Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Summary

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N⁰) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Abstract

Użycie autentycznego szablonu RNA jest kluczowe dla rozwoju podstawowej wiedzy na temat syntezy wirusowego RNA, która może kierować zarówno odkryciami mechanistycznymi, jak i rozwojem testów w wirusologii. Matryca RNA niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnym znaczeniu (NNS), takich jak syncytialny wirus oddechowy (RSV), nie jest samą cząsteczką RNA, ale raczej kompleksem rybonukleoproteinowym zamkniętym w nukleoproteinie (N). Pomimo znaczenia autentycznej matrycy RNA, generowanie i składanie takiego kompleksu rybonukleoproteinowego pozostaje wyrafinowane i wymaga dogłębnego wyjaśnienia. Głównym wyzwaniem jest to, że nadekspresja RSV N wiąże się niespecyficznie z komórkowymi RNA, tworząc losowe cząstki podobne do nukleokapsydu (NCLP). Tutaj ustaliliśmy protokół otrzymywania wolnego od RNA N (N⁰) najpierw poprzez koekspresję N z fosfoproteiną opiekuńczą (P), a następnie składanie N⁰ z oligonukleotydami RNA z sekwencją RNA specyficzną dla RSV w celu uzyskania nukleokapsydów specyficznych dla wirusa (NC). Protokół ten pokazuje, jak przezwyciężyć trudności w przygotowaniu tego tradycyjnie trudnego kompleksu rybonukleoprotein wirusa.

Introduction

Niesegmentowane wirusy RNA o ujemnym znaczeniu (NNS) zawierają wiele istotnych ludzkich patogenów, takich jak wścieklizna, Ebola i syncytialny wirus oddechowy (RSV)^1,2. RSV jest główną przyczyną chorób układu oddechowego, takich jak zapalenie oskrzelików i zapalenie płuc u małych dzieci i osób starszych na całym świecie³. Obecnie nie są dostępne żadne skuteczne szczepionki ani terapie przeciwwirusowe zapobiegające lub leczące RSV⁴. W ramach cyklu życiowego genom RSV służy jako matryca do replikacji przez polimerazę RNA zależną od RNA RSV w celu wytworzenia antygenomu, który z kolei działa jako matryca do generowania genomu potomnego. Zarówno RNA genomu, jak i antygenomu są całkowicie zamknięte w nukleoproteinie (N), tworząc nukleokapsydy (NC)³. Ponieważ NC służą jako matryce zarówno do replikacji, jak i transkrypcji przez polimerazę RSV, prawidłowe złożenie NC ma kluczowe znaczenie dla polimerazy, aby uzyskać dostęp do matryc do syntezy RNA⁵. Co ciekawe, na podstawie analiz strukturalnych polimeraz wirusowych NNS przypuszcza się, że kilka białek N przejściowo dysocjuje od NC, aby umożliwić dostęp polimerazy i ponowne związanie się z RNA po syntezie RNA^{6,7,8,9,10,11,12}.  

Obecnie, test polimeryzacji RSV RNA został opracowany przy użyciu oczyszczonej polimerazy RSV na krótkich szablonach nagiego RNA^13,14. Jednak aktywność polimerazy RSV nie osiąga optymalnej wartości, co obserwuje się w produktach nieprocesowych i nieudanych wytwarzanych przez polimerazę RSV przy użyciu nagich matryc RNA. Brak NC z RNA specyficznym dla wirusa jest główną barierą dla dalszego mechanistycznego zrozumienia syntezy RNA RSV. Dlatego korzystanie z autentycznej matrycy RNA staje się krytyczną potrzebą do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat syntezy RNA RSV. Znane struktury cząstek nukleokapsydopodobnych (NCLP) z RSV i innych wirusów RNA NNS ujawniają, że RNA w NCLP są albo losowymi komórkowymi RNA, albo średnimi wirusowymi genomowymi RNA^{15,16,17,18,19}. Razem główną przeszkodą jest to, że N wiąże się niespecyficznie z komórkowymi RNA, tworząc NCLP, gdy N ulega nadekspresji w komórkach gospodarza.

Aby pokonać tę przeszkodę, opracowaliśmy protokół pozwalający najpierw uzyskać wolne od RNA (N⁰) i złożyć N⁰ z autentycznym wirusowym genomowym RNA w NCLPs²⁰. Zasada tego protokołu polega na uzyskaniu dużej ilości rekombinowanego N wolnego od RNA (N⁰) poprzez koekspresję N z chaperonem, N-końcową domeną fosfoproteiny RSV (P_NTD). Oczyszczony N⁰P może być stymulowany i łączony w NCLP przez dodanie oligonukleotydów RNA specyficznych dla RSV, a podczas procesu składania opiekun P_NTD jest przemieszczany po dodaniu oligonukleotydów RNA.

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół generowania i składania NC specyficznych dla RNA RSV. W tym protokole opisujemy klonowanie molekularne, przygotowanie białka, składanie in vitro i walidację złożenia złożonego. Zwracamy uwagę na strategię klonowania w celu wygenerowania bi-cistronicznych konstruktów do koekspresji białek do klonowania molekularnego. W przypadku przygotowania białka opisujemy procedury hodowli komórkowej, ekstrakcji białek i oczyszczania kompleksu białkowego. Następnie omówiono metodę składania in vitro NC specyficznych dla RNA RSV. Na koniec używamy chromatografii wykluczania wielkości (SEC) i mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem (EM) do scharakteryzowania i wizualizacji zmontowanych NCLP.

Protocol

1. Klonowanie molekularne

UWAGA: Klonowanie niezależne od ligazy (LIC) zostało użyte do stworzenia bi-cistronicznego konstruktu koekspresji RSV. LIC to metoda opracowana na początku lat 90., która wykorzystuje aktywność 3'-5' Exo polimerazy DNA T4 do tworzenia nawisów z komplementarnością między wektorem a DNA insert^21,22. Konstrukty zostały wykonane przy użyciu wektora DNA 2BT-10, który składa się z 10-krotnego znacznika His na N-końcu otwartej ramki odczytu (ORF) (Rysunek 1).

1. Wykonaj linearyzację wektorów LIC za pomocą mineralizacji SSPI.
   1. Połączyć 10 μl buforu SSPI 10X, 4 μl enzymu SSPI o stężeniu 5 U/μL, równoważną objętość 5 μg wektorowego miniprepu DNA i sterylny ddH₂O do 100 μL.
   2. Inkubować trawienie przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
   3. Uruchom trawienie na 1,0% żelu agarozowym w celu ekstrakcji DNA wektora.
   4. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby przeprowadzić ekstrakcję i oczyszczenie. Zawiesić końcową objętość DNA wektora w 30 μl ddH₂O i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotuj wstawki DNA dla N_1-391 i P_1-126 za pomocą N_1-391 Forward Primer, N_1-391 Reverse Primer, P_1-126 Forward Primer i P_1-126 Reverse Primer (Tabela 1).
   UWAGA: Nakładanie się na wektor linearyzowany jest w wystarczającym stopniu, aby zapewnić temperaturę topnienia między 55 °C a 60 °C. W przypadku startera odwrotnego z tego samego powodu występuje wystarczające zachodzenie na odwrotną nić komplementarną wektora linearyzowanego.
   1. Przeprowadzić amplifikację PCR wstawki DNA, stosując warunki podane w Tabeli 2 i Tabeli 3.
   2. Wyekstrahuj amplifikowaną wstawkę DNA. Uruchom produkty PCR z poprzedniego kroku na 1,0% żelu agarozowym, a następnie wyekstrahuj i oczyść pasma przez ekstrakcję żelu. Zawiesić końcową objętość wyekstrahowanego DNA w 15 μl ddH₂O.
3. Traktowanie wektora i insercji DNA za pomocą polimerazy DNA T4 (Tabela 4).
   UWAGA: Zabieg należy przeprowadzić oddzielnie dla DNA wektora i DNA insercji.
   1. Inkubować mieszaninę przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inaktywować polimerazę na gorąco w temperaturze 75 °C przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Wyżarzanie wektora LIC i wektora wstawiania.
   1. Ustanowić kontrolę ujemną za pomocą 2 μl wektora LIC DNA i 2 μl sterylnego ddH₂O.
   2. Połącz 2 μl insercji DNA i 2 μl wektora LIC DNA z poprzednich reakcji polimerazy DNA T4 w probówce o pojemności 0,2 ml.
   3. Przeprowadzić reakcję wyżarzania w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   4. Ugasić reakcję za pomocą 1,3 μl EDTA o stężeniu 25 mM.
   5. Przekształć reakcję w 100 μl kompetentnych komórek E. coli Top10 i umieść je na płytce selekcyjnej ampicyliny^23,24.
5. Zidentyfikuj pozytywne konstrukty.
   1. Przygotuj roztwór minipreparatu plazmidu. Można to zrobić poprzez zbieranie kolonii i inokulację w pożywce LB. Zwykle wystarczą 3 kolonie.
   2. Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 37 °C.
   3. Odwirować mieszaninę o sile 4,560 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
   4. Ponownie zawiesić granulki w 250 μl buforu P1 i przygotować minipreparaty plazmidowe za pomocą zestawu do minipreparacji wirowej.
   5. Przeprowadź analizę trawienia produktu miniprep przy użyciu AseI lub innych enzymów restrykcyjnych.
   6. Załaduj próbki na 0,8% żelu agarozowym i uruchom strawiony plazmid. Przeanalizuj żel pod lampą UV.
   7. Użyj usługi sekwencjonowania, aby zweryfikować sekwencję dodatniego produktu.
6. Uzyskać wstawkę DNA o koekspresji.
   1. Wykonaj PCR, aby uzyskać N_1-391 i P_1-126, używając wcześniej skonstruowanych 2BT-10 N_1-391 i 2BT-10 P_1-126 jako szablonów.
   2. Wykonaj 1. PCR, aby uzyskać N_1-391 z konstruktu 2BT-10 N_1-391, używając warunków PCR w Tabeli 2 i Tabeli 3 z N_1-391 Forward starter i Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTCTGATGCAATGCGGCGGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
   3. Wykonaj drugi PCR, aby uzyskać P_1-126 z konstruktu 2BT-10 P_1-126 przy użyciu startera Forward: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́i P_1-126 Reverse starter (należy użyć warunków PCR w Tabeli 2 i Tabeli 3).
   4. Na koniec wykonaj nakładanie się PCR na zmieszanych produktach poprzednich 2 reakcji PCR, aby połączyć N_1-391 i P_1-126. Użyj startera N_1-391 Forward i P_1-126 Reverse startera. Należy użyć warunków PCR w Tabeli 5 i Tabeli 6.
7. Połącz wektor i wstawkę DNA.
   1. Nakładający się produkt PCR należy potraktować polimerazą DNA T4 zgodnie z protokołem w kroku 1.3.
   2. Wyżarzać wektor LIC i iloczyn PCR zgodnie z protokołem w kroku 1.4.
   3. Zidentyfikuj dodatnie konstrukty zgodnie z protokołem w kroku 1.5.

2. Ekspresja i oczyszczanie białek

UWAGA: Użyj E. coli do bi-cistronicznego konstruktu koekspresji zarówno N, jak i P. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, ale przeprowadzaj ekspresję w obniżonej temperaturze (16 °C) przez noc. Oczyść kompleksy białkowe poprzez kombinację kolumny kobaltowej, wymiany jonowej i chromatografii wykluczania wielkości (Rysunek 2).

1. Użyj szczepu E. coli BL21(DE3) do produkcji białka. Hodować 4 litry kultur komórkowych w temperaturze 37 °C w podłożu LB (bulion Luria), aż OD₆₀₀ osiągnie 0,6.
2. Obniżyć temperaturę do 16 °C. Godzinę później wyindukuj ekspresję za pomocą 0,5 mM izopropylo-1-tio-D-galaktopyranozydu (IPTG) przez noc.
3. Odwirować komórki w stężeniu 4,104 x g przez 25 minut, a następnie odrzucić supernatant.
4. Ponownie zawiesić osady komórkowe w 200 ml buforu do lizy A (50 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolu, 10% glicerolu i 0,2% NP40). Użyj 50 ml buforu do lizy, aby ponownie zawiesić osady komórkowe z 1 litra hodowli komórkowej.
5. Lizuj komórki za pomocą sonikacji przez 15 minut, 3 sekundy włączone i 3 sekundy wyłączone. Następnie odwirować komórki o stężeniu 37 888 x g przez 40 min.
   UWAGA: Protokół można wstrzymać poprzez zamrożenie komórek przed sonikacją w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
6. Załaduj supernatant do kobaltowej kolumny grawitacyjnej (średnica x długość: 2,5 cm x 10 cm) z ~10 ml kulek wstępnie zrównoważonych z 5-10 objętościami kolumny (CV) buforu do lizy.
7. Przepłukać kolumnę 5 CV buforu B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glicerolu i 5 mM imidazolu) i 5 CV buforu C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glicerolu i 5 mM imidazolu).
8. Eluować białko z kulek za pomocą 2 CV buforu D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl i 250 mM imidazolu).
9. Rozcieńczyć eluowane białko 5x buforem QA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% glicerol) dla kolumny Q.
10. Przemyć 5 ml kolumny Q buforem QA w celu zrównoważenia kolumny, a następnie załadować rozcieńczoną próbkę do kolumny Q za pomocą pompy perystaltycznej (np. Rabbit).
11. Załaduj kolumnę Q do maszyny HPLC wraz z buforem QA i buforem QB (50 mM Tris-HCl pH7,4, 1,5 M NaCl, 5% glicerolu). Ustaw natężenie przepływu na 1 ml/min.
12. Uruchom program "mycie pompy", aby umyć maszynę z buforem QB, a następnie buforem QA (1-2 CV / każdy). Ustaw przepływ systemu na 3 ml/min.
13. Ustaw UV1 na 280 nm i UV2 na 260 nm. Użyj płytki głębinowej 96, aby zebrać frakcje.
14. Elute białka za pomocą stopniowego gradientu czynnika elucyjnego (bufor QB) stosując 3-4 CV każdego stężenia, zwiększając procent o 5% za każdym razem, zaczynając od 0% QB. Kompleks białkowy N⁰P wyjdzie przy 15% buforze QB.
15. Gdy całe białko zostanie wymyte, przemyć kolumnę 100% buforem QB (2 CV).
16. Wyizolować białko za pomocą filtracji żelowej Superdex 200 Increase 10/300 GL kolumny (średnica x długość: 1,0 cm x 30 cm) i zrównoważyć buforem E (20 mM HEPES, pH 7,4 i 200 mM NaCl).
17. Analizuj frakcje zawierające białka za pomocą SDS-PAGE.

3. Montaż in vitro NC specyficznego dla wirusa

UWAGA: Montaż in vitro specyficznego dla RSV NC (N:RNA) został przeprowadzony przez inkubację przygotowanego kompleksu N⁰P z oligonukleotydami RNA. Następnie zastosowano chromatografię SEC w celu oddzielenia kompleksu montażowego od N⁰P i nadmiaru RNA (Rysunek 2).

1. Wymieszać i inkubować oczyszczony kompleks N⁰P z oligo RNA o stosunku cząsteczkowym 1:1,5 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, zwykle 1 ml białka N⁰P o stężeniu 1 mg / ml wystarcza do następnego etapu. Ustawić próbkę kontrolną, która zawiera tylko taką samą ilość białka N⁰P.
2. Wstępnie zrównoważyć kolumnę filtracji żelowej Superdex 200 Increase 10/300 GL z buforem E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
3. Odwirować próbkę o masie 21,130 x g przez 15 minut, usunąć wszelkie osady i załadować supernatant do kolumny SEC.
4. Porównaj obrazy chromatograficzne SEC próbki złożonej N: RNA i próbki kontrolnej N⁰P, połącz stosunek A₂₆₀ / A₂₈₀, aby określić, które piki są złożonym N-RNA, N⁰P i wolnym RNA.
5. Zbierz frakcje pików, uruchom żel SDS-PAGE lub utwórz siatki.
6. W celu złożenia kompleksu N-RNA zbierz wszystkie frakcje piku N-RNA, wykonaj ekstrakcję RNA i uruchom żel Urea-PAGE, aby dwukrotnie sprawdzić długość specyficznego RNA, która jest taka sama, jak zmieszana i inkubowana w pierwszym etapie.

4. Wykonywanie siatek z ujemnymi plamami

UWAGA: Mikroskopia elektronowa z ujemnym zabarwieniem (EM) to metoda, w której cząsteczki są adsorbowane do warstwy węglowej, a następnie zatapiane w warstwie atomów metali ciężkich. Barwienie ujemne EM zapewnia wysoki kontrast obrazu, dzięki czemu łatwo jest dostrzec i obliczeniowo wyrównać cząstki. Kolejną zaletą jest to, że adsorpcja cząstek do filmu węglowego zwykle skłania cząsteczki do przylegania do siatki w kilku preferowanych orientacjach. Gdy cząsteczki są w podobnej orientacji, łatwo jest podzielić je na strukturalnie odrębne klasy. Barwienie ujemne EM jest zatem odpowiednią techniką do przygotowania próbki^25,26 (Rysunek 3).

1. Podgrzej w kuchence mikrofalowej lub podgrzej 5 ml ddH₂O w małej szklanej zlewce za pomocą grzałki wolframowej, aż się zagotuje.
2. Odważyć 37,5 mg mrówczanu uranylu i dodać do 5 ml podgrzanego ddH₂O, aby uzyskać 0,75% roztwór barwiący mrówczan uranylu. Wymieszać pod zlewką pokrytą folią aluminiową, aby chronić przed światłem.
3. Dodać 4 μl 10 M NaOH do roztworu barwiącego i kontynuować mieszanie przez 15 minut, chroniąc przed światłem.
4. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 mm do probówki.
5. Użyj wyładowania jarzeniowego, aby ciągłe siatki EM pokryte węglem były hydrofilowe²⁷.
   UWAGA: Kratki umieszczone są w komorze podłączonej do źródła zasilania. Po przyłożeniu wysokiego napięcia gaz w komorze jonizuje, a ujemnie naładowane jony osadzają się na siatkach węglowych, nadając im hydrofilowość.
6. Wytnij i złóż pasek parafilmu. Odpipetować 2 krople po 40 μl buforu po jednej stronie parafilmu i odpipetować kolejne 2 krople po 40 μl roztworu barwiącego na drugą stronę.
7. Aby wykonać siatki węglowe EM, nałóż 3 μl próbki białka na 1 minutę.
8. Osusz kratki na bibułce.
   UWAGA: Kratki myje się 2x buforem i 1x 0,75% roztworem barwiącym mrówczan uranylu osusza się po każdym kroku.
9. Przytrzymaj powierzchnię siatki w drugiej kropli 0,75% roztworu barwiącego mrówczanu uranylu przez 30 sekund.
10. Zetrzyj siatkę na bibułce, aby usunąć nadmiar roztworu plamy i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu.
11. Przechowuj siatki w pudełku siatki przed obrazowaniem.

Results

Oczyszczanie białka N⁰P wolnego od RNA
Dzięki temu protokołowi można uzyskać rozpuszczalny heterodimeryczny kompleks RSV N⁰P na dużą skalę. Pełna długość N i N końcowej części białek P uległa koekspresji z 10X His-Tag na białku N w E. coli. N⁰P oczyszczono za pomocą kolumny kobaltowej, chromatografii jonowymiennej i chromatografii wykluczania wielkości. N⁰P zawiera zarówno końcówkę N na całej długości, jak i N, ale nie zawiera komórkowego RNA w opa...

Discussion

Znane struktury cząstek podobnych do nukleokapsydu (NCLP) niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnym znaczeniu (NNS) pokazują, że złożone NCLP są kompleksem N z RNA komórki gospodarza, gdy są nadekspresyjne w bakteryjnych lub eukariotycznych systemach ekspresyjnych 15,16,17,18,19. Poprzednie badania próbowały uzyskać N wolny od RNA za pomocą różnych metod, takich...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agaroza	SIgma	A9539-500G	wytwarzanie konstruktu metodą LIC
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15	Miliporowy	UFC901024	zagęszczenia próbki białka
Ampicylina sodowa	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antybiotyk do hodowli komórkowych
AseI	NEB	R0526S	wytwarzanie konstruktu metodą LIC
Kobalt (Wysoka gęstość) Koraliki agarozy	Gold Bio	H-310-500	Do oczyszczania białka His-tag
Cyfrowy podgrzewacz do suchej kąpieli Corning LSE	CORNING	6885-DB	Podgrzej próbkę
dCTP	Invitrogen	10217016	wykonanie konstrukcji metodą LIC
dGTP	Invitrogen	10218014	wykonanie konstruktu metodą LIC
Glycerol	Sigma	G5516-4L	roztwór do produkcji
HEPES	Sigma	H3375-100G	roztwór do produkcji
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Oczyszczanie białek
Imidazol	Sigma	I5513-100G	roztwór do wytwarzania
IPTG (izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	indukuje ekspresję białek
Probówki do mikrowirówek	VWR	47730-598	do PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultradźwiękowy procesor cieczy	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonikator do lizy komórek
Siatki barwienia ujemnego	Mikroskopia elektronowa Nauki	CF400-Cu-TH	Do wytwarzania siatek barwiących ujemne
Nowy Brunszwik Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Wytrząsarka do hodowli komórek
Nonidet P 40 Substytut	Sigma	74385-1L	roztwór do wytwarzania
Polimeraza DNA OneTaq	NEB	M0480L	PCR
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick QIAGEN		28706	Oczyszczanie
DNA SSPI-HF	NEB	R3132S	tworzenie konstrukcji metodą LIC
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Oczyszczanie białka
DNA T4 polimeraza	Sigma	70099-3	wytwarzanie konstrukcji metodą LIC
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Wirówka	Fisher Scientific	36-101-0816	Wirówka, najwyższa prędkość 20 000 obr./min
Chlorowodorek Trizma	Roztwór do wytwarzania	Sigma	T3253-250G
Mrówczan uranylu	Mikroskopia elektronowa Sciences	22451	wytwarzanie roztworu barwienia ujemnego