Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja i sekcja udomowionego mózgu świni

26.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62030

⸱

25 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Animal Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Division of Nutritional Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje technikę usuwania mózgu świni w całości i sekcji kilku obszarów mózgu, które są powszechnie badane w neurobiologii.

Streszczenie

Użycie świni jako przedklinicznego i możliwego do przetłumaczenia modelu zwierzęcego zostało dobrze udokumentowane i zaakceptowane przez pola badawcze badające układy sercowo-naczyniowe, żołądkowo-jelitowe i żywienie, a świnia jest coraz częściej używana jako duży model zwierzęcy w neurobiologii. Co więcej, świnia jest akceptowanym modelem do badania rozwoju neurologicznego, ponieważ wykazuje wzorce wzrostu i rozwoju mózgu podobne do tego, co występuje u ludzi. Jako rzadziej spotykany model zwierzęcy w neurobiologii, zabiegi chirurgiczne i preparacyjne na świniach mogą nie być tak znane lub dobrze praktykowane wśród badaczy. Dlatego ustandaryzowany protokół wizualny szczegółowo opisujący spójne metody ekstrakcji i sekcji może okazać się cenny dla badaczy pracujących ze świnią. Poniższy film przedstawia technikę usuwania mózgu świni przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej kory i pnia mózgu oraz omawia metody preparowania kilku powszechnie badanych obszarów mózgu, w tym pnia mózgu, móżdżku, śródmózgowia, hipokampa, prążkowia, wzgórza i przyśrodkowej kory przedczołowej. Celem tego filmu jest dostarczenie naukowcom narzędzi i wiedzy niezbędnej do konsekwentnego przeprowadzania ekstrakcji i sekcji mózgu czterotygodniowej świni.

Wprowadzenie

Świnia została dobrze udokumentowana i zaakceptowana jako przekładalny model zwierzęcy do badań nad układami sercowo-naczyniowymi1, układy żołądkowo-jelitowe2, odżywianie3,4, cukrzyca5, toksykologia6, oraz techniki chirurgiczne7. Użycie świni w neurobiologii zaczyna rosnąć, ponieważ wyszukiwanie w PubMed słów kluczowych "model zwierzęcy mózgu świni" daje czterokrotnie więcej wyników z lat 1996-2005 niż w poprzednim okresie 10 lat8, a obecnie nawet więcej wyników. Głównym powodem, dla którego popularność modelu świni rośnie, są jego podobieństwa we wzroście, strukturze i funkcji mózgu w porównaniu z ludźmi. W porównaniu z ludzkim mózgiem, mózg świni wykazuje podobny wzór wirowy, unaczynienie i rozmieszczenie istoty szarej i białej9. Co więcej, mózg świni był wykorzystywany w procedurach neuroobrazowania, wywoływaniu zapisu potencjału oraz w ustalaniu technik neurochirurgicznych8,9. Jednak w przeciwieństwie do innych modeli zwierzęcych, świnie i ludzie doświadczają okołoporodowego wzrostu mózgu, w przeciwieństwie do gwałtownego wzrostu przed lub po urodzeniu. Po urodzeniu mózg człowieka i świni waży odpowiednio około 27 i 25 procent masy mózgu dorosłego osobnika, w porównaniu z mózgiem szczura, który waży 12 procent masy mózgu dorosłego człowieka, a mózgiem małpy rezus 76 procent masy ciała dorosłego osobnika10.

Jednym z powodów, dla których świnia dopiero powoli staje się modelem zwierzęcym dla neurobiologii, jest to, że wielu badaczy nie zna tego zwierzęcia w tym kontekście. Badacze mogą nie zdawać sobie sprawy z jego potencjalnych zastosowań w terenie lub mogą nie znać odpowiednich technik wymaganych do korzystania z takiego modelu. Ponieważ wykorzystanie świni jako modelu biomedycznego i przedklinicznego zyskuje na znaczeniu i jest wykorzystywane w neurobiologii, konieczne jest ustanowienie ustandaryzowanych procedur usuwania tkanek, aby zapewnić dokładne porównanie danych z badań. Chociaż sekcja zwłok i techniki chirurgiczne z udziałem mózgu świni zostały opublikowane gdzie indziej11,12,13, istnieje potrzeba prostych i ustandaryzowanych protokołów pobierania tkanki mózgowej świni, zwłaszcza do wykorzystania w testach biochemicznych. W związku z tym celem tego filmu jest dostarczenie wiedzy niezbędnej do umożliwienia naukowcom przeprowadzenia standaryzowanej ekstrakcji i sekcji mózgu. Ten film ilustruje jedną z właściwych technik usuwania mózgu świni przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej kory mózgowej i pnia mózgu, a następnie przegląd metod preparowania kilku kluczowych obszarów mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Illinois w Urbana-Champaign

UWAGA: Przed eutanazją, świnia została znieczulona poprzez wstrzyknięcie domięśniowe z kombinacją telazol:ketamina:ksylazyna (50,0 mg chlorowodorku tiletaminy plus 50,0 mg chlorowodorku zolazepamu odtworzonego w 2,50 ml ketaminy HCl (100 g/L) i 2,50 ml ksylazyny (100 g/L) i podawana w dawce 0,06 mg/kg m.c.). Po znieczuleniu świnia została poddana eutanazji poprzez dosercowe podanie pentobarbitalu sodu (390 mg/ml podawane w dawce 1 ml/5 kg masy ciała). W przypadku sekcji mózgu zaleca się, aby metoda eutanazji była wybrana w oparciu o pożądaną procedurę analityczną tkanki. Metoda eutanazji powinna powodować jak najmniejsze uszkodzenia mózgu.

1. Ekstrakcja mózgu świni

  1. Po humanitarnej eutanazji odetnij świnię poprzez nacięcie powyżej karku, między pierwszym a drugim kręgiem (odpowiednio atlasem i osią).
  2. Zamocuj głowę w unieruchomionym imadle stołowym zmodyfikowanym tak, aby zawierało kolce. Przed kontynuowaniem upewnij się, że głowa jest całkowicie unieruchomiona.
    1. Za pomocą skalpela wykonaj strzałkowe cięcie wzdłuż linii środkowej czaszki, które ciągnie się do tylnej części głowy.
    2. Wykonaj drugie (poprzeczne) cięcie z tyłu głowy.
    3. Wykonaj trzecie (poprzeczne) cięcie na tylnym końcu pyska i w linii z oczami. Przetnij skórę jak najdalej od czaszki, aby zapewnić łatwy dostęp do czaszki.
  3. Za pomocą piły do kości wykonaj dwa nacięcia od przodu do tyłu po bokach do linii środkowej, rozciągające się od oczu do wierzchołka krzywizny czaszki. Skoś piłę w kierunku linii środkowej i naciąć na tyle głęboko, aby przebić czaszkę.
    1. Powtórz powyższy proces na prostopadłych bokach, tworząc prostokątne "okno" w czaszce.
  4. Za pomocą haka do mięsa podważ prostokątną część czaszki. Zacznij od umieszczenia haczyka w jednym z rogów sekcji i naciskaj w górę, aby poluzować kawałek czaszki. Należy uważać, aby umieścić hak na mięso tylko na poziomie czaszki, aby zapobiec przypadkowemu przebiciu tkanki mózgowej.
  5. Jeśli na mózgu pozostaną jakiekolwiek warstwy opon mózgowych, użyj kleszczy i nożyczek (lub alternatywnie skalpela), aby delikatnie usunąć warstwy bez nacinania mózgu.
  6. Użyj skalpela, aby odciąć mięśnie i tłuszcz w tylnej części głowy, odsłaniając tylną część czaszki.
    1. Wykonaj dwa poprzeczne nacięcia wzdłuż tylnej części czaszki. Pamiętaj, aby nie ciąć tkanki mózgowej.
    2. Zabezpiecz głowę, kładąc twardą dłoń na pysku i naciskaj do tyłu, aby oderwać tylną część czaszki, odsłaniając móżdżek.
  7. Zdejmij głowę z imadła stołowego i połóż na macie chirurgicznej.
  8. Użyj długiego, smukłego narzędzia, takiego jak koniec skalpela, aby usunąć mózg. Odwróć głowę i delikatnym ruchem nabierającym, aby wydostać mózg z jamy czaszki bez uszkadzania powierzchni mózgu.
    UWAGA: Konieczne będzie przecięcie nerwów czaszkowych w celu usunięcia mózgu. Rób to delikatnie i nie próbuj wyciągać mózgu na siłę. Mózg wypadnie samoistnie, gdy zostanie prawidłowo i całkowicie odłączony od czaszki i kręgosłupa.

2. Sekcja mózgu świni

UWAGA: Pomocne może być użycie atlasu mózgu lub przewodnika po sekcjach włókien14 jako wizualnej reprezentacji podczas procedur preparacji. Upewnij się, że wypreparowane próbki tkanek są odpowiednio przechowywane zgodnie z potrzebami specyficznymi dla projektu po usunięciu każdej próbki (opisane bardziej szczegółowo poniżej). Ponadto należy pamiętać, że na potrzeby tego filmu wszystkie pokazane obszary mózgu zostały wypreparowane z prawej półkuli, ale może się to różnić w zależności od laboratorium w zależności od celów eksperymentalnych.

  1. Aby usunąć pień mózgu (głównie rdzeń), wykonaj koronalne cięcie ogonowe do móżdżku.
  2. Aby usunąć móżdżek, wykonaj cięcie koronalne z tyłu kory. Wyizoluj pożądane obszary (np. robak, kłaczek itp.) móżdżku z tej próbki. Pamiętaj, aby nie dołączać do tej próbki żadnych części pnia mózgu.
  3. Oddziel dwie półkule mózgu, wykonując cięcie w połowie strzałki wzdłuż podłużnej szczeliny. Wykonaj to cięcie jako ruch ciągły, aby zapobiec uszkodzeniu kory.
  4. Aby usunąć śródmózgowie, wypreparuj żądaną ilość tkanki tylko brzusznie do górnej i dolnej części szyjki.
  5. Aby usunąć hipokamp, umieść koniec skalpela w tylnej części ciała modzelowatego i delikatnie rozwałkuj hipokamp, wykonując ruch "J", zaczynając od tylnej części ciała modzelowatego; cały róg hipokampa ma kształt "fasoli".
  6. Prążkowie (przede wszystkim pokazane jest jądro ogoniaste) to szaro-biały obszar w paski materii tuż poniżej ciała modzelowatego i przed hipokampem. Skoś skalpel i usuń ten obszar, odsłaniając prążkowaną tkankę po usunięciu.
  7. Aby usunąć przyśrodkową korę przedczołową, wypreparuj tkankę od zakrętu czołowego do ciała modzelowatego, usuwając najbardziej przyśrodkową część tego odcinka. Prawa kora powinna pozostać po usunięciu przyśrodkowej kory przedczołowej.
  8. Aby usunąć wzgórze, usuń strukturę przypominającą bańkę w środku środkowej powierzchni mózgu i rostralną do śródmózgowia. Wzgórze ma kulisty kształt i będzie wyglądać na nieco ciemniejsze niż otaczająca tkanka.

3. Po sekcji

  1. Po zakończeniu sekcji należy odpowiednio zabezpieczyć próbki tkanek do kolejnych analiz. Pominięcie tego kroku spowoduje znaczną autolizę i degradację w ciągu zaledwie 20 minut.
  2. Pozostaw każdy obszar mózgu nienaruszony w momencie sekcji, jeśli zostaną przeprowadzone analizy strukturalne, lub zmiel tkanki, aby stworzyć jednorodną próbkę tkanki przed konserwacją. Typowe metody konserwacji próbek tkanek mózgowych obejmują kriokonserwację i utrwalanie chemiczne przy użyciu środków sieciujących15.
  3. W przypadku standardowych testów laboratoryjnych (np. ekspresji genów lub białek) należy zanurzyć w ciekłym azocie lub roztworach, które stabilizują materiał genetyczny przed długotrwałym przechowywaniem w temperaturze -80 °C, aby zapewnić wygodne i opłacalne metody konserwacji.
  4. Jeśli utrzymanie struktury tkanki jest priorytetem, należy zachować tkanki mózgowe za pomocą tradycyjnych metod utrwalania (np. przy użyciu utrwalaczy na bazie aldehydu do sieciowania białek), bez lub z perfuzją zwierzęcia lub narządu będącego przedmiotem zainteresowania przed sekcją tkanki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji opisano przykłady wyników uzyskanych po prawidłowym wyjęciu i sekcji mózgu 4-tygodniowego prosięcia. Rycina 1 przedstawia kształt poszczególnych obszarów mózgu, który może służyć jako pomoc podczas sekcji. Część pnia mózgu może pozostać w czaszce po usunięciu móżdżku (Rycina 1B). Można ją usunąć podczas izolowania pożądanego regionu móżdżku. Tabela 1 przedstawia średnią masę (średnia ± błąd standardowy średniej) dla każdego z wysekc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Techniki opisane w niniejszym dokumencie zostały opracowane dla świń w wieku około 4 tygodni. Bardzo ważne jest, aby wykonać te kroki natychmiast po humanitarnej eutanazji świni, aby zapewnić zachowanie integralności struktury tkanki mózgowej, zwłaszcza przy rozważaniu kolejnych testów biochemicznych. Pomocne jest korzystanie z atlasu lub przewodników po sekcjach włókien16 podczas pierwszej nauki technik. Zaleca się, aby eksperymentator przećwiczył kilka ekstrakcji i sekcji mózgu przed pobraniem p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Jimowi Knoblauchowi i Martinowi-Boothowi Hodgesowi z College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences Information Technology and Communication Services za ich doświadczenie w nagrywaniu, nagrywaniu i edycji audio i wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#22 Ostrza skalpela do uchwytów #4 TedPella, inc.549-4S-22
11 1/2" Piła do kości SatterleeLeica Biosystems38DI13425
5 1/2" Łamacz czaszek z końcówką dłuta (hak do mięsa)Leica Biosystems38DI37636
5-calowe imadło warsztatowe Pony29050
Nóż rzeźniczy 25cmVictorinox5.7403.25Naostrz przed użyciem
CM40 Light Duty Drop Kute zaciski CBessey00655BC3120
Diamentowy nóż do szlifowania ShaperSzef kuchni s Choice436-3
Uchwyt ostrza skalpela ze stali nierdzewnej Shandon #4ThermoScientific5334
Kleszczyki do tkanekHenry Schein101-5132
Winylowa podkładka preparcyjnaCarolina629006

Bibliografia

  1. Hughes, H. C. Swine in cardiovascular research. Laboratory Animal Science. 36 (4), 348-350 (1986).
  2. Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
  3. Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
  4. Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
  5. Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
  6. Lehmann, H. The minipig in general toxicology. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science. 25, 59-62 (1998).
  7. Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
  8. Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
  9. Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
  10. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 311, 79-83 (1979).
  11. Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
  12. Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
  13. Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511(2017).
  14. Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
  15. McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146(2019).
  16. Félix, B., et al. Stereotaxic atlas of the pig brain. Brain Research Bulletin. 49, 1(1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekcja mózgu świniwyodrębnianie mózgumodel dużego zwierzęciatechniki neuronaukoweizolacja obszarów mózgusekcja móżdżkuprzyśrodkowa kora przedczołowausuwanie hipokampasekcja wzgórzakonserwacja mózgu
Ekstrakcja i sekcja udomowionego mózgu świni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.