Artykuł metodologiczny

Montaż i eksploatacja urządzenia akustyczno-fluidycznego w celu lepszego dostarczania związków molekularnych do komórek

DOI:

10.3791/62035

⸱

21 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje montaż i działanie taniego urządzenia akustofluidycznego do szybkiego dostarczania molekularnego do komórek poprzez sonoporację wywołaną przez ultradźwiękowe środki kontrastowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywne wewnątrzkomórkowe dostarczanie biomolekuł jest wymagane dla szerokiego zakresu badań biomedycznych i zastosowań terapeutycznych opartych na komórkach. Sonoporacja za pośrednictwem ultradźwięków jest nową techniką szybkiego wewnątrzkomórkowego dostarczania biomolekuł. Sonoporacja występuje, gdy kawitacja wypełnionych gazem mikropęcherzyków tworzy przejściowe pory w pobliskich błonach komórkowych, co umożliwia szybkie pobieranie biomolekuł z otaczającego płynu. Obecne techniki sonoporacji in vitro komórek w zawiesinie są ograniczone przez niską przepustowość, zmienność warunków ekspozycji na ultradźwięki dla każdej komórki i wysokie koszty. Aby rozwiązać te problemy, opracowano niedrogie urządzenie akustofluidyczne, które integruje przetwornik ultradźwiękowy z urządzeniem fluidycznym opartym na PDMS w celu wywołania spójnej sonoporacji komórek przepływających przez kanały w połączeniu z ultradźwiękowymi środkami kontrastowymi. Urządzenie jest wytwarzane przy użyciu standardowych technik fotolitografii w celu wytworzenia chipa fluidycznego opartego na PDMS. Ultradźwiękowy przetwornik piezoelektryczny jest podłączony do urządzenia i sterowany przez mikrokontroler. Zespół można zintegrować w etui wydrukowanym w 3D dla dodatkowej ochrony. Komórki i mikropęcherzyki są przepychane przez urządzenie za pomocą pompy strzykawkowej lub pompy perystaltycznej podłączonej do rurki PVC. Za pomocą tego układu akustofluidycznego wykazano zwiększone dostarczanie biomolekuł do ludzkich limfocytów T i komórek raka płuc. W porównaniu z masowymi metodami leczenia, ten system akustofluidyczny zwiększa przepustowość i zmniejsza zmienność, co może poprawić metody przetwarzania komórek w zastosowaniach biomedycznych i produkcji leków opartych na komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platformy wirusowe i niewirusowe zostały wykorzystane do zwiększenia dostarczania molekularnego do komórek. Dostarczanie (transdukcja) wirusa jest powszechną techniką stosowaną w terapiach komórkowych wymagających modyfikacji genomu. Ograniczenia związane z dostarczaniem wirusa obejmują potencjalną mutagenezę insercji, ograniczoną zdolność transgeniczną i niepożądaną mnogość infekcji1,2. W związku z tym opracowywane są niewirusowe techniki dostarczania molekularnego dla szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych i badawczych. Typowe techniki obejmują mechaniczne, elektryczne, hydrodynamiczne lub wykorzystanie energii opartej na laserze w celu zwiększenia wchłaniania biomolekuł do komórek 3. Elektroporacja jest powszechnie stosowaną niewirusową platformą dostarczania molekularnego, która ma zdolność do indukowania przejściowej perforacji błony plazmatycznej w celu wewnątrzkomórkowego dostarczania związków molekularnych4,5,6,7,8,9. Jednak przejściowa perforacja błony plazmatycznej jest procesem stochastycznym, a wychwyt molekularny za pomocą elektroporacji jest na ogół zależny od pasywnej dyfuzji przez przejściowe pory błony4,7,8.

Alternatywną metodą jest wykorzystanie ultradźwięków do zwiększenia wewnątrzkomórkowego dostarczania molekularnego poprzez kawitację ultradźwiękowych środków kontrastowych (tj. mikropęcherzyków wypełnionych gazem). Kawitacja mikropęcherzyków indukuje efekty mikrostrumieniowania w otaczających mediach, które mogą powodować przejściową perforację pobliskich błon plazmatycznych ("sonoporacja"), umożliwiając szybki wewnątrzkomórkowy wychwyt biomolekuł poprzez pasywne lub aktywne mechanizmy transportu10,11,12. Sonoporacja jest skuteczną techniką szybkiego dostarczania molekularnego do komórek, ale takie podejście często wymaga drogiego sprzętu i masowych metod leczenia, które są ograniczone przez niższą przepustowość i większą zmienność warunków ekspozycji na ultradźwięki13. Aby zaradzić tym ograniczeniom, obecnie opracowywane są urządzenia akustofluidyczne, które umożliwiają spójną sonoporację komórek w zawiesinie.

Akustofluidyka to rozwijająca się dziedzina, która integruje technologie ultradźwiękowe i mikroprzepływowe dla szerokiej gamy zastosowań. Podejście to było wcześniej stosowane do separacji cząstek poprzez zastosowanie ciągłej energii ultradźwiękowej do indukowania stojących fal akustycznych w kanałach przepływowych14,15,16,17. Cząstki są sortowane w kierunku różnych części urządzenia na podstawie różnych właściwości, takich jak rozmiar cząstek, gęstość i ściśliwość w stosunku do medium16. Opracowywane są również technologie akustofluidyczne, które umożliwiają szybkie dostarczanie molekularne do różnych typów komórek do zastosowań badawczych i produkcji terapii komórkowych18. Niedawno wykazaliśmy ulepszone dostarczanie molekularne do erytrocytów za pomocą urządzenia akustofluidycznego opartego na PDMS19. Na platformie akustofluidycznej można manipulować dynamiką komórek i mikropęcherzyków w celu wywołania interakcji fizycznych, które umożliwiają lepsze dostarczanie biomolekuł. Wydajność i spójność wewnątrzkomórkowego dostarczania molekularnego można potencjalnie zwiększyć poprzez optymalizację odległości między komórkami a mikropęcherzykami.

Jednym z ważnych zastosowań sonoporacji za pośrednictwem akustofluidyki jest transport biomolekuł do pierwotnych ludzkich limfocytów T. Immunoterapie oparte na adoptywnym transferze limfocytów T, takie jak terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR T), szybko pojawiają się w leczeniu różnych chorób, w tym raka i wirusów, takich jak HIV20. Terapia CAR T jest szczególnie skuteczna u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL) u dzieci, z całkowitym wskaźnikiem remisji wynoszącym 70-90%21. Jednak produkcja limfocytów T w tych terapiach na ogół zależy od transdukcji wirusa, która jest ograniczona przez potencjalną mutagenezę insercji, długi czas przetwarzania i wyzwania związane z dostarczaniem niegenetycznych biomolekuł, takich jak białka lub małe cząsteczki1. Metody dostarczania molekularnego za pośrednictwem akustofluidyki mogą potencjalnie przezwyciężyć te ograniczenia i usprawnić produkcję terapii limfocytami T.

Innym ważnym zastosowaniem sonoporacji za pośrednictwem akustofluidyki jest wewnątrzkomórkowe dostarczanie związków konserwujących, takich jak trehaloza, które chronią komórki podczas zamrażania i suszenia. Trehaloza jest wytwarzana przez niektóre organizmy w przyrodzie i pomaga im tolerować zamarzanie i wysuszanie, chroniąc ich błony komórkowe22,23. Jednak trehaloza nie jest wytwarzana przez komórki ssaków i jest nieprzepuszczalna dla błon komórkowych ssaków. Dlatego skuteczne techniki dostarczania molekularnego, takie jak sonoporacja, są niezbędne do osiągnięcia wystarczających wewnątrzkomórkowych poziomów trehalozy wymaganych do ochrony wewnętrznych błon komórkowych. Podejście to jest obecnie opracowywane w celu konserwacji na sucho różnych typów komórek.

Ten protokół zawiera szczegółowy opis montażu i działania stosunkowo taniego systemu akustofluidycznego sterowanego przez mikrokontroler. Ultradźwiękowe środki kontrastowe są wykorzystywane do indukowania sonoporacji w kanałach płynowych i umożliwiają szybkie dostarczanie molekularne do różnych typów komórek, w tym limfocytów T i komórek rakowych. Ten system akustofluidyczny może być wykorzystywany do różnych zastosowań badawczych, a także może być przydatny jako prototypowy system do oceny metod sonoporacji w celu ulepszenia procesów wytwarzania terapii komórkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pełne pobrania krwi od zdrowych dawców zostały pobrane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję rewizyjną na Uniwersytecie w Louisville.

1. Produkcja urządzenia akustofluidycznego

  1. Uzyskaj fotomaskę o koncentrycznej spiralnej konstrukcji zawierającej kanały o średnicy 500 μm. Plik CAD znajduje się w plikach uzupełniających jako przykład. Niestandardową fotomaskę można zamówić u komercyjnego sprzedawcy lub wykonać wzór za pomocą edytora masek.
  2. Przygotuj formę koncentrycznej spirali na płytce krzemowej pokrytej fotorezystem przy użyciu standardowych technik fotolitografii.
    1. Dodaj około 2 łyżki (~30 ml) SU-8 2100 do wafla krzemowego o średnicy 100 mm.
    2. Wiruj płytkę na przędzarce z prędkością 150 obr./min przez 30 s, aby rozprowadzić fotorezyst, a następnie zwiększ prędkość do 1,200 obr./min przez 60 s, aby uzyskać grubość 200 μm.
    3. Utwardź płytkę pokrytą fotorezystem w poliimidowym piecu próżniowym z 30-minutowym wzrostem i 30-minutowym przebywaniem w temperaturze 115 °C, a następnie zmniejszaj na 30 minut.
    4. Naświetl płytkę pokrytą fotorezystem przez 130 s za pomocą wyrównywacza maski z fotomaską z kroku 1.1.
    5. Upiecz wafel po naświetleniu, postępując zgodnie z tym samym procesem, który opisano w kroku 1.2.3.
    6. Wywołaj fotorezyst w rozwiązaniu wywoływacza SU-8 przez około 8 min.
      UWAGA: Używaj roztworu wywoływacza wyłącznie w dobrze wentylowanym dygestoriach chemicznych.
  3. Silanizuj formę, aby powierzchnia była bardziej hydrofobowa. Umieścić płytkę pokrytą fotorezystem w eksykatorze i dodać 20 μl kropli chlorosilanu (C, 8, H, 4, Cl,3, F, 13Si). Zastosuj próżnię do komory przez 30 s, następnie uszczelnij komorę i pozostaw na noc.
    UWAGA: Chlorosilan jest bardzo niebezpieczny i łatwopalny. Narażenie powoduje poważne oparzenia i uszkodzenie oczu.
  4. Połącz 54 g bazy polidimetylosloksanu (PDMS) i 6 g utwardzacza w filiżance i energicznie i dokładnie mieszaj szpatułką przez co najmniej 1 minutę.
  5. Umieścić kubek zawierający roztwór PDMS w eksykatorze na około 30 minut lub do momentu, gdy resztki pęcherzyków powietrza zostaną usunięte z roztworu.
  6. Umieść płytkę pokrytą fotorezystem wzorami skierowanymi do góry na 150-milimetrowej szalce Petriego.
  7. Wlej roztwór PDMS na formę wewnątrz 150-milimetrowej szalki Petriego.
  8. W razie potrzeby umieść 150-milimetrową szalkę Petriego w eksykatorze i zastosuj próżnię, aż znikną resztki pęcherzyków powietrza.
  9. Przenieść 150-milimetrową szalkę Petriego do pieca laboratoryjnego i piec przez 2 godziny w temperaturze 60 °C, aby utwardzić PDMS.
  10. Po utwardzeniu ostrożnie usuń PDMS z szalki Petriego, przecinając krawędzie wafla za pomocą żyletki.
  11. Wytnij każde urządzenie z osobna za pomocą noża lub żyletki.
  12. Przebij otwory w portach wlotowych i wylotowych każdego urządzenia za pomocą dziurkacza do biopsji 2.5 mm.
  13. Umieść każde urządzenie PDMS w asherze plazmowym z kanałami odsłoniętymi (skierowanymi do góry). Zastosuj obróbkę plazmą tlenową (100 W przez 45 s, 500 mbar O2), a następnie natychmiast umieść każde urządzenie PDMS na czystym szkiełku mikroskopowym ze szkła sodowo-wapniowego (75 mm x 25 mm x 1 mm) z kanałami skierowanymi do powierzchni szkła.
  14. Pozwól urządzeniom związać się przez noc w temperaturze pokojowej.
  15. Delikatnie nałóż silikon na powierzchnię przetwornika piezoelektrycznego o średnicy 1 cm o grubości ~1-2 mm, a następnie ostrożnie wyrównaj przetwornik z koncentryczną spiralą i delikatnie dociśnij go do dolnej części szklanego szkiełka mikroskopowego (po przeciwnej stronie niż urządzenie PDMS).

2. Montaż i działanie systemu akustofluidycznego

  1. Podłącz mikrokontroler do komputera za pomocą USB A do B. Powinien zaświecić się zielony wskaźnik LED zasilania (oznaczony PWR).
  2. Użyj powiązanego programu na komputerze, aby wgrać program, który generuje sygnał 8 MHz. Przykładowy program znajduje się w plikachuzupełniających. Po wgraniu programu zostanie on zapisany w pamięci mikroprocesora i nie będzie trzeba go ponownie wgrywać.
  3. przewód 1" 22G do końca każdego przewodu na przetworniku PZT.
  4. Podłącz ujemny () przewód zaciskowy przetwornika PZT do pinu GND za pomocą przylutowanego przewodu.
  5. Podłącz dodatni (czerwony) przewód zaciskowy przetwornika PZT do pinu wyjściowego (#9 w dostarczonym przykładowym programie) za pomocą przylutowanego przewodu.
  6. Opcjonalnie zamontuj urządzenie akustyczne i mikrokontroler w obudowie wydrukowanej w 3D. Pliki CAD są dostępne w Sdodatkowych Fylach jako przykłady. Dodatkowe przewody można podłączyć do innych pinów mikrokontrolera, aby sterować zewnętrznym wskaźnikiem LED i przyciskiem włączania/wyłączania w razie potrzeby.
  7. Wytnij 3-6-calowe odcinki miękkiej plastikowej rurki z tworzywa sztucznego tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) i wepchnij rurkę do portów wlotowych i wylotowych. Może być konieczne obrócenie rurki podczas wywierania nacisku, aż zmieści się w otworze. Opcjonalnie, po włożeniu rurki do każdego portu, można nałożyć klej na złączu, aby połączyć ze sobą PDMS i wężyki.
  8. Zbiornik mikroprzepływowy należy zamontować zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Wytnij 3-6-calowy odcinek rurki z miękkiego tworzywa sztucznego tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) i wsuń rurkę na rurkę ID 1/32" z rurki wyjściowej zbiornika mikroprzepływowego. Opcjonalnie owiń złącze folią parafinową, aby zapobiec wyciekom.
  10. Napełnij strzykawkę o pojemności 60 ml powietrzem z otoczenia (opcjonalnie przefiltruj powietrze filtrem 0,2 μm) i podłącz ją do rurki z PVC tygon (1/16" ID, 1/8" OD) z boku zbiornika mikroprzepływowego.
  11. Ustawić pompę strzykawkową na szybkość 200 ml / h, aby przepchnąć roztwory komórek/ultrasonograficznego środka kontrastowego przez urządzenie akustofluidyczne z objętościowym natężeniem przepływu 50 ml / h i pobrać próbki z wyjścia urządzenia akustofluidycznego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Opcjonalnie przepłukać kanał przed zabiegiem akustofluidycznym 15 ml 70% roztworu etanolu, aby zwiększyć sterylność kanałów płynowych. Dodatkowo kanały można przepłukać 15 ml wody dejonizowanej w celu usunięcia resztek etanolu z urządzenia przed przepompowaniem komórek przez system.

3. Przygotowanie ultradźwięków środków kontrastowych

UWAGA: Ultradźwiękowe środki kontrastowe znacznie zwiększają akustofluidyczne dostarczanie związków molekularnych poprzez przejściowe zwiększenie przepuszczalności pobliskich błon komórkowych19. Dostarczanie molekularne jest bardzo ograniczone bez ultradźwięków kontrastowych w tym systemie.

  1. Przygotować roztwór fosfolipidów w 20 ml fiolce scyntylacyjnej zawierającej następującą mieszaninę:
    1. Dodać 25 mg 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DSPC).
    2. Dodać 11,6 mg 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholiny (DSEPC).
    3. Dodać 0,26 mg 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoglicerolu (DSPG).
    4. Dodać 0,88 mg stearynianu polioksyetylenu40.
  2. Dodawać chloroform, aż wszystkie fosfolipidy się rozpuszczą (np. 3 ml chloroformu).
  3. Odparować chloroform w eksykatorze przez 48 godzin, aby utworzyć suchy film lipidowy (w celu przyspieszenia procesu suszenia można zastosować odparowanie pod argonem lub za pomocą wyparki obrotowej).
  4. Ponownie nawodnić film lipidowy za pomocą 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  5. Sonikować roztwór lipidów przez 3 minuty przy amplitudzie 40%, aby utworzyć kationowy roztwór micelarny.
  6. Po sonikacji roztwór fosfolipidów należy przechowywać w temperaturze 2-6 °C przez okres do 1 miesiąca.
  7. Aby przygotować ultradźwiękowe środki kontrastowe, dodaj 200 μl kationowego roztworu micelarnego i 600 μl sterylnego PBS do szklanej fiolki z przegrodą o pojemności 2 ml.
  8. Zapieczętować fiolkę, zaciskając nakrętkę.
  9. Użyj igły 1,5" 20G, aby wypełnić przestrzeń nad fiolką dekafluorobutanem przez 30 sekund.
  10. Mieszaj fiolkę przez 45 s przy 4,350 cpm, aby utworzyć ultradźwiękowe środki kontrastowe wypełnione gazem perfluorobutanowym.
  11. Dodać 25 μl roztworu ultradźwiękowego środka kontrastowego na 1 ml roztworu komórkowego bezpośrednio przed przepompowaniem połączonego środka kontrastowego i mieszaniny komórek przez urządzenie akustofluidyczne. Roztwór komórkowy może być modyfikowany zgodnie z życzeniem użytkownika, ale w naszych badaniach roztwór komórkowy składał się odpowiednio z pierwotnych limfocytów T w kroku 4.21 i komórek raka płuc A549 w kroku 5.7.

4. Przygotowanie pierwotnych komórek Tcell

  1. Wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z roztworów krwi pełnej i przechowywać w temperaturze -150 °C. Separacja gradientu gęstości zawierająca substrat jest powszechnie stosowana do oddzielania PBMC od krwi pełnej24,25,26.
  2. Zamrożoną fiolkę rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Rozcieńczyć rozmrożone PBMC w stosunku 1:10 PBS w 15 ml probówce wirówkowej. Każda fiolka o pojemności 1 ml zawiera około 10 milionów PBMC.
  4. Odwirować rozcieńczone PBMC o stężeniu 580 x g przez 11 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant i dodać 13 ml buforu MAC w celu ponownego zawieszenia komórek.
  6. Policz PBMC za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
  7. Ponownie odwirować PBMC przy 580 x g przez 11 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
  8. Dodać 40 μl schłodzonego buforu na 10 milionów PBMC.
  9. Aby wyizolować limfocyty T, dodaj 10 μl koktajlu przeciwciał biotynowych Pan T-Cell na 10 milionów PBMC.
  10. Delikatnie wymieszać PBMC i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez 5 minut na 10 milionów komórek.
  11. Dodać 30 μl buforu bieżącego i 20 μl koktajlu mikrokulkowego Pan T-Cell na 10 milionów PBMCs.
  12. Dokładnie wymieszać PBMC i kulki i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Dodaj bufor do biegania, aby osiągnąć całkowitą objętość 500 μl.
  14. Oddziel pierwotne limfocyty T za pomocą dostępnego na rynku laboratoryjnego magnetycznego przyrządu do sortowania, stosując ustawienie "separacja zubożeń" zgodnie z protokołem producenta. Ten etap powinien dać od 5 do 10 milionów limfocytów T po sortowaniu komórek.
  15. Policz limfocyty T za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
  16. Rozcieńczyć limfocyty T w 10 ml sterylnego PBS i odwirować przy 580 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
  17. Odessać supernatant i ponownie zawiesić limfocyty T w 1 ml PBS.
  18. Policz limfocyty T za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i podwielokrotność 1 miliona/ml do eksperymentów.
  19. Przygotować roztwór fluoresceiny o stężeniu 1 mg/ml w PBS.
  20. Bezpośrednio przed przetworzeniem dodać 100 μl roztworu fluoresceiny o stężeniu 1 mg/ml na 1 ml roztworu limfocytów T (końcowe stężenie fluoresceiny = 100 μg/ml).
  21. Dodać 25 μl roztworu ultradźwiękowego środka kontrastowego, jak opisano wcześniej w kroku 3.11.
  22. Przetwarzać 1 ml podwielokrotności komórek za pomocą układu akustofluidycznego (patrz kroki 2.10-2.11). Ten etap zwiększa dostarczanie fluoresceiny do pierwotnych limfocytów T.
  23. Bezpośrednio po zabiegu przepłukać komórki trzykrotnie przez odwirowanie przy 580 x g przez 10 minut z 500 μl PBS w celu usunięcia zewnątrzkomórkowej fluoresceiny. Komórki należy przemyć w ciągu 10 minut po dodaniu roztworu fluoresceiny.
  24. Po ostatnim etapie płukania ponownie zawieś komórki w 250 μl PBS i zmierz fluorescencję na cytometrze przepływowym.

5. Przygotowanie komórek raka płuc A549

  1. Hodowla komórek A549 (adenokoraksynomiczna ludzka podstawa pęcherzyków płucnych) w kompletnych pożywkach DMEM (10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w płaskodennej kolbie do hodowli tkankowej.
  2. Zbierz komórki A549, gdy osiągną 70-90% konfluencji. Odessać pożywkę z kolby i przemyć komórki raz PBS w celu usunięcia białek surowicy.
  3. Dodać trypsynę (0,25%) EDTA do kolby i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Trypsyna jest enzymem trawiennym, który powoduje oderwanie się komórek od dolnej powierzchni kolby do hodowli tkankowej.
  4. Przenieś roztwór trypsyny do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i zneutralizuj go, dodając całe podłoże DMEM w stosunku 1:3.
  5. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w stężeniu 100 000/ml w roztworze PBS zawierającym 200 mM trehalozy w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml.
  7. Dodać 25 μl roztworu ultradźwiękowego środka kontrastowego, jak opisano wcześniej w kroku 3.11.
  8. Przetwarzać 1 ml podwielokrotności komórek za pomocą układu akustofluidycznego (patrz kroki 2.10-2.11). Ten etap zwiększa dostarczanie trehalozy do komórek raka płuc A549.
  9. Bezpośrednio po zabiegu przemyć komórki trzykrotnie przez odwirowanie z 500 μl PBS w celu usunięcia zewnątrzkomórkowej trehalozy. Komórki należy przemyć w ciągu 10 minut po dodaniu roztworu trehalozy.
  10. Po ostatnim etapie mycia ponownie zawieś komórki w 100 μl PBS.
  11. Dodaj 11 μl 1% roztworu Triton X-100, aby lizować komórki i uwalniać wewnątrzkomórkową trehalozę.
  12. Wirować przez 15 s, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Ponownie wirować przez 15 sekund, a następnie zmierzyć stężenie trehalozy za pomocą dostępnego w handlu testu trehalozy zgodnie z zaleceniami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obraz systemu akustofluidycznego umieszczonego w obudowie wydrukowanej w 3D jest pokazany w Rysunek 1. Protokół ten wytwarza system akustofluidyczny, który można wykorzystać do zwiększenia wewnątrzkomórkowego dostarczania molekularnego w wielu liniach komórkowych za pomocą ultradźwiękowych środków kontrastowych.

Rysunek 2 pokazuje zwiększone wewnątrzkomórkowe dostarczanie związku fluorescencyjnego, fluoresceiny, do p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje montaż i działanie taniego systemu akustofluidycznego, który usprawnia wewnątrzkomórkowe dostarczanie biomolekuł do zastosowań badawczych. Istnieje kilka ważnych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas montażu i obsługi tego systemu. Urządzenie akustyczno-przepływowe jest wytwarzane z PDMS, który jest biokompatybilnym materiałem, który można łatwo formować z zachowaniem spójnych wymiarów kanału27. Kanały urządzenia można przepłukać 15 ml 70% roztworu etanolu przed obró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Współautorzy, MAM i JAK, są właścicielami DesiCorp, która może czerpać korzyści finansowe z produktów związanych z tym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) i National Institutes of Health (U01HL127518). Usługi fotolitografii świadczyło Centrum Mikro/Nanotechnologii Uniwersytetu w Louisville.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja urządzenia akustycznego
DOW SYLGARD 184 SILIKONOWA KAPSUŁKA BEZBARWNA 0,5 KG ZESTAWEllsworth Adhesives4019862 (SKU)https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2,5 mm)Nauki o mikroskopii elektronowej69039-25
Zbiornik mikroprzepływowy do probówki Falcon 15 ml - S (2/4 port)Darwin MicrofluidicsLVF-KPT-S-2 (SKU)https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Szkiełko mikroskopoweVWR16004-430https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilanGelest105732-02-3 (nr kat.)Chlorosilan jest bardzo zalążkowy i łatwopalny. Narażenie powoduje poważne oparzenia i uszkodzenia oczu.
Rurka z miękkiego tworzywa sztucznego Tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD)McMaster-Carr5233K51 (Część #)https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Montaż systemu akustycznego
Arduino UnoArduino7630049200050 (kod kreskowy)https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparat ultrasonograficznych środków kontrastowych
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)Avanti Lipids890703P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Lipids850365P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/850365
1,2- distearoilo-sn-glycero-3-fosfoglicerol (DSPG)Avanti Lipids840465P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (gaz dekafluorobucjanowy)FlouroMed355-25-9 (nr CAS)http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators COXOhttps://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
stearynian polioksyetylenu 40 Sigma-AldrichP3440-250G (SKU)https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 SonicatorQsonicaQ125-110 (Ref.)https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Przygotowanie limfocytów T Primarty
autoMACs z uruchomionym buforemMiltenyi Biotec130-091-221 (nr zamówienia)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Zestaw do izolacji limfocytów Pan T, ludzki (koktajl przeciwciał biotynowych Pan T-cell & Koktajl z mikrokulek Pan T-Cell) Miltenyi Biotec130-096-535 (Nr zamówienia)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetyczny sortownik komórek (autoMACS Pro Separator)Miltenyi Biotec130-092-545 (Nr zamówienia)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Przygotowanie komórek raka płuc A549
Trehaloza zestaw do oznaczania MegazymeK-TREH (Kat. Nie.)https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Błękit trypanowy (0,4% w roztworze wodnym gotowy do użycia, sterylny)VWR97063-702 (Kat. Nie.)https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
  3. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27(2012).
  4. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
  6. Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
  7. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
  8. Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
  9. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315(2015).
  10. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  11. Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
  12. Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
  13. Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
  14. Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
  15. Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
  16. Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
  17. Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861(2016).
  18. Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
  19. Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114(2020).
  20. Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361(2020).
  21. Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
  22. Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
  23. Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198(2017).
  24. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  25. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  26. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  27. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  28. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
  31. Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
  32. Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
  33. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  34. Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika sonoporacjidostarczanie wewn trzkom rkoweprzetwornik ultrad wi kowykawitacja mikrop cherzyk wchip fluidyczny PDMSpermeabilizacja b ony kom rkowejludzkie limfocyty Tkom rki raka p ucintegracja z mikrokontrolerem

Powiązane artykuły