Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie zwapnienia zastawki aortalnej poprzez izolację i hodowlę limfocytów T przy użyciu komórek zasilających z napromieniowanej Buffy Coat

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62059

⸱

4 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Campus Benjamin Franklin, Charité Universitätsmedizin Berlin and German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), 2Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Berlin Institute of Health, 4Department of Cardiology, German Heart Centre Berlin (DHZB), 5Sod of Interdisciplinary Internal Medicine, Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi (AOUC), 6Department of General and Interventional Cardiology, Helios Klinikum Erfurt

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu opisujemy proces izolacji limfocytów T ze świeżych próbek zwapniałych zastawek aortalnych oraz etapy analityczne klonowania limfocytów T w celu scharakteryzowania adaptacyjnych podzbiorów leukocytów za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Zwapnienie zastawki aortalnej (CAVD), aktywny proces chorobowy od łagodnego pogrubienia zastawki do ciężkiego zwapnienia, wiąże się z wysoką śmiertelnością, pomimo nowych opcji terapeutycznych, takich jak przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej (TAVR).

Pełne ścieżki, które zaczynają się od zwapnienia zastawki i prowadzą do poważnego zwężenia zastawki aortalnej, pozostają tylko częściowo poznane. Dzięki zapewnieniu wiernej reprezentacji komórek zastawki aortalnej in vivo, oznaczanie limfocytów T ze zwężonej tkanki zastawki może być skutecznym sposobem wyjaśnienia ich roli w rozwoju zwapnienia. Po chirurgicznym wycięciu świeża próbka zastawki aortalnej jest preparowana na małe kawałki, a limfocyty T są hodowane, klonowane, a następnie analizowane przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

Procedura barwienia jest prosta, a poplamione probówki mogą być również utrwalone za pomocą 0,5% paraformaldehydu i analizowane do 15 dni później. Wyniki uzyskane z panelu barwienia mogą być wykorzystane do śledzenia zmian stężeń limfocytów T w czasie w odniesieniu do interwencji i mogą być łatwo rozwijane w celu oceny stanów aktywacji określonych podtypów limfocytów T będących przedmiotem zainteresowania. W tym badaniu pokazujemy izolację limfocytów T, przeprowadzoną na świeżych zwapnionych próbkach zastawki aortalnej oraz etapy analizy klonów komórek T za pomocą cytometrii przepływowej w celu lepszego zrozumienia roli odporności adaptacyjnej w patofizjologii CAVD.

Wprowadzenie

Zwapnienie zastawki aortalnej (CAVD) jest jednym z najczęstszych zaburzeń zastawek serca, mającym duży wpływ na opiekę zdrowotną. Częstotliwość wymiany zastawki aortalnej w ostatnich latach dramatycznie wzrosła i oczekuje się, że będzie nadal rosła ze względu na rosnącą populację osób starszych1.

Patofizjologia leżąca u podstaw CAVD jest tylko częściowo znana, a obecne strategie terapeutyczne ograniczają się do środków zachowawczych lub wymiany zastawki aortalnej, zarówno poprzez zabiegi chirurgiczne, jak i przezskórne. Do tej pory żadne skuteczne leczenie nie jest w stanie zatrzymać lub odwrócić progresji CAVD, a wysoka śmiertelność wiąże się z wczesnym wystąpieniem objawów, chyba że zostanie przeprowadzona wymiana zastawki aortalnej (AVR)2. U pacjentów z ciężkim objawowym zwężeniem zastawki aortalnej 3-letnie przeżycie wolne od objawów było zgłaszane na poziomie zaledwie 20%3. Przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej (TAVR) stanowi nową opcję, rewolucjonizując leczenie pacjentów wysokiego ryzyka, zwłaszcza wśród osób starszych, i radykalnie zmniejszyła śmiertelność, która była z natury wysoka w tej populacji4,5,6. Pomimo obiecujących wyników TAVR, konieczne są dalsze badania, aby zrozumieć patofizjologię CAVD w celu zidentyfikowania nowych wczesnych celów terapeutycznych7,8,9.

Wcześniej uważany za pasywny, zwyrodnieniowy proces, CAVD jest teraz rozpoznawany jako aktywna choroba postępująca, charakteryzująca się osteoblastyczną zmianą fenotypu komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej10. Choroba ta polega na postępującej mineralizacji, zmianach włóknisto-wapiennych i zmniejszonej ruchliwości płatków zastawki aortalnej (stwardnienie), które ostatecznie utrudniają przepływ krwi, prowadząc do zwężenia (zwężenia) otworu zastawki aortalnej11.

Stan zapalny jest uważany za kluczowy proces w patofizjologii CAVD, podobny do procesu miażdżycy tętnic naczyniowych. Uszkodzenie śródbłonka umożliwia odkładanie się i akumulację gatunków lipidów, zwłaszcza utlenionych lipoprotein w zastawce aortalnej12. Te utlenione lipoproteiny wywołują reakcję zapalną, ponieważ są cytotoksyczne, a aktywność zapalna prowadzi do mineralizacji. Rola odporności wrodzonej i nabytej w rozwoju CAVD i progresji choroby została ostatnio podkreślona13. Aktywacja i ekspansja klonalna określonych podzbiorów limfocytów T pamięci została udokumentowana u pacjentów z CAVD i zmineralizowanymi płatkami zastawki aortalnej, tak więc zakłada się, że procesy zapalne są zaangażowane co najmniej w rozwój CAVD i przypuszczalnie również w progresję choroby14. W rzeczywistości, chociaż komórki i makrofagi prezentujące antygen są obecne zarówno w zdrowej, jak i chorej zastawce, obecność limfocytów T wskazuje na starzejącą się i chorą zastawkę aortalną. Ten naciek limfocytarny wraz ze wzrostem neowaskularyzacji i metaplazji są charakterystycznymi objawami histologicznymi CAVD15.

Stawiamy hipotezę o istnieniu interakcji między komórkami śródmiąższowymi zastawki aortalnej a aktywacją układu odpornościowego, która potencjalnie powoduje zainicjowanie przewlekłego procesu zapalnego w zastawce aortalnej. Oznaczanie limfocytów T ze zwężonej tkanki zastawki aortalnej może być skutecznym sposobem wyjaśnienia ich roli w rozwoju zwapnienia, ponieważ może zapewnić ścisłą reprezentację komórek zastawki aortalnej in vivo. W niniejszej pracy, wykorzystując tkankę zastawki aortalnej, izolujemy limfocyty T, hodujemy je i klonujemy, a następnie charakteryzujemy za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Świeże próbki zastawki aortalnej wycięto od pacjentów z CAVD, którzy otrzymali chirurgiczną wymianę zastawki z powodu ciężkiego zwężenia zastawki aortalnej. Po chirurgicznym wycięciu świeżą próbkę zastawki rozbiorowano na małe kawałki, a limfocyty T wyhodowano, sklonowano, a następnie przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Procedura barwienia jest prosta, a barwione probówki można utrwalić za pomocą 0,5% paraformaldehydu i przeanalizować do 15 dni później. Dane wygenerowane z panelu barwienia mogą być wykorzystane do śledzenia zmian w rozmieszczeniu limfocytów T w czasie w odniesieniu do interwencji i mogą być łatwo dalej rozwijane w celu oceny stanów aktywacji określonych podzbiorów limfocytów T będących przedmiotem zainteresowania.

Ekstrakcja zwapniałej tkanki, izolacja leukocytów od zwapniałej tkanki, a w szczególności zastosowanie cytometrii przepływowej na tego typu tkankach, może być wyzwaniem, ze względu na problemy takie jak autofluorescencja. Niewiele jest publikacji z protokołami do tego konkretnego celu16,17,18. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół opracowany specjalnie do bezpośredniej izolacji i hodowli limfocytów T z próbek ludzkiej zastawki aortalnej. Klonalna ekspansja limfocytów jest cechą charakterystyczną odporności adaptacyjnej. Badanie tego procesu in vitro dostarcza wnikliwych informacji na temat poziomu heterogeniczności limfocytów19. Po trzytygodniowym okresie inkubacji klony limfocytów T są gotowe do eksplantacji, ponieważ uzyskano odpowiednią ilość limfocytów T z każdego klonu, aby umożliwić badanie fenotypowe i funkcjonalne. Następnie fenotyp klonów T bada się za pomocą cytofluorometrii.

Ten protokół immunologiczny jest adaptacją metody wcześniej opracowanej przez Amedei et al. do izolacji i charakterystyki limfocytów T z tkanki ludzkiej, specjalnie zaprojektowanej dla zwapniałych tkanek ludzkich, takich jak w CAVD20,21,22. Przedstawiony tutaj protokół izolacji PBMC (komórek jednojądrzastych krwi obwodowej) przy użyciu napromieniowanego płaszcza kożuchowego opisuje skuteczny sposób uzyskiwania komórek zasilających (FC), specjalnie dostosowanych do fazy klonowania limfocytów T wyizolowanych z komórek śródmiąższowych zastawki. Warstwa zasilająca składa się z komórek zatrzymanych we wzroście, które są nadal żywotne i bioaktywne. Rola komórek żywicielskich jest ważna dla wspierania przeżycia in vitro i wzrostu limfocytów T wyizolowanych z komórek śródmiąższowych zastawki23. Aby uniknąć proliferacji komórek żywicielskich w hodowli, komórki te muszą przejść zatrzymanie wzrostu. Można to osiągnąć na dwa sposoby: za pomocą metod fizycznych, takich jak napromienianie, lub poprzez leczenie cytotoksycznymi substancjami chemicznymi, takimi jak mitomycyna C (MMC), antybiotyk przeciwnowotworowy, który można stosować bezpośrednio na powierzchnię hodowli24. Tutaj pokazujemy zatrzymanie wzrostu komórek zasilających osiągnięte przez napromieniowanie komórek.

Ta metoda przedstawia efektywny, ekonomiczny sposób izolowania i charakteryzowania limfocytów T z tkanki zastawki aortalnej, przyczyniając się do poszerzenia spektrum metod immunologicznych do badania patofizjologii CAVD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie ze Statutem Charité dla Zapewnienia Dobrej Praktyki Naukowej, a wytyczne prawne i przepisy dotyczące prywatności i etyki były przestrzegane. Komisja Bioetyczna zatwierdziła wszystkie eksperymenty na ludziach, a prywatność i anonimowość pacjentów zostały zachowane zgodnie z zasadami przedstawionymi w Formularzu Etycznym.

UWAGA: Do opisanego poniżej protokołu użyto świeżych próbek ludzkiej zastawki stenotycznej.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotuj wzbogaconą kompletną pożywkę RPMI, dodając do niej pożywkę RPMI 1640: aminokwasy endogenne; Pirogonian sodu, L-glutamina, ß-merkaptoetanol i penicylina-streptomycyna (pióro/paciorkowiec). Przefiltruj go przed użyciem. Przechowywać w temperaturze +4 °C i zużyć w ciągu dwóch miesięcy.
  2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej (CCM) do fazy klonowania przy użyciu wzbogaconej pożywki RPMI 1640 z dodatkiem inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), podłoża podstawowego HB, 50 j. interleukiny 2 (IL-2) i surowicy ludzkiej (HS). Filtruj i używaj go w ciągu dnia. Nie przechowywać.
  3. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych do fazy ponownego karmienia, używając wzbogaconej kompletnej pożywki RPMI 1640 z dodatkiem FBS, pożywki podstawowej HB, 30 j. IL-2 i HS. Filtruj i używaj go w ciągu dnia. Nie przechowywać.
  4. Przygotować bufor do przemywania zawierający 250 ml RPMI i 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca. Przechowywać w temperaturze +4 °C, zużyć w ciągu dwóch miesięcy.

2. Izolacja ludzkich limfocytów T i hodowla w kolbach T-25

  1. Umieść próbkę zaworu zwężonego na sterylnej szalce Petriego wypełnionej buforem do mycia, upewniając się, że cała próbka zaworu jest nim pokryta. Odstawić na 15 minut.
  2. Pokrój zawór zwężony na małe kawałki za pomocą skalpela i odstaw na 10 minut.
  3. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej z 50 j. IL-2, jak opisano wcześniej, i przefiltrować ją.
  4. Dodać CCM do kolb T25 i za pomocą sterylnych szczypiec z tworzywa sztucznego umieścić części zaworów wewnątrz kolb.
  5. Przechowywać kolby w pozycji pionowej w inkubatorze CO2 przez tydzień, zwracając uwagę na obserwację stanu kolby pod mikroskopem. Klony limfocytów T powinny być widoczne po około trzech dniach od etapu hodowli; Dla lepszej obserwacji zaleca się umieszczenie kolb w pozycji poziomej na 20 minut przed analizą mikroskopową.
    UWAGA: Ilość pożywki do hodowli komórkowych zależy od ilości obecnej próbki i od tego, ile kolb T25 zostanie użytych. Biorąc pod uwagę, że każdy kawałek zaworu wymaga 10 ml CCM wewnątrz kolby, 25 ml CCM w kolbie T25 jest odpowiednie dla 3 części zaworu.

3. Faza klonowania

UWAGA: Do fazy klonowania limfocytów T, konieczne jest rozpoczęcie od izolacji komórek zasilających z napromieniowanej kożuchy (BC), zgodnie z protokołem PBMCs.

  1. Otwórz worek BC pod pokrywą z przepływem laminarnym za pomocą kolca workowego z zaworem bezigłowym i przenieś 50 ml krwi do kolby T150. Dodać 70 ml PBS w celu rozcieńczenia krwi wewnątrz kolby.
  2. Weź cztery stożkowe probówki o pojemności 50 ml i umieść w każdej z nich 20 ml pożywki o gradiencie gęstości i ostrożnie nałóż na nią 30 ml krwi.
  3. Wirować przez 25 minut przy 800 x g i temperaturze 20 °C przy wyłączonym hamulcu.
  4. Ostrożnie odessać supernatant i wyrzucić go jako odpad. Zebrać pierścień PBMC w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, dodając do roztworu PBS do objętości 50 ml.
  5. Wirować przez 10 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 20 °C.
  6. Odrzucić sklarowany osad i zawiesić osad, dodając do roztworu PBS do objętości 50 ml. Powtarzać fazę wirowania przez 10 minut w 400 x g i temperaturze 20 °C.
  7. Odrzucić supernatant i zawiesić FC w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  8. Weź nową probówkę do pobierania i rozcieńcz FC PBS w stosunku 1:10, dodając do środka 9,9 ml PBS i 100 μl z probówki z FC i pożywką do hodowli komórkowych. Dobrze spłukać pipetą i pobrać 7 μl z tego rozcieńczenia i policzyć komórki pod mikroskopem.
  9. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowej do fazy klonowania: 70 ml z 50 j. IL-2, a następnie podziel ją na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml, każda probówka będzie zawierała 25 ml pożywki do hodowli komórkowej, jak opisano poniżej:
    • Probówka 1: 25 ml CCM + FC + 0,6% fitohemaglutyniny (PHA)
    • Probówka 2: 25 ml limfocytów CCM + T
      UWAGA: Celem metody PMBC jest uzyskanie 2 x 106 komórek na każdy ml, dlatego należy odpowiednio obliczyć 25 ml przygotowanego CCM (probówka 1). Ogólny stosowany wzór to: Liczba zliczonych komórek x 106: 1 ml = CCM x 106: X

4. Hodowla limfocytów T na płytkach wielodołkowych

  1. Za pomocą pipety elektronicznej zebrać całą pożywkę do hodowli komórkowych wewnątrz kolb i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Puste kolby można wyrzucić.
  2. Granulować komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 20 °C.
  3. Odrzucić supernatant, zawiesić osad w 50 ml PBS i zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 20 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
  4. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 1 ml CCM. Pobrać 7 μl z tego rozcieńczenia i policzyć komórki pod mikroskopem.
    UWAGA: Liczbę zliczonych komórek należy pomnożyć w zależności od objętości komory i zastosowanego rozcieńczenia.
  5. Przystąpić do rozcieńczania komórek liczonych od 105 do 103 w pożywce do hodowli komórkowych, a następnie pobrać 500 μl z 103 i umieścić je w probówce 2.
  6. Wlać 25 ml pożywki do hodowli komórkowych z probówki 1 do plastikowej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm.
  7. Weź cztery dolne płytki wielodołkowe 96-U i za pomocą pipety wielokanałowej ustaw na 100 μl FC nasion w każdym dołku.
  8. Weź probówkę 2 i wlej pożywkę do hodowli komórkowych na szalkę Petriego. Za pomocą pipety wielokanałowej ustawionej na 100 μl, wysiewaj komórki T w każdym dołku.
  9. Płytki wielodołkowe należy przechowywać w inkubatorze CO2 przez tydzień.

5. Pierwsza faza ponownego karmienia

  1. Używając napromieniowanej torby na płaszcz typu buffy, postępuj zgodnie z metodą PBMCs, aby uzyskać FC zgodnie z opisem w poprzedniej metodzie.
  2. Przygotuj odpowiednią ilość CCM bez PHA i przefiltruj ją.
  3. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń 100 μl z każdej studzienki, uważając, aby nie dotykać dna studzienki.
  4. Dodać 100 μl FC do wszystkich studzienek jako warstwę zasilającą, aby dostarczyć składniki odżywcze do hodowli komórkowych i zmienić pożywkę.
    UWAGA: Dla każdej studzienki wielostudzienkowej zaleca się rozważenie 6 ml CCM, więc zalecana ilość dla 4 dołków wielostudzienkowych wynosi około 30 ml. PHA (0,4% całkowitej ilości CCM) należy dodawać do CCM raz na dwa tygodnie.

6. Druga faza ponownego karmienia

  1. Powtórzyć fazę ponownego karmienia po opisanym powyżej pasażu. Do pożywki do hodowli komórkowej należy dodać 0,4% PHA.

7. Pierwsza faza podziału z 1 dołka/próbki na 2 dołki/próbkę

  1. Sprawdź wszystkie cztery dołki wielofunkcyjne pod mikroskopem i śmiało dziel te studzienki za pomocą klonów limfocytów T (TCC).
  2. Postępuj zgodnie z protokołem PBMCs, aby wyizolować komórki zasilające z napromieniowanej torby na kożuch.
  3. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych z 30 j. IL-2. Dodaj FC i weź nową 96-dołkową płytkę wielodołkową z dnem U.
  4. Za pomocą pipety ustawionej na 100 μl dobrze przepłukać wybrane próbki w studzienkach i podzielić 200 μl objętości zawartej w każdym dołku na 2 nowe dołki nowej płytki wielodołkowej, tak aby uzyskać 100 μl objętości dla każdej z nowych 2 studzienek.
  5. Dodaj 100 μl FC do wszystkich nowych studzienek. Każda studzienka musi zawierać całkowitą objętość 200 μl.
  6. Ustawić pipetę na 100 μl i dodać 100 μl do dodatkowych dwóch studzienek, zawierających tylko FC, które służą jako kontrola.
    UWAGA: Użyj mikroskopii świetlnej, aby obserwować wszystkie płytki wielodołkowe w celu określenia, w których studzienkach udało się wyhodować TCC. Aby ułatwić wybór klonów, można dokonać porównania z kontrolą (dwie studzienki zawierające tylko FC), przy czym klon wydaje się ciemniejszy i większy w porównaniu z kontrolą. Studzienki, które należy wybrać, to te z dużym, przezroczystym, okrągłym klonem, z limfocytami gęsto upakowanymi razem. Jeśli po dwóch tygodniach ponownego karmienia nie ma TCC, zaleca się odczekanie jeszcze jednego tygodnia i wykonanie dodatkowej fazy ponownego karmienia.

8. Druga faza podziału z 2 dołków/próbkę na 4 dołki/próbkę

  1. Ustawić pipetę na 100 μl, dobrze wypłukać w dwóch dołkach każdej próbki i zasiać dwie nowe studzienki po 100 μl dla każdej z nich.
  2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej z 30 j. IL-2 i postępować zgodnie z techniką PBMCs, aby wyekstrahować FC z worka na kożuchy i umieścić FC w CCM.
  3. Ustawić pipetę na 100 μl i wysiać FC we wszystkich studzienkach. Przechowuj studzienki w inkubatorze CO2 przez tydzień.

9. Trzecia faza podziału z 4 dołków/próbkę do 8 dołków/próbkę:

  1. Używając pipety wielokanałowej ustawionej na 100 μl, dobrze przepłukać wszystkie cztery dołki każdej próbki i wprowadzić 100 μl do każdej z czterech nowych studzienek na nowej 96-dołkowej płytce.
  2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych i postępować zgodnie z techniką PBMCs, aby wyekstrahować FC z napromieniowanej torby z kożuchem.
  3. Umieść FC w CCM. Ustawić pipetę na 100 μl i wysiać FC we wszystkich studzienkach. Przechowuj studzienki w inkubatorze CO2 przez tydzień

10. Analiza cytofluorymetryczna

  1. Pobrać płytkę wielodołkową z najstarszą datą z inkubatora CO2 i zidentyfikować probówki do pobrania z numerami próbek do analizy.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 200 μl z 2 końcówkami dokładnie wypłukać dwie studzienki tej samej próbki i umieścić obie w tej samej probówce zbiorczej. Powtórz ten krok dla wszystkich próbek.
    UWAGA: Próbki FC nie będą analizowane, ponieważ służą jedynie jako kontrole.

11. Przygotowanie panelu barwienia przeciwciał do analizy cytofluorymetrycznej

  1. Dodać 1 ml roztworu PBS do każdej probówki i odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 20 °C.
  2. Po fazie wirowania odrzucić supernatant.
    UWAGA: Panel barwienia przeciwciał można znaleźć w Tabeli 1. Każde obliczone stężenie pojedynczego przeciwciała wynosi około 2 μl / próbkę. Zaleca się krótkie odkręcenie probówek z przeciwciałami przed użyciem. Aby chronić przeciwciała sprzężone z fluoroforem przed światłem, wszystkie czynności należy wykonywać w ciemności.
  3. Przygotuj mieszaninę przeciwciał w probówce o pojemności 1,5 ml i
    4. przemieszaj ją.
  4. Dodać przeciwciała do próbek i pozostawić próbki do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  5. Dodać 1 ml PBS do każdej próbki i wirować przez 10 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 20 °C.
  6. Odrzucić sklarowany osad i zawiesić osad w 500 μl roztworu PBS.
  7. Kontynuować analizę cytofluorymetryczną (analiza FACS, tabela 1).
    UWAGA: Barwione próbki można utrwalić za pomocą 0,5% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w roztworze PBS i przeanalizować do 15 dni później.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
markerFluorofor
Płyta CD3PE/CY7
Płyta CD4Alexa Fluor 488
Płyta CD8Fioletowy brylantowy 510
Płyta CD14Fioletowy brylantowy 421
Płyta CD25Pe
Płyta CD45Fioletowy brylantowy 711

Tabela 1. Panel barwienia przeciwciał do wykrywania populacji limfocytów T w zwapnieniu zastawki aortalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowaliśmy prostą i tanią metodę w celu charakterystyki populacji leukocytów w świeżych próbkach zastawki aortalnej pobranych od pacjentów z ciężką stenozą zastawki aortalnej (patrz protokół). Metoda izolacji PBMC jest kluczowym etapem pozyskiwania komórek odżywczych, które są wykorzystywane w każdym kroku eksperymentu (w fazach klonowania, ponownego odżywiania i rozdzielania) i umożliwiają detekcję oraz charakterystykę leukocytów infiltrujących próbki zastawki aortalnej. Kluczowe etapy tej metody przedstawiono na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono metodę charakterystyki subpopulacji limfocytów T wyizolowanych z próbek zwężonej zastawki aortalnej za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta wymaga użycia napromieniowanego kożucha w celu wyizolowania PBMC. Częstotliwość promieniowania, na którą muszą być poddane worki z kożuchem, wynosi 9000 Rad/90 Gray (Gy) i stanowi kluczowy krok w kierunku zatrzymania proliferacji komórek zasilających. Rolą komórek wyizolowanych z worków z kożuchem jest działanie tylko jako komórki zasilające i do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wszystkie worki na płaszcze buffy użyte do tego protokołu zostały napromieniowane dzięki dostępności dr Petera Rosenthala, dr Dirka Böhmera i całego zespołu Działu Radiologii Charité Benjamin Franklin. Stypendystka/Mary Roxana Christopher, praca ta jest wspierana przez stypendium Niemieckiego Towarzystwa Kardiologicznego (DGK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plastikowe strzykawki 50 mlFisherbrand9000701
96-dołkowe płytki wielodołkowe z dnem w kształcie litery UGreiner Bio-One10638441
Bag Spike (bez igieł)SigmaP6148Rozcieńczyć do 4% z PBS
CD14 Fioletowy brylantowy 421  Biolegend560349
CD25 PE  Biolegend302621
CD3 PE/CY7  Biolegend300316
CD4 Alexa Fluor 488  Biolegend317419
CD45 Brylantowy fiolet 711  Biolegend304137
CD8 Fioletowy brylantowy 510  Biolegend301047
Probówka Eppendorf 1,5 mlEppendorf13094697
Probówka Eppendorf 0,5 mlThermo ScientificAB0533
Stożkowa probówka wirówkowa Falcon 15 mlFalcon10136120
Falcon 50 ml stożkowe probówkiFalcon10788561
Falcon Falcon Probówki polistyrenowe okrągłodenneBD2300E
Szybki odczyt 102 plastikowa komora liczącaKOVA INTERNATIONAL630-1893
Filtry do podłoża hodowlanego 250 mlNalgeneThermo Fisher Scientific168-0045
Filtry do podłoża hodowlanego 500 mlNalgeneThermo Fisher Scientific166-0045
HB 101 Liofilizowany suplementIrvine ScientificT151
HB Basal MediumIrvine ScientificT000
Inaktywowany termicznie FBS (płodowa surowica bydlęca)EurocloneECS0180L
HS (surowica ludzka)Sigma AldrichH3667
Human IL-2 ISMiltenyi Biotec130-097-744
L-glutaminaGibco11140050
LymphoprepFalcon352057
Roztwór aminokwasów endogennychSigma11082132001
ParaformaldehydThermo Fisher Scientific10538931
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Thermo Fisher Scientific10010023
Penicylina/StreptomycynaGibco1507006310000 U/ml
PHA (fitohemaglutynina)Komórka macierzysta Technologie7811
Plastikowe szalki PetriegoThermo ScientificR80115TS10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 MediaHyClone15-040-CV
Pirogronian soduGibco by Life technologie11360070
Filtry strzykawkowe 0,45&mikro; lRotilabo-SpritzenfilterP667.1
T-25 Kolby do hodowli komórkowychInvitrogenThermo Fisher ScientificAM9625
T-75 Kolba do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific10232771
β- MerkaptoetanolGibcoA2916801
wirówkowe

Bibliografia

  1. Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
  2. Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
  3. Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
  4. Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
  5. Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
  6. Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
  7. Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
  8. Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
  9. Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
  10. Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945(2015).
  11. Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
  12. Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
  13. Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
  14. Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
  15. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
  16. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  17. Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51(2019).
  18. Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
  19. Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
  20. Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
  21. Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
  22. Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900(2017).
  23. Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
  24. Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
  25. Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854(2017).
  26. Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
  27. Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
  28. Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
  29. Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
  30. Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja limfocytów Tzwapnienie zastawki aortalnejcytometria przepływowaklonowanie limfocytów Tizolacja PBMClimfocyty T CD4aktywacja immunologiczna
Badanie zwapnienia zastawki aortalnej poprzez izolację i hodowlę limfocytów T przy użyciu komórek zasilających z napromieniowanej Buffy Coat
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.