Artykuł metodologiczny

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

DOI:

10.3791/62067

⸱

23 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt zawiera protokół reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ (HCR) połączonej z immunofluorescencją do wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) w linii komórkowej i trójwymiarowych (3D) kulturach ludzkiego nabłonka dróg oddechowych. Metoda ta pozwala na wysoce specyficzną i czułą wizualizację wirusowego RNA poprzez oparcie się na HCR zainicjowanym przez lokalizację sondy. Sondy z dzielonym inicjatorem pomagają wzmocnić sygnał przez wzmacniacze znakowane fluorescencyjnie, co skutkuje znikomą fluorescencją tła w mikroskopii konfokalnej. Znakowanie wzmacniaczy różnymi barwnikami fluorescencyjnymi ułatwia jednoczesne rozpoznawanie różnych celów. To z kolei pozwala na mapowanie infekcji w tkankach, aby lepiej zrozumieć patogenezę i replikację wirusa na poziomie pojedynczej komórki. Sprzężenie tej metody z immunofluorescencją może ułatwić lepsze zrozumienie interakcji gospodarz-wirus, w tym przemiany epigenomu gospodarza i szlaków odpowiedzi immunologicznej. Dzięki czułej i specyficznej technologii HCR, protokół ten może być również używany jako narzędzie diagnostyczne. Należy również pamiętać, że technikę tę można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić wykrywanie dowolnego RNA, w tym niekodujących RNA i wirusów RNA, które mogą pojawić się w przyszłości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SARS-CoV-2 to nowy ludzki betakoronawirus, który pojawił się pod koniec 2019 roku, wywołując bezprecedensową pandemię kilka miesięcy później. Ponieważ wirus jest nowy dla nauki, większość jego biologii i wpływu na komórki gospodarza pozostaje nieznana. Dlatego mapowanie tropizmu wirusa-komórki i tkanki podczas infekcji jest ważne, jeśli chcemy zrozumieć jego podstawowe cechy biologiczne i wpływ na gospodarza. Do badania interakcji wirus-gospodarz stosuje się kilka technik, w tym testy biochemiczne, biologiczne i fizyczne. Hybrydyzacja in situ jest powszechną metodą, która wykorzystuje znakowane komplementarne DNA, RNA lub zmodyfikowane sondy kwasów nukleinowych, które lokalizują się w określonych sekwencjach DNA lub RNA w komórce lub tkance.

Nowa metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji RNA in situ (RNA-FISH) została opracowana, która zawiera modyfikacje w celu zwiększenia czułości poprzez wzmocnienie stosunku sygnału do szumu za pomocą HCR1. HCR pozwala na badanie lokalizacji RNA na poziomie pojedynczej komórki. Ze względu na wysoką specyficzność, czułość i rozdzielczość, metoda ta jest przydatna nie tylko w badaniach z zakresu nauk podstawowych, ale także w projektach aplikacyjnych, np. diagnostyce. Niedawno wykazano wykonalność tej metody do wykrywania RNA SARS-CoV-2 zlokalizowanego w komórkach rzęskowych w całkowicie zróżnicowanych kulturach 3D ludzkiego nabłonka dróg oddechowych (HAE)2. Hodowle HAE stanowią jedno z najbardziej zaawansowanych narzędzi wykorzystywanych do badania infekcji wirusowych w kontekście mikrośrodowiska "naturalnej infekcji"3,4.

Kilka doniesień na temat ludzkich koronawirusów (HCoV), w tym SARS-CoV-2, podkreśla znaczenie modyfikacji epigenetycznych w odniesieniu do infekcji i patofizjologii HCoV [przejrzane w 5], np. wzór metylacji genu kodującego receptor enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE-2)6,7. Co ciekawe, badania przesiewowe metodą spektrometrii mas zidentyfikowały kilka czynników epigenetycznych, które wchodzą w interakcje z proteomem SARS-CoV-2 klasy 8. Dokładniej, niestrukturalne białko 5 (NSP5) wiąże się z regulatorem epigenetycznym, deacetylazą histonową 2, a katalitycznie nieaktywny NSP5 (C145A) oddziałuje z metylotransferazą tRNA 1 (24). Dodatkowo, aktywność metylotransferazy NSP16 jest blokowana przez inhibitor metylotransferazy, sinefungin9. Jednak dokładna rola tych czynników epigenetycznych w COVID-19 pozostaje niejasna. Replikacja HCoV odbywa się w cytoplazmie zakażonej komórki i wyzwala reakcje zapalne, które są regulowane przez modyfikacje epigenetyczne10.

Na przykład, HCoV-229E precyzyjnie dostraja sygnalizację czynnika jądrowego kappa B i głęboko przeprogramowuje krajobraz chromatyny komórkowej gospodarza poprzez zwiększenie acetylacji H3K36 i H4K5 w niektórych regionach11. Zakażenie koronawirusem związanym z bliskowschodnim zespołem oddechowym zwiększa poziom H3K27me3 i wyczerpuje H3K4me3 w regionach promotorowych podzbiorów specyficznych genów wrażliwych na interferon12. Ponadto wirusowe RNA wyzwala odpowiedź immunologiczną komórek, jak wykazano w przypadku flawiwirusów13, retroviruses14,15 i coronaviruses16. Markery epigenetyczne na wirusowym RNA mogą odgrywać rolę w rozpoznawaniu przez czujniki komórkowe, jak pokazano w przypadku metylacji m7A ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1 RNA17. Pozostają jednak pytania: Jaki jest wpływ RNA SARS-CoV-2 na odpowiedź immunologiczną i czy w grę wchodzą znaki epigenetyczne?

Tutaj opisano zoptymalizowaną metodę RNA-FISH połączoną z analizą immunofluorescencyjną linii komórkowych i tkanek 3D (w pełni zróżnicowane HAE). Chociaż metody cytologiczne, takie jak FISH i immunofluorescencja, są szeroko stosowane, ta metoda hybrydyzacji in situ nowej generacji oparta na HCR nigdy nie była używana do wykrywania wirusów (z wyjątkiem niedawnej publikacji)2. Ogólnie rzecz biorąc, barwienie immunologiczne i FISH wymagają następujących etapów: przepuszczalność, aby umożliwić penetrację sond lub przeciwciał; utrwalenie, w którym materiał komórkowy jest utrwalony i zachowany; wykrywanie, w którym stosowane są przeciwciała lub sondy kwasów nukleinowych; i wreszcie montaż próbek do wizualizacji.

Chociaż istniejące protokoły mają te ogólne cechy, różnią się one znacznie pod względem parametrów. W tym miejscu opisano zoptymalizowany, prosty protokół immuno-RNA-FISH do wykrywania RNA SARS-CoV-2 w kulturach HAE i komórkach Vero. Technika składa się z następujących etapów: (1) utrwalanie komórek za pomocą paraformaldehydu; (2) przepuszczalność z detergentem lub metanolem (MeOH); (3) rehydratacja za pomocą stopniowanej serii roztworów MeOH (tylko kultury HAE); (4) wykrywanie; (5) amplifikacja z wykorzystaniem technologii HCR do wykrywania RNA SARS-CoV-2; (6) barwienie immunologiczne; oraz (7) obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie bufora

  1. Na 500 ml buforu 2x PHEM połącz 18,14 g piperazyno-N,N′-bis(kwasu 2-etanosulfonowego) (PIPES), 6,5 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanasulfonowego (HEPES), 3,8 g kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA) i 0,99 g siarczanu magnezu (MgSO4). Uzupełnić objętość do ~400 ml wodą destylowaną (dH2O), wymieszać i dostosować pH do 7,0 za pomocą 10 M wodorotlenku potasu (KOH) lub wodorotlenku sodu (NaOH). Uzupełnij końcową objętość do 500 ml, a następnie podziel na porcje po 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie to wymagane.
    UWAGA: Bufor nie będzie przezroczysty, dopóki pH nie osiągnie 7,0.
  2. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 37% w/v paraformaldehydu (PFA). Na 50 ml wymieszaj 18,5 g PFA i 35 mldH2Ow szklanej butelce. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym z podgrzewaniem. Dodać 900 μl 1 M KOH lub NaOH i mieszać, aż roztwór stanie się klarowny. Pozostawić do ostygnięcia i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml; uzupełnić do 50 ml dH2O. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebny.
    UWAGA: Z formaldehydem należy obchodzić się pod wyciągiem, nosząc rękawice ochronne i fartuch laboratoryjny.
  3. Przygotować bufor utrwalający (3,7% PFA buforowany PHEM). W przypadku 50 ml połącz 5 ml 37% roztworu PFA, 25 ml 2x buforu PHEM i 20 ml dH2O w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie to wymagane.
    UWAGA: Po rozmrożeniu bufor można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  4. Przygotować PBST (0,1% Tween-20 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]). Na 50 ml dodaj 50 μl 100% Tween-20 do 50 ml 1x PBS i dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Przygotować do rehydratacji, łącząc MeOH/PBST w proporcjach 3:1, 1:1 i 1:3 (końcowa objętość 100 ml każdego z nich; patrz Tabela 1).
    UWAGA: MeOH jest bardzo toksyczny i łatwopalny. Ponieważ może uszkodzić nerw wzrokowy, należy obchodzić się z nim pod wyciągiem, unikając otwartego ognia. Ponieważ mieszanie MeOH i PBST powoduje reakcję egzotermiczną, połącz roztwory na lodzie.
  6. Na 1000 ml 20x SSC połącz 175,3 g chlorku sodu (NaCl) i 88,2 g cytrynianu sodu w zlewce i uzupełnij 800 ml dH2O. Mieszaj aż do rozpuszczenia i dostosuj pH do 7,2 za pomocą NaOH. Dodać dH2O do całkowitej objętości 1000 ml i autoklawować lub przefiltrować przez filtr 0,22 μm do autoklawowanej butelki.
  7. Aby uzyskać 50 ml 5x SSCT, połącz 12,5 ml buforu 20x SSC z 37,5 ml dH2O i dodaj 50 μl 100% Tween-20. Dobrze wymieszaj.
  8. W przypadku 50 ml 50% 5x SSCT/50% PBST, połącz 25 ml 5x SSCT z 25 ml PBST.
  9. Na 50 ml 2x SSC połącz 5 ml buforu 10x SSC z 45 ml dH2O. Dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Wszystkie SSC powinny być przechowywane w RT w ciemności.

2. Definicja celu, sondy i wzmacniacze

  1. Skorzystaj z narzędzi dostępnych na stronie producenta do projektowania wzmacniaczy i sond. Upewnij się, że sondy są komplementarne w stosunku do odwrotnej nici DNA genu N SARS-CoV-2 (rysunek uzupełniający 1).
  2. Określ najlepszy rozmiar zestawu sond (zestaw 20 sond jest wystarczający do wizualizacji).
  3. Ustaw wzmacniacze używane do wykrywania docelowego RNA.
    1. Użyj HCR amplifier B1 oznaczony Alexa Fluor 647.
      UWAGA: Wzmacniacz HCR składa się z metastabilnych spinek do włosów HCR h1 i h2. Przy użyciu tego protokołu można projektować eksperymenty multipleksowe. Jeśli jest to planowane, należy wybrać inny wzmacniacz HCR (B1, B2, ...) dla każdego docelowego RNA, który ma być obrazowany w tej samej próbce (np. wzmacniacz B1 dla celu 1, wzmacniacz B2 dla celu 2, ...).

3. Hodowla komórkowa i zakażenie SARS-CoV-2

  1. Hodowla komórek Vero (komórki nabłonka nerki małpy) w zmodyfikowanej pożywce Eagle firmy Dulbecco zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej.
    1. Wysiewaj 50 000 komórek na szkiełkach nakrywkowych (nr 1, 15 × 15 mm) na płytce 12-dołkowej.
  2. Przygotuj w pełni zróżnicowane kultury HAE zgodnie z opisem18 na przepuszczalnych podporach wkładu Transwell z membraną (średnica = 6,5 mm) i posiew w pożywce do wzrostu nabłonka oskrzeli aż do całkowitego zrostu.
  3. Infekcja wirusowa
    1. Zaszczepić komórki wirusem SARS-CoV-2 w dawce 1000-krotności mediany dawki zakaźnej w kulturze tkankowej (TCID50) na ml
    2. Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    3. Umyj komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć niezwiązanego wirusa.
    4. Hodowla komórek przez 48 godzin.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH w komórkach Vero hodowanych na szkiełkach nakrywkowych

DZIEŃ 1

  1. Utrwalanie i przepuszczalnie komórek
    1. Napraw zainfekowane komórki za pomocą 3,7% w/v roztworu PFA przez 1 godzinę w RT.
    2. Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie umyć komórki za pomocą 1x PBS.
    3. Przepuszczać komórki roztworem PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    4. Odessać PBST i dwukrotnie umyć komórki 1x PBS.
  2. wykrywanie
    1. Odessać 1x roztwór PBS i dwukrotnie przemyć komórki 2x SSC w RT.
    2. Odessać 2x roztwór SSC i wstępnie zhybrydyzować próbki, dodając co najmniej 300 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Przykryć studzienki zawierające komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    3. Przygotować roztwór sondy, dodając 1,2 pmol mieszaniny sondy do buforu hybrydyzacji sondy.
      1. Użyj 1,2 μl sondy 1 μM, aby przygotować 300 μl materiału roboczego.
    4. Usuń roztwór do prehybrydyzacji i przenieś szkiełka nakrywkowe do wilgotnej komory.
      1. Odpipetować 30-50 μl roztworu sondy na parafilm, aby utworzyć pojedyncze kropelki.
    5. Próbki inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 37 °C.

      DZIEŃ 2
    6. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do płytki 12-dołkowej i usunąć nadmiar roztworu sondy, przemłukując przez 4 x 5 minut 400 μl buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jako alternatywę dla umieszczania 30-50 μl podwielokrotności na parafilmie i pod szkiełkami nakrywkowymi w celu inkubacji, należy dodać 300 μl roztworu sondy bezpośrednio do szkiełek nakrywkowych na płytce 12-dołkowej. Ta procedura jest prostsza, ale wymaga znacznych ilości odczynników. Przed użyciem podgrzej bufor do płukania sondy do temperatury 37 °C. Oblicz potrzebną ilość buforu i przenieś go do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    7. Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w RT.
    8. Zastąp 5 x roztwór SSCT 1 x PBS i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.
  3. wzmocnienie
    1. Usunąć 1x roztwór PBS ze studzienek i dodać co najmniej 300 μl buforu amplifikacyjnego do każdego dołka. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj każdą spinkę do włosów HCR (h1 i h2), schładzając zatrzaskowo żądaną objętość w oddzielnych probówkach.
      1. Aby przygotować 300 μl roztworu do amplifikacji, użyj 18 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 300 μl użyj 6 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).
      2. Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek.
      3. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.
      4. Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.
    3. Przygotuj mieszankę spinek do włosów, dodając schłodzone zatrzaskowo spinki do włosów "h1" i "h2" do bufora wzmacniającego.
    4. Umieść krople 30-50 μl mieszanki spinek do włosów na parafolii.
    5. Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w ciemności w temperaturze RT.

      DZIEŃ 3
    6. Przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytkę 12-dołkową i usuń nadmiar spinek do włosów, myjąc przez 5 x 5 minut 5x SSCT w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    7. Zassać 5x bufor SSCT i zastąpić go 1x PBS.
      UWAGA: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie wybarwieć jądra (patrz punkt 5).
  4. Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
    1. Odessać 1x roztwór PBS i zastąpić go 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 0,2 μg / ml) w 1x roztworze PBS.
    2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
    4. Umieścić dwie krople po 10 μl podłoża montażowego każda; upewnić się, że krople są wystarczająco oddzielone, aby umożliwić umieszczenie dwóch szkiełek nakrywkowych na jednym szkiełku.
    5. Usuń nadmiar płynu, stukając w szkiełka nakrywkowe czystym ręcznikiem, a następnie umieść je w podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu komórkami skierowanymi w dół.
    6. Umieść zamontowane próbki na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności i pozwól im się utwardzić.
    7. Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISH w kulturach HAE

DZIEŃ 1

  1. Utrwalanie i przepuszczalność kultury HAE
    1. Odessać pożywkę i utrwalić zainfekowane komórki za pomocą 3,7% roztworu PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać 3,7% roztwór PFA i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
      1. Zastąp 3,7% roztwór PFA 1x PBS pod wkładką Transwell.
    3. Odrzucić PBS i odwodnić próbki, przemywając je 2 x 5 minut 100% MeOH schłodzonym do temperatury -20 °C.
    4. Po drugim płukaniu należy wymienić bufor na świeży, schłodzony MeOH w celu przepuszczalności pod wkładem Transwell. Przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.

DZIEŃ 2

  1. Nawadnianie
    Ponownie uwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii roztworów MeOH/PBST (każda przez 5 minut) na lodzie: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS i 100% PBST (dwukrotnie).
    1. Myj komórki przez 5 minut na lodzie z 50% 5x SSCT/50% PBST.
    2. Myć komórki przez 5 minut na lodzie za pomocą 5x SSCT.
    3. Zastąp bufor 5x SSCT na 1x PBS.
  2. wykrywanie
    1. Inkubować komórki (wewnątrz wkładki Transwell) przez 5 minut na lodzie ze 100 μl buforu do hybrydyzacji sondy. Następnie przenieść płytkę do inkubatora na 30 minut w temperaturze 37 °C (prehybrydyzacja).
      UWAGA: Bufor do hybrydyzacji sondy musi być wstępnie podgrzany do 37 °C przed użyciem. Oblicz wymaganą objętość: 100 μl jest potrzebne na pojedynczą wkładkę Transwell.
    2. Przygotuj roztwór sondy. Ponieważ 1 ml roztworu sondy wymaga 4 pmol sondy, dodaj 4 μl 1 μM roztworu podstawowego sondy do 1 ml buforu hybrydyzacyjnego sondy i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Do wykrywania RNA użyj 100 μl roztworu sondy na wkładkę Transwell. Pozostaw roztwór sondy na lodzie do końca etapu prehybrydyzacji.
    3. Usuń roztwór prehybrydyzacyjny i dodaj roztwór sondy.
    4. Inkubować komórki przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 37 °C.

      DZIEŃ 3
    5. Nadmiar sondy usunąć przez mycie przez 4 x 15 minut 100 μl buforu do płukania sondy w temperaturze 37 °C.
    6. Myć próbki przez 2 x 5 minut za pomocą 5x SSCT w temperaturze pokojowej.
    7. Zastąp 5x SSCT 1x PBS i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C do czasu amplifikacji.
  3. wzmocnienie
    1. Próbki należy wstępnie amplifikować, inkubując je z buforem amplifikacyjnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj każdą spinkę do włosów, schładzając zatrzaskowo żądane objętości w osobnych tubkach.
      1. Aby przygotować 500 μl roztworu do amplifikacji, użyj 30 pmol każdej spinki do włosów (np. dla 500 μl użyj 10 μl 3 μM roztworu podstawowego spinki do włosów).
      2. Przenieś roztwór spinki do włosów do rurek.
      3. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 90 s.
      4. Schłodzić do RT przez 30 minut w ciemności.
    3. Przygotować roztwór spinki do włosów, dodając wszystkie schłodzone spinki do włosów schłodzone zatrzaskowo do 500 μl buforu wzmacniającego w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń roztwór do wstępnego amplifikacji i dodaj kompletny roztwór spinki do włosów.
    5. Próbki należy inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Usunąć nadmiar spinek do włosów, myjąc 5x SSCT w RT w następujący sposób: 2 x 5 min, 2 x 15 min i 1 x 5 min.
    7. Zastąp 5x roztwór SSCT 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2-3 dni lub przejdź bezpośrednio do barwienia jądrowego.
      UWAGA: W razie potrzeby należy użyć próbek RNA-FISH w standardowym teście immunofluorescencyjnym, a następnie barwieniu jądrowym (patrz punkt 6).
  4. Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
    1. Odessać 1x PBS roztwór i zastąpić go roztworem DAPI (0,2 μg/ml) w 1x PBS.
    2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
    4. Umieść membranę wyciętą z wkładek Transwell na 10 μl podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe medium montażowe (5 μl) do membrany.
    5. Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.
    6. Zamontowane próbki należy utwardzać na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności.
    7. Po utwardzeniu uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelniaczem VALAP lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu próbek.

6. Analiza immunofluorescencyjna komórek Vero i kultur HAE

UWAGA: Wykonaj test immunofluorescencyjny w dniu 3 dla linii komórkowych lub w dniu 4 dla hodowli HAE. Dla każdego modelu należy zastosować inne podejście. Wszystkie różnice są wyraźnie wskazane.

  1. Odessać 1x roztwór PBS ze studzienek.
  2. Blokować próbki przez inkubację z 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej w roztworze PBST przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, przygotowując odpowiednie rozcieńczenia w roztworze blokującym, a następnie inkubować.
    1. Dla komórek Vero na szkiełkach nakrywkowych:
      1. Umieścić krople (30-50 μl) roztworu przeciwciał na parafilmie w komorze wilgotnościowej.
      2. Umieść szkiełka nakrywkowe na kroplach przeciwciał komórkami skierowanymi w dół.
    2. W przypadku HAE zastąpić środek blokujący w wkładkach roztworem przeciwciał (100 μl) i inkubować próbki w wilgotnej komorze.
      UWAGA: Dostosuj czas i temperaturę dla każdej inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Typowe parametry to 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Przemywać próbki PBST przez 3 x 5 minut.
    1. W przypadku komórek na szkiełkach nakrywkowych przenieść na płytkę 12-dołkową i dodać roztwór PBST.
    2. W przypadku posiewów HAE roztwór przeciwciała należy zastąpić roztworem PBST.
  5. Sprawdź źródła światła i filtry dostępne dla mikroskopu konfokalnego.
  6. Wybierz przeciwciała drugorzędowe w zależności od gatunku gospodarza. Wybierz parametry fluoroforu (długości fal wzbudzenia i emisji, szerokość widma i wydajność wzbudzenia w zależności od dostępnego źródła światła).
    UWAGA: Parametry spektralne można modelować za pomocą narzędzi online (patrz Tabela materiałów).
  7. Przygotuj odpowiednie roztwory przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając je roztworem blokującym.
  8. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (jak w ppkt 6.3), ale inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  9. Umyć próbki jak w kroku 6.4.
  10. Barwienie jądrowe i montaż ślizgowy
    1. Do komórek na szkiełkach nakrywkowych
      1. Odessać PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/ml) w roztworze 1x PBS.
      2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
      4. Umieścić szkiełka nakrywkowe na kroplach 10 μl podłoża montażowego komórkami skierowanymi w dół.
      5. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
    2. Do kultur HAE
      1. Zassać 1x PBST i zastąpić go DAPI (0,2 μg/mL) w roztworze 1x PBS.
      2. Próbki należy inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      3. Odessać roztwór DAPI i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS.
      4. Umieść wycięte membrany na kroplach 10 μl pożywki montażowej komórkami skierowanymi do góry i dodaj dodatkowe (5 μl) podłoża montażowego do membrany.
      5. Przykryj membrany szkiełkami nakrywkowymi.
      6. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.

7. Mikroskopia konfokalna

  1. Zdefiniuj ścieżki, określając używane fluorofory.
  2. Wybierz tryb i szybkość skanowania.
  3. Dostosuj wartości mocy, wzmocnienia i przesunięcia lasera dla każdego fluoroforu, porównując je z odpowiednimi kontrolami negatywnymi: dla wirusa, pozorowane komórki; dla białek komórkowych, próbki barwione przeciwciałami kontrolnymi izotypu od odpowiedniego gospodarza.
  4. Aby uzyskać obraz 3D, aktywuj tryb z-stack i ustaw górny i dolny limit. Ustaw rozmiar/liczbę kroku.
    UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat obrazowania koronawirusa, zobacz19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół immuno-RNA-FISH opisany w tym manuskrypcie został przeprowadzony przy użyciu dwóch systemów komórkowych: linii komórkowej Vero i hodowli 3D HAE. Główne kroki dla obu modeli komórkowych przedstawiono w tabeli 2. Protokół RNA-FISH do wizualizacji SARS-CoV-2 w kulturach HAE obejmuje etapy typowe dla próbek tkanek, tj. przepuszczalność ze 100% MeOH i ponowne uwodnienie za pomocą stopniowanej serii roztworów MeOH-PBS i 0,1% Tween. Immunofluorescencję przeprowadzono po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immuno-RNA-FISH to niezawodna metoda podwójnego barwienia RNA i białek komórkowych. W tym miejscu opisano zmodyfikowany protokół immuno-RNA-FISH, który umożliwia wykrywanie RNA SARS-CoV-2 i białek komórkowych w liniach komórkowych i kulturach HAE. Protokół ten można dostosować do stosowania w różnych modelach komórek, w tym monowarstwach komórkowych lub określonych tkankach. Metoda opiera się na koncepcji HCR inicjowanego przez odpowiednią lokalizację sondy. Następnie, użycie sond z dzielonym inicjatorem w celu rozpoczęc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego na badania nad SARS-CoV-2 oraz przez granty z Narodowego Centrum Nauki (granty UMO2017/27/B/NZ6/02488 dla K.P. i UMO-2018/30/E/NZ1/00874 dla A.K.-P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt Mikroskop
konfokalny LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- ShakerFisher Scientific12965501
New BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materiały
Szkiełka nakrywkowe 15 mm x 15 mm nr 1LabSolute7695022
probówki 1,5 mlFL-MEDICAL5.350.023.053
Płytka 12-dołkowaTTP92412
Stożkowa probówka wirówkowaSarstedt5.332.547.254
parafilmPipetyP7793-1EA
Kolekcja VWR612-5523P, 612-5827P
szkło ślizgowePTH CHEMLAND04-296.202.03
Odczynniki Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Odczynniki
Alexa fluorofor 488-sprzężone przeciwciała drugorzędowe Invitrogen
β 5-tubulina Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
Fosforan disodowySigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR AmplificationBuffer Molecular Instruments, Inc.Można również przygotować BAM01522 Bufor doi:10.1242/dev.165753: Informacje uzupełniające
Wzmacniacz HCR B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
Wzmacniacz HCR B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.Bufor
hybrydyzacyjny sondy S012522 HCRInstrumenty molekularne, Inc.Możnarównież przygotować BPH03821 Bufor doi:10.1242/dev.165753: Zestaw sondy HCR z informacjami uzupełniającymi
dla SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR Probe Wash BufferMolecular Instruments, Inc.Możnarównież przygotować BPW01522 Bufor doi:10.1242/dev.165753: Informacje uzupełniające
HEPESBioShopHEP001.100
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma63138-250G
MetanolSigma32213-1L-M
Fosforan monopotasowySigmaP5655-100G
ParaformaldehydSigmaP6148-1KG
RURYBioShopPIP666.100
Chlorek potasuSigmaP5405-250G
Prolong Diamentowe medium montażowe zapobiegające blaknięciuInvitrogenP36970
Chlorek soduBioShopSOD001.5
Cytrynian trisodowy 2-hydratPOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
Oprogramowanie
PrzeglądarkaModelowanie parametrów spektralnych
ImageJ FidżiAkwizycja i przetwarzanie obrazów z-stack
Inkubator Galaxy170R serologiczne Sigma S013922 spektrawizora fluorescencji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118(2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286(2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8(2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889(2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830(2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SARS CoV 2 VisualizationImmuno RNA FISHIn Situ HybridizationHybridization Chain ReactionViral RNA DetectionHuman Airway EpitheliumConfocal MicroscopyImmunofluorescence LabelingSingle Cell AnalysisProtein RNA Interactions

Powiązane artykuły