Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie platform magnetycznych do organizacji połączonych neuronów w skali mikronowej

DOI:

10.3791/62013

⸱

14 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia oddolne podejście do inżynierii lokalnych sił magnetycznych do kontroli organizacji neuronów. Komórki podobne do neuronów załadowane nanocząstkami magnetycznymi (MNP) są powlekane na wierzchu i kontrolowane przez platformę o mikrowzorze z prostopadłym namagnesowaniem. Opisano również charakterystykę magnetyczną, wychwyt komórkowy MNP, żywotność komórek i analizę statystyczną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do kierowania neuronów do zorganizowanych sieci neuronowych ma ogromne implikacje dla medycyny regeneracyjnej, inżynierii tkankowej i bio-interfejsów. Wiele badań miało na celu kierowanie neuronami za pomocą wskazówek chemicznych i topograficznych. Doniesienia o kontroli organizacyjnej w skali mikronowej na dużych obszarach są jednak rzadkie. W tym miejscu opisano skuteczną metodę umieszczania neuronów w ustalonych miejscach i kierowania wzrostem neuronów z rozdzielczością w skali mikronowej, przy użyciu platform magnetycznych osadzonych w mikrowzorzystych elementach magnetycznych. Wykazano, że ładowanie neuronów nanocząstkami magnetycznymi (MNP) przekształca je we wrażliwe jednostki magnetyczne, na które mogą wpływać gradienty magnetyczne. Podążając za tym podejściem, stworzono unikalną platformę magnetyczną, na której komórki PC12, powszechny model podobny do neuronu, zostały posiane i załadowane superparamagnetycznymi nanocząstkami. Cienkie warstwy wielowarstwowych ferromagnetyków (FM) o stabilnym namagnesowaniu prostopadłym zostały osadzone, aby zapewnić skuteczne siły przyciągania w kierunku wzorców magnetycznych. Te załadowane MNP komórki PC12, posiane i zróżnicowane na platformach magnetycznych, były preferencyjnie przyłączone do wzorców magnetycznych, a wyrostek neurytów był dobrze dopasowany do kształtu wzoru, tworząc zorientowane sieci. Przedstawiono ilościowe metody charakterystyki właściwości magnetycznych, wychwytu MNP przez komórki, żywotności komórek oraz analizy statystycznej wyników. Podejście to umożliwia kontrolę tworzenia sieci neuronowych i poprawia interfejs neuron-elektroda poprzez manipulację siłami magnetycznymi, co może być skutecznym narzędziem do badań sieci in vitro i może zaoferować nowatorskie kierunki biointerfejsów terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrowzory neuronów mają ogromny potencjał do regeneracji tkanek1,2,3,4,5 oraz rozwój urządzeń neuroelektronicznych6,7,8. Jednak umiejscowienie neuronów w skali mikronów w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, podobnie jak w tkankach biologicznych, stanowi poważne wyzwanie. Tworzenie wstępnie zaprojektowanych struktur w tej skali wymaga kierowania procesami komórek nerwowych poprzez lokalną kontrolę ruchliwości somy i wzrostu aksonów. Wcześniejsze badania sugerowały użycie chemicznych i fizycznych wskazówek9,10,11,12 do kierowania wzrostem neuronów. W tym przypadku nowatorskie podejście skupia się na kontrolowaniu położenia komórek za pomocą gradientów pola magnetycznego13,14,15,16,17, zamieniając komórki załadowane MNP w jednostki wrażliwe na pole magnetyczne, którymi można zdalnie manipulować.

Kunze i wsp., którzy scharakteryzowali siłę potrzebną do wywołania odpowiedzi komórkowych za pomocą komórek z chipem magnetycznym i MNP, udowodnili, że wczesne wydłużenie aksonów może być wywołane przez mechaniczne napięcie wewnątrz komórek18. Tay i wsp. potwierdzili, że mikrofabrykowane podłoża o zwiększonych gradientach pola magnetycznego pozwalają na bezprzewodową stymulację obwodów nerwowych dozowanych MNP za pomocą barwników wskaźnikowych wapnia19. Co więcej, Tseng i in. połączyli nanocząstki wewnątrz komórek, w wyniku czego powstały zlokalizowane siły, w których pośredniczą nanocząstki, które zbliżyły się do napięcia komórkowego20. Doprowadziło to do wytworzenia zdefiniowanych wzorów substratów mikromagnetycznych, które pomogły w badaniu reakcji komórek na siły mechaniczne. Napięcie komórkowe wynikające z zastosowania zlokalizowanych sił za pośrednictwem nanocząstek osiągnięto poprzez łączenie nanocząstek w komórkach20. Komplementarny hybrydowy system mikroprzepływowy oparty na półprzewodnikach z tlenku metalu (CMOS) został opracowany przez Lee i wsp., którzy umieścili w układzie CMOS układ mikroelektromagnesów w celu kontrolowania ruchu poszczególnych komórek oznaczonych kulkami magnetycznymi21.

Alon i in. użyli mikroskalowych, wstępnie zaprogramowanych, magnetycznych pól jako magnetycznych "gorących punktów" do lokalizacji komórek22. Specyficzna aktywność może być również stymulowana w komórkach za pomocą mikrowzorców magnetycznych w celu zlokalizowania nanocząstek w określonych lokalizacjach subkomórkowych23. Komórkowy wychwyt MNP został pomyślnie zademonstrowany w pierwotnych neuronach pijawek, szczurów i myszy24,25,26. W tym przypadku wykazano to na szczurzej linii komórkowej guza chromochłonnego PC12, która wcześniej wykazała wysoki wychwyt MNPs27. W ostatnich latach pojawiły się różne zastosowania medyczne MNP, w tym dostarczanie leków i termoterapia w leczeniu raka28,29,30,31. W szczególności badania dotyczą zastosowania MNP i sieci neuronowych32,33,34,35. Jednak organizacja magnetyczna neuronów wykorzystujących MNP na poziomie pojedynczej komórki zasługuje na dalsze badania.

W tej pracy opisano podejście oddolne do inżynierii lokalnych sił magnetycznych za pomocą wstępnie zaprojektowanych platform do kontrolowania układu neuronów. Przedstawiono sposób wytwarzania wzorów wielowarstwowych FM w skali mikronowej. Ta unikalna, wielowarstwowa struktura FM tworzy stabilne prostopadłe namagnesowanie, które skutkuje skutecznymi siłami przyciągania w kierunku wszystkich wzorców magnetycznych. Poprzez inkubację MNP załadowano do komórek PC12, przekształcając je w jednostki wrażliwe na działanie pola magnetycznego. Komórki załadowane MNP, platerowane i zróżnicowane na platformach magnetycznych, były preferencyjnie przyłączone do wzorców magnetycznych, a wyrostek neurytów był dobrze dopasowany do kształtu wzoru, tworząc zorientowane sieci. Opisano kilka metod charakteryzujących właściwości magnetyczne wielowarstw FM i MNP, a także przedstawiono techniki wychwytu komórkowego MNP i oznaczania żywotności komórek. Dodatkowo szczegółowo omówiono parametry morfometryczne wzrostu neuronów oraz analizę statystyczną wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przeprowadź wszystkie reakcje biologiczne w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Produkcja platformy magnetycznej

  1. litografia
    1. Wytnij szkiełka na 2 x 2 cm2 za pomocą pisaka. Wyczyść szkiełka w acetonie, a następnie izopropanolu przez 5 minut w kąpieli ultradźwiękowej. Suszyć azotem o ultrawysokiej czystości (UHP).
    2. Pokryj szkło fotorezystem za pomocą powlekania wirowego z prędkością 6 000 obr./min przez 60 s, aby uzyskać grubość 1,5 μm, i wypalaj w temperaturze 100 °C przez 60 s. Wystaw próbkę na działanie źródła światła, używając odpowiedniej długości fali dla fotorezystu, z pożądanym wzorem, używając fotomaski lub litografii bez maski.
    3. Wywoływać przez 40 s w wywoływaczu, rozcieńczać w wodzie destylowanej (DW) zgodnie z instrukcją producenta; myć w DW przez 45 s i suszyć azotem gazowym UHP. Sprawdź wzór pod mikroskopem optycznym.
  2. Osadzanie napylania
    1. Włóż próbkę do głównej komory systemu osadzania i poczekaj na ciśnienie podstawowe (~5 × 10-8 Torr). Otwórz przepływ gazu; Ustaw przepływ argonu dla standardowego napylania (28 SCCM [standardowy cm sześcienny na minutę) w tym dokumencie. Zapal cele rozpylania, a następnie ustaw ciśnienie rozpylania na 3 mTorr.
    2. Zwiększaj moc na każdym celu, aż do osiągnięcia żądanej szybkości.
      UWAGA: Szybkość Pd: 0,62 A/s = 1,0 nm w ciągu 16 s; Co80Fe20 Szybkość: 0,32 A / s, 0,2 nm w 6,25 s.
    3. Włącz obrót. Umieść wielowarstwę FM, naprzemiennie między celami Co80Fe20 i Pd, otwierając i zamykając odpowiednio przesłony celu. Nałóż 14 dwuwarstwowych warstw Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) i zakończ dodatkową warstwą zamykającą Pd 2 nm.
    4. Podnoszenie: Zanurzyć próbkę w acetonie na 30 minut i spłukać izopropanolem. Następnie wysuszyć azotem UHP i przechowywać próbkę w czystym i suchym środowisku do czasu użycia.

2. Charakterystyka urządzenia magnetycznego za pomocą pomiarów transportowych

  1. Użyj podłoża Si lub szkiełka podstawowego z prętem magnetycznym w kształcie krzyża o szerokości 100 μm, osadzonym wielowarstwami FM (patrz Rysunek 1C wstawka). Przymocuj próbkę do uchwytu za pomocą taśmy dwustronnej.
  2. Za pomocą łącznika drutowego przymocuj 4 druty do próbki, po jednym na każdej nodze elektrody krzyżowej. Ustawić uchwyt próbki i próbkę wewnątrz transportowego układu pomiarowego za pomocą pola magnetycznego tak, aby pole magnetyczne było prostopadłe do próbki. Wykonuj pomiary w temperaturze pokojowej.
  3. Wykonaj pomiar napięcia poprzecznego (VT) urządzenia; postępuj zgodnie z oznaczeniami w Rysunek 1C (wstawka): doprowadź prąd 1 mA między stykami 1 i 3; zmierz VT między stykami 2 i 4; następnie przyłóż prąd między 2 a 4 i zmierz napięcie między 1 a 3. Na koniec oblicz różnicę między napięciami obu pomiarów i podziel przez 2, aby uzyskać VT. Użyj systemu przełączającego, aby automatycznie przełączać się między dwiema konfiguracjami pomiarów.
  4. Przemiataj pole magnetyczne w zakresie od 0,4 T do -0,4 T w krokach co 5 mT i zmierz VT w funkcji pola. Wykreśl rezystancję poprzeczną (V, T/I) w funkcji pola magnetycznego, aby określić anomalny sygnał Halla, który jest proporcjonalny do prostopadłego namagnesowania folii.

3. Charakterystyka MNP i wielowarstwowych magnetyków za pomocą pomiarów magnetometrycznych

  1. Pomiar magnetometryczny dla wielowarstwowych FM
    1. Osadzać wielowarstwę FM na podłożu Si (patrz rozdział 1.2). Pokrój próbkę na 6 kwadratów o wymiarach 4 x 4 mm2. Ułóż próbki jedna na drugiej i ułóż je w kapsule prostopadle do kierunku pola magnetycznego (patrz Rysunek 1D).
    2. Włóż kapsułkę do magnetometru i zmierz namagnesowanie w temperaturze pokojowej. Przemiatanie pola magnetycznego między -0,4 T a 0,4 T.
    3. Oblicz całkowitą objętość materiału magnetycznego, biorąc pod uwagę grubość warstwy magnetycznej, wielkość próbek i liczbę substratów. Podziel namagnesowanie przez całkowitą objętość materiału magnetycznego.
    4. Wykreśl namagnesowanie (na jednostkę objętości) w funkcji pola magnetycznego. Odejmij diamagnetyczne tło podłoża od odpowiedzi silnego pola magnetycznego i ekstrapoluj namagnesowanie nasycenia FM z wykresu.
  2. Pomiar magnetometryczny dla MNP
    1. Wprowadzić wyznaczoną masę MNP do syntetycznej kapsułki polimerowej. Rozważ większą objętość, jeśli mierzysz małe wartości nasycenia magnesowaniem.
    2. Jeśli MNP są zawieszone w rozpuszczalniku, należy je wysuszyć, pozostawiając kapsułkę otwartą na noc. Włóż kapsułkę do magnetometru i zmierz namagnesowanie w temperaturze pokojowej. Przemiatanie pola magnetycznego w zakresie od -0,2 T do 0,2 T.
    3. Obliczyć całkowitą masę MNP, mnożąc wyznaczoną objętość przez stężenie cząstek. Normalizuj wyniki do 1 g.
    4. Wykreśl znormalizowane namagnesowanie (na gram) w funkcji pola magnetycznego. Ekstrapoluj nasycenie namagnesowaniem MNP z wykresu.

4. Protokół powlekania kolagenem

  1. Powlekanie naczyń plastikowych
    1. Przygotować 0,01 M HCl, dodając 490 μl HCl do 500 ml autoklawowanej podwójnie destylowanej wody (DDW).
      UWAGA: Wykonaj ten krok tylko w okapie chemicznym.
    2. Rozcieńczyć kolagen typu 1 (roztwór z ogona szczura) 1:60-1:80 w 0,01 M HCl, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 50 μg/ml. Umieścić 1,5 ml rozcieńczonego roztworu w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm. Pozostaw naczynie w okapie na 1 godzinę pod przykryciem.
    3. Usunąć roztwór i przemyć 3x w sterylnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Naczynie jest gotowe do wysiewu komórek.
  2. Powlekanie szkiełek szkiełkowych
    1. Rozcieńczyć kolagen typu 1 (roztwór z ogona szczura) w stosunku 1:50 w 30% v/v etanolu. Aby pokryć naczynie o średnicy 35 mm, dodaj 20 μl kolagenu do 1 ml 30% etanolu.
    2. Przykryj naczynie roztworem i poczekaj, aż cały roztwór wyparuje, pozostawiając naczynie odkryte na kilka godzin. Umyć 3x w sterylnym 1x PBS; Szkiełko szklane jest gotowe do wysiewu komórek.

5. Wykorzystanie i żywotność MNP w komórkach

  1. Wychwyt komórkowy MNP
    1. Przygotuj podstawową pożywkę wzrostową do hodowli komórek PC12, dodając 10% surowicy końskiej (HS), 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,2% amfoterycyny do pożywki Roswell Park Medical Institute (RPMI) i przefiltruj za pomocą filtra nylonowego 0,22 μm.
    2. Dodać 1% surowicy końskiej (HS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,2% amfoterycyny do pożywki RPMI, aby przygotować pożywkę różnicującą PC12 i przefiltrować za pomocą filtra nylonowego 0,22 μm.
    3. Hodować komórki w niepoddanej działaniu substancji kolbie hodowlanej z 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej; dodawać 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej do kolby co 2-3 dni i podkulturować komórki po 8 dniach.
    4. W celu wypobrania komórkowego należy odwirować zawiesinę komórkową w probówce wirówkowej przez 8 minut w temperaturze 200 × g i temperaturze pokojowej, a supernatant należy odrzucić.
    5. Zawiesić komórki w 3 ml świeżej podstawowej pożywki wzrostowej. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze 200 × g i temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 3 ml świeżej pożywki różnicującej.
    6. Odessaj komórki 10x za pomocą strzykawki i igły, aby rozbić skupiska komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 106 komórek w zwykłym niepowlekanym naczyniu o średnicy 35 mm.
    7. Dodać do naczynia obliczoną objętość zawiesiny MNP i objętość pożywki różnicującej, aby uzyskać pożądane stężenie MNP i objętość całkowitą. Wymieszaj komórki, MNP i pożywkę różnicującą; inkubować naczynie w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    8. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze pokojowej o stężeniu 200 × g i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki różnicującej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  2. Różnicowanie komórek obciążonych MNP
    1. Wykonać protokół wychwytu (punkt 5.1). Nasiona 8 × 104 komórki obciążone MNP na 35 mm naczyniu pokrytym kolagenem typu l w obecności pożywki różnicującej (patrz protokół powlekania kolagenem w sekcji 4.1). Po 24 godzinach dodać 1:100 świeżego mysiego czynnika wzrostu beta-nerwów (β-NGF) (końcowe stężenie 50 ng/ml).
    2. Odnawiaj pożywkę różnicującą i dodawaj świeżą mysią β-NGF co 2 dni. Obrazuj komórki co 2 dni za pomocą mikroskopii optycznej. Po utworzeniu sieci (6-8 dni dla komórek PC12) zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej i obserwuj fluorescencję cząstek.
  3. Test żywotności komórek obciążonych MNP: test żywotności komórek 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolium-5-karboksyanilidu (XTT).
    1. Przygotować podstawowe podłoże wzrostowe zgodnie z krokiem 5.1.1. Hodować komórki PC12 z MNP w różnych stężeniach (0,1 mg / ml, 0,25 mg / ml i 0,5 mg / ml w podstawowej pożywce wzrostowej), a także bez MNP do kontroli w trzech powtórzeniach na płaskiej 96-dołkowej płytce (całkowita objętość 100 μl / dołek). Inkubować komórki przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    2. Przygotuj puste studzienki zawierające pożywkę bez komórek do korekcji tła. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić roztwór odczynnika XTT i roztwór reakcyjny zawierający siarczan metylu N-metylodibenzopirazyny) w łaźni o temperaturze 37 °C. Delikatnie obracać, aż do uzyskania klarownych roztworów.
    3. W przypadku jednej płytki 96-dołkowej zmieszać 0,1 ml roztworu aktywacyjnego z 5 ml odczynnika XTT. Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu reakcyjnego, lekko wstrząsnąć płytką w celu równomiernego rozprowadzenia barwnika w studzienkach, a następnie inkubować płytkę w inkubatorze przez 5 godzin.
    4. Zmierzyć absorbancję próbki w stosunku do studzienek ślepej próby za pomocą czytnika testu immunoenzymatycznego (ELISA) na długości fali 450 nm. Zmierzyć absorbancję odniesienia przy użyciu długości fali 630 nm i odjąć ją od pomiaru 450 nm.
    5. Ponieważ w pożywce hodowlanej inkubowanej z odczynnikiem XTT przy długości fali 450 nm występuje niewielka absorbancja spontaniczna, należy odjąć średnią absorbancję studzienek ślepych od absorbancji pozostałych studzienek. Odejmij wartości sygnału od równoległych próbek MNP o tych samych badanych stężeniach, co próbki komórek.
  4. Test żywotności komórek obciążonych MNP: test żywotności komórek na bazie resazuryny
    1. Przygotować podstawowe podłoże wzrostowe zgodnie z krokiem 5.1.1. Hodować komórki PC12 z MNP w różnych stężeniach (0,1 mg / ml, 0,25 mg / ml i 0,5 mg / ml w podstawowej pożywce wzrostowej) i bez MNP jako kontroli w trzech egzemplarzach na płaskiej 96-dołkowej płytce przez 24 godziny. Inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Przygotować ślepe studzienki zawierające pożywkę bez komórek.
    2. Umyj komórki 1x PBS. Dodać odczynnik na bazie resazuryny (10% w/v) do pożywki i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    3. Umieścić 150 μl podwielokrotności próbek w czytniku ELISA i zmierzyć absorbancję przy długości fali wzbudzenia 560 nm i długości fali emisji 590 nm. Odejmij wartości sygnału od równoległych próbek MNP o tych samych badanych stężeniach, co próbki komórek.

6. Charakterystyka stężenia MNP wewnątrz komórek za pomocą plazmy sprzężonej indukcyjnie (ICP)

  1. Przygotować podstawowe podłoże wzrostowe zgodnie z krokiem 5.1.1. Hodować komórki PC12 z MNP w różnych stężeniach (0,1 mg / ml, 0,25 mg / ml i 0,5 mg / ml w podstawowej pożywce wzrostowej) i bez MNP jako kontroli w trzech powtórzeniach na płaskiej 96-dołkowej płytce (całkowita objętość 100 μl / basenik). Inkubować w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  2. Przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej (z każdej studzienki osobno), odwirować komórki o masie 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki różnicującej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  3. Poddać komórki lizie przez traktowanie 100 μl 70% kwasu azotowego do każdej studzienki oddzielnie przez co najmniej 15 minut. Dodać 5 ml DDW do zlizowanych komórek i przefiltrować roztwory.
  4. Zmierz stężenie żelaza za pomocą ICP i użyj liczby komórek, aby zarejestrować stężenie Fe na komórkę.

7. Różnicowanie i wzrost komórek na platformie magnetycznej

  1. Oczyść wzorzyste podłoże 70% v/v/ etanolem i umieść substrat w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm w kapturze. Umieść duży magnes (~1500 Oe) pod wzorzystym podłożem na 1 minutę i wyjmij magnes, najpierw przesuwając naczynie w górę i odsuwając go od magnesu, a następnie wyjmij magnes z okapu. Włącz światło ultrafioletowe na 15 minut.
  2. Pokryć podłoże kolagenem typu 1 zgodnie z punktem 4.2. Zawiesić komórki po wychwycie komórkowym MNP (sekcja 5.1), wysiać10-5 komórek w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm i dodać 2 ml pożywki różnicującej. Inkubować kulturę w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  3. Po 24 godzinach dodać 1:100 świeżego mysiego β-NGF (końcowe stężenie 50 ng/ml). Odnów pożywkę różnicującą i dodawaj świeżą mysią β-NGF co 2 dni. Obrazować komórki co 2 dni za pomocą mikroskopii świetlnej, a po utworzeniu sieci wykonać barwienie immunologiczne komórek (sekcja 8.1).

8. Barwienie komórek z ładunkiem MNP

  1. Barwienie immunologiczne tubuliny
    1. Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA), mieszając 10 ml 16% w/v roztworu PFA, 4 ml 10x PBS i 26 ml DDW. Przygotuj 50 ml 1% PBT, dodając 500 μl niejonowego środka powierzchniowo czynnego do 50 ml 1x PBS. Przygotuj 50 ml 0,5% PBT, mieszając 25 ml 1% PBT z 25 ml 1x PBS. Przygotować roztwór blokujący, mieszając 1% albuminę surowicy bydlęcej i 1% normalną surowicę osła w 0,25% PBT.
      UWAGA: Używaj PFA tylko wewnątrz okapu chemicznego.
    2. Usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem z komórek. Umieść komórki obciążone MNP w 4% PFA na 15 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz okapu chemicznego. Umyj ogniwa załadowane MNP 3x w 1x PBS, po 5 minut każde mycie, wewnątrz okapu chemicznego.
    3. Przepuszczalność komórek obciążonych MNP 0,5% PBT przez 10 minut. Inkubować komórki obciążone MNP najpierw w roztworze blokującym przez 45 minut w temperaturze pokojowej, a następnie z przeciwciałem królika anty-α-tubuliny w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C. Umyć komórki załadowane MNP 3x w 1x PBS, 5 minut każde płukanie.
    4. Inkubować komórki obciążone MNP z sprzężonym z Cy2 drugorzędowym przeciwciałem anty-króliczym osła przez 45 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej. Umyj ogniwa załadowane MNP 3x w 1x PBS po 5 minut każde mycie.
    5. Wykonaj obrazowanie konfokalne. W przypadku tubuliny należy użyć długości fali wzbudzenia 492 nm i długości fali emisji 510 nm. W przypadku MNP (rodaminy) należy użyć długości fali wzbudzenia 578 nm i długości fali emisji 613 nm.
  2. Barwienie jądrowe 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI)
    1. Umyj ogniwa załadowane MNP 3x w 1x PBS po 5 minut każde mycie. Usunąć nadmiar płynu wokół próbki, dodać 1 kroplę (~50 μl) podłoża montażowego zawierającego DAPI na powierzchni 22 mm x 22 mm i inkubować przez 5 minut w ciemności i temperaturze pokojowej.
    2. Umyj ogniwa załadowane MNP 3x w 1x PBS po 5 minut każde mycie. Wykonaj obrazowanie konfokalne. W przypadku DAPI należy użyć długości fali wzbudzenia 358 nm i długości fali emisji 461 nm. W przypadku MNP (rodaminy) należy użyć długości fali wzbudzenia 578 nm i długości fali emisji 613 nm.

9. Pomiary i analiza statystyczna

  1. Analiza morfometryczna różnicowania komórek obciążonych MNP
    1. Aby zmierzyć liczbę przecięć w różnych odległościach od ciała komórki, należy uzyskać obrazy fazowe hodowanych komórek do 3 dni po leczeniu NGF.
      UWAGA: Jeśli zostanie to zrobione później, komórki mogą tworzyć sieci, uniemożliwiając pomiary rozdzielczości pojedynczej komórki.
      1. Otwórz obrazy w programie do przetwarzania obrazów, ImageJ, i użyj wtyczki NeuronJ, która umożliwia półautomatyczne śledzenie neurytów i pomiar długości36. Korzystając z wtyczki śledzenia neurytów, śledź neuryty i konwertuj dane na obrazy binarne. Nakreśl środek somy.
      2. Wykonaj analizę Sholl, dostępną we wtyczce NeuronJ. Umożliwia zdefiniowanie promienia maksymalnego. Powtórz eksperyment trzy razy. Przeanalizuj ponad 100 komórek w każdym eksperymencie.
  2. Analiza lokalizacji komórek
    1. Aby określić procent komórek zlokalizowanych w obszarze magnetycznym po 3 dniach inkubacji, należy uzyskać konfokalne obrazy mikroskopowe komórek z wychwytem MNP i bez niego. Stosować barwienie DAPI (punkt 8.2).
    2. Ręcznie policz komórki na szczycie lub częściowo na szczycie wzoru (dotykając komórek) oraz komórki, które nie są. Powtórz dla trzech eksperymentów. Przeanalizuj ponad 400 komórek za pomocą MNP i bez wychwytu.
    3. Oblicz względną proporcję komórek, które znajdują się na szczycie wzorców magnetycznych, w stosunku do całkowitej liczby komórek, z MNP i bez nich. Dodatkowo oblicz procent efektywnej powierzchni wzoru magnetycznego, dodając średnicę ciała komórki do szerokości wzoru, aby określić losowe prawdopodobieństwo lądowania komórek na wzorcu magnetycznym.
    4. Wykonaj test Z pojedynczej próbki, aby przeanalizować, czy rozkład komórek jest wynikiem izotropowego lądowania komórek, czy też istnieje preferowane odchylenie wzorca magnetycznego.
  3. Analiza kierunkowości wzrostu
    1. Aby określić ilościowo wpływ na kierunkowość wzrostu neurytów, należy uzyskać konfokalne obrazy mikroskopowe komórek z i bez leczenia MNP po 8 dniach inkubacji. Wykonać barwienie immunologiczne (punkt 8.1).
    2. Za pomocą oprogramowania ImageJ zmierz kąt między neurytem komórki a paskami magnetycznymi w obu warunkach.
      UWAGA: Analizuj tylko neuryty, które pochodzą z somy znajdujących się na paskach magnetycznych.
    3. Wykreślić rozkład kątów neurytów w stosunku do kierunku pasków (Δθ). Wykonać test chi-kwadrat rozkładu Δθ, aby wykazać, że rozkład nie jest normalny lub jednorodny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyprodukowano platformy magnetyczne o różnych kształtach geometrycznych (Rysunek 1A). Wzory magnetyczne zdeponowano metodą rozpylania: 14 wielowarstw Co80Fe20 i Pd, odpowiednio 0,2 nm i 1 nm. Mikroskopia elektronowa wykazała, że całkowita wysokość wzorów magnetycznych wynosi ~18 nm (Rysunek 1B). To unikalne wielowarstwowe osadzanie FM tworzy stabilną platformę z prostopadłą anizotropią namagnesowania (PMA) względem płaszczyzny ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki wskazują na skuteczność przedstawionej metodyki kontrolowania i organizowania tworzenia sieci neuronalnych w skali mikronowej. Ogniwa PC12 obciążone MNP pozostały żywotne i zostały przekształcone w jednostki wrażliwe na działanie pola magnetycznego, które były przyciągane przez siły magnetyczne z elektrod FM do określonych miejsc. Najlepiej widać to na rysunku 5C, gdzie komórki preferencyjnie przylegały do większych wierzchołków sześciokątów, a nie do cienkich linii. C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Izraela oraz przez Izraelską Fundację Naukową (569/16).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% roztwór wodny paraformaldehydu (formaldehydu)NAUKI O MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJ15710
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejFALCON353846
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowejSPL nauki przyrodnicze30096
Roztwór amfoterycyny BPrzemysł biologiczny03-028-1B
AZ 1514H fotorezystułMicroChemicals
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Biological Industries03-010-1B
Kolba do hodowli komórek i tkanekBiofilTCF00225075,0 cm^2 250 mL Nasadka odpowietrzająca, niepoddana działaniu
metody Naczynie do hodowli komórkowychGreiner Bio-One627-16035 mm
Zestaw do proliferacji komórek (oparty na XTT)Przemysł biologiczny20-300-1000
Probówka wirówkowaBiofilCFT02150050 ml
Co80Fe20 at% napylanie doceloweStopy99,95%
Kolagen typu ICorning Inc.354236Rat Tail, zakres stężeń 3-4 mg/ml
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SP5
Cy2-sprzężone AffiniPure Donkey Przeciwciało wtórne przeciwko królikowiJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Igła jednorazowaKDL23 G
Jednorazowe  strzykawkaMedispo116022764010 ml
Surowica konia dawcyBiological Industries04-124-1A
Czytnik ELISAMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid czytnik mikropłytek
Etanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Etanol absolutny (odwodniony)Biolab-chemikalia52505
Surowica bydlęca płodu (FBS)Biological Industries04-127-1A
Świeży mysi β-NGFPeprotech450-34
GMW Elektromagnes C-frame .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Kwas solny 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJAmerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia, wtyczka BethesdaNeuronJ
Plazma sprzężona indukcyjnie (ICP)Ametek Spectro SPECTROARCOS ICP-OES, Plazma FHX22 MultiView
Keithley źródłoKeithley2400
System przełączający KeithleyKeithley3700
L-glutaminaBiological Industries03-020-1B
Mikroskop świetlnyLeicaDMIL LED
Fotolitografia bezmaskowaHeidelberg Inst.MLA150
BAR-NAORBN1042000C
Kwas azotowy 70%Sigma-Aldrich438073
Normalna surowica osła (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 linia komórkowaATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99,95%
Roztwór nystatyny penicyliny-streptomycynyPrzemysł biologiczny03-032-1B
Odczynnik żywotności komórek PrestoBlueSondy molekularneA-13261bazie resazuryny
Przeciwciało królika przeciwko &alfa;-tubulinieSanta Cruz Biotechnology, Inc.
System rozpylania magnetronowego RFOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 z l-glutaminąBiological Industries01-100-1A
Kąpiel sonikacyjnaKUDOSSK3210HPCzęstotliwość: 53 kHz. Moc ultradźwiękowa: 135 W
Magnetometr SQUIDQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279niejonowy środek powierzchniowo czynny
XTT odczynnik
GmbH ACI pomiarowe Szkiełka mikroskopowe na żywotności komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560(2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299(2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030(2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37(2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32(2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290(2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055(2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911(2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303(2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403(2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organizacja neuron wnanocz stki magnetycznekom rki PC12tworzenie sieci neuronowychferromagnetyczne warstwy wielowarstwowewzorowanie w skali mikronowejwzrost neuryt wpozycjonowanie kom rekurz dzenia do biointerfejsingu

Powiązane artykuły