Artykuł metodologiczny

Mysi model ksenoprzeszczepu Ommaya do badania terapii ukierunkowanej na chorobę opon mózgowo-rdzeniowych

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62033

⸱

29 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuro-Oncology, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 2Department of Tumor Biology, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 3Department of Comparative Medicine, University of South Florida, 4Department of Breast Oncology, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 5Department of Cancer Physiology, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 6Department of Drug Discovery, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 7Department of Medical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy model mysiego ksenoprzeszczepu, który funkcjonalnie przypomina rezerwuar Ommaya u pacjentów. Opracowaliśmy mysi Ommaya w celu zbadania nowych metod leczenia powszechnie śmiertelnej choroby opon mózgowo-rdzeniowych.

Streszczenie

Choroba opon mózgowo-rdzeniowych (LMD) jest rzadkim typem przerzutów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Najczęstszymi nowotworami powodującymi LMD są rak piersi i płuc oraz czerniak. Pacjenci, u których zdiagnozowano LMD, mają bardzo złe rokowanie i na ogół przeżywają tylko kilka tygodni lub miesięcy. Jedną z możliwych przyczyn braku skuteczności terapii ogólnoustrojowej przeciwko LMD jest niemożność osiągnięcia terapeutycznie skutecznych stężeń leku w płynie mózgowo-rdzeniowym z powodu nienaruszonej i stosunkowo nieprzepuszczalnej bariery krew-mózg (BBB) lub bariery krew-płyn mózgowy w poprzek splotu naczyniówkowego. Dlatego bezpośrednie podawanie leków dooponowo lub dokomorowo może pokonać te bariery. Grupa ta opracowała model, który pozwala na skuteczne dostarczanie środków terapeutycznych (tj. leków, przeciwciał i terapii komórkowych) w sposób przewlekły oraz wielokrotne pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego w celu określenia stężeń leku i docelowej modulacji w płynie mózgowo-rdzeniowym (gdy mikrośrodowisko guza jest ukierunkowane u myszy). Model ten jest mysim odpowiednikiem zbiornika Ommaya kompatybilnego z rezonansem magnetycznym, który jest stosowany klinicznie. Ten model, który jest przymocowany do czaszki, został oznaczony jako "Murine Ommaya". Jako terapeutyczny dowód słuszności koncepcji, przeciwciała ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu receptora 2 (klon 7.16.4) zostały dostarczone do płynu mózgowo-rdzeniowego za pośrednictwem mysiego Ommaya w celu leczenia myszy z LMD z ludzkiego receptora naskórkowego czynnika wzrostu 2-dodatniego raka piersi. Murine Ommaya zwiększa efektywność dostarczania leków za pomocą miniaturowego portu dostępowego i zapobiega marnotrawstwu nadmiaru leku; nie zakłóca pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego do badań molekularnych i immunologicznych. Mysi Ommaya jest przydatny do testowania nowych terapii w eksperymentalnych modelach LMD.

Wprowadzenie

Choroba opon mózgowo-rdzeniowych (LMD) to agresywne późne stadium przerzutów do OUN, w którym komórki nowotworowe uzyskują dostęp do płynu mózgowo-rdzeniowego i infiltrują powierzchnię mózgu i rdzenia kręgowego1. Najczęstsze nowotwory powodujące LMD to nowotwory piersi i płuc, a także czerniak2. LMD powoduje szereg objawów neurologicznych i przedmiotowych, takich jak bóle głowy, porażenie nerwów czaszkowych, sztywność karku i radikulopapie. Rokowanie dla pacjentów z LMD jest na ogół bardzo złe (średni czas przeżycia mierzy się w tygodniach) i jest powszechnie śmiertelne3,4,5,6,7. Leczenie chirurgiczne, radioterapia i chemioterapia ogólnoustrojowa ma charakter paliatywny. Terapia ogólnoustrojowa LMD może zakończyć się niepowodzeniem z powodu niewystarczającej penetracji leku do płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną barierę krew-mózg lub płyn mózgowo-rdzeniowy krwi przez splot naczyniówkowy1.

Dlatego podawanie leków przeciwnowotworowych (np. leków i terapii opartych na przeciwciałach, w tym inhibitorów punktów kontrolnych i terapii komórkowych) bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego, może przezwyciężyć to ograniczenie8. Dostęp do płynu mózgowo-rdzeniowego i pobieranie próbek od pacjentów jest możliwe dzięki zbiornikowi Ommaya, który jest wszczepiany pod skórę głowy. Urządzenie to pozwala na podawanie leków przeciwnowotworowych (np. metotreksatu i trastuzumabu), a także pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego do badań diagnostycznych (np. diagnostyki cytologicznej LMD w celu monitorowania odpowiedzi na leczenie) bez wykonywania nakłucia lędźwiowego. Mysi zbiornik Ommaya został zaprojektowany tak, aby naśladować te używane klinicznie. Zbiornik wymaga montażu portu dostępowego i części dystansowych oraz modyfikacji techniki kaniulacji myszy, co pozwala na trwałe utrzymanie urządzenia w stanie nienaruszonym przez cały czas trwania badania leku. Urządzenie to zostało oznaczone jako "Murine Ommaya".

W przeciwieństwie do techniki osmotycznej pompy infuzyjnej, która wymaga przygotowania nadmiaru płynu w celu wstępnego wypełnienia pustej przestrzeni w rurze i ciągłego infuzji poprzez częste wstrzyknięcia9, Mysia Ommaya minimalizuje marnotrawstwo roztworów leków. Pozwala na skuteczne podawanie wielu pojedynczych dawek leków w dowolnym momencie w małych ilościach (3-7 μl) do płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą strzykawki Hamiltona, miniaturowego portu dostępowego i automatycznego wstrzykiwacza. W czasie rzeczywistym skuteczność badanych leków przeciwko LMD można określić za pomocą obrazowania. Stosując to podejście, różne chemioterapie, przeciwciała i immunoterapie komórkowe (jako pojedyncze lub skojarzone leki) mogą być testowane pod kątem LMD, aby przełożyć wyniki in vivo na racjonalne strategie leczenia pacjentów. Aby jeszcze bardziej poprawić możliwości obrazowania modelu LMD opartego na ksenoprzeszczepie pochodzącym od pacjenta (PDX), podjęto współpracę z producentem w celu opracowania kompatybilnej z obrazowaniem metodą rezonansu magnetycznego (MRI) wersji mysiego Ommaya, która nie wymaga montażu i jest gotowa do użycia. Zdolność MRI jest korzystna, szczególnie w przypadku modeli PDX, w których ilość krążących komórek nowotworowych (CTC) z płynu mózgowo-rdzeniowego jest czasami czynnikiem ograniczającym, a często gdy wstępne znakowanie CTC jest niewykonalne.

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół, który rozpoczyna się od wstrzyknięcia CTC w celu renderowania myszy za pomocą LMD. Mysia Ommaya jest następnie wszczepiana chirurgicznie i przeprowadza się wiele etapów leczenia farmakologicznego za pomocą Mysiego Ommaya. Jako dowód słuszności koncepcji do demonstracji, przeprowadzono porównanie równoległe in vivo, w którym dostarczono mysie przeciwciało receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (Her2) o nazwie klon 7.16.4 (ludzki odpowiednik trastuzumabu10. Przeciwciało jest ukierunkowane na komórki raka piersi Her2+ za pośrednictwem mysiego leku Ommaya (terapia ukierunkowana bezpośrednio lub dooponowa) lub przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (terapia ogólnoustrojowa). Wyniki wykazały, że myszy z LMD, które otrzymały bezpośrednią immunoterapię dooponową, żyły znacznie dłużej niż te leczone tą samą terapią ogólnoustrojowo. Przerzuty do OUN u myszy leczonych mysim produktem Ommaya uległy prawie całkowitej regresji po podaniu trzeciej dawki w trzecim tygodniu leczenia, co skutkowało poprawą przeżycia całkowitego.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Południowej Florydy (IS00005974).

1. Wstrzykiwanie CTC do płynu mózgowo-rdzeniowego w celu wygenerowania mysiego modelu LMD

  1. Przygotowanie CTC
    1. Obliczyć liczbę CTC potrzebną do wstrzyknięcia i przygotować zawiesinę jednokomórkową w stężeniu 1,0 ×10 4 komórek/μl w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Zawiesinę komórkową umieszczać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania zabiegu.
      UWAGA: W przypadku korzystania z linii komórkowych, które wymagają trypsynizacji, należy dwukrotnie umyć komórki sterylnym PBS w celu usunięcia trypsyny. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Jeśli używana jest duża kohorta (>50 myszy), należy ponownie przeliczyć komórki i zweryfikować żywotność komórek między wstrzyknięciami, aby upewnić się, że na mysz podawana jest stała liczba komórek.
  2. Zabieg przedoperacyjny
    1. Wstrzyknąć myszowi podskórnie 1 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (Bup-SR).
      UWAGA: Nie wstrzykiwać w obszar proponowanego nacięcia; Wybrać miejsce wstrzyknięcia z dala od łopatki.
    2. Znieczulij mysz 2-3% izofluranem, aż nie wykaże oznak odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby potwierdzić stan znieczulenia.
    3. Przygotuj mysz do zabiegu w miejscu oddalonym od obszaru operacyjnego. Przytnij miejsce operacji (tj. grzbietową powierzchnię czaszki) z wystarczającą powierzchnią graniczną, aby futro nie zanieczyściło miejsca nacięcia; Następnie nasącz miejsce bakteriobójczym środkiem antyseptycznym do skóry, działającym od środka miejsca do obrzeży, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Zastosuj sterylną serwetę lub sterylną obłogę z tworzywa sztucznego na podłożu samoprzylepnym, aby chronić miejsce operacji przed zanieczyszczeniem.
      UWAGA: Narzędzia należy wcześniej sterylizować w autoklawie, a końcówki ponownie sterylizować między zwierzętami za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi.
    4. Ogolić sierść na całej brzusznej powierzchni głowy i przygotować skórę za pomocą sterylnej techniki.
    5. Umieść nos ze zmodyfikowanym stożkiem nosowym w kształcie litery L aparatu stereotaktycznego, upewniając się, że nozdrza pozostają czyste i otwarte. Używając taśmy w poprzek brzusznych powierzchni obu małżowin usznych, delikatnie pociągnij skórę do przodu, aby przymocować ją do stożka nosa, a po zabezpieczeniu zegnij szyję pod kątem około 90°. Podawać 1,5% izofluranu w celu utrzymania znieczulenia.
      UWAGA: Prawidłowe ułożenie spowoduje, że obszar nacięcia zostanie przedstawiony w sposób umożliwiający łatwą identyfikację grzbietu ogonowego kości potylicznej.
    6. Ustaw tułów tak, aby grzbiet był utrzymywany na poziomie cisterna magna, a przy lekkim nacisku na ogon umieść taśmę u podstawy ogona, aby zabezpieczyć.
  3. Chirurgiczne wstrzyknięcie cisterna magna
    1. Z pełnym wyprostem szyi i zaczynając tuż między małżowinami usznymi, przesuń końcówki nożyczek chirurgicznych w dół, lekko naciskając na kość potyliczną.
      UWAGA: W tej pozycji środkowej zauważalne jest niewielkie wgłębienie, gdy końcówki nożyczek zanurzają się we wklęsłym obszarze nad cisterna magna.
    2. Wykonaj małe nacięcie linii środkowej o średnicy 3-5 mm tuż nad wklęsłością palpacyjną. Pobrać 5 μl zawiesiny komórek w temperaturze 1,0 × 104 komórek/μl (łącznie 5,0 ×10 4 komórek) do strzykawki Hamiltona o pojemności 30 g.
    3. Użyj kleszczyków z końcówkami z końcówkami 1-2 mm, aby delikatnie docisnąć cisterna magna. Wprowadź końcówki w pozycji zamkniętej i otwórz je, wywierając nacisk na oponę twardą w dół.
    4. Powtarzaj rozwarstwienie opisane w poprzednim kroku, aż błona opony twardej zostanie łatwo zidentyfikowana, a związane z nią naczynia krwionośne będą widoczne w odsłoniętym obszarze.
      UWAGA: Powstałe okienko iniekcji zapewnia, że naczynia krwionośne nie są uszkodzone podczas wprowadzania igły.
    5. Trzymając kleszcze otwarte, aby cofnąć otaczające mięśnie, wprowadź igłę 30 G bez rdzenia pod oponę twardą, aby uwidocznić skos. Upewnij się, że igła jest wprowadzona tylko tuż za samym skosem. Powoli wysunąć tłok strzykawki i dostarczyć komórki tuż poniżej opony twardej.
    6. Prawidłowo umieścić skos, aby obserwować wstrzyknięcie pod oponą twardą. Ostrożnie zastosuj technikę i użyj igły 30 G bez rdzenia, aby zapobiec uszkodzeniu membrany i zapewnić minimalny wyciek. W przypadku zauważenia wycieku delikatnie dociśnij aplikatorem z bawełnianą końcówką.
    7. Zamknij skórę, nakładając klips na ranę lub mikrokroplę kleju do skóry. Po pomyślnym wykonaniu wstrzyknięcia pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu na ciepłym kocu, obserwując je w sposób ciągły, aż będą w stanie utrzymać pozycję mostka i zademonstrować celowy ruch.
    8. Monitoruj myszy codziennie po operacji przez pierwszy tydzień. Jeśli mysz wydaje się odczuwać ból lub niepokój, należy ją leczyć podskórnym zastrzykiem karprofenu w dawce 10 mg/kg raz na 12 do 24 godzin przez okres do 5 dni w oparciu o konsultację weterynaryjną i dyrektywę. Pozwól myszom dojść do siebie i monitoruj je przez co najmniej 48 do 72 godzin przed przejściem do następnego kroku.
      UWAGA: Bup-SR, podawany zapobiegawczo, trwa do 72 godzin, więc dodatkowe leki przeciwbólowe zwykle nie są konieczne. Jednak w razie potrzeby zwierzętom zostaną dostarczone dodatkowe środki przeciwbólowe (jeśli są ospałe, nie jedzą, są potargane). Jeśli w miejscu operowanym pojawią się oznaki infekcji pooperacyjnej (tj. zaczerwienienie, obrzęk, tkliwość, allodynia, hiperalgezja, hiperpatia lub ropienie) lub jeśli mysz strzeże dotkniętego obszaru, należy poddać mysz eutanazji. Jeśli komórki rakowe zostaną pomyślnie wstrzyknięte do płynu mózgowo-rdzeniowego, LMD i progresja guza rozwiną się w OUN w ciągu 1 lub 2 tygodni (w zależności od typów CTC lub użytej linii komórkowej) (Rysunek 1).

2. Montaż i implantacja Mysiego Ommaya

  1. Przygotowanie stacji
    1. Zdezynfekuj powierzchnię stacji. Umieść niebieską powłokę na powierzchni i przygotuj wszystkie wysterylizowane narzędzia i materiały wskazane w Rysunek 2.
  2. Zabieg przedoperacyjny
    1. Zastosować środek przeciwbólowy (Bup-SR) i utrzymać sterylną technikę opisaną w punkcie 1.2.
  3. Chirurgiczne wszczepienie implantu mysiego Ommaya
    1. Zmontuj urządzenie do wstrzykiwań Murine Ommaya za pomocą miniaturowego portu iniekcyjnego o średnicy zewnętrznej 25 G (0,51 mm) i krążka dystansowego 1 mm. Użyj sterylnego kleju cyjanoakrylowego, aby zapewnić penetrację około 2,5 mm metalowej kaniuli do prawej półkuli mózgowej (Rysunek 3A-C).
      UWAGA: W tym laboratorium opracowano prototyp myszy Ommaya kompatybilny z MRI, który ma już obie części (miniaturowy port wtryskowy i przekładkę) wydrukowane w 3D razem jako pojedynczą jednostkę (Rysunek 3D). Wersja z pojedynczym urządzeniem została przetestowana za pomocą rezonansu magnetycznego i może zaoszczędzić czas, eliminując etap montażu.
    2. Znieczulaj mysz 2-3% izofluranem, aż nie pojawią się oznaki odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby potwierdzić stan znieczulenia.
    3. Ogolić całą brzuszną powierzchnię głowy futra i przygotować skórę zgodnie z techniką sterylną, jak opisano wcześniej w kroku 1.2.3. Umieścić mysz w aparacie stereotaktycznym ze stożkiem nosowym, aby kontynuować podawanie izofluranu podczas zabiegu; Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,5%. Delikatnie dokręć nauszniki, aby zabezpieczyć głowę, i nałóż smar do oczu, aby zakryć oczy myszy.
    4. Wykonaj małe nacięcie skóry (3 mm), a następnie rozwarstwienie leżących poniżej tkanek podskórnych, aby odsłonić czaszkę. Osusz czaszkę za pomocą aplikatora w sztyfcie nasączonego wodą wodorową z bawełnianą końcówką.
    5. Wywierć otwór w czaszce 0,5 mm z tyłu i 1,1 mm z boku bregmy - anatomiczny punkt na czaszce, w którym szew koronalny jest przecięty prostopadle przez szew strzałkowy (Rysunek 3A) - a także otwór zadziorowy 0,9 mm, aby odsłonić oponę twardą. Odsuń mikrowiertło na bok i delikatnie naciąć kość bezpośrednio otaczającą otwór zadziorowy przed włożeniem portu iniekcyjnego (głębokość około 2,5 mm), przymocowanego do czaszki za pomocą sterylnego kleju cyjanoakrylowego. Skonfiguruj szew wokół miejsca wstrzyknięcia za pomocą nylonowych szwów 4-0 o zerowej chłonności w przerywanym wzorze ściegu lub szwu sznurkowego torebki11.
    6. Trzymanie myszy pooperacyjnych w indywidualnych klatkach do rekonwalescencji po operacji.
      UWAGA: Możliwe jest, że mysi Ommaya może odpadnąć, gdy wiele myszy wyleczonych po operacji jest trzymanych w tej samej klatce, prawdopodobnie z powodu ciągłych interakcji manipulacyjnych. Zaleca się, aby myszy z implantami Murine Ommaya były trzymane pojedynczo (lub nie więcej niż 2 myszy w klatce) w trakcie badania skuteczności leku.

3. Leczenie Mysiego Ommaya

  1. Dawkowanie myszy za pomocą mysiego Ommaya
    1. Znieczulij mysz 2-3% izofluranem, aż nie pojawią się oznaki odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby potwierdzić utrzymanie znieczulenia.
    2. Uzyskaj dostęp do Mysiej Ommayi za pomocą adaptera do wstrzykiwań z portem i strzykawki Hamiltona. Za pomocą kleszczyków przytrzymaj górną część miniaturowego portu iniekcyjnego i delikatnie włóż adapter wtryskiwacza portu całkowicie do przegrody portu.
      UWAGA: Wtryskiwacz portu przebija przegrodę portu w sposób, który zmniejsza martwą przestrzeń do minimum i pozwala na kontrolowane wstrzykiwanie za pomocą zmotoryzowanej pompy strzykawkowej (Rysunek 4A). Ukierunkowane/nowatorskie terapie są wstrzykiwane z szybkością przepływu 1 μl/min w znieczuleniu. Leczenie należy podawać w określonych odstępach czasu (codziennie/co tydzień) przez określony czas (tygodnie/miesiące), zgodnie z uznaniem badacza.
      Optymalna jest objętość od 3 do 7 μl, ponieważ objętość < 3 μl jest zawodna, a objętość > 7 μl może powodować zbyt duże ciśnienie. Wielkość strzykawki Hamilton może wynosić od 10 do 100 μl, w zależności od liczby myszy w każdym ramieniu leczenia. Wstępne załadowanie odpowiedniej objętości do strzykawki Hamilton zapobiegnie wielokrotnej wymianie strzykawki, minimalizując w ten sposób błędy. Najlepiej jest przeznaczyć 1 strzykawkę Hamiltona na ramię zabiegowe.
    3. Po wykonaniu wstrzyknięcia odłącz mysz Ommaya od adaptera do wstrzykiwań z portem za pomocą kleszczy i umieść mysz z powrotem w klatce, aby doszła do siebie po znieczuleniu, jak opisano powyżej w kroku 1.3.7.
  2. eutanazja
    1. Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ) ze sprężonego źródła w zbiorniku. Wystaw myszy na rosnące stężenie CO2 (tj. należy zastosować szybkość przemieszczania od 10% do 30% objętości komory/min), aby uniknąć lub zminimalizować dyskomfort lub niepokój. Monitoruj myszy, aż do uzyskania pewności, że ustaną ruchy sercowo-naczyniowe i oddechowe.

Wyniki

U myszy całkowita objętość CSF wynosi około 35-40 µL, a jej produkcja odbywa się w tempie około 350 nL/min; wymiana następuje 12-13 razy na dobę12. W celu wizualizacji drogi wstrzyknięcia, za pomocą mysiego modelu Ommaya podano 2% Evans Blue, po czym odczekano 15 min i 30 min przed pobraniem mózgów do analizy. Barwnik skutecznie przeniknął do komór i mózgu w ciągu 15 min. W ciągu 30 min barwnik stał się widoczny w rdzeniu kręgowym (Rycina 4).

W ramach dowodu koncepcji myszom BALB/c wstrzyknięto do cysterny linii komórek raka piersi Her2+ TUBO znakowanych lucyferazą, a następnie wszczepiono mysie zbiorniki Ommaya. Około 1 tygodnia po iniekcji komórek nowotworowych u myszy zaczęła rozwijać się LMD. Myszy te leczono raz w tygodniu przez okres do 4 tygodni immunoterapią przeciwciałami przeciwko Her2, stosując terapię systemową poprzez iniekcje dosytnieniowe lub terapię dokanałową za pomocą mysiego zbiornika Ommaya (Ryc. 5A).

Chociaż myszy nieleczone padły do 19. dnia, wszystkie myszy, które otrzymały terapię dokanałową za pomocą zbiornika Ommaya dla myszy, przeżyły (P = 0.004). Do 4. tygodnia zaobserwowano całkowitą regresję guzów. W porównaniu do myszy leczonych terapią systemową, która odniosła umiarkowany sukces w leczeniu LMD, mysze otrzymujące terapię dokanałową wykazały znacznie dłuższy przeżywalność całkowitą (Rycina 5B).

Iniekcja CTC do cysterny wielkiej myszy; obrazowanie bioluminescencyjne; badanie migracji komórek nowotworowych.
Rycina 1: Iniekcja krążących komórek nowotworowych do cysterny wielkiej w mysim modelu ksenoprzeszczepu w celu badania choroby leptomeningealnej i przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego. (A) Ilustracja przedstawiająca położenie cysterny wielkiej oraz miejsce dostępu do płynu mózgowo-rdzeniowego, w którym za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzykuje się CTC. (B) Reprezentacyjny obraz IVIS myszy, u których rozwinęła się choroba leptomeningealna i przerzuty do ośrodkowego układu nerwowego (mózgu i wzdłuż rdzenia kręgowego) po 2 tygodniach od iniekcji krążących komórek nowotworowych. Komórki zostały znakowane genem reporterowym lucyferazy. Zwierzęta kontrolne, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, nie rozwinęły guzów (n = 3); eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Skróty: CTC = krążące komórki nowotworowe; IVIS = system obrazowania in vivo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Laboratoryjne stanowisko mikrochirurgiczne z instrumentami do precyzyjnych operacji, w tym z lupą.
Rysunek 2: Przykład konfiguracji stanowiska do implantacji zbiornika Ommaya u myszy. (1) Aparat do znieczulenia gazowego/parowar. (2) Sterylna niebieska draperia papierowa pokrywająca statyw stereotaktyczny. (3) Urządzenie stereotaktyczne (statyw/stół, pręty uszne, stożek nosowy). (4) Mikrowiertarka. (5) Lupa z oświetleniem. (6) Sterylne bawełniane aplikatory z pojemnikiem z jałowym roztworem soli fizjologicznej. (7) Nadtlenek wodoru. (8) Sterylizator koralikowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat mysiego systemu Ommaya i obrazy MRI, konfiguracja chirurgiczna, celowanie w bregma w badaniach mózgu.
Rysunek 3: Implantacja urządzenia Murine Ommaya. (A) Ilustracja ze strzałką wskazującą położenie bregma na czaszce oraz przybliżoną odległość, w której za pomocą mikrotrepanu wierci się otwór w czaszce (0.5 mm tylnie/1.1 mm bocznie) od bregma. (B) Montaż urządzenia Murine Ommaya poprzez połączenie metalowej kaniuli i 1 mm dystansera, który służy jako baza do przyklejenia urządzenia do czaszki. (C) Reprezentatywne zdjęcia myszy z implantowanymi urządzeniami Murine Ommaya; myszy te są monitorowane, aby upewnić się, że są żwawe, czujne i reaktywne przed wykonaniem jakichkolwiek iniekcji. (D) Przykład prototypu urządzenia Murine Ommaya kompatybilnego z obrazowaniem rezonansem magnetycznym oraz reprezentatywne obrazy MRI mózgu z implantami Murine Ommaya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment z iniekcją do mózgu myszy; wyniki sekcji; dyfuzja barwnika w czasie; analiza porównawcza.
Rycina 4: Iniekcja dokomorowa (do ośrodkowego układu nerwowego) z wykorzystaniem systemu Murine Ommaya. (A) Obraz iniekcji, uzyskanie dostępu do komory i ośrodkowego układu nerwowego za pomocą systemu Murine Ommaya. Myszy pozostają pod narkozą podczas iniekcji. W przykładzie system Murine Ommaya jest połączony z miniaturowym portem przymocowanym do uprzednio napełnionej strzykawki Hamiltona. Iniekcje są wykonywane za pomocą automatycznego wstrzykiwacza ustawionego na szybkość infuzji 1 µL/min i objętość 5-7 µL. Przedstawiono obraz mózgu myszy po iniekcji błękitu Evansa. Okrąg wskazuje miejsce przymocowania systemu Murine Ommaya. Na zewnętrznej powierzchni mózgu nie zaobserwowano wycieku barwnika. Przekrój poprzeczny mózgu wykazuje, że komory boczne zostały wypełnione barwnikiem; barwnik nie przeniknął do miąższu mózgu. (B) Obrazy mózgów myszy po 15 i 30 min od iniekcji barwnika błękitu Evansa. Barwnik przeniknął do mózgu (15 min) i zaczął krążyć w obrębie rdzenia kręgowego (30 min). Z 5 myszy 4 otrzymały barwnik do wizualizacji, a 1 służyła jako kontrola. Eksperyment powtórzono trzykrotnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie modelu mysiego raka piersi; porównanie leczenia, wykres przeżywalności; terapia systemowa a celowana.
Rycina 5: Immunoterapia celowana bezpośrednio z użyciem mysiego zaworu Ommaya zwiększa całkowitą przeżywalność myszy z chorobą leptomeningealną powiązaną z rakiem piersi. (A) Myszy BALB/c otrzymały wstrzyknięte komórki TUBO (mysia linia komórkowa raka piersi) dodatnie pod kątem ludzkiego receptora czynnika wzrostu naskórka 2, znakowane reporterem lucyferazy. Trzy dni po iniekcjach do cysterny wielkiej (cisterna magna) zaimplantowano mysie zawory Ommaya. U myszy zaczęła rozwijać się choroba leptomeningealna (LMD) 1 tydzień po iniekcji. Myszy z LMD leczono przeciwciałem przeciwko ludzkiemu receptorowi czynnika wzrostu naskórka systemowo poprzez iniekcje doprzewnowłyskową lub dokanałowo (zawór Ommaya) jako podejście celowane bezpośrednio. Iniekcje podawano raz w tygodniu przez maksymalnie 4 tygodnie. W porównaniu z myszami nieleczonymi, myszy otrzymujące immunoterapię przeżyły znacznie dłużej. U myszy z zaworem Ommaya w czwartym tygodniu nastąpiła całkowita regresja choroby i w efekcie myszy te zostały wyleczone. (B) Myszy te charakteryzowały się również istotnie lepszą medianą przeżycia (test Mantel-Cox; P = 0,004; n = 5 myszy na grupę terapeutyczną) oraz lepszą całkowitą przeżywalnością niż myszy z LMD leczone systemowo. Skróty: LMD = choroba leptomeningealna; IP = doprzewnowłyskowo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym przypadku mysi Ommaya został opisany jako wiarygodny model, który pozwala na wielokrotne podawanie leków przeciwnowotworowych do przestrzeni płynu mózgowo-rdzeniowego w przedklinicznych modelach LMD i innych chorób związanych z OUN. Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrano od myszy, gdy urządzenie było nadal podłączone bez przerwy. Ten model ksenoprzeszczepu terapii ukierunkowanej jest ważnym krokiem w opracowywaniu i testowaniu racjonalnych strategii leczenia LMD. Czas od wstrzyknięcia cisterna magna do początkowych objawów rozwoju LMD różni się w zależności od typu komórki nowotworowej. Przerzuty LMD i OUN zaczynają tworzyć się około 1 lub 2 tygodnie po inokulacji CTC. Jeśli zostanie użyta wysoce proliferacyjna linia komórek rakowych, możliwe jest, że przerzuty mogą wystąpić w ciągu <7 dni. W takim przypadku unaczynienie spowodowane wzrostem guza może czasami sprawić, że implantacja mysiego Ommaya będzie wyzwaniem. Jednym z rozwiązań tego problemu jest zmniejszenie liczby komórek rakowych do wstrzyknięcia do przestrzeni płynu mózgowo-rdzeniowego, co pozwala na wydłużenie czasu przed rozwojem guza. Co więcej, protokół ten został zoptymalizowany tak, aby wszczepić mysi Ommaya nie później niż 72 godziny po wstrzyknięciu cisterna magna, aby zapewnić myszom wystarczająco dużo czasu na powrót do zdrowia po operacji przed pierwszym zabiegiem. Naukowcy powinni obliczyć tempo wzrostu CTC w modelach ksenoprzeszczepów przed zaplanowaniem schematu leczenia.

Chociaż istnieją inne metody bezpośredniego podawania dokomorowego, takie jak użycie systemu pompy osmotycznej lub wstrzyknięcie bolusa do komory mózgowej (ICV), jak opisano wcześniej9, istnieje kilka zalet stosowania modelu Murine Ommaya. Na przykład wstrzyknięcie bolusa ICV jest wykonywane w jednej dawce, podczas gdy wstrzykiwacz Mysia Ommaya pozwala na podanie wielu dawek leczenia w dowolnym momencie, niezależnie od tego, czy jest podawany jako pojedynczy środek, czy jako terapie skojarzone. Pompa osmotyczna jest zaprojektowana tak, aby wytrzymać do 14, 28 lub 42 dni, zanim pompa będzie wymagała wymiany, a czasami częściej, jeśli używana jest mniejsza mysz z mniejszą pompą. Zmiana pompy osmotycznej wymaga zabiegu chirurgicznego, który zwiększa stres u myszy z guzem. Zamiennik Murine Ommaya nie jest konieczny w przypadku długotrwałych eksperymentów, o ile urządzenie pozostaje nienaruszone. Minimalizuje również potencjalną zmienność wynikającą z wymiany pompy9. Wszczepione mysie Ommayas eksperymentalnym myszom pozostały nienaruszone przez ponad 42 dni, a czas ten pozwolił na długotrwałe schematy leczenia.

Wcześniejsze odkrycia sugerują, że pulsacyjne, przerywane dawkowanie do płynu mózgowo-rdzeniowego ma lepszą skuteczność przeciwko LMD niż przedłużony proces dostarczania leku przez infuzję13. Niemożliwe byłoby wykonanie wielokrotnych iniekcji jednodawkowych przy użyciu systemu pompy osmotycznej. Nie ma łatwego sposobu na wypłukanie pozostałej uwięzionej cieczy po każdym wstrzyknięciu. Pompa osmotyczna jest również ograniczona do dostarczania mieszanin kompatybilnych lub pojedynczych leków i zazwyczaj wymaga większych objętości preparatu leku do ciągłej infuzji. W przeciwieństwie do tego, Mysia Ommaya jest przeznaczona do dokładnych mikroiniekcji już od 3 do 7 μl, bez konieczności uwzględniania martwej przestrzeni i nie ma ograniczeń co do rodzaju leków, które naukowcy mogą stosować, w tym terapii komórkami odpornościowymi. Mysia Ommaya minimalizuje również straty odczynników, jeśli dana próbka jest cenna i maksymalizuje wykorzystanie tego zasobu. W przypadku każdego schematu leczenia, który wymaga wielokrotnych dawek terapii przeciwnowotworowych, Mysz Ommaya jest łatwy w użyciu i istnieje minimalne ryzyko infekcji lub niepowodzenia chirurgicznego, z alternatywnymi podejściami polegającymi na wielokrotnym dostępie do płynu mózgowo-rdzeniowego chirurgicznie lub poprzez wielokrotne dostarczanie za pomocą igły. Mysia Ommaya zapewnia naukowcom elastyczność w dostosowywaniu stężeń leków i częstotliwości dawkowania oraz w ocenie docelowej modulacji i czasu trwania badania zgodnie z interesującymi ich badaniami.

Ograniczeniem mysiego Ommaya jest to, że naukowcy mogą mieć trudności z wszczepieniem urządzenia mniejszym myszom. Dlatego lepiej jest używać myszy w wieku co najmniej 8 do 10 tygodni. Możliwe jest, że mysi Ommaya odpadnie podczas próby leczenia, jeśli urządzenie nie zostanie przymocowane do czaszki podczas etapów implantacji, a klej zużywa się lub jeśli myszy majstrowały przy nim w sposób ścierny. Ten drugi scenariusz występuje częściej, gdy wiele myszy było trzymanych w tej samej klatce. W związku z tym zaleca się trzymanie nie więcej niż dwóch myszy z implantem Mysi Ommaya w klatce przez cały czas trwania harmonogramu leczenia. Protokół ten został zmodyfikowany w celu nałożenia sterylnego kleju cyjanoakrylowego na przekładkę, który okazał się najskuteczniejszym klejem do przylegania przekładki do powierzchni czaszki i zapobiegania odpadaniu mysiego Ommaya. Wyniki wykazały, że myszy z LMD odniosły korzyści z bezpośredniej terapii dooponowej za pośrednictwem mysiego Ommaya, ze zwiększonym całkowitym przeżyciem. Pojedyncze objętości mikrolitrów mogą być bezpiecznie podawane, omijając barierę krew-mózg, zmniejszając w ten sposób ilość preparatu lekowego. Co najważniejsze, myszy, które zostały wyleczone z przerzutów do OUN w badaniu immunoterapii przeciwciałami Her2, pozostały zdrowe.

Współpraca z producentem miała na celu opracowanie kompatybilnej z rezonansem magnetycznym wersji mysiego Ommaya dla modelu PDX LMD. Ponieważ ta prototypowa wersja ma wbudowaną przekładkę, nie jest wymagany montaż, co pozwala na lepsze przyleganie do czaszki. Ograniczeniem tego prototypu jest to, że chociaż urządzenie jest kompatybilne z rezonansem magnetycznym, generuje cień w miejscu, w którym urządzenie jest włożone, co zmniejsza widoczność obrazu do analiz ilościowych. Wersja kompatybilna z MRI jest dobrym alternatywnym narzędziem, gdy próbkowanie CTC ex vivo jest czynnikiem ograniczającym, a wstępne znakowanie komórek nie jest możliwe. Połączenie modelu ksenoprzeszczepu LMD i techniki Mysiej Ommayi jest korzystne dla badania skuteczności leków ukierunkowanych bezpośrednio z pominięciem bariery krew-mózg. Wyniki tych badań in vivo są klinicznie istotne dla projektowania racjonalnych strategii terapeutycznych dla pacjentów z LMD.

Oświadczenia

Peter Forsyth zasiada w radach doradczych firm Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen i Ziopharm. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Michele L. Danielson, Tricii Favors-Watson i reszcie zespołu medycyny porównawczej na Uniwersytecie Południowej Florydy za ich wsparcie techniczne i utrzymanie naszych zwierząt. Dziękujemy firmie Instech Laboratories, Inc. za ich wysiłek włożony we współpracę w oparciu o naszą prośbę o opracowanie kompatybilnego z rezonansem magnetycznym Murine Ommaya. Prace te są wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (dla K.S.M. Smalleya), Departamentu Obrony (DOD) W81XWH1910675 (dla B. Czernieckiego i P. Kalińskiego) oraz Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (dla P. Forsytha i D. Ducketta). Pomoc redakcyjną zapewniło Biuro Pisania Naukowego Moffitt Cancer Center przez dr Paula Fletchera i Daleya Druckera. Nie wypłacono żadnego wynagrodzenia poza normalnym wynagrodzeniem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Krążek dystansowy 1 mmAlzet, Durect Corporation#0008670Tylko krążek dystansowy
4-0 szew nylonowy ethilonDowolny dostawcanie dotyczy
Automatyczne pompy strzykawkoweHarvard Pompy strzykawkowe (lub dowolny dostawca)#70-4505Pompa 11
Elite Sterylizator koralikówBraintree Scientific Inc. (lub dowolny dostawca)#GER 5287-120VGerminator 500
Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu (Bup-SR)ZoopharmDEA kontrolowany
sterylny klej cyjanoakrylowyDowolny sprzedawca
System anestehsji do inhalacji gazowejVeteEquip#901812COMPAC5
Strzykawki mikrolitrowe Hamilton10, 25, 50 i 100 μ L30 G do iniekcji cisterna magna
Nadtlenek wodoruDowolny dostawcanie dotyczy
systemu obrazowania IVIS 200Suwmiarka Nauki przyrodniczenie dotyczy
Szkło powiększające ze światłemDowolny dostawcanie dotyczy
MicrodrillStoelting (lub dowolny dostawca)#51555M
Obrazowanie MRIBrukerBioSpecOpcjonalnie
Prototyp Murine Ommaya (kompatybilny z MRI)Instech Laboratories, Inc.#VAB620-25MRI-3.3
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Dowolny dostawcan/a0,1 mm sterylnie filtrowany
wtryskiwacz PinPortInstech Laboratories, Inc.#PNP3M-50
PinPortInstech Laboratories, Inc.#1-PNP3F28-50
Instrumenty chirurgiczne dla gryzoni (nożyczki, kleszcze)Instrument chirurgiczny Roboz (lub dowolny sprzedawca)
Urządzenie stereotaktyczneStoelting (lub dowolny sprzedawca)#51730M
Sterylny niebieski papier / zasłonaDowolny sprzedawcaniedotyczy
Sterylne patyczki bawełnianeDowolny sprzedawcanie
Seria dotyczy

Bibliografia

  1. Chamberlain, M. C. Leptomeningeal metastasis. Current Opinion in Neurology. 22 (6), 665-674 (2009).
  2. Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
  3. Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
  4. Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
  5. Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
  6. Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
  7. Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
  8. Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
  9. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326(2013).
  10. Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939(2019).
  11. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiments. (75), e50265(2013).
  12. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  13. Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przerzuty do o rodkowego uk adu nerwowegodokana owe dostarczanie lek wbariera krew m zgchirurgia stereotaktycznaprzerzuty raka piersipobieranie p ynu m zgowo rdzeniowegowstrzykni cie do cysterny
Mysi model ksenoprzeszczepu Ommaya do badania terapii ukierunkowanej na chorobę opon mózgowo-rdzeniowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.