Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62017

⸱

4 marca 2021

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London, 2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Połączenie preparatów halo DNA z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ umożliwia analizę interakcji genomowych z nukleoszkieletem w wysokiej rozdzielczości. Przyłączony genom prowadzi do zhybrydyzowanych sygnałów fluorescencyjnych zlokalizowanych w resztkowych wyekstrahowanych jądrach, podczas gdy nieprzyłączony genom znajduje się w halo DNA otaczającym resztkowe jądra.

Streszczenie

Genom jest powiązany z kilkoma strukturami wewnątrz jąder komórkowych, w celu regulacji jego aktywności i zakotwiczenia go w określonych miejscach. Struktury te są zbiorczo znane jako nukleoszkielet i obejmują blaszkę jądrową, jąderka i ciała jądrowe. Chociaż istnieje wiele wariantów fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do badania genomu i jego organizacji, są one często ograniczone rozdzielczością i dostarczają niewystarczających informacji na temat związku genomu ze strukturami jądrowymi. Metoda halo DNA wykorzystuje wysokie stężenia soli i niejonowe detergenty do generowania pętli DNA, które pozostają zakotwiczone w strukturach w jądrach poprzez regiony przyłączeniowe w genomie. Tutaj ekstrahowane są rozpuszczalne białka jądrowe, takie jak histony, lipidy i DNA, które nie są ściśle związane z macierzą jądrową. Prowadzi to do powstania aureoli nieprzyłączonego DNA otaczającego szczątkowe jądro, które samo w sobie zawiera DNA ściśle związane z wewnętrznymi strukturami jądrowymi i białkami odpornymi na ekstrakcję. Te rozszerzone nici DNA umożliwiają zwiększenie rozdzielczości i mogą ułatwić mapowanie fizyczne. W połączeniu z FISH, metoda ta ma dodatkową zaletę polegającą na badaniu interakcji genomowych ze wszystkimi strukturami, w których genom jest zakotwiczony. Technika ta, nazwana HALO-FISH, jest bardzo wszechstronna, dzięki której halo DNA może być sprzężone z sondami kwasów nukleinowych w celu ujawnienia loci genów, całych chromosomów, satelity alfa, telomerów, a nawet RNA. Technika ta zapewnia wgląd w organizację i funkcję jądra w normalnych komórkach oraz w postępie choroby, takiej jak rak.

Wprowadzenie

"Matryca jądrowa" została po raz pierwszy opisana przez Berezneya i Coffeya w 1974 roku1. Po przeprowadzeniu ekstrakcji z wysoką molowością soli i leczeniu nukleazą jąder wątroby szczura, zidentyfikowali białkowy szkielet strukturalny. Procedura halo DNA została następnie zaadaptowana z tej metody i polega na usunięciu rozpuszczalnych białek, tak aby przetrwała tylko macierz jądrowa (NM) oraz białka i chromosomy związane z NM. Regiony przyłączania DNA znajdują się u podstawy pętli DNA i nazywane są regionami przyłączonymi do macierzy (MAR) lub regionami przyłączenia rusztowania (SAR), które są odporne odpowiednio na ekstrakcję wysokimi stężeniami soli i jonowym detergentem lit-3,5-dijodosalicylanem (LIS). W halo DNA DNA związane z MAR / SAR jest związane w jądrze resztkowym, podczas gdy pętle DNA rozciągają się od tych miejsc i tworzą halo DNA. Wiemy teraz, że genom jest zakotwiczony poprzez domeny związane z blaszką (LAD) do blaszki jądrowej oraz poprzez regiony związane z jądrami (NAD) i prawdopodobnie przez inne struktury jądrowe, takie jak określone ciała jądrowe.

Metoda halo DNA może być używana do fizycznego mapowania DNA, genów i regionów chromosomowych, ponieważ rozszerzone DNA i chromatyna zapewniają większą rozdzielczość, ponieważ chromatyna jest pozbawiona histonów, a DNA jest rozciągnięte2,3,4,5,6. Istnieją jednak pewne ograniczenia podczas używania aureoli DNA do tego zastosowania. Na przykład, DNA ściśle związane z resztkowymi jądrami halo DNA może być niedostępne dla sond, co wyklucza jego analizę i mapowanie fizyczne6. Inne techniki, takie jak fiber-FISH2,4,5,7 i molekularne combing8 również umożliwiają mapowanie fizyczne i mają tę zaletę, że są stosunkowo szybkie i łatwe do wykonania. Oba są preferencyjnie używane do mapowania DNA genów w porównaniu z halo DNA. Metody te ekstrahują włókna chromatyny za pomocą ekstrakcji rozpuszczalnikiem lub solą z jądra, jednak czesanie molekularne ma zwykle lepszą odtwarzalność8,9.

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że nukleoszkielet odgrywa rolę we wspieraniu kluczowych procesów jądrowych, takich jak miejsca przyczepiania się DNA, przebudowa chromatyny, transkrypcja DNA, naprawa DNA i replikacja DNA11,12. W związku z tym technika halo DNA została opracowana w celu zbadania interakcji między nukleoszkieletem a genomem podczas tych czynności komórkowych i jest rutynowo stosowana i opisywana w badaniach. Technika ta została również wykorzystana do zbadania interakcji między genomem a nukleoszkieletem w odniesieniu do postępu choroby z identyfikowanymi zmianami w strukturze jądrowej związanymi z nowotworem złośliwym11.

Technika halo DNA została również wykorzystana do zbadania związku między genomem a nukleoszkieletem podczas rozwoju i różnicowania12. W wielu badaniach wykorzystano odmianę techniki halo DNA znaną jako halosperm13 lub SpermHalo-FISH w połączeniu z FISH14. Chromatyna plemników jest ściśle związana z białkami znanymi jako protaminy, a technika ta została opracowana w celu poprawy dostępu do DNA plemników. Halosperm został wykorzystany do zbadania integralności DNA plemników i określenia, czy występuje uszkodzenie DNA. Plemniki z mniejszymi uszkodzeniami DNA korelują z większym rozmiarem halo DNA, podczas gdy plemniki ze zwiększonym poziomem pofragmentowanego i uszkodzonego DNA miały albo małe aureole, albo nie miały ich wcale. W związku z tym halosperm może być używany jako potencjalny marker prognostyczny jakości zarodka i udanej ciąży z IVF13. Ten przykład podkreśla potencjalne zastosowania kliniczne tej techniki. W naszej pracy wykorzystaliśmy HALO-FISH do oceny zmian w zachowaniu genomu i wpływu określonych terapii lekowych w chorobie przedwczesnego starzenia się Zespół Progerii Hutchinsona-Gilforda (HGPS)15.

Razem te i inne badania podkreślają szeroki zakres procesów/zastosowań, które technika halo DNA może być wykorzystana do badania i użyteczność techniki.

Protokół

1. Przygotowanie preparatu, sterylizacja i hodowla komórkowa

  1. Przygotować 500 ml 10% HCl (v/v) i przelać do dużej zlewki.
  2. Wrzuć szkiełka mikroskopowe pojedynczo do kwasu i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce ustawionej na 2 x g.
    UWAGA: HCl jest i drażniący. Może powodować poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenie oczu i podrażnienie skóry, oczu i układu oddechowego. Upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny.
  3. Zdekantować kwas ze zlewki i przepłukać szkiełka dziesięć razy w wodzie z kranu, a następnie kolejne dziesięć razy w wodzie dejonizowanej.
  4. Dwukrotnie przepłukać szkiełka w metanolu i przechowywać w metanolu do czasu sterylizacji przez płomieniowanie.
    UWAGA: Metanol jest wysoce łatwopalną cieczą i jest toksyczny w przypadku połknięcia, kontaktu ze skórą lub wdychania. Ponadto metanol może powodować uszkodzenia narządów, działa żrąco i drażniąco. Przestrzegaj limitów narażenia w miejscu pracy i upewnij się, że nosi się odpowiednią ochronę osobistą, w tym rękawice z kauczuku butylowego, ochronę oczu i fartuch laboratoryjny. Jeśli to możliwe, należy umieścić w lokalnej dygestorium z wentylacją wyciągową (LEV).
  5. Za pomocą metalowych szczypiec lub długich kleszczy wyjmij szkiełko mikroskopowe ze zlewki zawierającej metanol. Podpalić palnik Bunsena w celu sterylizacji i przenieść do prostokątnego naczynia do hodowli komórkowej zawierającego cztery komory na szkiełka, umieszczonego w pobliżu palnika Bunsena.
    UWAGA: Płomieniowanie umożliwia natychmiastową sterylizację szkiełek mikroskopowych przed użyciem; Jednak ta metoda wiąże się z zagrożeniami. Ponieważ metanol jest wysoce łatwopalny, ważne jest, aby zlewka zawierająca szkiełka była umieszczona z dala od palnika Bunsena. Należy używać długich szczypiec lub kleszczy, które mocno chwytają szkiełka. Poziom metanolu w zlewce powinien po prostu zakrywać szkiełka, zarówno w celu zminimalizowania ilości użytego metanolu, jak i w taki sposób, aby tylko końce kleszczy/szczypiec miały kontakt z metanolem. Zawsze upewnij się, że metanol wyparował z kleszczy lub szczypiec po użyciu i że ostygły one przed ponownym umieszczeniem w zlewce zawierającej szkiełka i metanol. Zlewkę należy przykryć kawałkiem folii aluminiowej, aby pozbawić tlenu w przypadku zapalenia się metanolu. Nigdy płomień nie ślizga się w okapie z przepływem laminarnym klasy II, w którym krąży powietrze.
  6. Alternatywnie wykonaj kroki od 1.1 do 1.4, ale zamiast palić szkiełka po inkubacji z metanolem, umieść szkiełka na niestrzępiącej się chusteczce do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu zawiń w folię aluminiową i umieść w sterylizatorze, piekarniku lub autoklawie.
  7. Hodować komórki w odpowiednim podłożu z surowicą przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2 aż do osiągnięcia 60-70% zgryzu. Protokół ten przeprowadzono na wczesnym pasażu ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) oraz na klasycznych fibroblastach (AG06297) i atypowych fibroblastach HGPS typu 2 (AG08466). Zbierz każdy typ komórek i policz je za pomocą hemocytometru, aby określić gęstość komórek. Wysiew 1 x 105 komórek w 10 ml podłoża na szkiełko.
    UWAGA: Gęstość komórek jest ważna, ponieważ pętle DNA z różnych jąder mogą się zbiegać, jeśli komórki staną się zbyt zlewne. Gęstość wysiewu może wymagać optymalizacji w zależności od użytego typu komórki, ponieważ przekształcone komórki mogą rozmnażać się szybciej, podczas gdy późniejsze hodowle komórek pasażowych mogą potrzebować więcej czasu, aby osiągnąć pożądaną konfluencję.
  8. Jeśli komórki muszą zostać zatrzymane w G0, aby przeszły w stan spoczynku, należy wysiać 1 x 105 komórek (w 10 ml pożywki) na szkiełko i pozostawić do wzrostu na 24 godziny. Przemyć komórki dwukrotnie pożywką bez surowicy i inkubować w standardowej pożywce, która zawiera niższe stężenie surowicy na poziomie 0,5% (surowica nowonarodzonego cielęcia, NCS; lub płodowa surowica bydlęca, FBS) przez 7 dni.
  9. Jeśli status proliferacyjny komórek jest wymagany do testu DNA Halo, należy określić komórki, które przeszły przez fazę S przez włączenie 5-bromo-2'-deoksy-urydyny (BrdU) do DNA podczas replikacji.
    1. Komórki nasienne jak normalnie i rosną przez 24 godziny. Usunąć pożywkę hodowlaną i zastąpić pożywką zawierającą BrdU i 5-fluoro-2'-deoksyurydynę (3 μg/μL). Po kolejnych 24 godzinach usunąć pożywkę, raz przemyć komórki pożywką (10% NCS), a następnie ponownie nakarmić świeżą pożywką (10% NCS). Inkubować przez dodatkowe 24 godziny, a następnie przygotować szkiełka do testu halo DNA.

2. Przygotowanie sondy

  1. Sondy do malowania całych chromosomów i ramion
    1. Wykonaj sondy chromosomowe z amplifikacji chromosomów posortowanych przepływowo lub mikrorozciętych przez zdegenerowaną reakcję łańcuchową polimerazy posadzonej oligonukleotydami (DOP-PCR) przy użyciu metody Telenius et al.16. Użyj DOP-PCR, aby oznaczyć sondy chromosomowe biotyną-16-dUTP lub digoksygeniną-11-dUTP, jak pokazano w Tabeli 1. Proszę zapoznać się z instrukcjami producenta dotyczącymi amplifikacji profil, jednak warunki użyte w tym eksperymencie są pokazane w Tabeli 2.
    2. Przygotować sondę ramienia lub całego chromosomu, dodając razem 8 μl znakowanego produktu PCR, 7 μl DNA Cot-1, 3 μl nasienia śledzia, 1/20 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,4) i 2 objętości 100% etanolu. Inkubować roztwór sondy przez minimum 30 minut w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Ta metoda może być stosowana do tworzenia sond z pojedynczym chromosomem lub sond z wieloma chromosomami, jeśli dla każdego chromosomu będącego przedmiotem zainteresowania stosuje się różne znaczniki (tj><. Biotyna-16-UTP i Digoxigenin-11-dUTP). UWAGA: Etanol jest wysoce łatwopalną cieczą i parą i może powodować poważne podrażnienie oczu. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni i źródeł zapłonu. Przestrzegaj limitów narażenia w miejscu pracy i upewnij się, że nosi się odpowiednią ochronę osobistą, w tym rękawice z kauczuku butylowego, ochronę oczu i fartuch laboratoryjny. Tam, gdzie to możliwe, uchwyt w dygestorium LEV.
    3. Odwirować roztwór sondy o sile 13 700 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przepłukać 70% etanolem. Powtórzyć procedurę wirowania i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć ani nie stracić osadu DNA. Pozostaw osad DNA do wyschnięcia.
    4. Dodać 12 μl buforu hybrydyzacyjnego (50% formamidu, 10% siarczanu dekstranu, 10% 20x słony cytrynian sodu (SSC; 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian trisodu; pH 7,0), 1% (v/v) monolaurynian polioksyetylenosorbinalu (Tween-20)) do osadu DNA. Pozostawić w temperaturze 37 °C na co najmniej 2 godziny, aby osad DNA rozpuścił się w buforze hybrydyzacyjnym.
      UWAGA: Formamid jest rakotwórczy i teratogenny, więc może poważnie zaszkodzić nienarodzonemu dziecku. Jeśli kobieta jest w ciąży lub podejrzewa, że jest w ciąży, powinna unikać pracy z formamidem. Formamid powinien być stosowany w dygestoriach LEV. Przestrzegaj limitów narażenia w miejscu pracy i upewnij się, że nosi się odpowiednią ochronę osobistą, w tym rękawice z kauczuku butylowego, ochronę oczu i fartuch laboratoryjny.
  2. Izolacja DNA ze sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC)
    1. Umieść niewielką część wywaru glicerolu z klonu BAC na płytce agarowej Luria-Bertani (LB) (1% (w/V) NaCl; 1% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 1,5% (w/v) Agar Techniczny, 12,5 μg/ml (w/v) chloramfenikolu). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki i zaszczep 10 ml bulionu LB (1% (w/v) NaCl, 1% (w/v) baktotryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 12,5 μg/ml (w/v) chloramfenikolu). Pozostawić roztwór na noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Podejrzewa się, że chloramfenikol powoduje raka. Obchodź się z nią ostrożnie i zmniejsz narażenie.
    3. Odwirować kulturę przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Odrzucić supernatant i dodać 300 μl roztworu P1 (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNazy A) do osadu. Energicznie wirować i przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
    5. Dodać kroplami 300 μl roztworu P2 (0,2 M NaOH, 1% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) do komórek. Odwróć zamkniętą probówkę do mikrowirówki 5 razy i pozostaw w temperaturze pokojowej na maksymalnie 5 minut.
      UWAGA: Wodorotlenek sodu jest i może powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Może powodować korozję metali. Obchodź się z nią ostrożnie i zmniejsz narażenie. Przestrzegaj limitów narażenia w miejscu pracy i upewnij się, że nosi się odpowiednią ochronę osobistą, w tym rękawice z kauczuku nitrylowego, ochronę oczu i fartuch laboratoryjny. Tam, gdzie to możliwe, uchwyt w dygestoriach LEV.
      UWAGA: Dodecylosiarczan sodu jest łatwopalnym ciałem stałym, szkodliwym w przypadku połknięcia i może powodować podrażnienie skóry i dróg oddechowych. Może również spowodować poważne uszkodzenie oczu. Upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice z kauczuku nitrylowego, ochrona oczu i fartuch laboratoryjny. Tam, gdzie to możliwe, uchwyt w dygestorium LEV.
    6. Powoli dodaj 300 μl P3 (3 M octanu potasu) do komórek i delikatnie wymieszaj. Umieść probówkę mikrowirówki na lodzie na 10 minut.
    7. Wirować przy 8,100 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do probówki zawierającej 800 μl lodowatego izopropanolu. Odwrócić probówkę kilka razy i inkubować w temperaturze -20 °C przez noc.
      UWAGA: Izopropanol jest wysoce łatwopalną cieczą i parą i może powodować poważne podrażnienie oczu, senność lub zawroty głowy. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni i źródeł zapłonu. Przestrzegaj limitów narażenia w miejscu pracy i upewnij się, że nosi się odpowiednią ochronę osobistą, w tym rękawice z kauczuku nitrylowego, ochronę oczu i fartuch laboratoryjny. Tam, gdzie to możliwe, uchwyt w dygestorium LEV).
    8. Odwirować przy 8 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i przenieść do innej probówki. Dodaj 500 μl lodowatego 70% etanolu. Kilkakrotnie odwrócić probówkę i odwirować przy 8 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Usunąć supernatant i wysuszyć granulki na powietrzu w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu osadu zawiesić go ponownie w 40 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (poddanej działaniu DEPC) i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C. Po całkowitym zawieszeniu usunąć 5 μl roztworu i naładować 1% żelem agarozowym, aby sprawdzić obecność DNA.
  3. Przygotowanie BAC za pomocą pojedynczej sondy genowej poprzez translację nicków
    1. Korzystaj z dostępnych na rynku zestawów do etykietowania tłumaczeń nicków. Alternatywnie użyj następującego protokołu. Patrz tabela 3 dla składników i objętości.
    2. Dodać składniki z tabeli 3 razem w probówce do mikrowirówki, dodając polimerazę DNA I na końcu, delikatnie wymieszać i krótko odwirować przez kilka sekund. Inkubować roztwór w temperaturze 15 °C przez 2 godziny.
    3. Aby sprawdzić wielkość fragmentów, załaduj 5 μl roztworu na 2% żel agarozowy. Zakres wielkości fragmentów DNA powinien wynosić od 200 do 600 pz. Jeśli rozmiary fragmentów DNA są większe, należy kontynuować inkubację roztworu przez kolejne 15 minut w temperaturze 15 °C i uruchomić produkty na 2% żelu agarozowym.
    4. Zatrzymaj reakcję translacji nacięcia, dodając 10 mM EDTA, 0,1% SDS (2,5 μl z 0,5 M EDTA, pH 8,0 w 100 μL i 1 μL 10% SDS w 100 μL). Podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
    5. Aby usunąć nieinkorporowane nukleotydy, przyłóż sondę BAC do kolumny wirowej. Komercyjne kolumny wirowe można zakupić lub można je utworzyć za pomocą strzykawki w następujący sposób:
    6. Dodać 30 g Sephadex G-50 do 500 ml buforu kolumnowego (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie. Zrób również 500 ml buforu kolumnowego (bez Sephadex G-50) i autoklawu.
    7. Wykonaj kolumny wirowe, dodając autoklawowaną watę szklaną na dno strzykawki o pojemności 1 ml. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml preparatem Sephadex G-50 w buforze kolumnowym. Umieść strzykawkę o pojemności 1 ml w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, która ma probówkę do mikrowirówki bez pokrywki na dole. Wirować przy 1 600 x g przez 5 min.
    8. Wyjąć strzykawkę i wyrzucić probówkę mikrowirówki znajdującą się na dnie. Wlej świeżą probówkę do mikrowirówki z powrotem do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać bufor kolumnowy (bez Sephadex G-50) do strzykawki o pojemności 1 ml i ponownie włożyć do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 1 600 x g przez 5 min. Powtórz ten krok ponownie dwa razy.
    9. Wyjąć strzykawkę i włożyć ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, która zawiera nową, czystą probówkę do mikrowirówki. Przyłożyć sondę do strzykawki i zebrać sondę w probówce do mikrowirówki.
    10. Aby wytrącić sondę DNA, do roztworu DNA należy dodać 5 μl DNA plemników śledzia (10 mg/ml), 10 μl octanu sodu i 2,25 objętości 100% etanolu. Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę. Wirować przy 13 700 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Odrzucić supernatant i przemyć osad 200 μl lodowatego 70 % etanolu przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu. Po wyschnięciu zawiesić osad w 20 μl wody uzdatnionej DEPC w temperaturze pokojowej na kilka godzin lub przez noc w temperaturze 4 °C. Sonda jest teraz gotowa do użycia lub może być przechowywana w temperaturze -20 °C.
    12. Na każdym szkiełku wymieszaj 5 μl DNA sondy z 5 μl DNA Cot-1 i wysusz za pomocą koncentratora próżniowego Speed Vac. Po wyschnięciu osadu ponownie zawiesić w 12 μl mieszanki hybrydyzacyjnej.

3. Przygotowanie DNA Halo

  1. Wyjąć z inkubatora kwadratową szalkę hodowlaną zawierającą szkiełka i dołączone komórki. Wyrzucić pożywkę, oznaczyć szkiełka za pomocą ołówka i umieścić w słoiku Coplin zawierającym 50 ml lodowatego buforu cytoszkieletu (CSK): 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 M sacharozy, 10 mM 1, kwas 4-piperazynodienosulfonowy (PIPES; pH 7,8), 0,5% (v/v) Triton X-100 uzupełniony w wodzie dejonizowanej. Inkubować przez 15 minut na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Triton X-100 może powodować podrażnienie skóry i poważne uszkodzenie oczu. Należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym rękawic nitrylowych, okularów i fartucha laboratoryjnego.
  2. Wyrzuć bufor CSK i szybko przepłucz szkiełka w 50 ml 1x buforu halo DNA (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO4, 15 mM KH2PO4; pH 7,4) trzy razy, tj. zanurz szkiełko w słoiku Coplin zawierającym DHB i wyjmij.
  3. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 50 ml buforu ekstrakcyjnego: 2 M NaCl, 10 mM PIPES (pH 6,8), 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,1% (w/v) digitonina, 0,05 mM (v/v) spermina, 0,125 mM (v/v) spermidyna. Inkubować przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Digitonina jest toksyczna w przypadku połknięcia lub w kontakcie ze skórą i jest śmiertelna w przypadku wdychania. Upewnij się, że digitonina jest obsługiwana w dygestorium LEV i nosić fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe (z podwójnymi rękawiczkami), okulary ochronne i maskę. Zarówno spermina, jak i spermidyna mogą powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, podczas gdy EDTA powoduje poważne podrażnienie oczu, dlatego z każdą substancją chemiczną należy obchodzić się ostrożnie.
    UWAGA: Przygotować digitoninę oddzielnie, rozpuszczając proszek w wodzie o temperaturze 60-70 °C. Po schłodzeniu dodać rozpuszczoną digitoninę do buforu ekstrakcyjnego. Dodać sperminę, spermidynę i digitoninę jako ostatnie do buforu ekstrakcyjnego, aby zachować aktywność biologiczną.
  4. Inkubować szkiełka emisyjnie kolejno w 50 ml 10x DHB (1,4 M NaCl, 270 mM KCl, 1,1 M NaHPO4, 150 mM KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x i 1x DHB po 1 min każdy.
  5. Zanurzanie (prosto i prosto) przez sekwencyjną serię etanolu o pojemności 50 ml 10%, 30%, 70% i 95% (v/v).
  6. Szkiełka suszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia dwuwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (2D FISH).

4. Dwuwymiarowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

  1. Przygotować 20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian trisodu, pH 7,0. Ten bufor może być sterylizowany w autoklawie, przechowywany w temperaturze pokojowej i rozcieńczany w razie potrzeby.
  2. Przygotować 70% (v/v) formamidu, 2x SSC pH 7,0 i podgrzać do 70 °C w łaźni wodnej.
  3. Inkubować szkiełka, przez 5 minut każda, przez sekwencyjną serię 50 ml etanolu o stężeniu 70, 90 i 100% etanolu.
  4. Wysuszyć na powietrzu zjeżdżać na blasze grzewczej i piec w piekarniku o temperaturze 70°C przez 5 minut.
  5. Denaturyzacja szkiełek poprzez umieszczenie w 70% formamidzie, 2x roztworze SSC na 2 minuty w temperaturze 70 °C.
    UWAGA: Temperatura i czas mają kluczowe znaczenie dla kroku 4.5. Jeśli temperatura jest równa, DNA nie ulegnie denaturacji, a sondy nie będą hybrydyzować, a żaden sygnał nie zostanie uzyskany z halo DNA FISH.
  6. Umieść denaturowane szkiełko w 50 ml lodowatego 70% etanolu na 5 minut i przeprowadź serię etanolu 90%, 95% i 100% w temperaturze pokojowej przez 5 minut każda.
  7. Suszyć na powietrzu na płycie grzewczej
  8. Obsługuj bezpośrednio znakowane sondy całkowitego chromosomu ludzkiego zgodnie z instrukcjami producenta. Do tych eksperymentów użyliśmy farb 1, 13, 15, 17 i 18 z całego ludzkiego chromosomu. Ponadto w tym eksperymencie wykorzystano sondy genowe CCND1 i CTNNA1.
    UWAGA: Zarówno sondy całego chromosomu, jak i sondy specyficzne dla genu BAC zostały znakowane biotyną-11-dUTP i wykryte przez streptawidynę sprzężoną z cyjaniną 3 (Cy3). W przypadku sond do malowania chromosomów wykonanych metodą (DOP-PCR) i DNA BAC znakowanego przez translację nicka, będą one od tego momentu określane jako sondy DNA w protokole i traktowane w następujący sposób.
  9. Denaturować sondę DNA (farbę całego chromosomu lub sondę specyficzną dla genu) w temperaturze 75 °C przez 10 minut w gorącym bloku lub łaźni wodnej.
  10. Podgrzewaj sondy DNA w temperaturze 37 °C przez 30 minut w gorącym bloku lub łaźni wodnej przed pipetowaniem 10 μl na odpowiednie szkiełko.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, aby zablokować powtarzające się sekwencje chromosomów. Jeśli nie zostanie to wykonane, w DNA Halo FISH mogą powstawać niespecyficzne sygnały.
  11. Nałożyć sondę na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 21 mm x 21 mm i uszczelnić za pomocą cementu gumowego.
  12. Inkubować szkiełka podstawowe przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze hybrydyzacyjnej.
    UWAGA: Nawilżone komory hybrydyzacyjne mogą być wykonane z pudełek kanapkowych, które zawierają kilka warstw zwilżonej tkanki i podniesionej platformy zbudowanej z pociętych plastikowych pipet o pojemności 10 ml, na których można oprzeć szkiełka. Jest pokryty folią aluminiową, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
  13. Ostrożnie usuń cement gumowy za pomocą kleszczy.
  14. Inkubować szkiełka w 50 ml 50% (v/v) formamidu, 2x SSC, roztworze o pH 7,0, który został wstępnie podgrzany do 45 °C przez trzy 5-minutowe inkubacje.
    UWAGA: Pozwolić, aby szkiełko nakrywkowe odpadło od szkiełka w pierwszej inkubacji w 50% (v/v) formamidzie, 2x SSC, roztworze pH 7,0. Zapobiega to uszkodzeniom preparatu DNA Halo, które mogłyby zostać spowodowane "odciągnięciem" szkiełka nakrywkowego. Szkiełka można mieszać w buforze poprzez chwytanie kleszkami, aby ułatwić odczepienie szkiełka nakrywkowego.
  15. Następnie umieścić szkiełka w 50 ml 0,1 x SSC, roztworu o pH 7,0, który został wstępnie podgrzany do 60 °C, ale umieszczony w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C. Inkubować przez 5 minut i zastąpić bufor jeszcze dwa razy inkubacją trwającą 5 minut.
  16. Umieścić szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 4x SSC, roztworu pH 7,0 w temperaturze pokojowej i inkubować przez 15 minut z trzema zmianami buforu.
  17. Nałóż 100 μl 4% roztworu BSA, 4x SSC na każde szkiełko i nałożyć na nie kawałek folii parafinowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zapobiega to nieswoistemu wiązaniu przeciwciała.
  18. Aby wykryć znakowaną sondę (biotyna-16-dUTP), inkubować ze 100 μl 1:200 (wykonanego w 1% BSA, 4x SSC) streptawidyny-Cy3 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta z rozcieńczeniami przeciwciał i rozcieńczeniem testu przed eksperymentem, aby upewnić się, że wytwarzany jest dobry sygnał
  19. Umieścić szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 4x SSC (0,5% Tween-20) roztworu pH 7,0 w temperaturze pokojowej i inkubować przez 15 minut z trzema zmianami buforu. Na tym etapie można zamontować szkiełka, jak pokazano w kroku 4.21, jeśli immunofluorescencja nie jest wymagana.
  20. Jeśli wymagany jest status proliferacyjny komórek utworzonych w aureole DNA, należy wybarwić przeciwciałami anty-pKi67 po etapach FISH, przed zamontowaniem lub wybarwieć w celu uzyskania włączonego BrdU.
    1. Umyj szkiełka 3 razy przez 5 minut każdy w 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie zablokuj 4% NCS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Nałożyć 200 μl niezbędnego przeciwciała pierwszorzędowego (króliczego przeciwciała anty-ludzkiego pKi67; mysi anty-BrdU) na szkiełko, nałożyć na nie pasek folii parafinowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    3. Myć szkiełka 3 razy przez 5 minut w 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w 200 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorochromem (pKi67: TRITC przeciwko królikowi świni; BrdU: osioł anty-mysz Cy3). Wykonaj jeszcze 3 5-minutowe prania z PBS. Wszystkie rozcieńczenia należy wykonać przy użyciu 1% (v/v) NCS w PBS w zakresie sugerowanych przez producentów rozcieńczeń.
  21. Zamocuj szkiełka w 20 μl mocownika zawierającego DAPI i nałóż na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm.

5. Telomery PNA RYBA

  1. Do wykrywania telomerów należy użyć zestawu telomerów PNA FISH - FITC; procedurę należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Zabieg powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
  2. Zanurz szkiełka w trójbuforowym roztworze soli fizjologicznej (TBS, pH 7,5) na 2 minuty, a następnie umieść w 3,7% formaldehydzie (w TBS; v/v) dokładnie na 2 minuty
    UWAGA: Roztwór TBS zawiera 10-30% trometamolu i 10-30% chlorowodorku 2-amino-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu. Może to spowodować poważne podrażnienie oczu i skóry, dlatego należy nosić rękawice i okulary ochronne/ochronę twarzy. Stosować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
  3. Umyj szkiełka w słoiku Coplin dwa razy z TBS przez 5 minut każde.
  4. Zanurz szkiełka w roztworze do obróbki wstępnej na 10 minut, a następnie umyj je dwukrotnie TBS przez 5 minut na pranie.
  5. Następnie przeprowadź szkiełka przez lodowatą serię etanolu składającą się z 50 ml etanolu o stężeniu 70%, 85% i 95% (v/v) przez 2 minuty na stężenie. Następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
  6. Nałóż 10 μl Telomere PNA Probe/FITC (lub Cy3) w zależności od wyboru zabarwienia znacznika fluorescencyjnego, na każde szkiełko podstawowe i nakładkę okładkową z szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować w piekarniku nagrzanym do 80 °C przez 5 minut, a następnie umieścić w ciemności na około 1 godzinę
    UWAGA: Telomere PNA Probe/FITC zawiera 6-100% formamidu, który powoduje poważne podrażnienie oczu i jest teratogenny, więc może poważnie zaszkodzić nienarodzonemu dziecku. Jeśli kobieta jest w ciąży lub podejrzewa, że jest w ciąży, powinna unikać pracy z formamidem. Formamid powinien być stosowany w dygestoriach LEV i należy nosić odpowiednią ochronę oczu lub twarzy.
  7. Aby usunąć szkiełka nakrywkowe, zanurz je w "roztworze do płukania" na 1 minutę, a następnie umieść w "roztworze do mycia" na 5 minut w temperaturze 65 °C.
    UWAGA: Roztwór myjący zawiera 1-5% eteru polioksyetylenowooktylofenylowego i 1-5% chlorku sodu. Jest to i może spowodować poważne uszkodzenie oczu. Upewnij się, że podczas obchodzenia się z roztworem myjącym noszone są okulary lub ochrona twarzy.
  8. Inkubacja przepuszcza 50 ml lodowatego etanolu (70%, 85% i 95% (v/v)) przez 2 minuty na stężenie, a następnie suszy na powietrzu. Po wyschnięciu zamontować na szkiełku z mocowaniem zawierającym DAPI i nałożyć szkiełko nakrywkowe.

6. Przechwytywanie i analiza obrazu

  1. Aby zobrazować halo DNA i terytoria chromosomów, użyj mikroskopu epifluorescencyjnego (np. mikroskopu Leica DM4000), rejestrując obrazy za pomocą obiektywu olejowego HC PL FLUOTAR 100X/1.30 i kamery DFC365FX
    2. .
  2. Przechwytuj obrazy w skali szarości i definiuj kolor dla każdego przechwyconego kanału, aby umożliwić pseudokolorowanie obrazów. W tym eksperymencie użyto komercyjnego oprogramowania (np. oprogramowania LAS AF w wersji 4.5.0). Poszczególne kanały kolorów zostały wyeksportowane jako pliki TIFF.
  3. Analizuj obrazy za pomocą programu do przetwarzania obrazów Java Fiji ImageJ. Prześlij obraz, naciskając Plik i Otwórz.
  4. Wczytaj osobne kanały obrazu lub podziel obraz kompozytowy na osobne kanały w skali szarości, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały. Wybierz kanał obrazu i kliknij opcję Obraz | Dostosuj, a następnie wybierz Jasność i kontrast. Zmień odpowiednio i powtórz z innymi kanałami.
  5. Utwórz maskę jądra resztkowego, wybierając kanał barwiony DAPI przedstawiający jądro. Kliknij Obraz | Dostosuj, a następnie wybierz opcję Próg. Pojawi się okno dialogowe, w którym można zmienić próg, zaznacz pole Ciemne tło. Zmieniaj, aż pozostałe jądro zostanie usunięte, a następnie naciśnij Zastosuj i zamknij okno dialogowe.
    UWAGA: Spowoduje to utworzenie maski binarnej na podstawie intensywności pikseli, z białymi pikselami pokazującymi obszary zainteresowania i czarnymi pikselami pokazującymi tło. Powtórz tę samą procedurę na kanale sondy.
  6. Użyj zaznaczenia odręcznego, aby obrysować obwód jądra resztkowego, a następnie kliknij przycisk Edytuj i wyczyść na zewnątrz. Nałóż kanał sondy na jądro resztkowe. Można to zrobić, naciskając Obraz| Kolor | Scalanie kanałów.
  7. Aby ustawić skalę pomiaru w obrazie ImageJ, narysuj linię na pasku skali lub między punktami dwóch znanych odległości. Przejdź do opcji Analizuj i naciśnij Ustaw skalę. W oknie dialogowym dodaj długość odległości i kliknij przycisk OK. Aby zmierzyć odległości, narysuj linię między mierzonymi punktami i kliknij przycisk Analizuj | Miara. Spowoduje to przeniesienie wartości odległości do okna danych.
  8. Zmierz najjaśniejszą intensywność DAPI, ponieważ zbiega się ona ze środkiem jądra. Na tej podstawie należy zmierzyć odległość od centrum jądra do najdalszej krawędzi terytorium chromosomu (CTE). Zmierz odległość środka jądra atomowego od krawędzi jądra (NE).
  9. Upewnij się, że wyniki są przedstawione jako stosunek CTE/NE. Tutaj odległość od centrum jądra do każdej najdalszej krawędzi terytorium chromosomu (CTE) jest dzielona przez odległość od centrum jądra do każdej odpowiedniej krawędzi jądrowej (NE). Należy to wykonać na co najmniej 50 jądrach. Może to być przedstawione jako wykres słupkowy lub pudełkowy.
  10. W przypadku analizy telomerów należy przeanalizować co najmniej 30 jąder na zestaw danych. Obrazy mogą być analizowane za pomocą Fiji ImageJ lub ręcznie, aby policzyć liczbę telomerów w jądrze resztkowym i w halo DNA. BrdU lub pKi67 umożliwiły różnicowanie jąder proliferujących (BrdU/piK67+) i starzejących się/spoczynkowych (BrdU/pKi67-). Dane mogą być przedstawiane na wykresach słupkowych ze słupkami błędów odpowiadającymi błędowi standardowemu średniej (SEM).
  11. Użyj testu t-Studenta (niesparowanego), aby statystycznie porównać wyniki z p> 0,05 uznanym za istotne.

Wyniki

Ta metoda przygotowania halo DNA pomogła nam w dążeniach do określenia różnic w zachowaniu genomu w komórkach młodych i starych, a także w komórkach pochodzących z chorób przedwczesnego starzenia z aberracyjnymi białkami nukleoszkieletu15. Rysunek 1 przedstawia przykłady halo DNA, na których można dostrzec krawędź pozostałego jądra, DNA pozostające wewnątrz jądra resztkowego oraz nieprzypisane DNA, które rozwinęło się do otaczającego obszaru, tworząc halo DNA. Przedstawiono na nim również analizę pokazującą, w jaki sposób uzyskuje się jądro resztkowe, oraz pomiary NE i CTE. Możliwe jest rozróżnienie między komórkami proliferującymi a nieproliferującymi poprzez włączenie znakowanego nukleotydu, takiego jak BrdU, gdy komórki znajdują się w fazie S, lub zastosowanie diagnostycznego markera proliferacji anty-pKi67, który ujawnia jąderka oraz obszary heterochromatyny w komórkach G117,18. Komórki pierwotne hodowane w wysokim stężeniu surowicy bez osiągnięcia konfluencji, które są negatywne pod kątem markerów proliferacji, uznaje się za senescencyjne. Komórki pierwotne hodowane w niskim stężeniu surowicy lub takie, które stały się konfluencyjne, tzn. zahamowane kontaktowo, a są negatywne pod kątem markerów proliferacji, uznaje się za spoczywające (quiescent) i zdolne do ponownego wejścia w cykl proliferacyjny przy zapewnieniu odpowiednich składników odżywczych i warunków. Możliwość rozróżnienia między komórkami Ki67-dodatnimi a Ki67-ujemnymi pozwoliła nam określić różnice między proliferującymi, spoczywającymi i senescencyjnymi ludzkimi fibroblastami skóry. Rysunek 2 przedstawia halo DNA proliferujących ludzkich fibroblastów skóry, wytworzone z komórek, do których podczas replikacji DNA włączono BrdU (mechanizm ten nie zachodzi w komórkach nieproliferujących), a następnie zabarwione przeciwciałem anty-BrdU. Barwienie markerem proliferacji przeciwciałem anty-pKi67 jest również widoczne na Rysunku 2. Jest to stabilny antygen, który przetrwa protokół FISH, zatem barwienie może być wykonane po FISH i przed montowaniem preparatu. W związku z tym komórki proliferujące są dodatnie (czerwone) dla BrdU i anty-pKi67 (czerwone) w lewej kolumnie, natomiast komórki nieproliferujące, a konkretnie komórki senescencyjne na Rysunku 2, są przedstawione w prawej kolumnie. Zielone sygnały to poszczególne telomery ujawnione za pomocą zestawu telomere PNA FISH/FITC. Połączenie immunofluorescencji z halo DNA umożliwia analizę w różnych stanach komórkowych, co pokazano na Rysunku 2 podczas badania komórek proliferujących, spoczywających i senescencyjnych. W zależności od wybranego przeciwciała można badać inne stany, takie jak różnicowanie, uszkodzenia DNA w wyniku napromieniowania itp.

Terytoria chromosomów mogą być również wizualizowane w obrębie halo DNA przy użyciu metody FISH. Ze względu na sposób przygotowania preparatu, który umożliwia rozwijanie się DNA z jąder, kształt terytorium chromosomowego może ulec zaburzeniu, a w halo DNA może znajdować się mniejsza lub większa ilość chromosomu, w zależności od zakotwiczenia genomu wewnątrz pozostałości jądra i jego struktur. Rycina 3 przedstawia panel halo DNA, w którym poszczególne chromosomy zostały uwidocznione za pomocą specyficznych sond do malowania całych ramion chromosomów (czerwony) dla chromosomów 1, 13, 17 i 18. Przeciwciało anti-pKi67 (zielony) zostało użyte do oznaczenia komórek proliferujących, a jego brak w tej samej kulturze, na tym samym szkiełku, wskazuje na komórki senescencyjne. Z obrazów oraz danych przedstawionych jako CTE/NE wyraźnie wynika, że mały, ubogi w geny chromosom 18 posiada niewiele punktów przyczepienia i rozwija się dalej w halo DNA, z dala od pozostałości jąder, znajdując się znacznie dalej od centrum pozostałości jąder niż pozostałe chromosomy. Jest to jednak prawdą również w przypadku chromosomu 1. Dzięki zastosowaniu markera proliferacji anti-pKi67 możliwe było porównanie komórek proliferujących z komórkami senescencyjnymi w obrębie tej samej kultury i na tym samym szkiełku; analiza ta wykazała, że chromosomy w tych dwóch bardzo różnych stanach komórkowych nie różnią się znacząco od siebie pod względem przyczepienia do pozostałych struktur jądrowych.

Interesujące jest to, że geny wykazują również statystycznie istotne różnice między komórkami proliferującymi a starzejącymi się pod względem pozostawania w jądrze resztkowym lub lokalizacji w halo DNA. Rysunek 4 demonstruje to za pomocą loci genowych wyznaczonych przez znakowane sondy BAC w kolorze czerwonym oraz przeciwciała anty-Ki67 w kolorze zielonym. Po przygotowaniu halo DNA nie stwierdzono istotnych różnic w lokalizacji genów między komórkami proliferującymi a starzejącymi się. Jednak w halo DNA znajduje się istotnie więcej loci kateniny alfa 1 CTNNA1 niż loci cykliny D1 CNDD1, których jest bardzo mało. Rysunek 5 przedstawia preparaty halo DNA z telomerami w kolorze zielonym. Tło pozostawiono celowo na wysokim poziomie, aby umożliwić wizualizację sygnałów telomerowych w obrębie halo DNA. W tym zestawie danych uwzględniono komórki spoczynkowe, tj. komórki poddane 7-dniowemu głodzeniu surowiczemu; interesujące jest to, że w komórkach spoczynkowych występuje istotnie więcej nieprzymocowanych telomerów zlokalizowanych w halo DNA niż w komórkach proliferujących i starzejących się. Na Rysunku 5a można zaobserwować proporcję telomerów w halo DNA, szczególnie na obrazie „Experiment 2”. Odpowiada to Rysunkowi 5b, gdzie średni procent telomerów w halo DNA wynosi około 17% w komórkach spoczynkowych. Istnieją dowody na to, że nie wszystkie telomery w komórkach starzejących się są widoczne, ponieważ niektóre z nich mogą być bardzo krótkie.

Ta metoda tworzenia halo DNA pozwoliła nam skutecznie badać zmiany w oddziaływaniach genomowych w obrębie jąder komórek chorobowych15. Rysunek 6 przedstawia różnice w przytwierdzeniu chromosomów w pierwotnych fibroblastach kontrolnych oraz w komórkach chorobowych z typowym (mutacja laminy A) i atypowym zespołem progerii Hutchinsona-Gilforda, wykazujących ekspresję innej izoformy SUN1 i brak mutacji laminy A19. Chromosomy 1 i 13 wykazują statystycznie istotne różnice w przytwierdzeniu w obrębie pozostałych jąder w porównaniu z kontrolnymi halo DNA. Rysunek 6b koreluje położenie całego terytorium chromosomu z pozostałym jądrem i halo DNA. Wartości równe 1 lub mniejsze wskazują, że chromosom znajduje się w obrębie pozostałego jądra, natomiast wartości powyżej 1 wskazują na obecność chromosomów lub ich fragmentów w obrębie halo DNA.

Podsumowując, podkreśla to użyteczność metody HALO-FISH w badaniu interakcji genomicznych całych chromosomów, konkretnych genów i telomerów w różnych warunkach wpływających na cykl komórkowy (proliferację, spoczynek i starzenie się) lub w komórkach chorobowo zmienionych, np. w liniach komórkowych progerii i nowotworów. Różnice w interakcjach między tymi stanami sugerują, że nukleoszkielet odgrywa istotną rolę w regulacji kluczowych procesów wewnątrz jądra komórkowego.

Halo DNA, jądro szczątkowe; obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący NE, wyniki analizy spektralnej CTE.
Rycina 1: Ekstrahowane jądro HDF wykazujące jądro szczątkowe i halo DNA oraz przegląd metody analizy. (a) Jądro HDF przygotowane za pomocą testu halo DNA i przeciwbarwione DAPI. Intensywnie zabarwione jądro szczątkowe pokazuje DNA zakotwiczone w cyto-szkielecie jądrowym, otoczone przez niezakotwiczone DNA, które tworzy halo DNA. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Kanał niebieski rejestruje jądro zabarwione DAPI i otaczające je DNA. Jądro szczątkowe zostaje wyselekcjonowane i usunięte przy użyciu programu ImageJ. Strzałka przedstawia odległość od centrum jądra do krawędzi jądra szczątkowego (NE). (c) Kanał czerwony pokazuje sygnał sondy. (d) Obraz oznaczony jako „Result” jest wynikiem nałożenia kanału czerwonego na obraz z kanału niebieskiego; pozwala to wyznaczyć odległość od centrum jądra do najdalszej krawędzi terytorium chromosomowego (CTE). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza proliferacji i starzenia się komórek; mikroskopia fluorescencyjna, barwienie Anti-BrdU, Anti-pKi67.
Rycina 2: Przygotowanie halo DNA z telomerycznym PNA FISH na proliferujących i starzejących się HDF. Telomeryczny PNA FISH na komórkach HDF poddanych analizie halo DNA. Sygnały telomerów są widoczne na zielono (FITC), pozostałe DNA oraz halo DNA zostały zabarwione DAPI (niebieski), a proliferujące jądra wykryto przy użyciu przeciwciał anti-BrdU lub anti-pKi67 metodą pośredniej immunofluorescencji na czerwono (TRITC). Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna, analiza chromosomów, barwienie pKi67, proliferacja, wykres słupkowy starzenia.
Rysunek 3: Interakcje nukleoszkielet-chromosom i analiza z wykorzystaniem testu halo DNA. (a) 2D-FISH z sondami specyficznymi dla chromosomów 1, 13, 15, 17 i 18 przeprowadzony na HDF poddanych preparatyce halo DNA. Całe chromosomy zostały zabarwione na czerwono (Cy3), a jądra przebadano pod kątem pKi67, aby określić, czy są one proliferującymi, czy starzejącymi się. Komórki proliferujące (pKi67+) zaznaczono na zielono (FITC), natomiast komórki starzejące się pozostały niezabarwione (pKi67-), tj. nie wykryto sygnału zielonego. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Zakotwiczenie chromosomów przez nukleoszkielet w proliferujących i starzejących się HDF, które poddano HALO-FISH. Pomiary przedstawiają stosunek krawędzi terytorium chromosomu (CTE) znajdującej się najdalej do odpowiadającej jej krawędzi jądra (NE) dla chromosomów 1, 13, 15, 17 i 18 w komórkach proliferujących (pKi67+) i starzejących się (pKi67-). Słupki błędów reprezentują ± SEM. (c) Zmodyfikowany wykres pudełkowy przedstawiający stosunek krawędzi terytorium chromosomu (CTE) do odpowiadającej jej krawędzi jądra (NE) specyficznych chromosomów w jądrach pKi67+ i pKi67-. Q1 = dolny kwartyl; Min = najniższa odnotowana wartość; Med = mediana; Max = maksymalna odnotowana wartość; Q3 = górny kwartyl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie DNA komórek proliferujących i senescencyjnych, obrazy mikroskopowe, wykres ekspresji genów (CCND1, CTNNA1).
Rycina 4: Interakcje specyficzne dla genów w komórkach HDF z wykorzystaniem techniki HALO-FISH. (a) Jądra z wyekstrahowanym halo DNA poddano hybrydyzacji z sondami specyficznymi dla genów (CCND1 oraz CTNNA1) w celu zbadania ich zakotwiczenia w błonie jądrowej (NM) w komórkach proliferujących i senescencyjnych. Sygnały genowe przedstawiono w kolorze czerwonym (Cy3), natomiast przeciwciała anty-pKi67 wyznaczają komórki proliferujące, a sygnał ten jest widoczny w kolorze zielonym (FITC). Na obrazie CCND1 dla komórek proliferujących pozostałość jądra znajduje się wewnątrz białego okręgu, a przestrzeń między białym a zielonym okręgiem przedstawia halo DNA. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Porównanie sygnałów specyficznych dla genów CCND1 oraz CTNNA1 pomiędzy pozostałością jądra a halo DNA, a także pomiędzy komórkami proliferującymi i senescencyjnymi. Słupki błędu reprezentują ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna jąder komórkowych, ekspresja Ki-67 i wykres słupkowy statusu proliferacji.
Rycina 5: Analiza halo DNA w spoczywających komórkach HDF z zastosowaniem PNA-FISH telomerów. (a) Stan spoczynku HDF indukowano poprzez hodowlę w medium z niską zawartością surowicy przez 7 dni. Przeprowadzono analizę halo DNA, a metoda PNA-FISH umożliwiła wizualizację telomerów za pomocą sygnału FITC (zielony); pozostałe jądro oraz otaczające je halo DNA przeciwbarwiono DAPI (niebieski). Komórki barwiono również przeciwciałem anty-pKi67, aby upewnić się, że jądra nie proliferują. Procedurę powtórzono w dwóch niezależnych seriach. Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Porównanie średniego procentu telomerów zlokalizowanych w obrębie halo DNA w proliferujących, senescencyjnych i spoczywających komórkach HDF. Słupki błędu reprezentują ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie i analiza komórkowa; mikroskopia fluorescencyjna DNA (po lewej), porównawczy wykres słupkowy (po prawej).
Rycina 6: Badanie zakotwiczenia całych chromosomów w nukleoszkielecie w komórkach HGPS z wykorzystaniem HALO-FISH26. (a) Jądra kontrolnych HDF (2DD), klasycznego HGPS (AG06297) oraz atypowego HGPS typu 2 (AG08466) poddano przygotowaniu halo DNA, a następnie 2D-FISH z użyciem sond malujących całe chromosomy dla chromosomów 1, 13, 15 i 17. Całe chromosomy przedstawiono w kolorze zielonym (FITC), a DNA zbarwiono DAPI (niebieski). Powiększenie = x 100; pasek skali 10 µm. (b) Położenie chromosomów wewnątrz ekstrahowanych jąder określono poprzez pomiar stosunku średniej krawędzi terytorium chromosomu (CTE) do krawędzi jądra (NE). Stosunek powyżej 1 wykazuje, że najdalej wysunięta CTE znajduje się poza odpowiadającą jej NE w obrębie halo DNA, natomiast stosunek poniżej 1 oznacza, że najdalej wysunięta CTE znajduje się w obrębie NE w pozostałości jądra. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

SkładnikiObjętośćμL)
bufor do PCR 5XDOP10
mieszanina dNTP (bez dTTP) (2 mM)5
dTTP(2mM)2
Biotyna-16-dUTP lub Digoksigenina-11-dUTP10
DOPprimer(20μM)5
polimeraza Taq DNA (1 U/μL)1
woda do PCR stopnia czystości analitycznego12
Szablon5

Tabela 1: Tabela przedstawiająca składniki i objętości DOP-PCR dla reakcji 1x

Krok Cykle Temp. (stopnie Celsjusza)Czas 
Denaturacja wstępna 1953 min
Denaturacja 349820 s
Przyłączanie starterów 621 min
Rozszerzenie 7230 s
Ostateczna elongacja 1725 min 
Chłodzenie 4Przytrzymać

Tabela 2: Tabela przedstawiająca cykle, temperatury i profile czasowe DOP-PCR.

SkładnikObjętość(μL)
10x bufor NT (0.5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA)5
0.1 M beta-merkaptoetanol5
10X stężenie nukleotydów (0.5 mM dATP, 0.5 mM dCTP, 0.5 mM dGTP, 0.5 mM dTTP, 0.5 mg/ml biotin-16-dUTP)5
Dnase I (1 ng/ml)2
DNA polimeraza I5U na μg DNA
Matryca DNA (1 μg)1
Woda traktowana DEPCdo 50 μL

Tabela 3: Tabela przedstawiająca składniki i objętości reakcji translacji nacięć dla jednej sondy.

Dyskusja

Metoda halo DNA jest doskonałą metodą z wyboru podczas analizy interakcji między nukleoszkieletem a genomem, jednak istnieją pewne krytyczne kroki, których również należy przestrzegać. Jednym z najważniejszych parametrów jest optymalizacja gęstości wysiewu komórek. Jeśli komórki staną się nadmiernie zlewne, aureole DNA będą nakładać się na sąsiednie komórki, uniemożliwiając przeprowadzenie analizy. CSK i ekstrakcyjne muszą być zawsze świeże w dniu użycia, a spermina, spermidyna i digitonina są dodawane do buforu ekstrakcyjnego na końcu procesu przygotowania, aby utrzymać ich aktywność biologiczną. W przypadku wykonywania Halo-FISH niezwykle ważne jest użycie prawidłowej temperatury denaturacji halo DNA, aby umożliwić późniejszą hybrydyzację sondy lub farby.

Mikroskopia elektronowa została wykorzystana do wizualizacji matrycy jądrowej, przy czym zidentyfikowano struktury nitkowate20. Jednak mikroskopia elektronowa jest ograniczona, ponieważ nie można łatwo wydedukować asocjacji matrycy z chromatyną. Rzeczywiście, metoda DNA Halo jest bardziej wszechstronna w porównaniu z mikroskopią elektronową, ponieważ można badać określone geny, chromosomy i stany komórek. Ponadto prowadzona jest analiza proteomiczna białek macierzy jądrowej21,22. Ta metoda jest dobra do porównywania składników macierzy jądrowej, szczególnie podczas porównywania chorych komórek, jednak nie zapewnia rozkładu przestrzennego i przyłączeń podkreślonych przez standardową technikę DNA Halo.

Testy DNA Halo mają ograniczenia. Po pierwsze, podczas ekstrakcji matrycy można to wykonać tylko na stałych komórkach, więc obrazowanie na żywo nie jest możliwe. Chociaż metoda DNA Halo jest stosunkowo szybka i łatwa do wykonania, cały proces może być czasochłonny, jeśli weźmie się pod uwagę hodowlę komórkową, generowanie sondy, Halo-FISH i analizę.

Przechwytywanie obrazów DNA Halo i HALO-FISH przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej znacznie poprawiłoby rozdzielczość sond i przeciwciał specyficznych dla DNA. Ponadto, ponieważ fluorochromy mogą być łatwiej rozdzielone spektralnie, możliwe jest użycie wielu sond DNA w jednym eksperymencie, dostarczając jeszcze więcej informacji. Ulepszenia w technikach biologii molekularnej, takie jak wychwytywanie konformacji chromosomów (3C), zostały wykorzystane do określenia interakcji loci genów i analizy organizacji przestrzennej chromatyny w komórce. Testy DNA Halo i 3C mogą być połączone, termin znany jako M3C23, ponownie demonstrując zdolność adaptacji techniki DNA Halo.

Przedstawione tutaj oryginalne dane mają na celu zademonstrowanie możliwości badania zachowań genomu oraz sposobu prezentacji tych danych. Dzięki tym danym wykazaliśmy, że możliwe jest określenie znaczących różnic w przyłączaniu genomu za pomocą (1) sond do malowania chromosomów, w tym badaniu ujawniając, że chromosom 18 jest najmniej przyłączonym chromosomem spośród analizowanych (Figura 3); (2) Loci genów ze znacznymi różnicami między dwoma loci genów i (ryc. 4) (3) telomerami, które są słabiej przyłączone w komórkach w stanie spoczynku w porównaniu z komórkami proliferacyjnymi i starszymi (ryc. 5). Jesteśmy w stanie rozróżnić komórki proliferujące i nieproliferujące poprzez obecność markera proliferacji antygenu Ki67, który jest białkiem nierozpuszczalnym, więc pozostaje z resztkowymi jądrami lub wykorzystując włączenie nukleotydów do podświetlenia komórek, które przeszły przez fazę S w określonym czasie (ryc. 2). Technika ta umożliwiła nam również analizę zachowania genomu w komórkach, które są naruszone w swoich nukleoszkieletach, tj. komórkach laminopatii, a tutaj i w Bikkul i in., 2018 ujawniamy, że genom może być mniej ściśle związany w porównaniu z komórkami kontrolnymi i może zostać przywrócony podczas leczenia specyficznymi lekami, które łagodzą efekt mutacji laminy A w klasycznych komórkach HGPS15. Jednak pokazujemy tutaj nowe dane dla nietypowych komórek AGO8466 HGPS, pozbawionych mutacji laminy A, ale zawierających niezwykłą formę białka kompleksu LINC SUN119 , w którym chromosom 13 jest mniej ściśle związany (ryc. 6).

HALO-FISH to unikalna metoda, która umożliwia badanie interakcji genomowych z nukleoszkieletem w połączeniu z immunofluorescencją pośrednią w celu rozwiązania białek, które nie zostały usunięte z procedury ekstrakcji. Wykazano, że nukleoszkielet jest modyfikowany w różnych chorobach, takich jak niektóre typy nowotworów19 oraz znaczenie niektórych białek związanych z nukleoszkieletem jako biomarkerów diagnostycznych24,25. Tak więc technika ta odgrywa ważną rolę w badaniu wpływu nukleoszkieletu na organizację/dezorganizację chromatyny w chorobie 15,24,25,27 i nie ogranicza się do komórek ludzkich, z sondami do malowania chromosomów od innych zwierząt, można zastosować ten sam protokół DNA-halo28.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Profesorowi Michaelowi Bittnerowi za miły dar w postaci sond do malowania ramion chromosomów. Firma LG otrzymała wsparcie w ramach finansowanego ze środków UE projektu EURO-Laminopathies oraz Funduszu Badawczego Brunel Progeria.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10XPBS Thermo Fisher Scientific10388739Służy do tworzenia aureoli DNA
5-bromo-2′-deoksy-urydyna   Sigma-AldrichB5002-100MGznakowany nukleotyd
5-fluoro-2′-deoksyurydynaSigma-AldrichF0503-100MGznakowany nukleotyd
Agar TechnicalThermo Fisher Scientific15562141Izolacja DNA klonów BAC
AgarozaSigma-AldrichA939-50GSprawdź rozmiar produktu DOP-PCR i translacji nicków
Nietypowy typ 2 HGPS fibroblasty (AG08466)Coriell InstituteAG08466Linia komórkowa
Bacto tryptoneThermo Fisher 16269751 naukoweIzolacja DNA klonów BAC
Biotin-16-dUTPRoche Diagnostics 11093711103Znakowane nukleotydy
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378-25GIzolacja DNA klonów BAC
Klasyczne fibroblasty zespołu progerii Hutchinsona-Gilforda (HGPS) (AG06297) Coriell InstituteAG0297Linia komórkowa
Słoik CoplinThermo Fisher Scientific12608596Mieści 5 szkiełek lub 8 szkiełek tyłem do siebie
Cot-1DNA Thermo Fisher Scientific15279011Blok niespecyficznej hybrydyzacji w
wodzie uzdatnionej HALO FISH DEPCSigma-Aldrich693520-1LIzolacja DNA klonów BAC
Siarczan dekstranuSigma-AldrichS4030Mieszanina hybrydyzacyjna
DigitoninaSigma-AldrichD141Składnik buforu ekstrakcyjnego
Digoxigenin-11-dUTP Sigma-Aldrich11093088910znakowane nukleotydy
Osioł anty-mysz Cy3Jackson Laboratory715-165-150Przeciwciało wtórne
EDTASigma-AldrichE6758Składnik buforu ekstrakcyjnego
EtanolSkładnik buforu ekstrakcyjnego
EtanolSigma-Aldrich443611Wytrącanie sondy i HALO FISH
Płodowy układ bydlęcyThermo Fisher Scientific26140079Surowica do hodowli komórkowych
FormamidThermo Fisher Scientific105235252D RYBA z aureolami DNA
Wełna szklanaSigma-Aldrich18421Kolumna wirująca
Plemniki śledziaSigma-AldrichD7290Sonda wytrącająca
HXP™ Lampa (lampa mikroskopu metalohalogenkowego)OSRAMHXP-R120W45C VISPrzechwytywanie obrazu halo DNA
Kwas solnyThermo Fisher Scientific10313680Czyszczenie szkiełek mikroskopowych
IzopropanolSigma-AldrichI9516-25MLIzolacja DNA klonów BAC
Zestaw KAPA HiFi PCR ZestawKAPA BiosystemsKK2103PCR
Mikroskop fluorescencyjny Leica DM4000 z kamerą DFC365 FX i oprogramowaniem do akwizycji obrazów LAS AF (wersja: 4.5.0).Leica MicrosystemsPrzechwytywanie obrazu halo DNA
agaru Luria-Bertani Thermo Fisher Scientific13274843Izolacja DNA klonów BAC
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266Składnik buforu CSK
Metanol ThermoFisher Scientific10284580Czyszczenie i sterylizacja szkiełek mikroskopowych
Mysie przeciwciało anty-BrdUBD PharmingenB2531-100ULWizualizacja BrdU
Surowicydla noworodkówThermo Fisher Scientific16010159Surowica do hodowli komórkowych i odczynnik blokujący
Zestaw do translacji Nicka WodaInvitrogen
PCRSigma-Aldrich693520-1LPCR i izolacja DNA klonów BAC Startery
PCRSigma-Aldrich
P1851Składnik CSK i
Octan potasuSigma-AldrichP1190-100GIzolacja DNA klonów BAC
QuadriPERM® 4 X 12SARSTEDT94.6077.307Kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych, polistyren z czterema komorami. Ma hydrofobową powierzchnię, jest sterylny, niepirogenny/endotoksyczny i niecytotoksyczny.
Królicze przeciwciało anty-Ki67Sigma-AldrichZRB1007-25ULMarker proliferacji
Rnaza ASigma-AldrichR6513Izolacja DNA klonów BAC
Cement kauczukowyHalford's1018362D RYBA DNA halos
Sephadex G-50Sigma-AldrichS6022-25GKolumna wirowa
Octan soduSigma-AldrichS2889Opady sondy
Chlorek soduSigma-AldrichS5886Składnik CSK, ekstrakcyjnych i SSC
Cytrynian soduSigma-AldrichC8532Składnik buforu SSC
Dodecylosiarczan sodu L3771-100GIzolacja DNA klonów BAC
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045-500GIzolacja DNA klonów BAC
SpermidineSigma-AldrichS2626Składnik buforu ekstrakcyjnego
SpermineSigma-AldrichS4264Składnik buforu ekstrakcyjnego
Streptawidyna-Cy3 Amersham Life Sciences Ltd, Laboratorium Naukowe Dostarczapa43001Przeciwciało sondy
SacharozaSigma-AldrichS0389Składnik buforu CSK
SacharozaSigma-AldrichS0389Bufor CSK + A66: D68
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost & tradeThermo Fisher Scientific12372098Szkiełka mikroskopowe: grubość 1 mm, długość 76 mm, szerokość 26 mm. Niepowlekane.
Anty-królik trzody chlewnej TRITC Dako
TELO-PNA FISH KITAgilent DakoK532511-8Wyznaczanie telomerów
Tris-HClSigma-AldrichT3253-100GBufor kolumnowy
Triton™ X-100Sigma-AldrichT9284Składnik buforu CSK
TryptoneThermo Fisher Izolacja DNA10158962klonów BAC
Tween-20Sigma-AldrichP9416- 100MLDetergent
Uchwyt Vectashield zawierający DAPIVector LaboratoriesH-12002D RYBA z aureolami DNA
Sondy chromosomów całych ludzkichCalbiochem2D FISH of DNA halo
Ekstrakt drożdżowyThermo Fisher Scientific10108202Izolacja DNA klonów BAC
klasy RURY Sigma-Aldrichekstrakcyjnych DNA

Bibliografia

  1. Berezney, R., Coffey, D. S. Identification of a nuclear protein matrix. Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).
  2. Haaf, T., Ward, D. C. High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes. Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).
  3. Parra, I., Windle, B. High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization. Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).
  4. Senger, G., et al. Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization. Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).
  5. Florijn, R. J., et al. High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes. Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).
  6. Elcock, L. S., Bridger, J. M. Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres. Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).
  7. Heiskanen, M., et al. Visual mapping by fiber-FISH. Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).
  8. Bensimon, A., et al. Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface. Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).
  9. Michalet, X., et al. Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies. Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).
  10. Wilson, R. H., Coverley, D. Relationship between DNA replication and the nuclear matrix. Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).
  11. Wilson, R. H. C., Coverley, D. Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos. Science Reports. 7 (1), 6475(2017).
  12. Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).
  13. Tandara, M., et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).
  14. Repping, S., et al. The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number. Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).
  15. Bikkul, M. U., et al. Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts. Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).
  16. Telenius, H., et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).
  17. Bridger, J. M., et al. Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells. Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).
  18. Sales Gil, R., Vagnarelli, P. Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).
  19. Bikkul, M. U., et al. Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform. Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).
  20. Jackson, D. A., Cook, P. R. Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat. EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).
  21. Albrethsen, J., et al. Unravelling the nuclear matrix proteome. Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).
  22. Mika, S., Rost, B. NMPdb: Database of nuclear matrix proteins. Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).
  23. Gavrilov, A. A., et al. of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).
  24. Sjakste, N., et al. Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis. Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).
  25. Leman, E. S., Getzenberg, R. H. Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).
  26. Volpi, E. V., Bridger, J. M. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).
  27. Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. Human Interphase Chromosomes. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).
  28. Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues. BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci
Posted by JoVE Editors on 6/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. The Authors section was updated from:

Lauren S. Godwin1
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

to:

Lauren S. Godwin1
Emily Roberts2
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Przeglądaj więcej artykułów

Przygotowanie halo DNAterytoria chromosomowewizualizacja telomerówmapowanie loci genóworganizacja jądraprzytwierdzianie do nukleoszkieletumikroskopia epifluorescencyjnamalowanie chromosomówimmunofluorescencja
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.