Ten protokół przedstawia rutynową metodę korzystania z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBF-SEM), potężnej techniki obrazowania 3D. Skuteczne zastosowanie SBF-SEM zależy od prawidłowych technik utrwalania i barwienia tkanek, a także od starannego rozważenia ustawień obrazowania. Protokół ten zawiera praktyczne rozważania dotyczące całego tego procesu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa ze skaningiem blokowym (SBF-SEM) próbek tkanek biologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBF-SEM) pozwala na gromadzenie setek do tysięcy seryjnie rejestrowanych obrazów ultrastrukturalnych, oferując niespotykany dotąd trójwymiarowy widok mikroanatomii tkanek. Chociaż w ostatnich latach SBF-SEM odnotował gwałtowny wzrost stosowania, aspekty techniczne, takie jak odpowiednie przygotowanie tkanek i parametry obrazowania, mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tej metody obrazowania. Ten system obrazowania korzysta ze zautomatyzowanego charakteru urządzenia, które pozwala na pozostawienie mikroskopu bez nadzoru podczas procesu obrazowania, z możliwością automatycznego zbierania setek obrazów w ciągu jednego dnia. Jednak bez odpowiedniego przygotowania tkanek ultrastruktura komórkowa może zostać zmieniona w taki sposób, że można wyciągnąć błędne lub wprowadzające w błąd wnioski. Ponadto obrazy są generowane poprzez skanowanie powierzchni blokowej próbki biologicznej zatopionej w żywicy, co często wiąże się z wyzwaniami i kwestiami, którymi należy się zająć. Nagromadzenie elektronów w bloku podczas obrazowania, znane jako "ładowanie tkanki", może prowadzić do utraty kontrastu i niemożności docenienia struktury komórkowej. Co więcej, zwiększenie natężenia/napięcia wiązki elektronów lub zmniejszenie prędkości skanowania wiązki może zwiększyć rozdzielczość obrazu, ale może to mieć również niefortunny efekt uboczny w postaci uszkodzenia bloku żywicy i zniekształcenia kolejnych obrazów w serii obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy rutynowy protokół przygotowania próbek tkanek biologicznych, który zachowuje ultrastrukturę komórkową i zmniejsza obciążenie tkanek. Zapewniamy również rozważania dotyczące obrazowania w celu szybkiego uzyskania wysokiej jakości obrazów seryjnych przy minimalnym uszkodzeniu bloku tkankowego.
Wprowadzenie
Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBF-SEM) została po raz pierwszy opisana przez Leightona w 1981 roku, gdzie stworzył skaningowy mikroskop elektronowy wzbogacony o wbudowany mikrotom, który mógł ciąć i obrazować cienkie odcinki tkanki zanurzonej w żywicy. Niestety, ograniczenia techniczne ograniczyły jego użycie do próbek przewodzących, ponieważ próbki nieprzewodzące, takie jak tkanka biologiczna, gromadziły niedopuszczalne poziomy ładunku (nagromadzenie elektronów w próbce tkanki)1. Powlekanie powierzchni bloku między cięciami odparowanym węglem zmniejszyło obciążenie tkanek, co znacznie wydłużyło czas pozyskiwania obrazu i przechow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi opisanymi w Oświadczeniu Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach wizyjnych i okulistycznych oraz wytycznych University of Houston College of Optometry dotyczących obchodzenia się ze zwierzętami. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucje, w których miały do czynienia: procedury dotyczące myszy, szczurów, królików, świnek morskich i naczelnych zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Houston, procedury dotyczące danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rogówka myszy
Niniejszy protokół był szeroko stosowany w badaniach rogówki myszy. Wykorzystując obrazowanie SBF-SEM wykazano obecność sieci pęczków mikrowłókien pozbawionych elastyny (EFMBs) w rogówce dorosłej myszy. Wcześniej uważano, że sieć ta występuje jedynie podczas rozwoju zarodkowego i wczesnego okresu postnatalnego. SBF-SEM ujawniło rozległą sieć EFMB w całej rogówce, przy czym pojedyncze włókna miały średnicę 100-200 nm w pomiarach w przekroju poprzecznym. Stwierdzono również, że sieć EFMB .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tego artykułu jest zwrócenie uwagi na metodologię przygotowania tkanek i obrazowania, która pozwoliła naszemu laboratorium niezawodnie rejestrować obrazy z seryjnej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości, a także wskazanie krytycznych kroków, które prowadzą do tego wyniku, a także potencjalnych pułapek, które mogą wystąpić podczas wykonywania obrazowania SBF-SEM. Sukces przy użyciu tego protokołu wymaga odpowiedniego utrwalenia tkanki, impregnacji metali ciężkich w próbce, modyfikacji żywicy osadzającej.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Dr. Samowi Hanlonowi, Evelyn Brown i Margaret Gondo za ich doskonałą pomoc techniczną. Badania te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 i P30 EY007551 (National Eye Institute), częściowo przez Lion's Foundation for Sight, a częściowo przez NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1/16 x 3/8 Nity aluminiowe | Nit przemysłowy i Łącznik Co. | 6N37RFLAP/1100 | Używany jako kołki do próbek. |
| Wkrętak płaski 2,5 mm | Wiha Quality Tools | 27225 | |
| Mikroskopia elektronowa acetonu | Sciences | RT 10000 | Służy do rozcieńczania farby srebrnej. |
| Kwas asparaginowy | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| Chlorek wapnia | FisherScientific | C79-500 | |
| Przewodząca srebrna farba | Ted Pella | 16062 | |
| Denton Desk-II Urządzenie do napylania próżniowego wyposażone w standardową tarczę ze złotej folii | Denton Vacuum | N/A | Jest to urządzenie do napylania złota używane przez autorów, dopuszczalne są alternatywy. |
| Obosieczne maszynki do golenia | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
| Embed 812 | Mikroskopia elektronowa Sciences | 14120 | |
| Gatan 3View2 zamontowany w Tescan Mira3 Emisja pola SEM | Gatan & Tescan | N/A | Jest to urządzenie SBF-SEM używane przez autorów, dopuszczalne są alternatywy. |
| Fiolki ze szklaną skorupą, 0,5 DRAM (1,8 ml) | Mikroskopia elektronowa Nauki | 72630-05 | |
| Mikroskopia elektronowa | aldehydu gluterowego | 16320 | |
| Gorilla Super Glue - Impact Tough | NA | NA | Określany w tekście jako klej cyjanoakrylowy. |
| Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | W tekście określany jako sadza. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| Azotan ołowiu | Fisher Scientific | L62-100 | |
| Kuchenka mikrofalowa | Pelco | BioWave Pro | Jest to kuchenka mikrofalowa używana przez autorów, dopuszczalne są alternatywy. |
| Tetratlenek osmu | Sigma-Aldrich | 201030 | |
| Żelazocyjanek potasu | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Silikonowa forma do zatapiania | Ted Pella | 10504 | |
| Kakodylan sodu Trójwodzian | Mikroskopia elektronowa Sciences | 12300 | |
| Pipeta transferowa Samco | ThermoFisher Scientific | 202 | Służy do wykonania szpilki do próbki rurki do przechowywania. |
| Szwajcarskie pilniki igłowe | Mikroskopia elektronowa Nauki | 62115 | |
| Tiokarbohydrazyd | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Octan uranylu | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
| Reconstruction Software | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Służy do tworzenia rekonstrukcji znajdujących się na rysunkach 5-7 i 9. |
| Fidżi (Fidżi to tylko ImageJ) | ImageJ.net | Nie dotyczy | TrakEM2 można dodać do Fidżi, aby ułatwić ręczną segmentację. |
| Przeglądarka obrazów mikroskopowych (MIB) | Uniwersytet w Helsinkach, Instytut Biotechnologii | Nie dotyczy | |
| Oprogramowanie do rekonstrukcji | Laboratorium systemów neuronowych | Nie | |
| Stół warsztatowy SuRVoS | Diamentowe źródło światła i Uniwersytet w Nottingham | N/A | |
| SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | Pozwala na rekonstrukcję w rzeczywistości wirtualnej i metody rekonstrukcji oparte na histogramie. |
Bibliografia
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscop....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
