tkanki tłuszczowej (WAT) poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC). Nowatorskie aspekty naszego BC-MPS obejmują wysiewanie komórek BC do zdrowej ludzkiej tkanki piersi (HBT) zawierającej natywną macierz zewnątrzkomórkową, dojrzałe adipocyty, rezydujące fibroblasty i komórki odpornościowe; oraz umieszczanie domieszki BC-HBT między arkuszami ASC pochodzącymi z HBT. Otrzymany BC-MPS jest stabilny w hodowli ex vivo przez co najmniej 14 dni. Ten system modelowy zawiera wiele elementów mikrośrodowiska, które wpływają na BC, w tym adipocyty, komórki zrębu, komórki odpornościowe i macierz zewnątrzkomórkową. W ten sposób BC-MPS może być używany do badania interakcji między BC a jego mikrośrodowiskiem.

Pokazujemy zalety naszego BC-MPS, badając dwa zachowania BC, o których wiadomo, że wpływają na progresję raka i przerzuty: 1) ruchliwość BC i 2) przesłuch metaboliczny BC-HBT. Podczas gdy ruchliwość BC została wcześniej zademonstrowana za pomocą obrazowania przyżyciowego, BC-MPS pozwala na obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez kilka dni. Ponadto, podczas gdy przesłuch metaboliczny został wcześniej zademonstrowany przy użyciu komórek BC i mysich preadipocytów różnicowanych w niedojrzałe adipocyty, nasz model BC-MPS jest pierwszym systemem, który demonstruje ten przesłuch między pierwotnymi ludzkimi adipocytami sutka a komórkami BC in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdego roku ponad 40 000 kobiet w USA umiera na raka piersi (BC)1. Pomimo ponad 700 milionów dolarów inwestowanych rocznie w badania nad BC, 97% potencjalnych leków BC nie przechodzi badań klinicznych2,3. Potrzebne są nowe modele, aby poprawić proces opracowywania leków i nasze zrozumienie BC. Program mikrofizjologiczny NIH (MPS) określił cechy wymagane dla przełomowych modeli w celu poprawy przełożenia nauk podstawowych na sukces kliniczny4. Obejmowały one wykorzystanie pierwotnych komórek lub tkanek ludzkich, stabilnych w hodowli przez 4 tygodnie, oraz włączenie natywnej architektury tkankowej i odpowiedzi fizjologicznej.

Obecne modele BC in vitro, takie jak dwuwymiarowa hodowla linii komórkowych BC, kokultura przez infuzję błonową oraz trójwymiarowe sferoidy i organoidy, nie spełniają kryteriów MPS NIH, ponieważ żaden z nich nie podsumowuje natywnej architektury tkanki piersi. Gdy do tych systemów dodaje się macierz zewnątrzkomórkową (ECM), ECM piersi nie jest używany; Zamiast tego stosuje się żele kolagenowe i matryce błony podstawnej.

Obecne systemy in vivo, takie jak ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), podobnie nie spełniają kryteriów MPS NIH, ponieważ mysie tkanki sutka znacznie różnią się od ludzkich piersi. Co więcej, interakcje układu odpornościowego z BC są coraz częściej uznawane za kluczowe w rozwoju nowotworu, ale mysie modele z obniżoną odpornością używane do generowania guzów PDX nie mają dojrzałych limfocytów T, limfocytów B i komórek NK . Ponadto, podczas gdy PDX pozwala na utrzymanie i rozszerzanie pierwotnych guzów piersi, powstałe guzy PDX są infiltrowane przez pierwotne mysie komórki zrębu i ECM5.

Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy nowatorski, ex vivo, trójwymiarowy MPS ludzkiej piersi, który spełnia kryteria MPS NIH. Podstawa naszego MPS piersi jest tworzona przez umieszczenie pierwotnej ludzkiej tkanki piersi (HBT) między dwoma arkuszami komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC), również wyizolowanych z HBT (Ryc. 1). Tłoki do przenoszenia arkuszy komórek do warstwy HBT mogą być drukowane w 3D lub wykonane z prostych tworzyw akrylowych (Rysunek 1H, I). Technika ta adaptuje nasze wcześniej opisane podejście do hodowli pierwotnej ludzkiej tkanki białych adipocytów6,7. MPS piersi można następnie zasiać za pomocą wybranego modelu BC, od standardowych linii komórkowych BC po pierwotne ludzkie guzy piersi. Tutaj pokazujemy, że te BC-MPS są stabilne w kulturze przez wiele tygodni (Rysunek 2); obejmują natywne elementy HBT, takie jak adipocyty sutka, ECM, śródbłonek, komórki odpornościowe (Rysunek 3); i podsumować fizjologiczne interakcje między BC i HBT, takie jak przesłuchy metaboliczne (Rysunek 4). Na koniec pokazujemy, że BC-MPS pozwala na badanie ruchu ameboidalnego komórek BC w całym HBT (Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie ludzkie tkanki zostały pobrane zgodnie z protokołem #9189, zatwierdzonym przez Biuro Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej LSUHSC.

1. Wysiewanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) do arkuszy komórkowych

  1. Kupuj ASC ze źródeł komercyjnych lub izoluj od pierwotnej tkanki piersi ludzkiej, postępując zgodnie z ustalonymi protokołami8,9. Wysiewaj ASC ludzkiej piersi o gęstości 70% (~ 80 000 komórek/cm 2 powierzchni) na 6-dołkowych standardowych płytkach do hodowli tkankowych w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną (BC-MPS Media). Upewnij się, że ASC, które mają być użyte do formowania arkuszy komórek, powinny być mniejsze niż przejście 10.
    1. Dla każdego dołka systemu mikrofizjologicznego raka piersi (BC-MPS), który zostanie wygenerowany, komórki nasienne w 1 standardowym dołku do hodowli tkankowej i 1 dołku o podobnej wielkości na plastikowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej poli(N-izopropyloakrylamidem) (pNIPAAm). Jedna 6-dołkowa płytka BC-MPS będzie wymagała jednej standardowej płytki 6-dołkowej do hodowli tkankowej (na dole) i jednej płytki pokrytej pNIPAAm (na górze). Płyty pNIPAAm można kupić ze źródeł komercyjnych lub można je pokryć w laboratorium10,11,12.
  2. Hodowla ASC w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 ° C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Hoduj ASC, aż staną się w 100% zlewające się i utworzą prążkowany wzór. W zależności od zbiegu, w którym zostały wysiane, zajmie to 7-10 dni. Zlewające się arkusze komórek są wymagane do zakotwiczenia wypornej tkanki tłuszczowej piersi.

2. Przygotowanie materiałów potrzebnych do BC-MPS

  1. Aby przygotować żelatynę na płytki 6-dołkowe, należy przygotować 12% roztwór żelatyny w destylowanymH2O. Wymieszać 19 g żelatyny typu B (moc żelu ~225 Bloom) i 125 mlH2Ow szklanej butelce o pojemności 250 ml. Dodać 1,6 ml 1 M NaOH do roztworu, aby zneutralizować pH.
  2. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym przez 25 minut w celu wysterylizowania roztworu.
  3. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 37 °C. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 16 ml sterylnego 10x zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) do roztworu, aby uzyskać końcową objętość 160 ml.
    UWAGA: Roztwór żelatyny można zużyć od razu lub przechowywać w temperaturze pokojowej do późniejszego wykorzystania. Przygotowana żelatyna jest stabilna w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc. Jeśli potrzebnych będzie tylko kilka tłoków, można przygotować 10 ml roztworu i sterylnie przefiltrować go tego samego dnia, co przygotowanie BC-MPS, jak opisano wcześniej7.
    1. Aby przygotować roztwór żelatyny przez sterylizację filtra, rozcieńczyć 1 ml 10x HBSS 9 mlH2O, aby uzyskać 1x roztwór HBSS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 100 μl 1 M NaOH do każdej probówki o pojemności 10 ml, a następnie dodać 0,7 g żelatyny do roztworu. Energicznie wymieszaj roztwór, aby rozpuścić żelatynę.
    2. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 75 °C przez 20 minut, wstrząsając co 5 minut. Użyć strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego 0,22 μm, aby przefiltrować roztwór żelatyny. Przefiltrować roztwór żelatyny bezpośrednio na tłoki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Drukuj 3D lub użyj prostego akrylu do wykonania tłoków używanych do przenoszenia arkuszy komórek. Upewnij się, że tłoki są luźno dopasowane do pożądanego rozmiaru. Standardowy tłok wydrukowany w 3D jest pokazany na Rysunek 1. Tłoki można zaprojektować przy użyciu standardowego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo, takiego jak TinkerCad, i wydrukować za pomocą drukarek 3D z filamentem, które są kompatybilne z kwasem polimlekowym (PLA)13,14.
  5. Aby przygotować stojak do trzymania tłoków, umieść stojak na probówki o pojemności 15 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść tłoki do góry nogami w stojaku, tak aby spód tłoków był skierowany do góry. Umieść plastikowe pudełko z pokrywką do transportu BC-MPS w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zaleca się, aby pudełko miało co najmniej 35,5 cm długości x 28 cm szerokości x 8,25 cm wysokości, aby zmieściły się 4 tabliczki BC-MPS. Zdejmij pokrywkę z pudełka i spryskaj stojak, tłoki i pudełko 70% EtOH.
  6. Przygotuj sterylne żyletki i kleszcze przez autoklawowanie lub umieszczając je w komorze bezpieczeństwa biologicznego i myjąc 70% EtOH.
  7. Spryskaj tłoki i pudełko 70% EtOH i włącz światło UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 30 minut, aby wysterylizować materiały.

3. Przygotuj tłoki żelatyny i nałóż na górne arkusze komórek

  1. Jeśli roztwór żelatyny został wcześniej przygotowany, podgrzej go w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C, aby się rozpuścił.
  2. Odpipetować roztwór żelatyny na tłoki w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 lub 10 ml. Tłok na 1 dołek z płytki 6-dołkowej będzie wymagał ~2,5 ml żelatyny.
  3. Gdy żelatyna zastygnie na tłokach (~30-45 min), przenieś płytki ASC pokryte pNIPAAm do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie umieścić tłoki w dołkach płytek ASC pokrytych pNIPAAm, tak aby żelatyna zetknęła się z ASC. Umieść metalową podkładkę (~7.5 g) na tłoku, aby obciążyć tłok tak, aby żelatyna miała bezpośredni kontakt z arkuszem komórek ASC. Pozostawić tłoki na arkuszach komórek ASC w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  4. Delikatnie przenieś płytkę z tłokami do sterylnego pudełka w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść na niej pokrywkę. Umieść pudełko w lodówce o temperaturze 4 °C na 30 minut. Jeśli lodówka o temperaturze 4 °C nie jest dostępna, umieść talerz na lodzie w wiaderku na lód w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut.

4. Przygotowanie linii komórek nowotworowych

  1. Wysiej linie komórek rakowych w standardowym naczyniu do hodowli tkankowej T75 i trzymaj je w kulturze, aby były ~ 80% zlewające się w dniu, w którym BC-MPS zostanie przetworzony. (~ 200 000 komórek rakowych będzie potrzebnych na BC-MPS). Hoduj komórki rakowe w normalnym podłożu.
    UWAGA: Aby zidentyfikować i wyizolować komórki rakowe, zaleca się, aby komórki były transfekowane białkiem fluorescencyjnym w celu odróżnienia ich od ASC i tkanki piersi. Liczba komórek rakowych potrzebnych na BC-MPS została zoptymalizowana dla komórek MCF7 i MDA-MB-231. Inne linie komórkowe mogą wymagać dalszej optymalizacji.
  2. W dniu, w którym przygotowywany jest BC-MPS, należy przenieść kolbę zawierającą komórki rakowe do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Odessać pożywkę z kolby. Umyć kolbę 5 ml PBS.
  3. Dodać 1 ml roztworu do odłączania komórek do kolby zawierającej komórki rakowe, a następnie inkubować kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą (~2-5 min).
  4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 9 ml PBS do kolby, przenieść komórki z PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  5. Odwirować komórki rakowe w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie zawiesić komórki w pożywce BC-MPS tak, aby były 2 x 106 komórek/ml.
  7. Umieść komórki rakowe w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do dodania do tkanki ludzkiej.

5. Przetwarzanie ludzkiej tkanki piersi

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umyj ludzką tkankę piersi (HBT) 3x 10 ml sterylnego PBS.
  2. Użyj sterylnych kleszczyków i żyletki, aby grubo zmielić BC-MPS i spróbuj usunąć jak najwięcej powięzi i tkanki łącznej. Nieusunięcie tkanki łącznej może spowodować, że górna warstwa ASC nie zakotwiczy prawidłowo HBT.
    UWAGA: Powięź i tkankę łączną można rozpoznać po białym lub przezroczystym wyglądzie w porównaniu z żółtym kolorem tkanki tłuszczowej.
  3. Po usunięciu tkanki łącznej użyj sterylnej żyletki, aby drobno zmielić tkankę, aż uzyska jednorodną płynną konsystencję. Tkanka jest drobno mielona, gdy można ją łatwo pipetować za pomocą końcówki serologicznej o pojemności 25 ml.
  4. Użyj sterylnej żyletki, aby odciąć końcówkę końcówki pipety p1000, aby pomóc w pipetowaniu mielonego HBT.
  5. W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj mielony HBT, linie komórek rakowych i pożywkę BC-MPS (dla 1 dołka z płytki 6-dołkowej wymaga to 200 μl mielonego HBT, 100 μl pożywki BC-MPS i 100 μl komórek rakowych).
  6. Przenieś płytkę ASC, która będzie używana do dolnego arkusza komórek, z inkubatora do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Zassać pożywkę z dolnej płytki ASC. Odpipetować mieszaninę na środek dołka dolnej płytki ASC za pomocą końcówki pipety p1000, która miała odcięty dystalny koniec od kroku 5.4
  7. Przenieść pudełko zawierające górną płytkę ASC z umieszczonymi na niej tłokami do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie wyjąć tłoki żelatyny z płytki pokrytej pNIPAAm i umieścić na wierzchu mieszaniny HBT. Dodaj pożywkę BC-MPS do dołka (na 1 dołek z płytki 6-dołkowej dodaj 2 ml pożywki). Ostrożnie przenieś dolne płytki ASC z mieszaniną BC-MPS i tłokami do sterylnego plastikowego pudełka i załóż pokrywę pudełka na czas transportu.
    UWAGA: Pokrywka płytki 6-dołkowej nie będzie pasować z powrotem do płytki ASC, gdy tłoki są założone. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia kultury.
  8. Inkubować dolną płytkę w pudełku w inkubatorze w temperaturze 37 ° C, aż żelatyna się rozpuści, a górna warstwa ASC zacznie przylegać do dolnej warstwy (~30 min).
  9. Przenieś pudełko z płytkami do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie wyjąć tłoki z dolnych płytek. Tkanka z komórkami rakowymi zostanie zakotwiczona na dnie studni.
  10. Umieścić pokrywkę płytki 6-dołkowej z powrotem na dolnej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C, aby całkowicie stopić żelatynę i pozwolić, aby górna warstwa całkowicie zakotwiczyła się w dolnej warstwie (~30–60 min).
  11. Delikatnie przenieś płytki do komory bezpieczeństwa biologicznego i odessaj pożywkę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Dodaj 2 ml świeżej pożywki do każdej studzienki. Zassać od krawędzi studzienki i pipetować do krawędzi studzienki, aby uniknąć przemieszczenia tkanki.
  12. Utrzymuj BC-MPS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez żądany czas i zmieniaj media co 2-3 dni.

6. Trawienie BC-MPS do analizy

  1. Gdy BC-MPS jest gotowy do analizy, przenieś płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Usunąć pożywkę za pomocą pipety serologicznej, aby uniknąć przypadkowego przemieszczenia się jakiejkolwiek tkanki.
  2. Dodaj 1 objętość PBS do każdego dołka.
  3. Usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej.
  4. Dodaj 1 ml roztworu dysocjacyjnego komórek do każdej studzienki. Przenieść płytkę z powrotem do inkubatora i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby umożliwić odłączenie komórek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj skrobaka do komórek, aby całkowicie odłączyć komórki i tkankę od płytki hodowlanej.
  5. Przenieść roztwór wraz z tkanką do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej. Dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, aby zebrać pozostałe komórki i przenieś ten roztwór do stożkowej probówki. Jeśli ogniwa są fluorescencyjne, owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
  6. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu w wytrząsarce orbitalnej o stężeniu 1 x g przez 10-20 minut, aby całkowicie oddzielić komórki od tkanki.
  7. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj pipety serologicznej, aby rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek w probówce i przefiltruj próbkę przez sitko tkankowe o wielkości 250 μm do nowej probówki o pojemności 15 ml. Powoli przetrzeć pipetą roztwór przez sitko, aby się nie przelał.
  8. Przepłucz sitko 1 ml PBS, aby zebrać wszelkie komórki znajdujące się jeszcze w sitku.
  9. Odwirować próbki o masie 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Po odwirowaniu adipocyty będą unosić się na górnej warstwie roztworu, podczas gdy komórki rakowe i ASC zostaną zmieszane ze sobą w granulce na dnie probówki.
  10. Aby wyizolować adipocyty, delikatnie wlej górną warstwę do nowej probówki lub alternatywnie odetnij końcówkę z końcówki pipety p1000 i przenieś górną warstwę do nowej probówki. Ponownie odwirować próbkę o masie 500 x g przez 5 minut i za pomocą strzykawki i igły usunąć roztwór spod adipocytów, tak aby pozostały tylko adipocyty. Adipocyty są teraz gotowe do analizy
  11. Po usunięciu adipocytów z roztworu należy oddzielić ASC i komórki rakowe od siebie w celu analizy, jeśli komórki rakowe były wcześniej transfekowane białkiem fluorescencyjnym. Odessać pozostały roztwór z probówki zawierającej ASC i komórki rakowe, nie przerywając pracy osadu komórkowego. Zawiesić osad w pożywce PBS lub BC-MPS i użyć cytometrii przepływowej do posortowania komórek na podstawie fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabilność w kulturze
BC-MPS jest stabilnym systemem mikrofizjologicznym, który może być hodowany in vitro przez okres do co najmniej 14 dni. Obraz arkuszy komórek ASC w jasnym polu został wykonany w powiększeniu 100x, aby wyświetlić prążkowany wzór zlewającego się arkusza (Rysunek 2A). Arkusze komórkowe ASC są stabilne w hodowli przez co najmniej 4 tygodnie. BC-MPS po 14 dniach hodowli w jednym dołku na płytce 6-dołkowej został zobrazowany za pomo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potrzebne są nowe systemy do modelowania raka piersi u ludzi, aby lepiej zrozumieć tę chorobę. Rozwój ludzkich systemów mikrofizjologicznych do modelowania ustawień chorobowych, które obejmują natywne komórki ECM i zrębu, zwiększy moc predykcyjną badań przedklinicznych. Prezentowany tutaj model BC-MPS jest nowo opracowanym systemem, który pokonuje ograniczenia poprzednich modeli, pozwalając na ocenę BC w jego natywnym środowisku HBT. System ten może być stosowany z liniami komórek rakowych lub z eksplantatami guza i jest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core, a także Tulane Histology Core za ich wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant oraz National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AccumaxInnovative Cell Technologies1333Roztwór do deasfuzji komórek do separacji BC-MPS
AccutaseCorning25-058-CIRoztwór do oddzielania komórek do pasażowania komórek
Pojemnik BioStor 16 uncjiNational Scientific Supply CoMPCE-T016do transportu sterylnych tkanek
Kultura komórkowa Kolby 75 cmCorning430641UDo hodowli ASC
Rurki stożkowe 15mL Kleszcze zakrzywione ThermoScientific339650
ThermoScientific1631T5Do manewrowania tkanką podczas mielenia 
DMEM o niskiej zawartości glukozy, z GlutamaxGibco10567-014Do hodowli ASC i BC-MPS
FBS KwalifikowanyGibco26140-079
ŻelatynaSigmaG9391
HBSS 10xGibco14185-052
NaOHSigma221465
Nunc UpCell 6-dołkowe płytkiThermoScientific174901Top Arkusz komórek ASC
PBSGibco10010-023
Długopis/Paciorkowiec 5,000UGibco15070-063
Szalka Petriego 150 cmFisherBrandFB0875714Do trzymania tkanki podczas mielenia 
ŻyletkiVWR55411-055Pojedyncza krawędź do mielenia tkanek
Sitko 250um ThermoScientific87791Do separacji
płytek 6-dołkowychCorning3506Dolna komórka ASC Ciężarki arkuszy
/podkładkiBCP ŁącznikiBCP672Do ważenia tłoków o średnicy wewnętrznej 1/2"
BC-MPS Culture

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1(2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909(2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489(2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912(2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364(2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104(2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485(2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67(2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modelowanie raka piersiadipogeniczne kom rki macierzystemacierz zewn trzkom rkowaruchliwo kom rek nowotworowychinterakcje metabolicznecytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnadysocjacja tkanek

Powiązane artykuły