Artykuł metodologiczny

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

DOI:

10.3791/62041

⸱

16 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 2Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 3Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje test reporterowy do badania regulacji translacji mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdarzenia związane z dojrzewaniem jądra oocytu zostały dobrze opisane. Jednak znacznie mniej wiadomo o szlakach i procesach molekularnych, które zachodzą w cytoplazmie w ramach przygotowań do zapłodnienia i nabycia totipotencji. Podczas dojrzewania oocytów zmiany w ekspresji genów zależą wyłącznie od translacji i degradacji matczynych informacyjnych RNA (mRNA), a nie od transkrypcji. Realizacja programu translacyjnego odgrywa zatem kluczową rolę w ustaleniu kompetencji rozwojowej oocytów w celu podtrzymania rozwoju zarodka. Niniejszy artykuł jest częścią badań nad zdefiniowaniem programu translacji mRNA w organizmie matki, która zachodzi podczas dojrzewania mejotycznego i przejścia oocytu do zygoty. W niniejszej pracy przedstawiono strategię badania regulacji translacji docelowych mRNA podczas dojrzewania oocytów in vitro. W tym przypadku reporter Ypet jest łączony z nieulegającym translacji regionem 3' (UTR) genu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie mikrowstrzykiwany do oocytów wraz z poliadenylowanym mRNA kodującym mCherry w celu kontrolowania wstrzykniętej objętości. Wykorzystując mikroskopię poklatkową do pomiaru akumulacji reportera, oblicza się szybkości translacji przy różnych przejściach podczas dojrzewania mejotycznego oocytów. W tym miejscu opisano protokoły izolacji i iniekcji oocytów, rejestracji poklatkowej i analizy danych, na przykładzie reportera UTR Ypet/interleukina-7 (IL-7)-3'.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pełni rozwinięty oocyt ssaka przechodzi gwałtowne zmiany w przygotowaniu do zapłodnienia i nabycia totipotencji. Zmiany te są niezbędne do podtrzymania rozwoju embrionalnego po zapłodnieniu. Chociaż zdarzenia związane z dojrzewaniem jądrowym są stosunkowo dobrze opisane, znacznie mniej wiadomo o procesach molekularnych i szlakach w cytoplazmie oocytów. Podczas końcowych etapów dojrzewania oocytów oocyty są wyciszone transkrypcyjnie, a ekspresja genów jest całkowicie zależna od translacji i degradacji mRNA1,2. Synteza białek krytycznych dla kompetencji rozwojowych opiera się zatem na programie czasowej translacji długożyciowych mRNA, które zostały zsyntetyzowane wcześniej podczas wzrostu oocytów1,3. W ramach skupienia się na zdefiniowaniu tego programu translacji mRNA matki wykonywanej podczas dojrzewania mejotycznego i podczas przejścia oocytu do zygoty, w artykule przedstawiono strategię badania aktywacji i represji translacji docelowych matczynych mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania mejotycznego in vitro.

W tej metodzie, otwarta ramka odczytu YPet jest klonowana przed 3' UTR interesującej nas transkrypcji. Następnie mRNA kodujące ten reporter są mikrowstrzykiwane do oocytów wraz z poliadenylowanymi mRNA kodującymi mCherry w celu kontroli wstrzykniętej objętości. Akumulacja reporterowa jest mierzona podczas dojrzewania mejotycznego oocytów in vitro za pomocą mikroskopii poklatkowej. Akumulacja białka żółtej fluorescencji (YFP) i mCherry jest rejestrowana w poszczególnych oocytach, a sygnały YFP są korygowane przez plateau poziomu współwstrzykiwanego mCherry. Po pozyskaniu danych oblicza się współczynniki translacji dla różnych przedziałów czasowych podczas dojrzewania mejotycznego oocytów in vitro, obliczając nachylenie krzywej uzyskane przez dopasowanie krzywej.

To podejście dostarcza narzędzia do eksperymentalnego potwierdzania zmian w translacji wybranych endogennych mRNA. Ponadto metoda ta ułatwia charakterystykę elementów regulatorowych, które kontrolują translację podczas dojrzewania mejotycznego oocytów poprzez manipulowanie elementami cis-regulatorowymi 3' UTR docelowych mRNAs4,5,6. Manipulacja długością ogona poli(A) pozwala również na wgląd w aktywność adenylazy/deadenylazy w oocytach5. Mutageneza elementów działających cis lub immunoprecypitacja RNA może być wykorzystana do badania interakcji z pokrewnymi białkami wiążącymi RNA6,7. Dodatkowo, metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji istotnych komponentów programu translacji, które są krytyczne dla kompetencji rozwojowych oocytów, mierząc docelową translację 3' UTR w modelach związanych z obniżoną jakością oocytów 8,9,10. W artykule przedstawiono reprezentatywny eksperyment, w którym ogołoconym oocytom 21-dniowych myszy C57 / BL6 wstrzyknięto mikro reporter Ypet połączony z 3' UTR IL-7. Opisano konfigurację i protokół wstrzykiwania komórek jajowych, nagrywania poklatkowego i analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (protokół AN182026).

1. Przygotowanie mediów

  1. Dodać wszystkie składniki, jak opisano w Tabeli 1, aby uzyskać podstawową pożywkę do pobierania oocytów i pożywkę do dojrzewania oocytów. W przypadku podstawowego podłoża zbiorczego należy ustawić pH na 7,4. Zarówno w przypadku pobierania, jak i pożywki do dojrzewania, w dniu stosowania dodać 3 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 μM cilostamidu.

2. Przygotowanie kodowania mRNA dla Ypet-3' UTR i mCherry

  1. Uzyskaj sekwencje 3′ UTR interesujących mRNA.
    UWAGA: W tym badaniu sekwencje uzyskano wcześniej z cDNA oocytów myszy.
  2. Zaprojektuj startery do amplifikacji docelowych 3' UTR z cDNA oocytu i części wektora pcDNA 3.1 zawierającego sekwencję kodującą Ypet, znacznik epitopu V5 i promotor T7.
  3. Amplifikacja za pomocą zestawu polimerazy DNA o wysokiej wierności. Uruchom produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na żelu, aby sprawdzić, czy fragmenty mają odpowiedni rozmiar, wyciąć prążki i wyekstrahować DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Połącz fragmenty PCR z wektorem za pomocą zestawu do klonowania PCR.
    UWAGA: Fragmenty PCR inkubowano na lodzie przez 4 godziny, aby ułatwić bardziej efektywny proces rekombinacji. Jest to sprzeczne z instrukcjami producenta, które zalecają czas inkubacji wynoszący zaledwie 45 minut.
  5. Transfekcyjna reakcja PCR przekształca się w kompetentne 5-α bakterie Escherichia coli.
    1. Dodaj mieszaninę i plazmid do bakterii i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
    2. Mieszaninę i plazmid poddać szokowi termicznemu, umieszczając mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 45 s i natychmiast schłodzić na lodzie przez 3 minuty.
    3. Dodać 500 μl bulionu Super Optimal z pożywką do represji katabolicznej (SOC) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Wirować z prędkością 7000 × g przez 2 minuty i usunąć większość supernatantu. Zawiesić i umieścić na płytce agarowej Luria Bulion (LB) z odpowiednim doborem antybiotyku.
      UWAGA: W tym badaniu zastosowano karbenicylinę.
    5. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Wyizolować kolonie, lekko naciskając końcówkę pipety na jedną z kolonii i umieszczając ją w 3 ml pożywki LB ze 100 μg/ml karbenicyliny. Inkubować przez 12-24 godziny w temperaturze 37 °C.
    6. Wyodrębnij DNA plazmidów za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta i potwierdź sekwencje za pomocą sekwencjonowania DNA.
  6. Dla Ypet/3' UTR:
    1. Opracowanie liniowej matrycy PCR do transkrypcji in vitro. Użyj startera do przodu przed sekwencją Ypet i startera wstecznego z 20 dodatkowymi pozostałościami tyminy. Patrz Tabela 2 dla sekwencji Ypet/IL-7 3' UTR oraz sekwencji starterów do przodu i do tyłu.
      UWAGA: Te dodatkowe reszty tyminy dodadzą oligo(A) do liniowego mRNA po transkrypcji in vitro.
    2. Transkrybować produkt PCR in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji T7 zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Oczyść powstały komplementarny RNA (cRNA) za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Eluować oczyszczone cRNA w wodzie wolnej od RNAzy, mierzyć stężenie i oceniać integralność za pomocą elektroforezy agarozowej. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Dla mCherry:
    1. Stwórz liniową matrycę PCR do transkrypcji in vitro przy użyciu enzymu restrykcyjnego o wysokiej wierności; użyj enzymu restrykcyjnego mfEI-HF, jeśli replikujesz ten przykład. Trawić w buforze mineralizacyjnym przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Uruchom żel, aby oczyścić próbkę i wyekstrahować liniowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Transkrybować produkt PCR in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji T7 zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Poliadenylować cRNA (150-200 nukleotydów) za pomocą zestawu do ogonowania poli(A) zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Oczyść powstałe cRNA za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Eluuj oczyszczone cRNA w wodzie wolnej od RNAzy, zmierz stężenia mRNA i oceń integralność wiadomości za pomocą elektroforezy żelowej. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Procedura eksperymentalna

UWAGA: Schematyczny przegląd mikroiniekcji oocytów i późniejszej mikroskopii poklatkowej znajduje się w Rysunek 1.

  1. Dzień 1
    1. Dootrzewnowo wstrzyknąć 21-dniowym myszom 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy, aby przyspieszyć wzrost pęcherzyków do stadium antralnego11.
  2. Dzień 3
    1. Pobieranie komórek jajowych
      1. Ofiaruj myszy 44-48 godzin po przygotowaniu, aby zebrać jajniki i umieść je na plastikowej szalce Petriego z podstawową pożywką do pobierania oocytów.
      2. Ostrożnie otwórz pęcherzyki antralne, wykonując małe nacięcie w ścianie pęcherzyka za pomocą igły 26 G. Wyizoluj nienaruszone oocyty zamknięte w wzgórkach (COC) z kilkoma warstwami komórek wzgórka za pomocą szklanej pipety obsługiwanej przez usta.
      3. Użyj mniejszej pipety (nieco większej niż średnica oocytu) i mechanicznie usuń COC poprzez wielokrotne pipetowanie.
        UWAGA: Alternatywnie należy wykonać mikroiniekcję na nienaruszone COC.
      4. Za pomocą większej pipety odessać ogołocone oocyty i umieścić je na szalce Petriego z pożywką do dojrzewania uzupełnioną 1 μM inhibitora fosfodiesterazy, cylostamidu, aby zapobiec wznowieniu dojrzewania mejotycznego12. Umieść naczynie w inkubatorze na 2 godziny, aby oocyty mogły zregenerować się po stresie wywołanym izolacją oocytów od pęcherzyków.
    2. Mikroiniekcja komórek jajowych
      1. Przygotować igły do wstrzykiwań, umieszczając rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego o długości 10 cm w mechanicznym ściągaczu. W celu uzyskania optymalnego wstrzyknięcia, należy zegnąć końcówkę igły pod kątem 45° za pomocą podgrzanego filamentu.
      2. Przygotuj naczynia styropianowe z 20 μl kropelkami podstawowego podłoża do pobierania oocytów i przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym.
      3. Przygotuj mieszankę reporterową, dodając 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR i 12,5 μg/μL mCherry. Przygotować większą objętość i wykonać porcje do przyszłych doświadczeń, aby zapewnić podobne stężenia reporterowe. Przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Po rozmrożeniu najpierw odwirować podwielokrotność porcji przez 2 minuty przy 20 000 x g i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki.
        UWAGA: To wirowanie zapobiegnie zatkaniu igły iniekcyjnej przez potencjalne agregaty w mieszance reporterowej.
      4. Obciążyć igłę iniekcyjną kapilarnie około 0,5 μl mieszanki reporterowej.
      5. Umieścić pipetę przytrzymującą i załadowaną igłę do wstrzykiwań w uchwytach i umieścić w kropli pożywki do pobierania oocytów. Odessać część pożywki do pipety podtrzymującej.
      6. Otworzyć igłę do wstrzykiwań, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą.
      7. Umieścić oocyty w kropli zasadowej pożywki zbiorczej i wstrzyknąć 5-10 ml mieszanki reporterowej.
      8. Inkubować oocyty w pożywce dojrzewającej z 1 μM cilostamidem przez 16 godzin, aby sygnał mCherry ustabilizował się.
      9. Przygotować szalkę Petriego, która będzie używana do mikroskopii poklatkowej z co najmniej dwiema kroplami pożywki dojrzewającej o objętości 20 μl na każdy wstrzyknięty reporter: jedną kroplę z 1 μM cilostamidem do kontroli oocytów zatrzymanych w profazie I i jedną kroplę bez cylostamidu dla dojrzewających oocytów. Przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym i umieść w inkubatorze.
    3. Mikroskopia poklatkowa
      1. Po wstępnej inkubacji należy wyjąć wstrzyknięte oocyty z inkubatora i przemyć je czterokrotnie w pożywce do dojrzewania bez cilostamidu. Trzymaj niektóre oocyty w pożywce do dojrzewania z 1 μM cilostamidem jako grupą kontrolną oocytów zatrzymaną w profazie I.
      2. Przenieś wstrzyknięte oocyty do odpowiednich kropelek na wcześniej przygotowanej czaszy mikroskopu poklatkowego. Zgrupuj oocyty za pomocą zamkniętej szklanej pipety (zamkniętą pipetę można przygotować, trzymając końcówkę w płomieniu przez kilka sekund).
        UWAGA: Grupowanie oocytów pomaga zapobiegać ich ruchowi podczas nagrywania.
      3. Umieścić szalkę pod mikroskopem wyposażonym w system oświetlenia diodami elektroluminescencyjnymi i zmotoryzowany stolik wyposażony w komorę środowiskową utrzymywaną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Aby powtórzyć to badanie, użyj następujących parametrów: zestaw filtrów: lustro dichroiczne YFP/CFP/mCherry 69008BS; Kanał YFP (wzbudzenie (Ex): S500/20 × 49057; Emisja (EM): D535/30 m 47281), mKanał Cherry (np.: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
      4. Wprowadź odpowiednie ustawienia dla eksperymentu poklatkowego (patrz Spis materiałów dla oprogramowania użytego w tym badaniu): Kliknij Aplikacje | Akwizycja wielowymiarowa. Wybierz pierwszą zakładkę Main i wybierz timelapse, wiele pozycji stage i wiele długości fal.
      5. Wybierz zakładkę Zapisywanie, aby wprowadzić lokalizację, w której eksperyment ma zostać zapisany.
      6. Wybierz zakładkę Timelapse, aby wprowadzić liczbę punktów czasowych, czas trwania i przedział czasu.
        UWAGA: Czas trwania eksperymentu poklatkowego zależy od badanego gatunku zwierząt, ponieważ czas dojrzewania mejotycznego oocytów różni się w zależności od gatunku. W tym eksperymencie z oocytami myszy oocyty rejestrowano co 15 minut przez 16 godzin.
      7. Wybierz zakładkę Etap. Włącz jasne pole i zlokalizuj położenie oocytów, otwierając nowe okno, wybierając Acquire | Nabywanie | Pokaż na żywo. Po zlokalizowaniu oocytów przełącz się z powrotem do okna Akwizycja wielowymiarowa i naciśnij +, aby ustawić lokalizację oocytów.
      8. Wybierz zakładkę Długości fal i ustaw 3 różne długości fal dla jasnego pola (ekspozycja 15 ms), YFP (ekspozycja 150 ms dla Ypet/IL7 3' UTR) i mCherry (ekspozycja 75 ms dla Ypet/IL7 3' UTR).
        UWAGA: Dostosuj ekspozycję dla każdego reportera Ypet/3' UTR w oparciu o poziom akumulacji reportera i wstrzykniętą objętość. Upewnij się, że sygnał YFP znajduje się w środku zakresu detekcji na początku eksperymentu, aby zapobiec niedoszacowaniu lub nasyceniu w przypadku aktywacji translacji. W przypadku mCherry dostosuj ekspozycję dla każdej partii mCherry, ponieważ sygnał zależy od liczby nukleotydów adeninowych, które zostały dodane podczas procedury poliadenylacji. Ze względu na różnice w skuteczności poliadenylacji, użyj tej samej partii mCherry w różnych eksperymentach, aby uzyskać lepsze porównanie między eksperymentami.
      9. Rozpocznij eksperyment poklatkowy, klikając przycisk Pobierz. Zobacz Rysunek 2 i Plik uzupełniający dla przykładu nagrania poklatkowego w pojedynczym oocycie.
    4. Analiza translacji Ypet-3' UTR
      1. W celu przeprowadzenia tej analizy (patrz Tabela materiałów dla oprogramowania użytego w tym badaniu) wykonaj dwa pomiary regionu dla każdego oocytu: samego oocytu - kliknij obszar elipsy i otocz oocyt - oraz mały obszar blisko oocytu, który ma być użyty do odejmowania tła - kliknij na obszar prostokątny.
        UWAGA: Upewnij się, że oocyty nie wychodzą poza wybrany region podczas nagrywania poklatkowego. Zwróć szczególną uwagę na umiejscowienie obszaru pomiaru wokół wytłoczenia ciała polarnego, ponieważ powoduje to ruch w oocycie i może zniekształcić zapis.
      2. Wyeksportuj dane pomiarowe regionu do arkusza kalkulacyjnego, klikając najpierw Otwórz dziennik, a następnie Dane dziennika, aby wyeksportować oprogramowanie do analizy danych.
      3. Dla każdego pojedynczego oocytu i dla wszystkich zmierzonych punktów czasowych odejmij pomiar regionu tła od pomiaru regionu oocytu. Zrób to osobno dla długości fal YFP i mCherry.
      4. Zapisz czas rozpadu pęcherzyków rozrodczych (GVBD) i wytłaczania ciał polarnych (PBE) do późniejszego wykorzystania.
        UWAGA: Wyklucz dojrzewające oocyty myszy, gdy GVBD przekracza 2 godziny.
      5. Wykreśl ekspresję YFP i mCherry w czasie dla każdego oocytu, aby sprawdzić, czy nie ma wartości odstających.
        UWAGA: Powinna to być gładka krzywa, jeśli tak nie jest, może to oznaczać, że oocyt poruszył się podczas nagrania.
      6. Dla każdego pojedynczego oocytu oblicz średnią ekspresję mCherry dla ostatnich dziesięciu punktów czasowych zapisu. Dla każdego punktu czasowego podziel ekspresję YFP przez uśrednioną ekspresję mCherry, aby skorygować objętość wstrzykniętej wiśni, aby uzyskać stosunek YFP/mCherry w każdym punkcie czasowym dla każdego pojedynczego oocytu.
      7. Obliczanie szybkości translacji dla określonego przedziału czasu poprzez dopasowanie nachylenia krzywej za pomocą regresji liniowej. Oceń różnice w szybkości tłumaczeń za pomocą wnioskowania statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozbawione profazy I-zatrzymane oocyty 21-dniowych myszy C57/BL6 zostały wstrzyknięte za pomocą mieszanki reporterowej zawierającej mRNA kodujące reporter Ypet połączony z 3' UTR IL-7 i mRNA kodujące mCherry. Ekspresję YFP i mCherry odnotowano w 39 oocytach, z których 30 było dojrzałych, a 9 zostało zatrzymanych w profazie I jako kontrola ujemna. Trzy dojrzewające oocyty zostały wykluczone do analizy, ponieważ albo miały opóźniony GVBD (N = 2), albo poruszały się w naczyniu podczas rejestracji (N = 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda opisuje strategię badania aktywacji i represji translacji docelowego mRNA przy różnych przejściach podczas dojrzewania mejotycznego oocytów in vitro. Do opisania tej metody wybrano IL-7, cytokinę uwalnianą przez oocyt, która może brać udział w komunikacji między komórką oocytowąa wzgórkiem 8,13. Wiadomo, że IL-7 ulega coraz większej translacji podczas dojrzewania oocytów8 i pozwala na dobrą wizualizację aktywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH R01 GM097165, GM116926 i Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 Marco Conti. Enrico M. Daldello otrzymał stypendium Fundacji Lalor, a Natasja G. J. Costermans otrzymała stypendium Rubicon od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przygotowanie pożywki
Surowica bydlęca Albumina w proszku BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
CilostamidEMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-AldrichM2645
Penicylina-Streptomycyna 100x Roztwór, sterylny filtrowanyGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Wodorowęglan sodu JT-Baker3506-1
Pirogronian soduGibco 11360-070
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977-015
Przygotowanie mRNA kodującego YFP/3' UTR i mCherry
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Sól disodowa karbenicylinySigma-AldrichC1389-1G
Zestaw do klonowania ciuchciMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)New England BiolabsB7204
ładujący DNA (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP SolutionNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb drabinka DNAThermo FisherSM1333
LB Płytki agarowe ze 100 i mikro; g/ml karbenicyliny, Teknova TeknovaL1010
LB Medium (kapsułki)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Zestaw do czyszczenia transkrypcji LifeTechnologiesAM1908
Enzym restrykcyjny MfeI-HFNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Zestaw do transkrypcjiInvitrogenAM1344
Phusion High Fidelity DNA polimerazaNew England BiolabsM0530
Poly(A) Zestaw do usuwania odpadówInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
bufor TAE Apex Biomedyczny 20-193
Ultrapure Ethidium Bromide SolutionLife Technologies15585011
Oocyte collection
Zestaw probówek aspiratora do kalibrowanych mikropipetSigma-AldrichA5177-5EA
Kalibrowane mikropipetyDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
Igła PrecisionGlide 26 G x 1/2BD305111
Strzykawka 1 mlBD309659
Oocyte mikroiniekcja
35 mm Naczynie | Szkiełko nakrywkowe nr 0 | Średnica szkła 20 mm | NiepowlekanyMatTekP35G-0-20-CDo mikroskopii poklatkowej
Szkło borokrzemianowe z żarnikiemSutter InstrumentBF100-78-10
Olej do hodowli zarodkówIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon 351006do mikroiniekcji
Naczynie do hodowli tkankowychFalcon353001Do inkubacji oocytów
VacuTip Holding KapilaraEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderPrzygotowanie Figure 1S
MetaMorph, wersja 7.8.13.0 Urządzenia molekularne  Do mikroskopii poklatkowej, analiza translacji 3' UTR 
barwnik

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
  3. Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
  4. Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
  5. Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
  6. Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399(2020).
  7. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  8. Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
  9. Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
  10. Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
  11. Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
  12. Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  13. Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
  14. Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
  15. Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).
  16. Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
  17. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  18. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).
  19. Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
  20. Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
  21. Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  23. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  24. Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
  25. Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
  26. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  27. Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Maternal mRNA TranslationOocyte MaturationSingle Oocyte AssayIn Vitro MaturationReporter AccumulationTime Lapse MicroscopyOocyte InjectionCumulus Oocyte ComplexTranslation RegulationYFP mCherry Ratio

Powiązane artykuły