Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Robak bawełniany, Helicoverpa armigera, jest jednym z najbardziej niszczycielskich szkodników na świecie. Połączenie genetyki molekularnej, fizjologii, genomiki funkcjonalnej i badań behawioralnych sprawiło, że H. armigera stał się gatunkiem modelowym w Lepidoptera Noctuidae. Aby badać funkcje in vivo i interakcje między różnymi genami, technologia edycji genomu z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) / powiązanym białkiem 9 (Cas9) jest wygodną i skuteczną metodą stosowaną do wykonywania funkcjonalnych badań genomicznych. W tym badaniu przedstawiamy systematyczną metodę krok po kroku w celu zakończenia nokautu genu u H. armigera przy użyciu systemu CRISPR/Cas9. Szczegółowo opisano budowę i syntezę przewodnikowego RNA (gRNA). Następnie podsumowano kolejne etapy składające się z projektowania specyficznego dla genu startera do tworzenia przewodnika RNA (gRNA), pobierania zarodków, mikroiniekcji, hodowli owadów i wykrywania mutantów. Na koniec przedstawiono porady i uwagi dotyczące rozwiązywania problemów, aby poprawić wydajność edycji genów. Nasza metoda posłuży jako odniesienie do zastosowania edycji genomu CRISPR/Cas9 u H. armigera, a także innych ciem z rzędu Lepidoptera.
Wprowadzenie
Zastosowanie technologii edycji genomu dostarcza skutecznego narzędzia do uzyskania mutacji genów docelowych u różnych gatunków. Pojawienie się systemu CRISPR/związanego z białkiem 9 (Cas9) w klastrach, regularnie rozmieszczonych, krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/związanego z nim białka 9 (Cas9) zapewnia nową metodę manipulowania genomami1. System CRISPR/Cas9 składa się z przewodnika RNA (gRNA) i endonukleazy Cas9 2,3, podczas gdy gRNA można dalej podzielić na dwie części, docelową komplementarną CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującą crRNA (tracrRNA). gRNA integruje się z end....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie starterów specyficznych dla genów i przygotowanie sgRNA
- Zweryfikuj konserwatywny region genomowy w genie będącym przedmiotem zainteresowania poprzez amplifikację PCR i analizy sekwencjonowania. Amplifikować gen docelowy z DNA genomu H. armigera i rozróżnić eksony i introny.
UWAGA: Specyficzność sekwencji miejsca przewodnika jest niezbędna, aby uniknąć edycji genów poza celem. Poszukiwane możliwe miejsca przewodników w eksonach znajdują się w pobliżu 5' UTR genu. Następnie ważne jest, aby upewnić się, że gen jest całkowicie niefunkcjonalny. Podsumowanie ścieżki przepływu do przygotowania sgRNA jest zilustrowane na
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół przedstawia szczegółowe etapy otrzymywania linii z nokautem genów u H. armigera z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9. Reprezentatywne wyniki uzyskane zgodnie z tym protokołem zostały podsumowane w zakresie selekcji gDNA, zbierania i mikroiniekcji zarodków, hodowli owadów oraz detekcji mutantów.
W niniejszym badaniu miejsce docelowe badanego genu znajdowało się w jego drugim eksonie (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowanie systemu CRISPR/Cas9 zapewniło potężne wsparcie techniczne w zakresie analizy funkcji genów i interakcji między różnymi genami. Szczegółowy protokół, który tutaj prezentujemy, pokazuje wytworzenie mutanta homozygoty u H. armigera poprzez edycję genomu CRISPR/Cas9. Ta niezawodna procedura zapewnia prosty sposób na ukierunkowaną mutagenezę genów u H. armigera.
Wybór miejsc docelowych CRISPR może mieć wpływ na skuteczność mutagenezy37. W tym p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31725023, 31861133019 do GW, a 31171912 do CY).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2kb drabinka DNA | TransGen Biotech | BM101 | |
| Szkło kapilarne | Świat Precision Instrucments | 504949 | określany jako "szkło kapilarne" w protokole |
| Taśma dwustronna | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Mikrowtryskiwacz Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Mikromanipulator Eppendorf InjectMan 4 | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Końcówki do pipet | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precyzyjny zestaw do syntezy gRNA | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Żagiel | do mikroskopu | 7105 | |
| Mikroskop Olympus | Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | używany do wykrywania mutantów |
| Ściągacz do mikropipet | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| Zestaw genomicznego DNA TIANamp | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
Bibliografia
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
