Artykuł metodologiczny

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa ze skaningiem blokowym (SBF-SEM) próbek tkanek biologicznych

DOI:

10.3791/62045

⸱

26 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia rutynową metodę korzystania z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBF-SEM), potężnej techniki obrazowania 3D. Skuteczne zastosowanie SBF-SEM zależy od prawidłowych technik utrwalania i barwienia tkanek, a także od starannego rozważenia ustawień obrazowania. Protokół ten zawiera praktyczne rozważania dotyczące całego tego procesu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBF-SEM) pozwala na gromadzenie setek do tysięcy seryjnie rejestrowanych obrazów ultrastrukturalnych, oferując niespotykany dotąd trójwymiarowy widok mikroanatomii tkanek. Chociaż w ostatnich latach SBF-SEM odnotował gwałtowny wzrost stosowania, aspekty techniczne, takie jak odpowiednie przygotowanie tkanek i parametry obrazowania, mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tej metody obrazowania. Ten system obrazowania korzysta ze zautomatyzowanego charakteru urządzenia, które pozwala na pozostawienie mikroskopu bez nadzoru podczas procesu obrazowania, z możliwością automatycznego zbierania setek obrazów w ciągu jednego dnia. Jednak bez odpowiedniego przygotowania tkanek ultrastruktura komórkowa może zostać zmieniona w taki sposób, że można wyciągnąć błędne lub wprowadzające w błąd wnioski. Ponadto obrazy są generowane poprzez skanowanie powierzchni blokowej próbki biologicznej zatopionej w żywicy, co często wiąże się z wyzwaniami i kwestiami, którymi należy się zająć. Nagromadzenie elektronów w bloku podczas obrazowania, znane jako "ładowanie tkanki", może prowadzić do utraty kontrastu i niemożności docenienia struktury komórkowej. Co więcej, zwiększenie natężenia/napięcia wiązki elektronów lub zmniejszenie prędkości skanowania wiązki może zwiększyć rozdzielczość obrazu, ale może to mieć również niefortunny efekt uboczny w postaci uszkodzenia bloku żywicy i zniekształcenia kolejnych obrazów w serii obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy rutynowy protokół przygotowania próbek tkanek biologicznych, który zachowuje ultrastrukturę komórkową i zmniejsza obciążenie tkanek. Zapewniamy również rozważania dotyczące obrazowania w celu szybkiego uzyskania wysokiej jakości obrazów seryjnych przy minimalnym uszkodzeniu bloku tkankowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBF-SEM) została po raz pierwszy opisana przez Leightona w 1981 roku, gdzie stworzył skaningowy mikroskop elektronowy wzbogacony o wbudowany mikrotom, który mógł ciąć i obrazować cienkie odcinki tkanki zanurzonej w żywicy. Niestety, ograniczenia techniczne ograniczyły jego użycie do próbek przewodzących, ponieważ próbki nieprzewodzące, takie jak tkanka biologiczna, gromadziły niedopuszczalne poziomy ładunku (nagromadzenie elektronów w próbce tkanki)1. Powlekanie powierzchni bloku między cięciami odparowanym węglem zmniejszyło obciążenie tkanek, co znacznie wydłużyło czas pozyskiwania obrazu i przechowywania obrazów, ponieważ ówczesna technologia komputerowa była niewystarczająca do zarządzania dużymi rozmiarami plików tworzonych przez urządzenie. Metodologia ta została ponownie przeanalizowana przez Denka i Horstmanna w 2004 roku przy użyciu SBF-SEM wyposażonego w komorę o zmiennym ciśnieniu2. Pozwoliło to na wprowadzenie pary wodnej do komory obrazowania, co zmniejsza ładunek w próbce, dzięki czemu obrazowanie próbek nieprzewodzących jest wykonalne, choć przy utracie rozdzielczości obrazu. Dalsze ulepszenia w metodach przygotowania tkanek i obrazowania pozwalają teraz na obrazowanie przy użyciu wysokiej próżni, a obrazowanie SBF-SEM nie polega już na parze wodnej w celu rozproszenia ładunku3,4,5,6,7,8,9. Chociaż w ostatnich latach SBF-SEM odnotował gwałtowny wzrost stosowania, aspekty techniczne, takie jak odpowiednie przygotowanie tkanek i parametry obrazowania, mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tej metody obrazowania.

SBF-SEM pozwala na automatyczne gromadzenie tysięcy seryjnie rejestrowanych obrazów mikroskopii elektronowej, o rozdzielczości planarnej tak małej jak 3-5 nm10,11. Tkankę nasączoną metalami ciężkimi i zatopioną w żywicy umieszcza się w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM) zawierającym ultramikrotom wyposażony w nóż diamentowy. Płaska powierzchnia jest cięta nożem diamentowym, nóż jest chowany, a powierzchnia bloku jest skanowana we wzorze rastrowym za pomocą wiązki elektronów w celu stworzenia obrazu ultrastruktury tkanki. Blok jest następnie podnoszony o określoną wartość (np. 100 nm) w osi z, znany jako "krok z", a nowa powierzchnia jest cięta przed powtórzeniem procesu. W ten sposób tworzony jest trójwymiarowy (3D) blok obrazów podczas wycinania tkanki. Ten system obrazowania dodatkowo korzysta ze zautomatyzowanego charakteru urządzenia, które pozwala na pozostawienie mikroskopu bez nadzoru podczas procesu obrazowania, z możliwością automatycznego zbierania setek obrazów w ciągu jednego dnia.

Podczas gdy obrazowanie SBF-SEM wykorzystuje głównie elektrony wstecznie rozproszone do tworzenia obrazu powierzchni bloku, podczas procesu obrazowania generowane są elektrony wtórne12. Elektrony wtórne mogą gromadzić się wraz z elektronami rozpraszanymi wstecznie i wiązką pierwotną, które nie uciekają z bloku, i wytwarzać "ładunek tkankowy", który może prowadzić do zlokalizowanego pola elektrostatycznego na powierzchni bloku. Ta akumulacja elektronów może zniekształcić obraz lub spowodować wyrzucenie elektronów z bloku i przyczynić się do sygnału zebranego przez detektor rozproszenia wstecznego, zmniejszając stosunek sygnału do szumu13. Podczas gdy poziom ładowania tkanki może być zmniejszony poprzez zmniejszenie napięcia lub intensywności wiązki elektronów lub skrócenie czasu przebywania wiązki, powoduje to zmniejszenie stosunku sygnału do szumu14. Gdy używana jest wiązka elektronów o niższym napięciu lub natężeniu, lub gdy wiązka może przebywać w każdej przestrzeni pikseli tylko przez krótszy czas, mniej elektronów rozpraszanych wstecznie jest wyrzucanych z tkanki i wychwytywanych przez detektor elektronów, co skutkuje słabszym sygnałem. Denk i Horstmann poradzili sobie z tym problemem, wprowadzając parę wodną do komory, zmniejszając w ten sposób ładunek w komorze i na powierzchni bloku kosztem rozdzielczości obrazu. Przy ciśnieniu w komorze 10-100 Pa część wiązki elektronów jest rozpraszana, przyczyniając się do szumu obrazu i utraty rozdzielczości, jednak powoduje to również wytwarzanie jonów w komorze próbki, które neutralizują ładunek w bloku próbki2. Nowsze metody neutralizacji ładunku w bloku próbki wykorzystują wstrzykiwanie azotu do gazu ogniskowego przez powierzchnię bloku podczas obrazowania lub wprowadzenie ujemnego napięcia do stopnia SBF-SEM w celu zmniejszenia energii ładowania wiązki sondy i zwiększenia zbieranego sygnału6,7,15. Zamiast wprowadzać odchylenie stopnia, ciśnienie w komorze lub miejscową wtrysk azotu w celu zmniejszenia gromadzenia się ładunku na powierzchni bloku, możliwe jest również zwiększenie przewodności żywicy poprzez wprowadzenie węgla do mieszanki żywicy, co pozwala na bardziej agresywne ustawienia obrazowania16. Poniższy ogólny protokół jest adaptacją protokołu Deerinck et al. opublikowanego w 2010 roku i obejmuje modyfikacje metodologii przygotowania tkanek i obrazowania, które uznaliśmy za przydatne do zminimalizowania ładowania tkanek przy zachowaniu akwizycji obrazu w wysokiej rozdzielczości3,17,18,19. Podczas gdy wcześniej wspomniany protokół koncentrował się na przetwarzaniu tkanek i impregnacji metalami ciężkimi, protokół ten zapewnia wgląd w proces obrazowania, analizy danych i rekonstrukcji nieodłącznie związany z badaniami SBF-SEM. W naszym laboratorium protokół ten został z powodzeniem i powtarzalnie zastosowany do szerokiej gamy tkanek, w tym rogówki i struktur przednich segmentów, powiek, gruczołu łzowego i twardziela, siatkówki i nerwu wzrokowego, serca, płuc i dróg oddechowych, nerek, wątroby, mięśni cremaster i kory mózgowej / rdzenia, a także u różnych gatunków, w tym myszy, szczura, królika, świnki morskiej, ryby, jednowarstwowe i warstwowe hodowle komórkowe, świnie, naczelne inne niż człowiek, a także człowiek20,21,22,23. Chociaż niewielkie zmiany mogą być opłacalne w przypadku określonych tkanek i zastosowań, ten ogólny protokół okazał się wysoce powtarzalny i przydatny w kontekście naszego głównego ośrodka obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi opisanymi w Oświadczeniu Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach wizyjnych i okulistycznych oraz wytycznych University of Houston College of Optometry dotyczących obchodzenia się ze zwierzętami. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucje, w których miały do czynienia: procedury dotyczące myszy, szczurów, królików, świnek morskich i naczelnych zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Houston, procedury dotyczące danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu DePauw, a procedury dotyczące świń zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Baylor College of Medicine. Wszystkie tkanki ludzkie zostały potraktowane zgodnie z Deklaracją Helsińską dotyczącą badań nad tkankami ludzkimi i uzyskano odpowiednią zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej.

1. Przetwarzanie tkanek

  1. Przygotować roztwór podstawowy 0,4 M buforu kakodylanu sodu, mieszając proszek kakodylanu sodu z ddH2O. Dokładnie wymieszać bufor i pH dostosować roztwór do 7,3. Bufor ten służy do wytwarzania utrwalacza (skład opisany poniżej w kroku 1.3), buforu myjącego, a także roztworów żelazocyjanku osmu i potasu.
    UWAGA: Fiksacja perfuzyjna jest często najlepszą metodą fiksacji w badaniach SBF-SEM, ponieważ fiksacja następuje szybko i w całym ciele. Jeśli fiksacja perfuzji nie jest możliwa w ramach projektu badania, przejdź do kroku 1.3.
  2. Wykonaj utrwalenie perfuzyjne z odpowiednim ciśnieniem fizjologicznym dla modelu zwierzęcego24,25,26. Odbywa się to poprzez sekwencyjną perfuzję przezsercową z heparynizowaną solą fizjologiczną, a następnie utrwalaczem, z których każdy umieszcza się na określonej wysokości (np. 100 cm) nad organizmem (odpowiednim do fizjologicznego ciśnienia układu naczyniowego w modelu zwierzęcym), przy czym utrwalacz wpływa do lewej komory i wychodzi z nacięcia wykonanego w prawym przedsionku. Tkanka będąca przedmiotem zainteresowania stanie się blada, gdy krew zostanie zastąpiona utrwalaczem, jeśli cała lub część tkanki nie bluźnie, tkanka może nie być odpowiednio utrwalona, a ultrastruktura może nie zostać zachowana.
  3. Użyj żyletki lub ostrego skalpela, aby przyciąć próbki tkanek do bloków nie większych niż 2 mm x 2 mm x 2 mm. Jeśli krok 1.2 został pominięty, zrób to szybko, aby można było jak najszybciej zamocować tkankę w zanurzeniu.
    1. Alternatywnie, wypreparuj tkankę pod utrwalaczem i przenieś do świeżego utrwalacza, aby zakończyć proces zanurzenia. Ostateczny skład utrwalacza składa się z 0,1 M buforu kakodylanu sodu zawierającego 2,5% aldehydu glutarowego i 2 mM chlorku wapnia. Pozostawić utrwalanie na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej i maksymalnie na noc w temperaturze 4 °C. Jeśli to możliwe, użyj kołyski/płytki przechylnej, aby delikatnie poruszyć próbki podczas mocowania.
    2. Alternatywnie, jeśli dostępna jest kuchenka mikrofalowa z inwerterem, utrwalij tkankę we wspomnianym wcześniej utrwalaczu pod próżnią o mocy 150 watów przez 4 cykle po 1 minutę włączenia, 1 minutę wyłączenia. Utrwalanie mikrofalowe jest preferowaną metodą w kroku 1.3, ponieważ szybko utrwala tkankę i zachowuje ultrastrukturę tkanki27.
      UWAGA: Nigdy nie należy dopuścić do wyschnięcia tkanki podczas tego protokołu, należy zachować ostrożność, aby szybko przenieść tkankę z jednego roztworu do drugiego.
  4. Myć utrwaloną tkankę 5x przez 3 minuty (łącznie 15 minut) w temperaturze pokojowej w 0,1 M buforze kakodylanu sodu zawierającym 2 mM chlorku wapnia.
  5. Przygotować następujący roztwór żelazocyjanku osmu na świeżo, najlepiej podczas poprzednich etapów mycia. Połączyć 4% roztwór tetratlenku osmu (przygotowany wddH2O) o równej objętości 3% żelazocyjanku potasu w 0,2 M buforze kakodylowym z 4 mM chlorku wapnia. Po poprzednim etapie mycia umieść chusteczkę w tym roztworze na 1 godzinę na lodzie w ciemności i w dygestorium.
    UWAGA: Tetroxide osmu to żółta krystaliczna substancja występująca w ampułku. Aby utworzyć roztwór tetratlenku osmu, otwórz ampułkę, dodaj ddH2O i sonikuj przez 3-4 godziny w ciemności, aż kryształy całkowicie się rozpuszczą. Roztwór tetratlenku osmu jest przezroczystym żółtym roztworem, jeśli roztwór jest, osm został zredukowany i nie powinien być już używany.
  6. Podczas inkubacji tkanki w roztworze żelazocyjanku osmu należy rozpocząć przygotowywanie roztworu tiokarbohydrazydu (TCH). Przygotować ten roztwór w stanie świeżym i mieć go pod ręką pod koniec 1-godzinnego okresu wiązania żelazocyjanku osmu. Połączyć 0,1 g tiokarbohydrazydu z 10 ml ddH2O i umieścić ten roztwór w suszarce o temperaturze 60 °C na 1 godzinę. Aby upewnić się, że roztwór się rozpuścił, delikatnie obracaj co 10 minut. Przed użyciem przefiltrować ten roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
  7. Przed inkubacją w NT przemyć tkankę roztworem o temperaturze pokojowej ddH2O 5x przez 3 minuty (łącznie 15 minut).
  8. Umieść tkankę w przefiltrowanym roztworze TCH na łącznie 20 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 1A-C).
  9. Po inkubacji w TCH przemywać tkankę 5 razy przez 3 minuty (łącznie 15 minut) w temperaturze pokojowej ddH2O.
  10. Umieścić tkankę w ddH2O zawierającym 2% tetratlenku osmu (nie osmu zredukowanego żelazocyjankiem potasu) na 30 minut w temperaturze pokojowej. Należy to zrobić w dygestorii i w ciemności, ponieważ osm może być redukowany przez światło (np. pod folią aluminiową) (Rysunek 1D-F).
  11. Po inkubacji tetratlenku osmu przemyć tkankę 5x przez 3 minuty (łącznie 15 minut) w temperaturze pokojowej ddH2O.
  12. Umieścić tkankę w 1% wodnym octanie uranylu (octan uranylu w proszku zmieszany z ddH2O) na noc w lodówce w temperaturze 4 °C.
  13. Tuż przed wyjęciem tkanki z lodówki przygotuj świeży roztwór asparaginianu ołowiu Waltona. Rozpocznij od rozpuszczenia 0,066 g azotanu ołowiu w 10 ml 0,03 M roztworu kwasu asparaginowego (0,04 g kwasu asparaginowego w 10 ml wody destylowanej) i dostosuj pH do 5,5 za pomocą 1 N KOH (0,5611 g w 10 ml wody destylowanej).
    UWAGA: Podczas regulacji pH może powstać osad. Jest to niedopuszczalne.
    1. Za pomocą mieszadła powoli dodawaj kroplami 1 N KOH, monitorując pH. Podgrzej gotowy klarowny roztwór asparaginianu ołowiu w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 30 minut. Jeśli utworzy się osad, nie można użyć roztworu i należy przygotować inny roztwór.
  14. Wyjmij chusteczkę z lodówki i myj 5x po 3 minuty (łącznie 15 minut) w temperaturze pokojowej ddH2O.
  15. Po umyciu umieść chusteczkę w podgrzanym roztworze asparaginianu ołowiu Waltona na 30 minut, utrzymując temperaturę 60 °C.
  16. Po inkubacji w asparaginianu ołowiu Waltona, przemyj tkankę 5x przez 3 minuty każdy (łącznie 15 minut) w temperaturze pokojowej ddH2O (Rysunek 1G-I).
  17. Odwodnić tkankę za pomocą lodowato zimnej serii acetonów (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% i 100% acetonu (w ddH2O, w stosownych przypadkach), pozostawiając 10 minut na każdy etap serii.
  18. Po serii lodowatego odwodnienia umieść tkankę w acetonie o temperaturze pokojowej na 10 minut.
    1. W tym czasie sformułuj żywicę Embed 812 ACM. Użyj przepisu na "twardą mieszankę", ponieważ jest ona bardziej odporna na uszkodzenia wiązki. Dokładnie wymieszaj żywicę i umieść chusteczkę w Embed 812: aceton (mieszanka 1:3) na 4 godziny, następnie Embed 812: aceton (mieszanka 1:1) na 8 godzin lub przez noc, a na koniec Embed 812: aceton (mieszanka 3:1) na noc. Wykonaj te etapy infiltracji żywicy w temperaturze pokojowej.
  19. Następnego dnia umieść chusteczkę w 100% Embed 812 na 4-8 godzin, następnie w świeżym 100% Embed 812 na noc, a na koniec w świeżym 100% Embed 812 na 4 godziny. Wykonaj te etapy infiltracji żywicy w temperaturze pokojowej.
    1. Tuż przed zatopieniem umieść niewielką ilość żywicy w pojemniku do mieszania i powoli mieszaj (do mieszania można użyć drewnianego patyczka) z sadzą, aż żywica zostanie nasycona proszkiem, ale nadal będzie płynna i nie stanie się ziarnista. Powinien przypominać gęsty tusz i móc powoli kapać z drewnianego patyczka bez widocznych grudek.
  20. Zorientuj próbki tkanek w formie z gumy silikonowej i zrób zdjęcie tak, aby orientacja próbki w bloku żywicy została zarejestrowana i można było się do niej odnieść. Przykryj próbki żywicą nasyconą sadzą na końcu formy silikonowej i umieść formę w piekarniku na ~1 godzinę w temperaturze 65 °C.
    1. Umieść formę pod kątem, aby zawierała żywicę na końcu formy, gdzie zakrywa próbkę tkanki. Umieść etykietę z identyfikatorem eksperymentu/próbki tkanki w formie na przeciwległym końcu żywicy (Rysunek 2A).
  21. Wyjmij silikonową foremkę z piekarnika i wypełnij pozostałą część formy przezroczystą żywicą (bez sadzy), upewniając się, że etykieta pozostaje widoczna. Żywicę nasączoną sadzą należy utwardzić na tyle, aby nie mieszała się łatwo z przezroczystą żywicą.
    1. Przygotuj dodatkowe dołek w formie, która nie zawiera tkanki. Zaczynając od dodatkowej studzienki, wypełnij pozostałą część formy przezroczystą żywicą.
    2. Jeśli żywica nasączona sadzą zacznie przenikać do przezroczystej żywicy, umieść silikonową formę z powrotem w piekarniku na dodatkowy czas (np. 15 minut).
    3. Gdy wszystkie próbki tkanek zostaną pokryte przezroczystą żywicą, umieść silikonową formę z powrotem w piekarniku (płaskim, bez nachylenia) w temperaturze 65 °C na 48 godzin, aby zakończyć proces utwardzania.

2. Przygotowanie bloku

UWAGA: Metoda będzie zależała od tego, jak próbka jest zorientowana w bloku i jak ma przebiegać cięcie. Jednak najczęstsza orientacja tkanki polega na tym, że tkanka jest wyśrodkowana na czubku bloku żywicy, prostopadle do długiego końca bloku żywicy.

  1. W większości przypadków najpierw przytnij koniec bloku, aby zlokalizować tkankę, umieszczając blok próbki w uchwycie mikrotomowym tak, aby zwężający się koniec wystawał około 5-6 mm z uchwytu. Zablokuj go na miejscu za pomocą ustalającej i umieść pod lampą grzewczą.
  2. Po kilku minutach blok będzie plastyczny i łatwy do przycięcia. Umieść uchwyt w uchwycie mikroskopu stereoskopowego i użyj nowej żyletki z podwójną krawędzią, aby wykonać cienkie odcinki równolegle do powierzchni bloku, aż tkanka będzie widoczna. Najlepiej widać to, kierując światło pod kątem w poprzek powierzchni bloku, próbka tkanki będzie mniej odblaskowa i ziarnista w porównaniu z tymi częściami żywicy, które są pozbawione tkanki. Zapoznaj się ze zdjęciem próbek tkanek wykonanym przed wprowadzeniem żywicy nasyconej sadzą, aby zorientować się, jak i gdzie znajduje się tkanka.
  3. Odłóż na bok jeden uchwyt na szpilkę próbki w celu przycinania. Ten uchwyt na szpilki nigdy nie jest umieszczany w komorze SEM i dlatego można go obsługiwać bez rękawiczek, będzie to określane jako uchwyt na kołek do przycinania. Uchwyt próbki przeznaczony do umieszczenia w komorze obrazowania nigdy nie powinien być dotykany bez rękawiczek. Pozwala to uniknąć wprowadzania smaru i oleju do komory mikroskopu.
  4. Umieść aluminiowy kołek do próbkowania w uchwycie kołka przycinającego i lekko dokręć ustalającą tak aby powierzchnia czołowa (płaska powierzchnia) kołka znajdowała się 3-4 mm nad uchwytem kołka.
  5. Wykonaj kilka głębokich, krzyżujących się zadrapań na powierzchni szpilki, aby zapewnić większą powierzchnię dla kleju używanego do utrzymywania próbki na miejscu. Jeśli używany jest aluminiowy kołek, do tego kroku zalecany jest mały stalowy śrubokręt płaski (Rysunek 2B).
  6. Umieść uchwyt zawierający próbkę tkanki z powrotem pod lampą grzewczą, aż żywica stanie się miękka i plastyczna, a następnie umieść go w pojemniku na uchwyt pod mikroskopem stereoskopowym.
  7. Za pomocą obosiecznej żyletki odciąć nadmiar żywicy z części bloku żywicy zawierającej próbkę tkanki. Docelowo rozmiar bloku tkanki przymocowanego do szpilki będzie miał około 3 mm średnicy i 2-3 mm wysokości.
    1. Ostrożnie wepchnij maszynkę prosto w dół do bloku żywicy na około 1-2 mm, a następnie ostrożnie wepchnij maszynkę poziomo w blok żywicy na głębokość równą poprzedniemu cięciu. Rób to powoli i z dużą ostrożnością, ponieważ możliwe jest uszkodzenie lub odcięcie części bloku zawierającej próbkę tkanki. Gdy dwa nacięcia się spotkają, nadmiar żywicy oddzieli się od bloku. Kontynuuj usuwanie żywicy, aż pozostanie tylko podniesiony obszar o wymiarach 3 mm x 3 mm.
  8. Po tym wstępnym przycięciu umieść blok (nadal w uchwycie) pod lampą grzewczą na kilka minut.
  9. Gdy żywica stanie się miękka i plastyczna, umieść blok z powrotem pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą nowej żyletki z podwójnymi krawędziami odetnij górną część bloku żywicy, około 1 mm poniżej przyciętej części, jednym gładkim cięciem. Preferowana jest płaska powierzchnia, ponieważ zostanie ona przyklejona do kołka próbki. Należy uważać, aby nie dopuścić do utraty próbki, ponieważ ten krok wymaga pewnej siły, która może przenieść się na usuniętą część bloku i spowodować jego odlot. Odłóż pociętą i przyciętą próbkę na bok.
  10. Umieść uchwyt kołka do przycinania zawierający wycięty aluminiowy kołek w gnieździe mikroskopu stereoskopowego. Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na powierzchnię szpilki tak, aby całkowicie zakryła szpilkę, nie tworząc widocznego menisku. Podnieś przycięty kawałek bloku tkanki za pomocą kleszczy i umieść na powierzchni szpilki. Wyśrodkuj próbkę tkanki na szpilce próbki. Dociśnij go i przytrzymaj przez kilka sekund. Pozostaw klej do związania na kilka minut.
  11. Gdy klej dokładnie wyschnie, umieść uchwyt szpilki do przycinania z powrotem pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą drobnego pilnika spiłuj nadmiar żywicy, aby żadna żywica nie wystawała poza szpilkę. Kształt żywicy powinien przypominać okrągłą główkę szpilki.
  12. Zlokalizuj tkankę na podniesionej części bloku żywicy, przydatne jest do tego ukośne oświetlenie. Za pomocą maszynki do golenia o dwóch krawędziach podniesioną część żywicy zawierającą próbkę tkanki należy przyciąć do powierzchni nie większej niż 1 mm2. Jeśli to możliwe, powierzchnię bloku można przyciąć jeszcze mniej, co zmniejszy naprężenia na nożu diamentowym i poprawi jego żywotność.
    1. Usuń jak najwięcej nadmiaru żywicy, pozostawiając blok nieco dłuższy w jednym wymiarze. Odbywa się to powoli i ostrożnie, ponieważ żywica zawierająca próbkę tkanki może się oderwać, jeśli zostanie przyłożona zbyt duża siła. Chociaż zalecana jest brzytwa, do tego kroku można użyć cienkiego metalowego pilnika.
  13. Za pomocą cienkiego metalowego pilnika ustaw nadmiar żywicy pod kątem, w obszarze poza wypukłą częścią zawierającą próbkę tkanki, w dół w kierunku krawędzi szpilki (Rysunek 2C).
  14. Usuń cząsteczki żywicy i pył z przygotowanej próbki przed nałożeniem farby srebrnej, a następnie napyleniem złota. Wymieszaj srebro z acetonem tak, aby było to łatwo rozprowadzający się płyn, podobny do lakieru do paznokci (ale nie na tyle rzadki, aby kapał z aplikatora) i nałóż cienką warstwę na całą powierzchnię bloku próbki. Aceton szybko odparowuje, więc może być konieczne dodanie dodatkowego acetonu, gdy srebrna farba zacznie gęstnieć.
    1. Pozostaw srebrną farbę do wyschnięcia na noc przed załadowaniem do mikroskopu.
      UWAGA: Ta srebrna warstwa musi być cienka, aby uniknąć rozszerzania się powierzchni bloku poza 1 mm x 1 mm i chociaż srebrna farba nigdy nie uszkodziła noża diamentowego, nadal zaleca się mniejsze powierzchnie blokowe, aby zachować długowieczność noża diamentowego. Aceton zmieszany ze srebrem musi całkowicie odparować przed napylaniem złota lub załadowaniem próbki do mikroskopu, aby uniknąć wprowadzenia oparów acetonu do komory obrazowania.
    2. Po nałożeniu farby srebrnej nałóż cienką warstwę złota na blok próbki. Przy użyciu standardowego urządzenia do rozpylania próżniowego wyposażonego w standardową tarczę ze złotej folii, ciśnienie w komorze 200 militorów (argon) i 40 miliamperów działające przez 2 minuty spowoduje powstanie złotej powłoki o grubości 20 nm.
  15. Po nałożeniu powłoki umieść zamontowany i przycięty blok w tubie z dołączoną odpowiednią etykietą eksperymentu. Twórz niestandardowe probówki za pomocą jednorazowych pipet transferowych.
    1. Przeciąć pipetę transferową tuż pod bańką, pozostawiając krótką część rurki pipety do przenoszenia przymocowaną poniżej bulwiastego końca. Skróć odciętą część rurki i odetnij końcówkę pipety na tyle, aby aluminiowy kołek próbki można było wsunąć do środka.
    2. Umieść końcówkę zawierającą aluminiowy kołek do próbki w bulwiastym końcu zmodyfikowanej pipety transferowej.
  16. Przed załadowaniem przygotowanego bloku tkanki należy ostrożnie odciąć nadmiar srebrnej farby z powierzchni powierzchni bloku.

3. Ustawienia SEM do obrazowania powierzchni bloku

UWAGA: Poniższe ustawienia obrazowania zostały wykonane na urządzeniu używanym przez autorów, które jest wymienione w Tabeli Materiałów dostarczonych. Chociaż urządzenie to jest zdolne do obrazowania o zmiennym ciśnieniu, najlepsze wyniki uzyskano w wysokiej próżni

.
  1. Czas przebywania: Użyj 12 μs/px podczas cięcia szeregowego. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania można uzyskać obraz o wyższej rozdzielczości przy 32 μs/px.
  2. Ustawienia podciśnienia: Użyj ciśnienia pistoletu 9e-008 Pa, ciśnienia w kolumnie 1.1e-004 Pa i ciśnienia w komorze 9.5e-002 Pa.
  3. Czas rejestrowania: Dzięki powyższym ustawieniom uchwyć stos obrazów o wymiarach 2048x2048 pikseli z szybkością 50 sekund na obraz. Obrazy obszarów zainteresowania o wyższej rozdzielczości można rejestrować w rozdzielczości 4096x4096 px w czasie krótszym niż 9 minut na obraz.
  4. Grubość przekroju: Użyj 100-200 nm. Mniej jest możliwe, ale może wymagać niższego napięcia wiązki, intensywności lub czasu przebywania.
  5. Wysokie napięcie (WN): Użyj 7-12 kV. Zwiększenie napięcia zmniejsza rozmiar plamki i zwiększa rozdzielczość, ale wprowadza większe prawdopodobieństwo uszkodzenia wiązki. Wyższe kV zwiększa penetrację wiązki, co skutkuje utratą szczegółów. Jednak obniżenie kV pogarsza stosunek sygnału do szumu (Rysunek 3)14.
  6. Natężenie wiązki (BI): Autorskie urządzenie SBF-SEM oferuje skalę intensywności wiązki w zakresie od 1 do 20. W tej skali wartości 5-7 dają wysokiej jakości obrazy bez nadmiernego ładowania i uszkodzenia wiązki. Im wyższy BI, tym większa rozdzielczość, jednak istnieje większa szansa na naładowanie i uszkodzenie wiązki14.
  7. Rozmiar plamki i powiększenie obrazu: Określ rozmiar plamki na podstawie intensywności wiązki i poziomu napięcia. Idealnie byłoby, gdyby rozmiar plamki nie był większy niż użyty rozmiar piksela. Rozmiar piksela jest określany przez podzielenie pola widzenia (FOV) przez liczbę pikseli. Na przykład pole widzenia 25 μm i rozmiar obrazu 2048x2048 px dałoby 12,2 nm na piksel. Dlatego rozmiar plamki nie powinien być większy niż 12,2 nm. Rysunek 4 pokazuje, jak HV, BI i rozmiar plamki są ze sobą powiązane.
  8. Odległość robocza (WD) — w przypadku obrazowania blokowego odległości roboczej nie można regulować. Jest to po prostu czynnik skupienia. Będzie on prawie identyczny dla wszystkich zobrazowanych bloków. Chociaż odległość robocza nie jest regulowana, odgrywa kluczową rolę w rozdzielczości rejestrowanego obrazu. Wraz ze zmniejszaniem się odległości roboczej zwiększa się limit rozdzielczości rejestrowanych obrazów. W niektórych przypadkach możliwe jest zmniejszenie odległości roboczej poprzez dokonanie modyfikacji w komorze obrazowania, jednak modyfikacje te muszą być dokonane według uznania użytkownika. W celu zmniejszenia odległości roboczej i zwiększenia rozdzielczości obrazu, poluzowaliśmy mikrotomu do montażu drzwi i przestawiliśmy mikrotom tak, aby po ponownym dokręceniu spoczywał ~2 mm bliżej detektora wiązki.
  9. Rozdzielczość - Przy powyższych ustawieniach możliwa jest rozdzielczość x i y sięgająca 3,8 nm. Ważne jest, aby pamiętać, że rozdzielczość jest ograniczona rozmiarem plamki wiązki, a także rozdzielczością pikseli przechwytywanego obrazu (np. pole widzenia 20 μm uchwycone na obrazie o rozdzielczości 2048x2048 pikseli ma rozdzielczość piksela 9,8 nm, nawet jeśli użyto rozmiaru plamki 3,8 nm). Rozdzielczość obrazu w płaszczyźnie z jest zależna od grubości przekroju, stwierdzamy, że 100-200 nm dobrze współpracuje z tym protokołem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rogówka myszy
Protokół ten został szeroko zastosowany do rogówki myszy. Za pomocą obrazowania SBF-SEM wykazano, że sieć wiązek mikrofibryli wolnych od elastyny (EFMB) jest obecna w rogówce dorosłej myszy. Wcześniej sądzono, że sieć ta jest obecna tylko podczas rozwoju embrionalnego i wczesnego rozwoju pourodzeniowego. SBF-SEM ujawnił rozległą sieć EFMB w całej rogówce, z pojedynczymi włóknami o średnicy 100-200 nm, mierzonymi w przekroju poprzecznym. Stwierdzono również, że ta sieć EFMB była zorganiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego artykułu jest zwrócenie uwagi na metodologię przygotowania tkanek i obrazowania, która pozwoliła naszemu laboratorium niezawodnie rejestrować obrazy z seryjnej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości, a także wskazanie krytycznych kroków, które prowadzą do tego wyniku, a także potencjalnych pułapek, które mogą wystąpić podczas wykonywania obrazowania SBF-SEM. Sukces przy użyciu tego protokołu wymaga odpowiedniego utrwalenia tkanki, impregnacji metali ciężkich w próbce, modyfikacji żywicy osadzającej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Samowi Hanlonowi, Evelyn Brown i Margaret Gondo za ich doskonałą pomoc techniczną. Badania te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 i P30 EY007551 (National Eye Institute), częściowo przez Lion's Foundation for Sight, a częściowo przez NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1/16 x 3/8 Nity aluminioweNit przemysłowy i Łącznik Co.6N37RFLAP/1100Używany jako kołki do próbek.
Wkrętak płaski 2,5 mmWiha Quality Tools27225
Mikroskopia elektronowa acetonuSciencesRT 10000Służy do rozcieńczania farby srebrnej.
Kwas asparaginowySigma-AldrichA8949
Chlorek wapniaFisherScientificC79-500
Przewodząca srebrna farbaTed Pella16062
Denton Desk-II Urządzenie do napylania próżniowego wyposażone w standardową tarczę ze złotej foliiDenton VacuumN/AJest to urządzenie do napylania złota używane przez autorów, dopuszczalne są alternatywy.
Obosieczne maszynki do goleniaFisher Scientific50-949-411
Embed 812Mikroskopia elektronowa Sciences14120
Gatan 3View2 zamontowany w Tescan Mira3 Emisja pola SEMGatan & TescanN/AJest to urządzenie SBF-SEM używane przez autorów, dopuszczalne są alternatywy.
Fiolki ze szklaną skorupą, 0,5 DRAM (1,8 ml)Mikroskopia elektronowa Nauki72630-05
Mikroskopia elektronowaaldehydu gluterowego16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNANAOkreślany w tekście jako klej cyjanoakrylowy.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDW tekście określany jako sadza.
KOHFisherScientific18-605-593
Azotan ołowiuFisher ScientificL62-100
Kuchenka mikrofalowaPelcoBioWave ProJest to kuchenka mikrofalowa używana przez autorów, dopuszczalne są alternatywy.
Tetratlenek osmuSigma-Aldrich201030
Żelazocyjanek potasuSigma-AldrichP9387
Silikonowa forma do zatapianiaTed Pella10504
Kakodylan sodu TrójwodzianMikroskopia elektronowa Sciences12300
Pipeta transferowa SamcoThermoFisher Scientific202Służy do wykonania szpilki do próbki rurki do przechowywania.
Szwajcarskie pilniki igłoweMikroskopia elektronowa Nauki62115
TiokarbohydrazydSigma-Aldrich223220
Octan uranyluPolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/ASłuży do tworzenia rekonstrukcji znajdujących się na rysunkach 5-7 i 9.
Fidżi (Fidżi to tylko ImageJ)ImageJ.netNie dotyczyTrakEM2 można dodać do Fidżi, aby ułatwić ręczną segmentację.
Przeglądarka obrazów mikroskopowych (MIB)Uniwersytet w Helsinkach, Instytut BiotechnologiiNie dotyczy
Oprogramowanie do rekonstrukcjiLaboratorium systemów neuronowychNie
Stół warsztatowy SuRVoSDiamentowe źródło światła i Uniwersytet w NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/APozwala na rekonstrukcję w rzeczywistości wirtualnej i metody rekonstrukcji oparte na histogramie.
Sciences dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329(2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985(2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11(2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107(2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721(2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434(2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388(2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53(2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801(2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910(2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357(2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173(2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011(2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Serial Block Face SEMScanning Electron MicroscopyTissue PreparationBiological Tissue SamplesThree Dimensional ImagingResin EmbeddingTissue UltrastructureImage AcquisitionElectron Microscopy ArtifactsCorneal Nerve Imaging

Powiązane artykuły