Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62046

⸱

9 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Streszczenie

Poprzednie modele ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC) wykorzystywały odłączone siatkówki; jednakże, bez wsparcia strukturalnego zapewnianego przez nabłonek nabłonkowy-naczyniówkę (RPE-naczyniówkę) i twardówkę, integralność delikatnej siatkówki może być łatwo naruszona. Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego modelu HORC, który zawiera siatkówkę, naczyniówkę RPE i twardówkę w celu utrzymania integralności siatkówki podczas hodowli eksplantatów siatkówki.

Po przecięciu obwodu wzdłuż rąbka w celu usunięcia tęczówki i soczewki, wykonano cztery głębokie nacięcia, aby spłaszczyć muszlę oczną. W przeciwieństwie do poprzednich protokołów HORC, trepanacja została użyta do przecięcia nie tylko siatkówki, ale także naczyniówki i twardówki. Powstałe w ten sposób trójwarstwowe eksplantaty hodowano przez 72 godziny. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) zastosowano do oceny struktur anatomicznych, a eksplantaty siatkówki zostały dodatkowo scharakteryzowane za pomocą immunohistochemii (IHC) pod kątem apoptozy, integralności komórek Müllera i zapalenia siatkówki. Aby potwierdzić możliwość indukcji choroby, eksplantaty wystawiono na działanie wysokiego stężenia glukozy (HG) i cytokin prozapalnych (Cyt), naśladujących retinopatię cukrzycową (DR). Test kulek magnetycznych Luminex wykorzystano do pomiaru cytokin związanych z DR uwalnianych do pożywki hodowlanej.

Barwienie H&E ujawniło wyraźne blaszki siatkówki i zwarte jądra w eksplantatach siatkówki z leżącym poniżej RPE-naczyniówką i twardówką, podczas gdy siatkówki bez podstawowych struktur wykazywały zmniejszoną grubość i poważną utratę jąder. Wyniki IHC wykazały brak apoptozy i zapalenia siatkówki, a także zachowaną integralność komórek Müllera. Testy Luminex wykazały znacznie zwiększone wydzielanie cytokin prozapalnych związanych z DR w eksplantatach siatkówki narażonych na HG + Cyt w stosunku do poziomów wyjściowych po 24 godzinach.

Udało nam się opracować i scharakteryzować nowy protokół HORC, w którym integralność siatkówki została zachowana bez apoptozy czy zapalenia siatkówki. Co więcej, indukowane wydzielanie biomarkerów prozapalnych związanych z DR podczas wystawiania eksplantatów siatkówki na HG + Cyt sugeruje, że model ten można wykorzystać do klinicznie przekładalnych badań nad chorobami siatkówki.

Wprowadzenie

Siatkówka jest wysoce wyspecjalizowaną strukturą oka odpowiedzialną za przekształcanie energii świetlnej w sygnały elektryczne, które są następnie przetwarzane przez mózg w celu percepcji wzrokowej. Ludzka siatkówka zawiera dynamiczny zestaw typów komórek, zorganizowanych w unikalną strukturę lamelarną składającą się z dwóch warstw synaptycznych i trzech warstw jąder komórkowych1 (Rysunek 1). Homeostaza siatkówki jest utrzymywana dzięki skomplikowanym połączeniom między komórkami neurosiatkówkowymi, naczyniami krwionośnymi, nerwami, tkankami łącznymi a RPE1. Ze względu na złożoną anatomię i fizjologię siatkówki, mechanizmy wielu chorób siatkówki wciąż pozostają słabo poznane2,3,4,5. Aby lepiej badać choroby siatkówki, opracowano modele HORC6,7,8,9. W porównaniu do badań na zwierzętach i hodowli in vitro, modele HORC są korzystne, ponieważ zachowują dynamiczne środowisko komórkowe oraz złożone interakcje naczyniowo-nerwowe in situ, stanowiąc dobry model dla translacji klinicznej.

Schemat budowy siatkówki z opisanymi warstwami, podkreślający rozmieszczenie elementów neuronalnych i fotoreceptorów.
Rycina 1: Tylne struktury gałki ocznej człowieka.Warstwy siatkówki, od przedniej do tylnej, to: warstwa włókien nerwowych (NFL), warstwa komórek zwojowych (GCL), wewnętrzna warstwa splotowata (IPL), wewnętrzna warstwa jądrowa (INL), zewnętrzna warstwa splotowata (OPL), zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL), wewnętrzny segment fotoreceptorów (IS) oraz zewnętrzny segment fotoreceptorów (OS). Komórki w obrębie siatkówki obejmują komórki zwojowe (niebieskie), komórki amakrynowe (żółte), komórki dwubiegunowe (czerwone), komórki poziome (fioletowe), fotoreceptory pręcikowe (różowe) oraz fotoreceptory czopkowe (zielone). Ciało szkliste znajduje się przed siatkówką. Nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE), błona Brucha, błona naczyniowa i twardówka znajdują się za siatkówką. Należy pamiętać, że przedstawiony obraz jest jedynie schematyczną reprezentacją siatkówki, a proporcje komórek i połączeń siatkówkowych w każdej warstwie mogą nie odzwierciedlać stanu in vivo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wcześniej opisane protokoły HORC6,7,8,9 obejmowały oddzielanie siatkówki od leżącego pod nią nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE), naczyniówki i twardówki przy użyciu trepanu chirurgicznego. Jednak bez wsparcia zapewnianego przez te struktury podścielne, półprzezroczysta siatkówka staje się wiotka, trudna do manipulowania, a narzędzia takie jak pęsety mogą łatwo naruszyć jej integralność. Co więcej, wykazano, że izolowanie siatkówki w hodowli bez RPE powoduje apoptozę komórek zwojowych i degenerację fotoreceptorów10,11,12. W związku z tym przydatny byłby alternatywny protokół HORC, który minimalizuje utratę integralności siatkówki i lepiej naśladuje środowisko in vivo. Jest to szczególnie istotne przy badaniu mechanizmów chorób siatkówki, ponieważ urazy fizyczne podczas manipulacji eksplantatem mogłyby wprowadzić artefakty. Celem niniejszego badania było zatem opracowanie nowego modelu HORC obejmującego RPE, naczyniówkę i twardówkę, aby chronić integralność siatkówki podczas manipulacji eksplantatem i hodowli.

Aby osiągnąć ten cel, wyekstrahowano eksplanty siatkówki „zamknięte” pomiędzy pozostałością ciała szklistego a podległym nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), naczyniówką i twardówką. W takich eksplantach ciało szkliste dociska siatkówkę, zapobiegając jej odwarstwieniu i fałdowaniu, natomiast twarda, włóknista twardówka pełni rolę zarówno rusztowania zapewniającego wsparcie strukturalne, jak i punktu uchwytu dla pęsety. Co więcej, modele zwierzęce wykazały, że zachowanie RPE w hodowli może zapobiegać degeneracji siatkówki i proliferacji glejowej, która jest odpowiedzią komórek Müllera na sygnały alarmowe, takie jak hipoksja i stan zapalny10,11,12.

W celu charakterystyki modelu wycinki siatkówki typu sandwich barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E), aby ocenić struktury anatomiczne, oraz przeprowadzono immunohistochemię (IHC), znakując wycinki za pomocą metody TUNEL (marker apoptotycznych komórek), białka kwaśnego włókienkowe glia (GFAP, marker stanu zapalnego siatkówki i aktywacji komórek Müllera) oraz vimentyny, będącej markerem integralności komórek Müllera. Aby ustalić, czy w modelu tym można wywołać molekularne objawy choroby, wycinki poddano działaniu wysokiego stężenia glukozy (HG) wraz z cytokinami prozapalnymi (Cyt): interleukiny-1β (IL-1β) i czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α). Jest to środowisko hodowlane, które w modelach komórkowych i zwierzęcych wykazuje zdolność do naśladowania retinopatii cukrzycowej (DR)13,14,15. W modelu DR wykorzystano testy Luminex do pomiaru cytokin uwalnianych do pożywki hodowlanej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Od ludzkich dawców pozyskano oczoplastyki z Nowozelandzkiego Banku Oczu (New Zealand National Eye Bank) po wycięciu rogówki do transplantacji, zgodnie z zatwierdzeniem Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).

UWAGA: Hodowlę należy prowadzić w komorze laminarnej klasy II, aby zapewnić sterylne warunki hodowli tkankowej. Tkanki muszą zostać poddane hodowli w ciągu 24 h po śmierci, aby uniknąć znacznej utraty integralności siatkówki.

Proces sekcji oka; schemat krok po kroku do badania anatomicznego; narzędzia obejmują pęsetę i skalpel.
Rycina 2: Zdjęcia przedstawiające procedurę pobierania eksplantów siatkówki typu „sandwich”. Do przygotowania eksplantów należy użyć nożyczek sekcyjnych z jedną ostrą końcówką i jednym tępym końcem, kierując tępy koniec do wnętrza gałki ocznej, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek podczas nacinania. Należy również stosować pęsety z tępymi końcami, aby uniknąć zadrapania tkanek wewnątrzgałkowych podczas manipulacji. Za pomocą nożyczek chirurgicznych, z tępym końcem skierowanym do wewnątrz, należy przeciąć wzdłuż limbusa, aby usunąć tęczówkę i soczewkę (A-C). Główkę nerwu wzrokowego (ONH) można zlokalizować, patrząc bezpośrednio w otwarta gałkę oczną (D). Używając pęsety z tępymi końcówkami, należy przytrzymać twardówkę, aby ustabilizować gałkę oczną (E). Podzielić gałkę pionowo na dwie połowy, wykonując dwa głębokie nacięcia w kierunku ONH, ale nie przecinając samego ONH. Powtórzyć tę czynność wzdłuż południka poziomego (G). Przyłożyć tępą pęsetę do twardówki i delikatnie rozewrzeć gałkę do kształtu koniczyny (H-K). Użyć pęsety, aby ostrożnie manipulować ciałem szklistym w celu wygładzenia zgięć siatkówki (ciało szkliste pociąga za siatkówkę), unikając bezpośredniego dotykania siatkówki (I). Usunąć ciało szkliste, jeśli powoduje ono odwarstwienie lub składanie się siatkówki (nie pokazano tego na Rycynie 2, ponieważ przezroczyste ciało szkliste nie jest dobrze widoczne na zdjęciach). Zlokalizować obszary, gdzie siatkówka jest płaska, i pobrać eksplanty siatkówki za pomocą trepana chirurgicznego (L). Przykładając pęsetę do twardówki, ostrożnie przenieść eksplanty siatkówki do wcześniej przygotowanej pożywki hodowlanej (M,N). Cały eksplant typu „sandwich” powinien opaść na dno studzienki ze względu na swój ciężar, dzięki czemu każdy eksplant zostanie zanurzony w pożywce (O). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Wyizolowanie preparatów siatkówki w układzie typu sandwich z oczodołu

  1. Usunięcie tęczówki i soczewki.
    1. Umieścić gałkę oczną w czarce Petriego tak, aby tęczówka i soczewka były skierowane do góry, a głowa nerwu wzrokowego (ONH) stykała się z dnem czarki (Rysunek 2A).
    2. Stabilnie przytrzymać gałkę oczną za obrąbek rogówki za pomocą pęsety (Rysunek 2B).
    3. Oddzielić tęczówkę i soczewkę, wykonując niewielkie nacięcia okrężnie wzdłuż zewnętrznej krawędzi obrąbka rogówki (Rysunek 2A).
    4. Ostrożnie usunąć tęczówkę i soczewkę. Unikać naruszania siatkówki podczas manipulacji (Rysunek 2C).
      UWAGA: Soczewka nie wypadnie do wnętrza gałki ocznej, ponieważ jest przytwierdzona do ciała rzęsistego za pomocą więzadełek soczewki.
  2. Spłaszczenie gałki ocznej.
    1. Przy zachowaniu pionowej pozycji gałki ocznej zidentyfikować ONH. Jest to łatwiejsze przy użyciu jasnego, białego źródła światła (Rysunek 2D).
    2. Wyciąć cztery kwadranty w kierunku ONH (Rysunek 2E). Dla ułatwienia manipulacji można obracać czarkę Petriego. NIE przecinać ONH.
    3. Ostrożnie rozłożyć i spłaszczyć gałkę oczną (Rysunek 2E).
    4. Pęsetę przykładamy do twardówki, a nie do siatkówki, aby uniknąć naruszenia integralności siatkówki.
      UWAGA: Obwodowe odwarstwienie i fałdowanie siatkówki jest nieuniknione, ponieważ ciężar wypływającego ciała szklistego będzie ściągać siatkówkę. W tych obszarach należy usunąć ciało szkliste, aby zapobiec dalszemu fałdowaniu siatkówki. Należy pamiętać o pozostawieniu resztkowego ciała szklistego, aby ustabilizować siatkówkę na powierzchni nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE), naczyniówki i twardówki.
  3. Pobieranie „sandwichowych” eksplantów siatkówki.
    1. Umieścić trepan chirurgiczny na siatkówce w obszarze pozbawionym fałdów (Rysunek 2F).
    2. Mocno nacisnąć, aby przebić twardówkę, co powinno wywołać dźwięk pęknięcia.
    3. Obrócić trepan o 180°, aby upewnić się, że twardówka została całkowicie przebita i eksplant siatkówki jest teraz oddzielony od pozostałej tkanki.
    4. Chwycić pęsetą za twardówkę i przenieść „sandwichowy” eksplant siatkówki do pożywki hodowlanej (Rysunek 2G-I).
    5. Pobrać 2-3 „sandwichowe” eksplanty siatkówki z siatkówki obwodowej każdego z kwadrantów.
      UWAGA: „Sandwichowy” eksplant siatkówki może czasami utknąć w otworze trepana. Używając pęsety, należy delikatnie odseparować niewielki fragment podstawy twardówki. Dzieje się to częściej, gdy ostrze jest tępe, i może prowadzić do utraty siatkówki (Rysunek 3A-C).
    6. Użyć nowego trepana po wycięciu 1-2 eksplantów siatkówki, ponieważ ostrze szybko się tępi (Rysunek 3CBadanie przygotowania powierzchni elektrody w ustawieniu mikroskopowym do analizy przewodności.
      Rysunek 3: Rozwiązywanie problemów. Podczas procesu ekstrakcji eksplant siatkówki może utknąć w otworze trepana chirurgicznego (A). Delikatnie odseparować tkankę od podstawy twardówki, nie dotykając siatkówki (B). Może to zdarzyć się częściej, jeśli trepan chirurgiczny jest używany do pobrania więcej niż dwóch eksplantów siatkówki, ponieważ ostrze może łatwo stępić się (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
  4. Hodowla eksplantów siatkówki.
    1. Przygotować pożywkę zawierającą mieszaninę nutrientów DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12) oraz 1x mieszaninę antybiotyków i antymykotyków (AA, roztwór zapasowy 100x).
    2. Przed ekstrakcją eksplantów wlać 500 µL pożywki do dołków płytki 24-dołkowej i wyrównać temperaturę w inkubatorze. Jest to ważne, ponieważ dodanie pożywki później może spowodować odkształcenie siatkówki.
    3. Hodować „sandwichowe” eksplanty siatkówki w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 72 h w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w pożywce przygotowanej w punkcie 1.4.2.
    4. Aby wywołać zmiany przypominające retinopatię cukrzycową (DR), hodować eksplanty siatkówki w pożywce DMEM-F12 z kombinacją 32.5 mM HG z Cyt, TNF-α (10 ng/mL) i IL-1β (10 ng/mL).

2. Odlew w parafinie warstwowych eksplantów siatkówki

  1. Utrwalenie eksplantów siatkówki w układzie typu „sandwich”.
    1. Zanurzyć eksplanty siatkówki w 10% formalinie na co najmniej 24 h.
    2. Usunąć roztwór formaliny i delikatnie przenieść eksplanty siatkówki do podkładek tkankowych i kaset.
    3. Namoczyć eksplanty siatkówki w 70% etanolu przez co najmniej 24 h.
    4. Zatopić eksplanty siatkówki w blokach parafiny.
    5. Przygotować skrawki tkanek siatkówki o grubości 5 µm za pomocą mikrotomu i nanieść je na szkiełka przedmiotowe. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu obrazowania.
  2. Deparafinyzacja skrawków.
    1. Zanurzyć skrawki w 70% ksylenie na 5 min.
    2. Zanurzyć skrawki w 100% ksylenie na 5 min.
    3. Rehydratyzować skrawki w 70% etanolu przez 5 min.
    4. Rehydratyzować skrawki w 100% etanolu przez 5 min.
    5. Płukać skrawki pod bieżącą wodą z kranu przez 10 min.

3. Charakterystyka z użyciem barwienia H&E, IHC oraz magnetycznego testu Luminex

  1. Protokół barwienia H&E
    1. Odparafinizować skrawki zgodnie z krokiem 2.2.
    2. Nawodnić skrawki w wodzie z kranu przez 5 min.
    3. Barwić skrawki w roztworze hematoksyliny Gilla 2 przez 5 min.
    4. Dokładnie płukać skrawki pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć nadmiar barwnika.
    5. Przeprowadzić różnicowanie, zanurzając skrawki dwukrotnie w 1% alkoholu kwasowym.
    6. Szybko płukać skrawki pod bieżącą wodą z kranu.
    7. Barwić skrawki na niebiesko, zanurzając je sześciokrotnie w 1% węglanie litu (10 mg/mL).
    8. Dokładnie płukać skrawki pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min, aby usunąć nadmiar niebieskiego barwnika.
    9. Zanurzyć skrawki 10 razy w 1% eozynie.
    10. Szybko płukać skrawki pod wodą z kranu, aby usunąć nadmiar barwnika.
    11. Odwodnić skrawki, zanurzając je 10 razy w 100% etanolu. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
    12. Zanurzyć skrawki 10 razy w 70% ksylenie.
    13. Zanurzyć skrawki 10 razy w 100% ksylenie.
    14. Zamontować szkiełka przykrywne, stosując medium montażowe dibutylophthalate polystyrene xylene (DPX).
    15. Wykonać zdjęcia przy użyciu mikroskopu świetlnego.
  2. Protokół znakowania IHC
    1. Odparafinizować skrawki zgodnie z krokiem 2.2.
    2. Umieścić preparaty w roztworze zawierającym 10 mM bufor cytrynian sodu z 0,05% Tween 20 przy pH 6,0 i przeprowadzić odzyskiwanie antygenu w automatycznym szybkowarze w temperaturze 121 °C przez 2 min.
    3. Płukać skrawki w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
    4. Zablokować skrawki w PBS zawierającym 0,1% Triton X-100 i 10% normalnego surowicy koziej przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować skrawki przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi sprzężonymi z przeciwciałami drugorzędowymi (Tabela materiałów).
    6. Płukać skrawki w PBS przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
    7. Barwić jądra komórkowe przy użyciu 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) przez 2 min.
    8. Płukać i zamontować skrawki, stosując odczynnik przeciwwyblakaniowy.
    9. Zabezpieczyć szkiełka przykrywne lakierem do paznokci.
    10. Wykonać zdjęcia przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.
  3. Analiza Luminex z koralikami magnetycznymi
    1. Przenieść 75 µL medium z każdej studzienki do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U po 24 i 72 h.
    2. Analizować supernatant komórkowy pod kątem zawartości IL-18, IL-6, IL-8 oraz czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) po 24 i 72 h przy użyciu analizy cytokin Luminex. Przeprowadzić analizę zgodnie z instrukcjami producenta16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym modelu HORC zachowano integralność siatkówki. Integralność siatkówki została zachowana w hodowanych eksplantach siatkówki w układzie kanapkowym (sandwich), natomiast utracono ją w siatkówce hodowanej bez sąsiadujących struktur. Wykonano barwienie H&E, aby zbadać integralność strukturalną przekrojów eksplantów siatkówki w układzie kanapkowym po 72 h hodowli. Eksplanty siatkówki w układzie kanapkowym wykazały zachowaną integralność i wyraźną strukturę warstwową od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

HORC jest obecnie najbardziej przekładalnym klinicznie modelem w badaniach przedklinicznych siatkówki. W porównaniu z modelami hodowli komórkowych in vitro, HORC może lepiej reprezentować anatomię ludzkiej siatkówki in situ, poprzez zachowanie dynamicznych typów komórek siatkówki i ich połączeń z neuronami, naczyniami krwionośnymi i środowiskiem zewnątrzkomórkowym19. W porównaniu z modelami zwierzęcymi, HORC są bardziej korzystne w badaniu patofizjologii i projektowaniu leczenia farmaceutycznego c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować hojnym darczyńcom tkanek oka oraz zespołowi z Narodowego Banku Oczu Nowej Zelandii za ich wsparcie. Prace te zostały wsparte finansowo przez granty projektowe z Maurice and Phyllis Paykel Trust oraz Auckland Medical Research Foundation (1117015). Kierownictwo IDR jest wspierane przez Fundację Charytatywną Buchanan. Stypendium CK jest zapewniane przez Nowozelandzkie Stowarzyszenie Optometrystów Fundusz Edukacyjny i Badawczy (CC36812), a stypendium HHL jest zapewniane przez Fundację Charytatywną Buchanan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednorazowe stemple do biopsji (5 mm)Integra York PA Inc., USA21909-142Określane jako trefiny chirurgiczne
w tym artykule
Ludzka rekombinowana IL-1 i beta;Peprotech, USA200-01BStężenie robocze: 10 ng/ml
rekombinowany ludzki  TNF-aPeprotech, USA300-01AStężenie robocze: 10 ng/ml
DAPI (1 &mikro; g/mL)Sigma Aldrich, Niemcy#D9542Plama jądrowa. Rozcieńczenie robocze 1:1000
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXGibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA10565018Dulbecco" s Zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle Medium F-12 zawierająca 1&razy; mieszanina antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych (AA, 100 i razy; zapas)
Drobne nożyczki - ostre-narzędzia do nauki (FST)14028-10Końcówki: ostre-, krawędź tnąca: 27mm, długość: 10cm, stop / materiał: stal nierdzewna, ząbkowana: nie, kształt końcówki: prosta
Kleszcze GraefeNarzędzia do nauki precyzyjnej (FST)11050-10Długość: 10 cm, Kształt końcówki: Prosty, Końcówki: Ząbkowane, Szerokość końcówki: 0,8 mm, Wymiary końcówki: 0,8 x 0,7 mm, Stop / Materiały:
Monoklonalny mysz ze stali nierdzewnej GFAP-Cy3Sigma Aldrich, Niemcy#C9205Przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z Cy3. Rozcieńczenie robocze 1:1000.
Mysi monoklonalny Vimentin-Cy3Sigma Aldrich, Niemcy#C9080Pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone z Cy3. Rozcieńczenie robocze 1:50.
Królicze poliklonalne TUNEL (zestaw do wykrywania śmierci komórki in situ, fluoresceina)Sigma Aldrich, Niemcy#11684795910Przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z fluoresceiną-dUTP. Rozcieńczenie robocze 1:10 roztworem buforu enzymatycznego.

Bibliografia

  1. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
  2. Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
  3. Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
  4. Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
  5. Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
  6. Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
  7. Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
  8. Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
  9. Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
  10. Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  11. Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
  12. Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
  13. Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
  14. Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
  15. Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156(2018).
  16. R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
  17. Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
  18. Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
  19. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  20. Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
  21. Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
  22. Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
  23. Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
  24. Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
  25. Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
  26. Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura eksplantu siatk wkiintegralno siatk wkiRPE naczyni wka tward wkabarwienie hematoksylin i eozynimmunohistochemia siatk wkizapalenie siatk wkisiatk wka w warunkach wysokiego st enia glukozymagnetyczny test Luminexmodel retinopatii cukrzycowej
Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.