Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62038

⸱

18 kwietnia 2021

 ,  ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

W tym artykule

Podsumowanie

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Streszczenie

Precyzyjne pomiary niejednorodności między i wewnątrz szczepów w tempie wzrostu mikroorganizmów są niezbędne do zrozumienia genetycznych i środowiskowych czynników wpływających na tolerancję na stres, chorobotwórczość i inne kluczowe składniki sprawności. Ten manuskrypt opisuje test oparty na mikroskopie, który śledzi około 105 mikrokolonii Saccharomyces cerevisiae na eksperyment. Po zautomatyzowanym obrazowaniu poklatkowym drożdży unieruchomionych na płytce wielodołkowej, tempo wzrostu mikrokolonii można łatwo przeanalizować za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu. Dla każdej mikrokolonii można również monitorować ekspresję i lokalizację białek fluorescencyjnych oraz przeżywalność ostrego stresu. Test ten pozwala na precyzyjne oszacowanie średniego tempa wzrostu szczepów, a także kompleksowy pomiar niejednorodności wzrostu, ekspresji genów i tolerancji na stres w populacjach klonów.

Wprowadzenie

Fenotypy wzrostu mają decydujący wpływ na kondycję drożdży. Dobór naturalny może skutecznie rozróżniać linie o tempie wzrostu różniącym się odwrotnością efektywnej wielkości populacji, która może przekraczać 108 osobników1. Co więcej, zmienność tempa wzrostu wśród osobników w populacji jest parametrem istotnym z ewolucyjnego punktu widzenia, ponieważ może służyć jako podstawa strategii przetrwania, takich jak hedging zakładów2,3,4,5,6. Dlatego testy, które pozwalają na bardzo dokładne pomiary fenotypów wzrostu i ich rozkładu, mają kluczowe znaczenie dla badania mikroorganizmów. Opisany tutaj test wzrostu mikrokolonii może wygenerować indywidualne pomiary szybkości wzrostu dla ~105 mikrokolonii na eksperyment. Test ten stanowi zatem potężny protokół do badania genetyki ewolucyjnej i genomiki drożdży. Szczególnie dobrze nadaje się do testowania, w jaki sposób zmienność w populacjach genetycznie identycznych pojedynczych komórek jest generowana, utrzymywana i przyczynia się do dopasowania populacji7,8,9,10.

Metoda opisana tutaj (Rysunek 1) wykorzystuje okresowo rejestrowane, w małym powiększeniu, jasne obrazy komórek rosnących w płynnym podłożu na 96- lub 384-dołkowej szklanej płytce do śledzenia wzrostu w mikrokolonie. Komórki przylegają do lektyny konkanawaliny A, która pokrywa spód płytki mikroskopu i tworzy dwuwymiarowe kolonie. Ponieważ mikrokolonie rosną w jednej warstwie, obszar mikrokolonii jest silnie skorelowany z liczbą komórek7. W związku z tym dokładne szacunki tempa wzrostu mikrokolonii i czasu opóźnienia mogą być generowane za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu, które śledzi tempo zmian obszaru każdej mikrokolonii. Co więcej, układ eksperymentalny może monitorować obfitość, a nawet subkomórkowe lokalizacje znakowanych fluorescencyjnie białek ulegających ekspresji w tych mikrokoloniach. Dalsze przetwarzanie danych z tego testu wzrostu mikrokolonii można osiągnąć za pomocą niestandardowej analizy lub istniejącego oprogramowania do analizy obrazów, takiego jak Processing Images Easily (PIE)11, algorytm do solidnego rozpoznawania obszaru kolonii i wysokoprzepustowej analizy wzrostu na podstawie obrazów o małym powiększeniu i jasnym polu, który jest dostępny za pośrednictwem GitHub12.

Ponieważ szacunki szybkości wzrostu pochodzące z testu wzrostu mikrokolonii są generowane z dużej liczby pomiarów pojedynczej kolonii, są one niezwykle dokładne, z błędami standardowymi o kilka rzędów wielkości mniejszymi niż same szacunki dla eksperymentu o rozsądnej wielkości. W związku z tym moc testu w wykrywaniu różnic w tempie wzrostu między różnymi genotypami, zabiegami lub warunkami środowiskowymi jest wysoka. Format płytki wielodołkowej umożliwia porównanie wielu różnych kombinacji środowisk i genotypów w jednym eksperymencie. Jeśli szczepy konstytutywnie wyrażają różne markery fluorescencyjne, można je zmieszać w tym samym dołku i odróżnić przez późniejszą analizę obrazu, co może jeszcze bardziej zwiększyć moc, umożliwiając normalizację danych dobrze po studni.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu. Protokół ten składa się z dwóch głównych etapów, którymi są przygotowanie płytki eksperymentalnej i przygotowanie komórek do obrazowania. Randomizacja płytek i wzrost komórek powinny być przeprowadzone przed i przed dniem eksperymentu. Wielokrotne mieszanie komórek na każdym etapie rozcieńczania jest konieczne na wszystkich etapach aż do posiewu, dlatego zaleca się najpierw przygotowanie płytki doświadczalnej, tak aby była gotowa do posiewu natychmiast po zakończeniu rozcieńczania komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie Losowo Wybranych Płytek (Przed Dniem Eksperymentu)

  1. Zaplanuj szczepy i warunki, które mają być testowane za pomocą testu wzrostu. W tym momencie losowo przypisz szczepy i warunki do dowolnej studni.
    UWAGA: Rozważając konfigurację płytki, zaleca się uwzględnienie więcej niż jednej powtórzonej próby na szczep i warunek wzrostu na jednej płytce, aby uwzględnić szum związany z odwiertem podczas pomiarów. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji.
  2. Obliczeniowo losowo dobieraj lokalizację każdego szczepu i warunki środowiskowe dla powtórzeń płytek, które będą uruchamiane w różnych dniach.
  3. Hodować wszystkie komórki, które zostaną użyte w eksperymencie, do nasycenia w pożywce z ekstraktem drożdżowym-peptonem-dekstrozą (YEPD; 2% glukozy) w wytrząsarce w temperaturze 30 °C (lub innej odpowiedniej temperatury).
  4. Twórz losowe tablice magazynowe ręcznie lub za pomocą robota do obsługi cieczy. Dodać 10 μl wyznaczonych nasyconych komórek do każdego dołka sterylnej płytki do hodowli tkankowej z dnem w kształcie litery U. Jeśli w jednym dołku będzie testowanych wiele szczepów, nie należy ich łączyć w tym momencie; To łączenie zostanie przeprowadzone tuż przed rozcieńczeniem komórek w dniu eksperymentu, aby upewnić się, że wszystkie szczepy mają prawidłowe stężenia po posianiu jako komórki założycielskie mikrokolonii.
  5. Dodaj 10 μl 30% glicerolu do każdego dołka każdej płytki. Pipetować w górę i w dół, aby komórki i glicerol dobrze się wymieszały.
  6. Każdą płytkę należy zamknąć foliową osłoną i natychmiast zamrozić w temperaturze -70 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Ważne jest, aby utworzyć wszystkie losowe płytki tego samego dnia i zamrozić je, tak aby warunki wstępnego wzrostu komórek na każdej płytce były identyczne i nie powodowały technicznych różnic w teście szybkości wzrostu.

2. Wstępny wzrost drożdży

UWAGA: Zazwyczaj zaczyna się to przed dniem eksperymentu i jest wysoce zależne od pytania eksperymentalnego. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać szczegółowe informacje.

  1. Wyjąć podstawową płytkę (10 μl drożdży, 10 μl glicerolu na studzienkę) z zamrażarki w temperaturze -70 °C i dodać 180 μl pożywki, która ma być użyta w doświadczeniu. Jeśli eksperyment będzie przeprowadzany przy użyciu pożywek ograniczających składniki odżywcze, nie należy wstępnie hodować drożdży do nasycenia w pożywce ograniczającej składniki odżywcze, ponieważ może dojść do zarodnikowania drożdży. Zamiast tego uprawiaj wstępnie na nieograniczających podłożach.
  2. Hodować drożdże, wytrząsając je w temperaturze 30 °C. Rozważyć, czy przeprowadzić test, zaczynając od komórek w fazie logarytmicznej, czy w fazie stacjonarnej, w celu określenia, czy konieczne będzie wielokrotne rozcieńczanie komórek przed eksperymentem. Jeśli oczekuje się, że szczepy drożdży lub warunki w teście będą miały znacznie różne tempo wzrostu, wówczas konieczny będzie dwudniowy okres wstępnego wzrostu, aby wszystkie różne warunki osiągnęły fazę stacjonarną.

3. Ustawienie mikroskopu

  1. Przygotowanie płytki mikroskopowej
    1. Upewnij się, że inkubator mikroskopu jest włączony i ogrzewa komorę mikroskopu do żądanej temperatury wzrostu dla warunków doświadczalnych. W przypadku standardowych doświadczeń z wykorzystaniem komórek Saccharomyces cerevisiae, inkubator powinien podgrzać komorę mikroskopu do 30 °C, aby zapewnić, że warunki wzrostu komórek będą prawidłowe podczas oznaczania szybkości wzrostu.
    2. Zdezynfekuj stół warsztatowy, pipety i inne narzędzia za pomocą 70% etanolu. Wyjmij płytkę mikroskopu i połóż ją na stole na niestrzępiącej się i statycznej chusteczce.
      UWAGA: Nigdy nie dotykaj dolnej części płytki mikroskopu, nawet w rękawiczkach, i zawsze kładź płytkę mikroskopu na niestrzępiącej się i statycznej chusteczce za każdym razem, gdy dotyka jakiejkolwiek powierzchni. Zapobiega to powstawaniu smug lub zadrapań, które utrudniają pomiary szybkości wzrostu podczas obrazowania eksperymentu.
    3. Rozmrozić 5 ml 5x roztworu konkanawaliny A, rozcieńczyć do 1x wodą i przefiltrować sterylizować przez strzykawkę wyposażoną w filtr 0,2 μm.
    4. Filtr Wysterylizuj wszystkie inne ciecze, które zostaną użyte w teście, za pomocą filtra 0,2 μm, w tym pożywki eksperymentalne, w celu usunięcia wszelkich kryształów lub zanieczyszczeń, które mogły zmaterializować się w roztworach. Obecność kryształów obniżyłaby jakość obrazów mikroskopowych.
    5. Odmierzyć pipetą 200 μl roztworu konkanawaliny A do każdej studzienki płytki mikroskopu.
    6. Wirować płytkę przez 2 minuty przy 411 x grawitacji (g) za pomocą niestrzępiącej się i statycznej chusteczki pod płytką, aby upewnić się, że roztwór konkanawaliny A równomiernie pokrywa dno każdej studzienki i że nie ma pęcherzyków powietrza.
    7. Przykryj talerz pokrywką i odstaw na 1-2 godziny. Dokładny czas, w którym płytka jest osadzona, jest elastyczny, ale ważne jest, aby zachować spójność między różnymi przebiegami eksperymentu.
    8. Usuń cały roztwór konkanawaliny A z talerza przez odsysanie lub przez mocne wylanie go do zlewu lub pojemnika. Uważaj, aby nie dotknąć szklanej części talerza. Dopuszczalne jest, jeśli w studzienkach pozostaną kilka kropli roztworu konkanawaliny A.
    9. Umyj studzienki płytki mikroskopu, dodając 400 μl sterylnej wody. Usuń wodę, tak jak w przypadku konkanawaliny A w poprzednim kroku. Nie pozwól, aby talerz pozostał suchy.
    10. Natychmiast dodaj 185 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do płytki. Do tej płytki zostanie dodanych 15 μl prawidłowo rozcieńczonych komórek.
  2. Rozcieńczenie komórek drożdży
    UWAGA: Poniższe kroki opisują rozcieńczenie drożdży z nasyconej kultury (około 10-8 komórek/ml) 400-krotnie w celu uzyskania stężenia 250 000 komórek/ml, z czego 15 μl zostanie rozcieńczone do 400 μl na płytce ze szklanym dnem, co daje końcową liczbę około 4000 komórek na studzienkę w płytce 96-dołkowej. W przypadku stosowania płytki 384-dołkowej ostateczna liczba komórek na studzienkę powinna wynosić około 700, a rozcieńczenia należy odpowiednio dostosować. Stosunek ten należy dostosować do komórek pobranych w fazie logarytmicznej, rosnących w bogatszych lub uboższych pożywkach przedwzrostowych lub pochodzących z różnych szczepów. Końcowa gęstość komórek na studzienkę powinna zostać zmniejszona podczas przeprowadzania testu szybkości wzrostu dla okresów dłuższych niż 10 godzin.
    1. Ustawić dwie 96-dołkowe płytki hodowlane do seryjnych rozcieńczeń: oznaczyć jako płytkę 1 i 2 i dodać 90 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej (tj. pożywki, w której drożdże będą rosły pod mikroskopem) do każdej płytki do rozcieńczania seryjnego.
      UWAGA: Niezależnie od tego, jakie końcowe rozcieńczenie zostanie użyte, zaleca się co najmniej dwa seryjne rozcieńczenia komórek, w każdym z których niewielka objętość drożdży jest pipetowana do większej objętości pożywki doświadczalnej, a następnie energicznie miesza się dużą objętość pożywki doświadczalnej za pomocą pipety (jak w krokach 3.2.5 i 3.2.6 poniżej).
    2. Pobrać płytkę z komórkami ze wstępnego wzrostu i odwirować płytkę przez 2 minuty przy 411 x g.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie zanieczyszczać krzyżowo różnych studzienek w płycie. Celem tego etapu wirowania przed usunięciem pokrycia foliowego z płytek jest upewnienie się, że kropelki wypełnione drożdżami z jednej studzienki nie odlecą z folii i nie trafią do innych studzienek. Należy uważać, aby nigdy nie przechylać ani nie wstrząsać płytkami, aby uniknąć kontaktu drożdży z folią pokrytą po odwirowaniu.
    3. Ostrożnie odkleić folię i ponownie zawiesić komórki, energicznie pipetując komórki pipetą ustawioną na około połowę całkowitej objętości płytki, przesuwając pipetę po dołku w celu wymieszania. Sprawdź, czy wszystkie komórki zostały ponownie zawieszone na dnie studzienek.
    4. Jeżeli w poszczególnych studzienkach ma być użytych wiele szczepów, szczepy powinny być w tym czasie mieszane w proporcji niezbędnej do przeprowadzenia eksperymentu. Jeżeli do wygenerowania pomiarów szybkości wzrostu ma być użyty szczep odniesienia, stosunek odkształcenia odniesienia do szczepu testowego powinien wynosić 1:1.
    5. Odmierzyć pipetą 10 μl drożdży z pożywki wzrostowej na płytkę rozcieńczającą 1. Dodać 100 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 200 μl na studzienkę. Energicznie pipetować w górę i w dół.
    6. Odpipetować 10 μl drożdży z płytki 1 na płytkę 2. Dodać 100 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki i energicznie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
      UWAGA: Te etapy rozcieńczania mają kluczowe znaczenie, aby pomóc oddzielić skupiska drożdży, które są sklejone ze sobą pod koniec etapu wstępnego wzrostu i zapewnić, że w każdym dołku znajdzie się w przybliżeniu równa liczba komórek drożdży. Posiadanie stałej liczby drożdży w każdym dołku pomaga usunąć eksperymentalny szum i błędy w pomiarach szybkości wzrostu (patrz Reprezentatywne wyniki).
  3. Sonikacja
    UWAGA: Sonikacja jest opcjonalna i musi być wykonywana tylko w przypadku szczepów drożdży, które mają dużą skłonność do przylegania do siebie (np. niektóre dzikie szczepy). W przypadku szczepów laboratoryjnych sonikacja na ogół nie jest konieczna i można ją pominąć, przechodząc do kroku 3.4.
    1. Zdezynfekuj 96-pinową głowicę sonikatora 70% etanolem, umieszczając ją w 96-dołkowej płytce wypełnionej 70% etanolem i osusz chusteczką bez kłaczków i ładunków elektrostatycznych.
    2. Ustaw program sonikacji, który jest wystarczająco silny, aby rozbić flokulowane komórki drożdży, ale nie zabija komórek ani nie powoduje podwyższonych reakcji na stres. Niektóre testy mogą być wymagane w celu zidentyfikowania najlepszego programu sonikacji dla danego eksperymentu. Program sonikacyjny zastosowany w tym eksperymencie to: amplituda = 10, czas procesu = 10 s, impuls włączony = 1 s, impuls wyłączony = 1 s. Ten dokładny program prawdopodobnie nie ma zastosowania do wszystkich sonikatorów, dlatego sugeruje się przeprowadzenie testów przed dniem eksperymentu.
    3. Ponownie wymieszać drożdże na płytce do rozcieńczania seryjnego 2, energicznie pipetując pięć razy w górę i w dół.
    4. Umieść płytkę rozcieńczającą 2 na platformie i zabezpiecz ją kołkami sonitora w zawiesinie ogniwa, ale nie dotykając dolnej części płytki. Uruchom program sonikacji, używając odpowiedniej ochrony słuchu.
    5. Po uruchomieniu programu należy oczyścić głowicę sonikatora 70% etanolem, a następnie wodą, a następnie natychmiast przystąpić do przygotowania płytki mikroskopowej, aby komórki nie uległy ponownemu flokulacji.
  4. Przygotuj płytkę pod mikroskop:
    1. Odpipetować 15 μl drożdży z płytki 2 do rozcieńczania seryjnego do objętości 200 μl. Dodać 200 μl eksperymentalnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki do końcowej objętości 400 μl na studzienkę i energicznie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania.
    2. Przykryj płytkę oddychającą membraną. Ważne jest, aby dobrze uszczelnić płytę tą membraną, na przykład za pomocą gumowego wałka.
    3. Aby przykleić komórki drożdży do konkanawaliny A na szklanej powierzchni, należy odwirować płytkę z niestrzępiącą się i statyczną chusteczką pod nią przez 2 minuty przy 411 x g.
    4. Pod mikroskopem przetrzyj górną i dolną część płytki niestrzępiącą się i statyczną chusteczką, a następnie wdmuchnij sprężone powietrze na płytkę, aby pozbyć się zanieczyszczeń.
    5. Umieść płytkę na mikroskopie, upewniając się, że jest wypoziomowana i że studzienka A1 znajduje się w lewym górnym rogu.

4. Pomiary tempa wzrostu w mikroskopii poklatkowej

UWAGA: Podczas mikroskopii poklatkowej następujące funkcje są sterowane komputerowo: pozycja x, y i z, przesłony i filtry fluorescencyjne. Sprzętowy system automatycznego ustawiania ostrości jest optymalny, aby zapobiec dryfowaniu płaszczyzny ogniskowej podczas obrazowania poklatkowego. Alternatywnie można użyć pętli automatycznego ustawiania ostrości opartej na oprogramowaniu. Aby utrzymać wilgotność w komorze mikroskopu, zaleca się trzymanie zlewki z oczyszczoną wodą w komorze przez cały czas trwania eksperymentu.

  1. Utwórz listę pozycji (x,y) do zobrazowania, tak aby każde gniazdo płytki mikroskopu było w pełni zobrazowane. Unikaj nakładania się obrazów, aby żadna komórka nie była analizowana wiele razy.
  2. Obraz w jasnym polu z oświetleniem diaskopowym (DIA) przy powiększeniu 15x. Ustaw ekspozycję na ~5 ms.
  3. Powiększ obraz cyfrowo, aby komórki były wyraźnie widoczne. Użyj pokręteł ostrości, aby określić idealną ostrość do eksperymentu w czterech dołkach w rogu płytki i w jednym dołku na środku płytki. Ustaw ostrość w taki sposób, aby uzyskać maksymalny kontrast komórek.
  4. Ustaw pozycję z (lub pozycję autofokusa) dla eksperymentu tak, aby była średnią pozycji z/autofokusa zidentyfikowanych dla każdej z tych studzienek. Jeśli płytka mikroskopu jest dobrze wykonana, a szklane dno nie ma wad, idealne pozycje ostrości powinny być podobne dla każdej studzienki.
    UWAGA: Podczas analizowania obrazów za pomocą potoku analizy obrazów PIE (Processing Images Easily - Processing Images Easily - PIE) 11, 12 pomocne jest, aby komórki były nieco nieostre pod mikroskopem, tak aby na zewnątrz komórki znajdowała się ciemna obwódka, a wnętrze było jasne, co pomaga w dokładnym rozpoznawaniu kolonii i szacowaniu wielkości.
  5. Jeśli używasz odkształceń fluorescencyjnych, zidentyfikuj kanały i ekspozycje, za pomocą których chcesz obrazować, upewniając się, że żadne piksele nie są prześwietlone. Ustawiając czas ekspozycji dla kanałów fluorescencyjnych, wyłącz tryb "przechwytywania na żywo" w mikroskopie, aby uniknąć narażania komórek na wzbudzenie fluorescencyjne przez długi czas, ponieważ może to zarówno fotowybielać komórki, jak i powodować stres.
  6. Skonfiguruj akwizycję sekwencji czasowej, aby przechwytywać obrazy w żądanym interwale czasu przez żądany okres czasu.
  7. Uruchom eksperyment.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nowością tego protokołu jest to, że tempo wzrostu można obliczyć dla poszczególnych komórek w populacji, śledząc ich wzrost w mikrokolonie za pomocą obrazowania poklatkowego (Rysunek 2A). Ponieważ mikrokolonie rosną przez wiele godzin w sposób płaski ze względu na obecność konkanawaliny A, ich obszary mogą być śledzone przez cały czas trwania eksperymentu, a liniowe dopasowanie do zmiany logarytmu naturalnego obszaru w czasie może być wykorzystane do obliczenia szybkości wzrostu dla każdej obserwowane...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest wszechstronnym testem, który pozwala na jednoczesne monitorowanie wzrostu komórek i ekspresji genów na poziomie poszczególnych mikrokolonii. Połączenie tych dwóch modalności daje unikalne informacje biologiczne. Na przykład w poprzednich pracach wykorzystano ten test, aby wykazać ujemną korelację między ekspresją genu TSL1 a szybkością wzrostu mikrokolonii w izogenicznych komórkach typu dzikiego, mierząc oba jednocześnie 7,10....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Naomi Ziv, Sashy Levy i Shuang Li za ich wkład w rozwój tego protokołu, Davidowi Greshamowi za udostępnienie sprzętu i Marissie Knoll za pomoc w produkcji wideo. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health w ramach grantu R35GM118170.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
General Materials
500 mL Filtr butelkowy .22 i mikro; m PES Sterylizacja, niskie wiązanie białek, z szyjką 45 mmFisherCLS431154służy do filtrowania pożywki
BD Falcon*Płytki do hodowli tkankowych, mikrotest U-bottomFisher08-772-5496-dołkowe probówki hodowlane używane do zamrażania komórek, komórek przed wzrostem i rozcieńczania
Strzykawki BD bez igły, 50 mlFisher13-689-8Służy do filtrowania
sterylnych jednorazowych zbiorników na odczynniki Concanavalin A CostarZbiorniki07-200-127używane do pipetowania roztworów za pomocą pipety wielokanałowej
Aluminiowa taśma uszczelniająca Costar ThermowellFisher07-200-68496-dołkowa uszczelka płytkowa do wstępnego wzrostu i zamrażania
kłaczków i ładunków elektrostatycznych KimwipesFisher06-666AChusteczki wolne od kłaczków i ładunków elektrostatycznych, aby dno płytki mikroskopu było wolne od zanieczyszczeń i zadrapań
Filtrystrzykawkowe NalgeneThermoFisher Scientific199-20200,2 μ m wielkość porów, średnica 25 mm; służy do filtrowania roztworu konkanawaliny A
Media Składniki
Minimalnie zdefiniowane chemicznie pożywki (MD; 2% glukozy)alternatywne podłoża mikroskopowe stosowane do wstępnego wzrostu i wzrostu drożdży podczas mikroskopii
Syntetyczne kompletne podłoża mikroskopowe (SC; 2% glukozy)stosowane do wstępnego wzrostu i wzrostu drożdży podczas mikroskopii
Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YEPD; 2% glukozy) średniwzrost komórek przed zamrożeniem randomizowanych płytek
< strong> Materiały mikroskopowe< / strong>
Breathe-Easy membrana uszczelniającaOddychające membrany Millipore SigmaZ380059-1PAKużywane do uszczelniania płytki podczas eksperymentu mikroskopowego. Na tym etapie zalecane są membrany oddychające, ponieważ zapobiegają one kondensacji pary wodnej w studzienkach i pozwalają na uzyskanie lepszych obrazów mikroskopowych
Brooks 96-well płaska płytka mikroskopowa z przezroczystego szkłaDot ScientificMGB096-1-2-LG-LPłytka mikroskopowa
Concanavalin A z canavalia ensiformis (Jack Bean), liofilizowany proszekMillipore Sigma45-C2010-1GPrzygotować 5x roztwór konkanawaliny A i zamrozić 5 ml 5x konkanawaliny A w 50 ml stożkowych probówkach w temperaturze -80 & stopni; Używane
szczepy C
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132Szczepy akumulacji mutacji haploidalnych w tle laboratoryjnym, opisane w Hall and Joseph 2010
EP026.2A-2CPotomstwo przodka Halla i Josepha 2010 szczep akumulacji mutacji, przekształcony za pomocą YFR054cΔ::Scw11P: :GFP
Sprzęt
Misonix Sonicator S-4000 z 96-pinową nasadkąSonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E z systememMikroskop odwrócony z automatycznym stolikiem i systemem autofokusa
na odczynniki Fisher Perfect Focus

Bibliografia

  1. Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320(2013).
  2. Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
  3. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
  4. King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
  5. Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
  6. Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
  7. Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325(2012).
  8. van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972(2015).
  9. Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
  10. Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744(2018).
  11. Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
  12. Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
  13. Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
  14. Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
  15. Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
  16. Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
  17. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
  18. Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wzrost mikrokoloniiheterogeniczno ekspresji gen wSaccharomyces cerevisiaemikroskopia time lapseobrazowanie fluorescencyjnezautomatyzowana analiza obrazutest na mikrop ytcepomiar szybko ci wzrostutolerancja na stres

Powiązane artykuły